ITUD950070A1 - Metodo epr la determinazione del potere antimicrobico di sostanze in sospensione liquida - Google Patents

Abstract

METODO PER LA DETERMINAZIONE DEL POTERE ANTIMICROBICO DI SOSTANZE IN SOSPENSIONE LIQUIDA, CHE UTILIZZA UN PROCEDIMENTO DI ANALISI CINETICO DIFFERENZIALE PER LA RIVELAZIONE DELLA CRESCITA O DELLA MANCATA CRESCITA DEI BATTERI SENSIBILI A TALI SOSTANZE.IL METODD PROPOSTO TROVA APPLICAZIONI IN LABDRATORI DI ANALISI MICROBIOLOGICHE PER L'ANALISI DI URINE, ANALISI DI SOLUZIONI ACQUOSE, ANALISI DI ALIMENTI.IN PARTICOLARE IL TROVATO CONCRETIZZA UN PROCEDIMENTO ANALITICO CHE FORNISCE RISULTATI IN TERMINI DI POTERE ANTIMIORDBICO PRECISI, AFFIDABILI E VELOCI VALUTANDO IL DIFFERENZIALE DELLA CINETICA DELLA CRESCITA BATTERICA RILEVATA RISPETTIVAMENTE NEI CAMPIONI DA ANALIZZARE PRESI A SE STANTI E NEI MEDESIMI CAMPIONI QUANDO AD ESSI VIENE AGGIUNTA UNA QUANTITA' NOTA DI UN BATTERIO SENSIBILE ALLE SOSTANZE ANTIMICROBICHE.

Description

DESCRIZIONE dell’invenzione avente per titolo:

"Metodo per la determinazione del potere antimicrobico di sostanze in sospensione liquida”

CAMPO DI APPLICAZIONE

Forma oggetto del presente trovato un metodo per la determinazione del potere antimicrobico di sostanze in sospensione liquida come espresso nelle rivendicazioni principali .

In particolare il trovato concretizza un procedimento analitico che fornisce risultati, in termini di potere antimicrobico valutando il differenziale della cinetica della crescita batterica rilevata rispettivamente nei campioni da analizzare presi a se' stanti e nei medesimi campioni quando ad essi viene aggiunta una quantità' nota di un batterio sensibile alle sostanze antimicrobiche. Il metodo proposto trova applicazioni in .laboratori di analisi microbiologiche vantaggiosamente per l'analisi di urine, analisi di soluzioni acquose, analisi di alimenti. STATO DELLA TECNICA

Allo stato attuale esistono tecniche che permettono di rivelare il potere antimicrobico di sostanze mediante l'utilizzo di batteri sensibili alla gran parte de l le sostanze antimicrobiche. Tali batteri sono ad esempio Staphilococcus aureus, Bacillus subtilis eccetera.

Il batterlo sensibile viene preparato in un terreno di coltura liquido per formare una sospensione omogenea. Tale sospensione viene distribuita in modo uniforme in piastre contenenti terreno di coltura nutriente del tipo agar solido adatto alla crescita del batterio sensibile. Nel campo delle analisi microbiologiche ed al fini del presente trovato i termini "crescita batterica” e "replicazione batterica” sono sinonimi in quanto esprimono un medesimo fenomeno che e' l'aumento della popolazione batterica nel tempo.

Dopo incubazione ad una opportuna temperatura delle piastre inoculate con il batterio sensibile, tale crescita risulta evidenziabile visivamente dall'intorbidamento della superficie del terreno di coltura.

Sulla superficie dello stesso terreno dove e ' stata distribuita la sospensione del batterio sensibile, vengono posti i campioni liquidi da analizzare sotto forma di microvolumi oppure di dischetti di carta che hanno assorbito piccole aliquote dei campioni; tale distribuzione deve garantire una separazione tra i vari campioni sulla superficie del terreno di coltura.

Tali campioni possono derivare dalsettore biomedico come ad esempio urine, sanque o dal settore alimentare come ad esempio latte, bibite, omogeneizzati diluiti in soluzioni acquose eccetera.

Dopo un adeguato periodo di incubazione durante in genere dalle 5 alle 18 ore a temperature che risultano caratteristiche dei singoli batteri e di solito comprese tra 30 e 60 "C, sulla superficie del terreno si potranno osservare delle zone piu' o meno torbide in funzione del fatto che si sia verificata o meno crescita batterica secondo l’equivalenza potere antimicrobico negativo crescita batterica = opacità', oppure secondo l'equivalenza potere antimicrobico positivo - mancata crescita “ trasparenza.

Tale tecnica e' manuale e la valutazione viene eseguita da un operatore visivamente.

Alcuni inconvenienti della tecnica attuale sono ad esempio il lungo tempo necessario ad ottenere i risultati; errori da parte dell'operatore riguardo alla corretta distribuzione dei campioni sul terreno di coltura; la diversa diluizione dei campioni distribuiti e la diversa distