JP2000014399A - 細胞傷害活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 放射性物質不用の細胞傷害活性を測定する方
法を提供する。 【構成】 標的細胞に蛍光色素ローダミン−１２３を取
り込ませて標識し、このローダミン−１２３標識標的細
胞と、細胞傷害活性を有するキラー細胞あるいは細胞傷
害活性物質とを培養することにより、傷害を受けた標的
細胞から蛍光色素ローダミン−１２３が遊離する。この
遊離したローダミン−１２３の蛍光強度を測定すること
により、キラー細胞あるいは細胞傷害性物質の標的細胞
に対する細胞傷害度を決定することができる。 【効果】 細胞傷害活性測定に通常使用される放射性同
位体^５１Ｃｒで標識した標的細胞を使用した場合と同等
以上の感度および精度を有し、且つ放射性同位体を使用
しないため、安全性が高く簡便かつ安価であり、環境汚
染の問題も生じることがない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、放射性同位体を使用す
ることなく、放射性同位体を使用した場合と同等以上の
感度および精度を有する、蛍光色素ローダミン−１２３
（Ｒｈ−１２３）を使用した細胞傷害活性の測定法を提
供するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトを含む哺乳動物に元来備わった免疫
学的防御機構の一つとして、ナチュラルキラー細胞（Ｎ
Ｋ細胞）と称せられる細胞傷害活性を有する細胞集団
が、リンパ組織や末梢血単核細胞・白血球の中に存在す
る。ＮＫ細胞が細胞を傷害又は破壊する作用を、ＮＫ細
胞媒介性細胞傷害活性（ＮＫ活性）といい、特異抗原認
識レセプターを介して標的細胞を傷害する細胞傷害性Ｔ
リンパ球とは異なり、特異抗原認識レセプターを介する
ことなく、ある種の細胞を標的として傷害する活性であ
り、ある程度の細胞選択性があり、腫瘍細胞又はウイル
ス関連抗原等を膜表面に提示する細胞を標的細胞とし、
高い傷害活性を示す。また、リンパ球がインビトロ（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ）あるいはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）
でインターロイキン−２などのリンホカインで活性化さ
れて生じる、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細
胞）もＮＫ細胞と類似の活性を有し、強力な腫瘍細胞傷
害作用を有することから、ガン治療に利用されている。

【０００３】従って、ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、患者
個々の概括的な免疫学的状態を良く反映していると考え
られており（トリンシェリ（Ｔｒｉｎｃｈｅｒｉ）、ペ
ルジア（Ｐｅｒｕｓｓｉａ）ら，ラボラトリー インベ
スティゲエション １９８４年第５０巻第４８９頁（Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ５
０，４８９，１９８４）、種々の治療の有効性評価のた
めに、治療開始前や治療後又は治療継続中の患者におい
て、ＮＫ細胞傷害活性を測定することは有用である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】細胞傷害活性測定は、
キラー細胞の場合だけではなく、腫瘍壊死因子−α（Ｔ
ＮＦ−α）または腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）など
の細胞傷害性サイトカイン、リシンなどの細胞毒あるい
は抗ガン剤などの細胞傷害活性評価の際にも行われる。
現在、ＮＫ活性等の細胞傷害活性の測定は、一般に標的
細胞の標識に^５１Ｃｒのような放射性同位体を使用する
測定法が使用されている。しかし、放射性同位体を使用
する場合、放射性同位体取扱訓練を受けた職員や、放射
性同位体特有の個別施設や設備が必要で、費用的にも嵩
む。そのため、放射性同位体の取り扱いが禁止されてい
る、若しくは許可されていない病院や小さな研究所では
その実施が困難である。またそれ以外にも、放射性物質
や重金属の使用は、当然その廃棄にも種々の規制を伴う
上、環境汚染の問題も非常に大きく、最近では世界的に
放射性同位体の使用を避ける努力がなされている。

【０００５】そこで、放射性同位体を用いない細胞傷害
活性測定法が過去にも検討され、いくつか報告されてい
る。例えば、細胞内酵素であるアルカリホスファターゼ
や乳酸脱水素酵素の遊離を測定する方法や、フローサイ
トメーターを用いて、キラー細胞あるいは細胞傷害性物
質との共培養後の、標的細胞中の死細胞の比率を算出す
る方法である。

【０００６】しかし、細胞内酵素の遊離を測定する方法
は、標的細胞の種類によって含有酵素量に差があり、ヒ
トＮＫ活性測定の標的細胞として最も汎用されているＫ
−５６２赤芽球系白血病細胞株（Ｋ−５６２細胞）など
では、遊離酵素量が低すぎて利用不可能であったり、培
養中に死んだキラー細胞を含む細胞群からも無視できな
い量の酵素の遊離が生じるため、標的細胞による酵素遊
離のみを測定することは不可能な場合が多い。特に、キ
ラー細胞が標的細胞数の１０倍以上の比率で細胞傷害活
性を測定する場合などには、これらの細胞内酵素遊離を
測定する方法では、正確に細胞傷害活性を測定すること
が出来ない。又、フローサイトメーターは非常に高価な
電子機器であるため一般の施設には普及していない上、
解析に細胞が多数必要なことなどの欠点があるため、細
胞傷害活性測定に広く使用されるには至っていない。

【０００７】我々は、先にキラー細胞と培養器付着性の
標的細胞との共培養後に、キラー細胞を除去して、標的
生細胞によるニュートラルレッド色素の取り込み量を測
定する方法で、マウス抗同種細胞傷害活性測定法を確立
した（未発表データ）。しかし、ヒトＮＫ活性測定に一
般に用いられる標的細胞であるＫ−５６２細胞が非付着
性であり、標的細胞とキラー細胞とを分離することが困
難なために、この試験方法は適用できなかった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この様な経験を踏まえ、
細胞傷害活性が標的細胞総数に対する傷害された細胞数
の比率として算出されるという基本に基づいて、正確な
分析を行うためには、特異的プローブで標的細胞を標識
するのがより適当であると判断した。我々は先ず、放射
性物質不用の細胞傷害活性測定法を確立するため、種々
のプローブでのＫ−５６２細胞標識を研究した。

【０００９】通常の場合、キラー細胞による細胞傷害活
性は、一定数の標識された標的細胞に、その数倍から１
００倍のキラー細胞を含む細胞懸濁液を加え、一定時間
培養し、標的細胞から培地中に遊離された標識物質を検
出することにより測定される。従って、キラー細胞を加
えないときに生じる標識物質自然遊離量の、標識細胞の
総てからの遊離量（総遊離量）に対する比率、即ち自然
遊離率が小さいこと、及び細胞が傷害を受けた場合、そ
の標識物質の遊離が容易であることが重要である。これ
らの点は、Ｋ−５６２細胞を標識細胞として用いて、細
胞傷害性物質であるＴＮＦ−αなどの細胞傷害性サイト
カインの活性を測定する場合でも同様である。

【００１０】鋭意研究した結果、蛍光色素であるＲｈ−
１２３が、Ｋ−５６２生細胞中に能率的に取り込まれ、
生細胞中のミトコンドリア膜に結合するミトコンドリア
プローブとなって保持され、自然遊離が少ないこと、標
識された細胞が傷害を受けた場合には容易に細胞外へ遊
離され、細胞傷害活性測定において優れた標識となり得
ること、細胞傷害活性のない細胞との接触では遊離され
ないこと、また遊離されたＲｈ−１２３の蛍光強度を測
定することから、測定感度も良好であることを知見し、
本発明を完成した。

【００１１】即ち、本発明は、Ｒｈ−１２３を標的細胞
に取り込ませて標識し、Ｒｈ−１２３標識標的細胞と
し、これとキラー細胞あるいは細胞傷害性物質とを共培
養して、培地中に遊離されるＲｈ−１２３の蛍光強度を
測定することにより、そのキラー細胞または細胞傷害性
物質の標的細胞に対する細胞傷害活性を測定するもので
ある。

【００１２】Ｒｈ−１２３は、陽荷電の蛍光色素であ
り、生細胞中の陰性に荷電するミトコンドリア膜上に選
択的に集積することが、ジョンソンらに報告された（プ
ロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミィ
オブ サイエンシス オブ ザユー・エス・エー１９８
０年第７７巻第９９０頁（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．７７，９
９０，１９８０）。その後、抗ガン剤などの細胞への影
響、特にミトコンドリアへの影響を解析する方法とし
て、薬物影響下あるいは薬物処理後の細胞へのＲｈ−１
２３の取り込み量を指標として、ミトコンドリアに対す
る傷害活性を観察する報告も出ている。しかしながら、
本発明に述べる様に、正常もしくは何らの薬物影響下に
ない細胞に、まずＲｈ−１２３を取り込ませて標識され
た細胞とし、キラー細胞あるいは細胞傷害性物質ととも
に培養後、傷害を受けた標識細胞より遊離されるＲｈ−
１２３の蛍光強度を測定することにより、キラー細胞あ
るいは細胞傷害性物質の細胞傷害活性を決定する方法
は、未だ報告されていない。従って、本発明においてＲ
ｈ−１２３を標的細胞標識のためのプローブとして応用
し、細胞傷害活性測定法として確立したことは新規であ
る。

【００１３】本発明の測定法は、放射性同位体を用い
ず、安全かつ安価に実施可能であり、測定感度および精
度も放射性同位体を用いる測定の場合とほぼ同等であ
る。乳酸脱水素酵素等の標的細胞からの酵素遊離を測定
する方法とは異なり、キラー細胞からのＲｈ−１２３の
遊離はあり得ないため、標的細胞数に対するキラー細胞
数の比率が低いものから、比較的高い、例えば、キラー
細胞の標的細胞に対する比（キラー細胞／標的細胞）が
５：１〜１００：１の実験系においても細胞傷害率の測
定が可能である。又、キラー細胞の細胞傷害活性を促進
する作用（インターフェロン等と類似の作用）を有する
物質のインビトロでのスクリーニングにも使用すること
が出来、さらにはキラー細胞とは無関係の、細胞傷害性
物質の細胞傷害活性測定および細胞傷害性Ｔリンパ球等
の特異抗原認識レセプターを介して標的細胞を傷害させ
る特異的な傷害活性の測定にも標的細胞をＲｈ−１２３
で標識することにより応用できる。

【００１４】本発明でいうキラー細胞とは、抗原非特異
的細胞傷害活性を有する細胞を意味し、代表的なものと
してヒトＮＫ細胞やヒトＬＡＫ細胞等が挙げられるが、
それら細胞を含有するリンパ組織、末梢血単核球や末梢
血リンパ球等の細胞群も含まれる。

【００１５】次に細胞傷害活性測定の実施例を挙げて、
本発明の細胞傷害活性測定法を具体的に説明するが、本
発明はその要旨を満たす限り以下の実施例に制約される
ものではない。

【００１６】使用した主な試薬類は以下のものである。 ・培養液：ＲＰＭＩ−１６４０培養液（ギブコ（ＧＩＢ
ＣＯ））に、Ｌ−グルタミン３００μｇ／ｍｌ、ペニシ
リン１０Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ
及びファンギゾン２５０ｎｇ／ｍｌ添加し、更に非働化
ウシ胎児血清を１０％添加して培養に供した。 ・標的細胞：Ｋ−５６２細胞（大日本製薬株式会社から
購入）を上記培養液を用いて継代培養し、標的細胞とし
て使用する前日に所定の細胞濃度で培養を開始し、２０
時間後に採取して使用した。 ・ヒトＮＫ細胞懸濁液：Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋不含リン酸
緩衝生理食塩液で希釈したヘパリン添加ヒト末梢血を、
白血球分離液（リンフォサイト セパレーションメディ
ウム（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
Ｍｅｄｉｕｍ））：フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）６．２
ｇ、ソディウム ジアトリゾェート（Ｓｏｄｉｕｍ ｄ
ｉａｔｒｉｚｏａｔｅ）９．４ｇ／１００ｍｌ、密度
１．０７７〜１．０８０（オルガノン テクニカ、ダル
ハム、ノースカロライナ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉ
ｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ））に上層し、密度勾配遠心
によりヒト末梢血中の白血球を分離した。細胞をリン酸
緩衝生理食塩液で洗浄後、培養液に再懸濁し、ＮＫ細胞
含有細胞懸濁液として使用した。 ・Ｒｈ−１２３保存液：Ｒｈ−１２３（モルキュラ プ
ローブ社、ユージン、オレゴン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏ
ｎ））を３．３３ｇ／ｍｌとなるようにエンドトキシン
不含滅菌精製水に溶解した。遮光下４℃で１週間保存可
能な液として使用した。 ・Ｒｈ−１２３標識溶液：Ｒｈ−１２３保存液を使用直
前に室温で強く攪拌した後、培養液で５０倍に希釈し、
フィルターろ過滅菌して使用した。 ・ヒト白血球由来インターフェロンーα：５×１０^６国
際単位（ＩＵ）／ｍｌ、（インターフェロン サイエン
ス社、ニュー ブランズウィック、ニュージャージー
（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，
Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ））の原液を培養液
にて必要濃度に希釈して使用した。 ・Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４（アイシーエヌ、アービン、カリ
フォルニア（ＩＣＮ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ））：Ｒｈ−
１２３を用いた細胞傷害活性測定法が、従来の放射性同
位体^５１Ｃｒを用いる細胞傷害活性測定法と同等の結果
を示すか否かを明らかにするために、標的細胞を^５１Ｃ
ｒで標識した。ウシ胎児血清不含ＲＰＭＩ−１６４０培
地で洗浄したＫ−５６２細胞１×１０^６個を２００μｌ
のＮａ_２ ^５１ＣｒＯ_４液（８０μＣｉ）に再懸濁し、３
７℃、５％炭酸ガス下で２時間培養後、ウシ胎児血清含
有ＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄し、５×１０^４
個／ｍｌの細胞濃度となるように培養液で調製して、
^５１Ｃｒ標識標的細胞懸濁液として用いた。

【００１７】

【実施例１】まず、Ｋ−５６２細胞のミトコンドリアに
対するＲｈ−１２３の親和性を観察するため、本細胞に
よるＲｈ−１２３の取り込み程度、及び細胞よりのＲｈ
−１２３の自然遊離程度について検討した。Ｒｈ−１２
３標識溶液中に、Ｋ−５６２細胞を１×１０^６個／ｍｌ
の濃度に懸濁し、３７℃、５％炭酸ガス下で１５分〜５
時間培養した。一定時間毎に細胞液をサンプリングし、
細胞を洗浄後、９６ウエル丸底培養プレートの各ウエル
に１００μｌの培養液に懸濁した５×１０^３個の細胞を
添加し、１００μｌの０．１％トリトン−Ｘ１００溶液
を加えて、細胞を完全に破壊してＲｈ−１２３を遊離さ
せ、プレートを８００ｒｐｍで５分間遠心後、上清中の
Ｒｈ−１２３の蛍光強度を測定した。蛍光強度は、各サ
ンプル液１００μｌを、蛍光測定用９６ウエルプレート
であるルミノコンビプレート８（Ｌｕｍｉｎｏｃｏｍｂ
ｉｐｌａｔｅ８ ）、ラボシステム、フィンランド（Ｌ
ａｂｓｙｓｔｅｍ，Ｆｉｎｌａｎｄ））の各ウエルに移
し、培養液のみを添加したウエルをブランクとして、励
起波長４９０ｎｍ、測定波長５３０ｎｍで測定した。図
１に示すように、Ｒｈ−１２３の取り込み量は時間とと
もに、ほぼ直線的に増加することが明らかとなった。

【００１８】次にＲｈ−１２３の自然遊離程度について
検討するため、上記条件で２時間Ｒｈ−１２３で標識さ
れたＫ−５６２細胞を培養液で３回洗浄後、さらに６時
間培養した。３０分毎にサンプリングし、５×１０^３個
の細胞内に残存するＲｈ−１２３の蛍光強度を測定し
た。図１に示すように、Ｒｈ−１２３標識Ｋ−５６２細
胞は、非常に緩慢にＲｈ−１２３を遊離し、培養３時間
内の、総遊離Ｒｈ−１２３の蛍光強度に対する細胞内に
保持されたＲｈ−１２３蛍光強度の比率は約８５％と高
く、それ以後保持率は減少する傾向を見せ、４時間で７
０％、６時間で５５％であった。

【００１９】

【図１】

【００２０】

【実施例２】上記試験結果より、Ｒｈ−１２３標識Ｋ−
５６２細胞は細胞傷害活性測定に標的細胞として応用可
能であることが明らかとなったので、細胞傷害活性測定
における標的細胞として用いるための最適条件を見出す
ために、Ｋ−５６２細胞の培養条件およびＲｈ−１２３
による標識条件について検討を行った。標的細胞として
採取する前日に、Ｋ−５６２細胞を種々の細胞濃度で２
０時間培養し、細胞採取洗浄後、上記の方法で細胞をＲ
ｈ−１２３で２時間標識し洗浄後、５×１０^３個／ウエ
ルの濃度で９６ウエル丸底培養プレートに分配し、さら
に３時間培養して、プレートを遠心後、培養上清中のＲ
ｈ−１２３の蛍光強度を、Ｒｈ−１２３自然遊離量とし
て測定した。Ｒｈ−１２３の総遊離による蛍光強度に対
する、自然遊離による蛍光強度の比率を、自然遊離率
（％）とした。細胞採取前日に高い細胞濃度（６０×１
０^４個／ｍｌ）で培養したＫ−５６２細胞を標識した場
合の３時間培養後の自然遊離率は１４％で、低い細胞濃
度（１．５×１０^４個／ｍｌ）で培養した場合の自然遊
離率１９％より、低いことが明らかとなった。

【００２１】次にＲｈ−１２３の濃度の影響について検
討するため、４．２〜６６．６μｇ／ｍｌの異なる濃度
の標識液中でＫ−５６２細胞を２時間培養後洗浄し、上
記方法で３時間後のＲｈ−１２３自然遊離率を測定し
た。自然遊離率はＲｈ−１２３の濃度によっては余り変
化せず、常に１９％以下であった。しかしながらＲｈ−
１２３の標識細胞よりの総遊離蛍光強度は、高濃度のＲ
ｈ−１２３で標識した細胞で最も高く、総遊離蛍光強度
と自然遊離蛍光強度との差が大きくなることから、６
６．６μｇ／ｍｌの濃度のＲｈ−１２３で、Ｋ−５６２
細胞を標識するのが最適であることが示された。

【００２２】またＲｈ−１２３による標識培養中のＫ−
５６２細胞の濃度の影響について検討したところ、細胞
濃度が１×１０^５個／ｍｌよりも低くても、１×１０^７
個／ｍｌより高くても、自然遊離率が２０％より高くな
る傾向が観察され、５〜１０×１０^５個／ｍｌの範囲の
細胞濃度で標識した場合は、２０％以下であった。以上
の結果より、Ｋ−５６２細胞の最適標識条件として、
１）Ｋ−５６２細胞を前日から培養して、飽和細胞濃度
よりやや低い濃度の時点で、標識細胞として採取する、
２）Ｒｈ−１２３標識液は、６６．６μｇ／ｍｌの濃度
で用いる、３）標識培養中のＫ−５６２細胞濃度は、１
×１０^６個／ｍｌとする。

【００２３】

【実施例３】細胞傷害活性測定条件の確立 上記条件で標識したＫ−５６２細胞を、細胞傷害活性測
定の標的細胞として用いるため、標的細胞濃度および細
胞傷害培養時間の条件について検討した。標識したＫ−
５６２細胞を３回培養液で洗浄後、９６ウエル丸底培養
プレートの各ウエルに、０．３×１０^３、０．６×１０
^３、１．２５×１０^３、２．５×１０^３及び５×１０^３
個の細胞を含む１００μｌの細胞懸濁液を添加し、２〜
５時間培養した。培養２時間以後、毎時間プレートを取
り出し、Ｒｈ−１２３総遊離蛍光強度および自然遊離蛍
光強度を測定した。

【００２４】図２ａに示すように、Ｒｈ−１２３総遊離
蛍光強度は、各ウエル中の標識細胞数に対し直線的に増
加すること、自然遊離蛍光強度は培養４時間目までは大
差はなく、５時間以上になると上昇傾向を示した。ま
た、各ウエル中の標的細胞濃度が高い程自然遊離率は低
いこと、また５×１０^３個／ウエルの標的細胞濃度では
培養時間が３時間で、自然遊離率は２０％以下となるこ
とが明らかとなった（図２ｂおよび図２ｃ）。また自然
遊離率が、単に細胞との接触に依っても上昇するか否か
を検討するため、Ｒｈ−１２３標識Ｋ−５６２細胞を、
全く細胞傷害活性のないヒト白血病細胞と共培養した後
に、自然遊離率を測定したが、細胞接触によるＲｈ−１
２３の自然遊離率上昇は認められなかった。以上の結果
より、細胞傷害活性測定は、５×１０^３個／ウエルの細
胞濃度のＲｈ−１２３標識Ｋ−５６２細胞を標的細胞と
して、培養時間３時間で行うのが最適であると結論し
た。

【００２５】

【図２ａ】

【００２６】

【図２ｂ】

【００２７】

【図２ｃ】

【００２８】

【実施例３】Ｒｈ−１２３遊離測定による細胞傷害活性
試験法と放射線同位体^５１Ｃｒ遊離測定による試験法の
比較 本発明による細胞傷害活性測定結果が、従来から一般的
に用いられている^５１Ｃｒ遊離測定結果と同一性がある
か否かを確認するため、細胞傷害活性測定の代表とし
て、ヒト末梢血白血球のＮＫ活性測定を両測定法で並行
して行い、その測定結果を比較した。各々の測定法の標
的細胞としてＲｈ−１２３標識Ｋ−５６２細胞およびＮ
ａ_２ ^５１ＣｒＯ_４標識Ｋ−５６２細胞を作成した。Ｒｈ
−１２３による標識は上記記載どおり行い、Ｎａ_２ ^５１
ＣｒＯ_４による標識は以下の通り行った。即ち、２００
μｌのウシ胎児血清不含培養液中にＫ−５６２細胞が１
×１０^６個となるように懸濁し、８０μＣｉのＮａ_２
^５１ＣｒＯ_４を添加して、３７℃、５％炭酸ガス下で２
時間培養した。ウシ胎児血清含有培養液で３回洗浄後、
標識細胞５×１０^３個を含む１００μｌの細胞懸濁液
を、培養プレートの各ウエルに分配した。

【００２９】ＮＫ細胞としてヒト末梢血より分離した白
血球の細胞濃度を調整して、Ｒｈ−１２３標識あるいは
^５１Ｃｒ標識標的細胞を５×１０^３個分配された各ウエ
ルに、標的細胞に対する比率が５、１０、２０、４０、
６０倍となるように添加した。３７℃、５％炭酸ガス下
３時間培養後プレートを８００ｒｐｍ５分間遠心し、各
ウエルより回収した１００μｌの培養上清中のＲｈ−１
２３の蛍光強度あるいは^５１Ｃｒ放射活性を測定した。
各標識物質の自然遊離量を測定するためのウエルには、
ＮＫ細胞懸濁液の代わりに培養液１００μｌのみを、ま
た総遊離量測定用ウエルには０．１％トリトンＸ−１０
０溶液１００μｌを添加した。各測定値として、３ウエ
ルの測定値の平均値を算出した。ＮＫ細胞を細胞傷害性
物質として、ＮＫ細胞により傷害された標的細胞から遊
離したＲｈ−１２３あるいは^５１Ｃｒの量の総遊離量に
対する百分率を、各標識物質の特異遊離率（％）とし
て、以下の式により算出した。この特異遊離率（％）
が、ＮＫ細胞などの細胞傷害性物質の特異細胞特異傷害
率に相当する。

【００３０】

【数１】

【００３１】まず、一人の健常者の血液より白血球を分
離し、両測定法を並行して行い、細胞傷害活性を測定し
た。図３ａに示すように、ＮＫ細胞／標的細胞の各比率
で、Ｒｈ−１２３特異遊離率と^５１Ｃｒ特異遊離率は非
常に良く一致し、また測定値のバラつきに関しても同程
度であった。さらに、本結果の再現性を確認するため、
他の健常者の血液より白血球を分離し、同様の試験を行
った。その結果を図３ｂに示す。やはりＲｈ−１２３特
異遊離率と^５１Ｃｒ特異遊離率は非常に良く一致し、良
好な再現性が認められた。また測定値のバラつきに関し
ては、この実験ではＲｈ−１２３による試験の方がバラ
つきが少なかったのに対して、^５１Ｃｒ特異遊離測定に
おける測定値のバラつきが、特に低いＮＫ細胞／標的細
胞の比率で観察された。

【００３２】

【図３ａ】

【００３３】

【図３ｂ】

【００３４】また両測定法による結果が、真に相関する
か否かを統計学的に解析した。ＮＫ細胞／標的細胞の各
比率におけるＲｈ−１２３特異遊離率と^５１Ｃｒ特異遊
離率をＹ軸とＸ軸にそれぞれプロットし、これらの点に
ついて直線回帰分析を行った（図４）。回帰直線の傾き
は１．０３４±０．０２４４、ｒ^２は０．９７６の値が
得られ、両測定法の非常に高い相関性が確認された。

【００３５】

【図４】

【００３６】

【実施例４】さらに本発明におけるＲｈ−１２３を用い
る細胞傷害活性測定法が、インターフェロン−α（ＩＮ
Ｆ−α）のような細胞傷害活性促進あるいは修飾物質の
生物活性測定にも応用できるか否かを検討した。ヒト末
梢血白血球を分離洗浄後、１０、１００、または１，０
００国際単位（ＩＵ）／ｍｌのＩＮＦ−α存在下に、３
７℃、５％炭酸ガスの環境で２時間培養した。対照群の
白血球は培養液のみで培養した。細胞を培養液で洗浄
後、Ｒｈ−１２３標識Ｋ−５６２細胞５×１０^３個を分
配された各ウエルに、ＮＫ細胞／標的細胞の比率が、１
０：１または２０：１となるように添加し、３時間培養
後、Ｒｈ−１２３特異遊離率を求めて、各濃度のＩＮＦ
−αの白血球中のＮＫ細胞傷害活性への影響を調べた。
図５に示すように、白血球をＩＮＦ−αで２時間前処理
することにより、細胞傷害活性は未処理の白血球の細胞
傷害活性と比較して、著しく促進されていた。また白血
球洗浄後残存する微量のＩＮＦ−αが、直接Ｒｈ−１２
３標識Ｋ−５６２細胞に作用して、Ｒｈ−１２３の遊離
を起こす可能性を検討するため、１，０００ＩＵ／ｍｌ
のＩＮＦ−αをＲｈ−１２３標識Ｋ−５６２細胞に３時
間直接作用させて、Ｒｈ−１２３の自然遊離率を測定し
たが、ＩＮＦ−αが直接的に標的細胞からのＲｈ−１２
３遊離を促進することは、全く無いことが確認された。
従って、本発明のＲｈ−１２３標識標的細胞を用いる細
胞傷害活性測定法は、一般的細胞傷害活性測定法として
ばかりでなく、ＩＮＦ−αのような細胞傷害活性を促進
する細胞傷害修飾性物質の生物活性にも応用できること
が明らかである。

【００３７】

【図５】

【００３８】

【発明の効果】Ｒｈ−１２３によって標識されたＫ−５
６２標的細胞は、細胞傷害活性のない細胞との接触では
全くＲｈ−１２３特異遊離を起こさず、ＮＫ細胞やＬＡ
Ｋ細胞あるいは細胞傷害性物質等によって細胞傷害を受
けた場合にのみ、Ｒｈ−１２３を特異的に遊離する。ま
た、放射性同位体^５１Ｃｒ標識標的細胞を用いる従来の
細胞傷害活性測定法と比較した結果、両測定法による測
定値の相関性は非常に高く、Ｒｈ−１２３遊離測定法の
測定感度も精度も、^５１Ｃｒを用いる細胞傷害活性測定
法の感度と精度とほぼ同等、あるいはそれ以上であっ
た。従って、本発明のＲｈ−１２３を用いる細胞傷害活
性測定法は、^５１Ｃｒ等の放射性同位体を用いず、安全
かつ安価に実施可能であり、信頼性の高い結果が得ら
れ、且つ環境汚染などの問題も無い測定法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１における、Ｋ−５６２細胞によるＲｈ
−１２３の取り込みと細胞内保持の時間的経過を示すグ
ラフである。

【図２ａ】実施例２における、９６ウエル培養プレート
各ウエル内のＲｈ−１２３標識Ｋ−５６２細胞濃度と、
Ｒｈ−１２３総遊離蛍光強度および自然遊離蛍光強度と
の関係を示すグラフである。

【図２ｂ】実施例２における、Ｒｈ−１２３標識Ｋ−５
６２細胞の９６ウエル培養プレート内での培養時間とＲ
ｈ−１２３自然遊離率との関係を示すグラフである。

【図２ｃ】実施例２における、Ｒｈ−１２３標識Ｋ−５
６２細胞の濃度と、Ｒｈ−１２３自然遊離率との関係を
示すグラフである。

【図３ａ】実施例３におけるヒト末梢血白血球のＮＫ活
性測定において、本発明測定法により得られた特異遊離
率と、^５１Ｃｒ標識標的細胞を使用した測定法により得
られた特異遊離率とを比較したグラフである。

【図３ｂ】実施例３におけるヒト末梢血白血球のＮＫ活
性測定の再現性試験において、本発明測定法により得ら
れた特異遊離率と、^５１Ｃｒ標識標的細胞を使用した測
定法により得られた特異遊離率とを比較したグラフであ
る。

【図４】実施例３におけるヒト末梢血白血球のＮＫ活性
測定において、本発明の測定法と^５１Ｃｒ標識標的細胞
を使用した測定法による特異遊離率（％）測定結果の相
関性を示すグラフである。

【図５】実施例４における、ＩＮＦ−αによるヒト末梢
血白血球のＮＫ活性促進作用を、本発明の測定法で測定
し得ることを示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞傷害活性測定において、ローダミン
   −１２３標識標的細胞とキラー細胞あるいは細胞傷害性
   物質とを共培養し、遊離されるローダミン−１２３の量
   を測定することによって、該キラー細胞または細胞傷害
   性物質の標的細胞に対する細胞傷害活性を決定すること
   を特徴とする細胞傷害活性測定法
2. 【請求項２】 遊離されるローダミン−１２３の量を測
   定することが、ローダミン−１２３の蛍光強度を測定す
   ることである請求項１記載の細胞傷害活性測定法
3. 【請求項３】 キラー細胞がナチュラルキラー細胞また
   はリンホカイン活性化キラー細胞である請求項１〜２記
   載の細胞傷害活性測定法
4. 【請求項４】 細胞傷害性物質が、細胞傷害性サイトカ
   イン、細胞毒リシンまたは抗ガン剤のいずれかである請
   求項１〜２記載の細胞傷害活性測定法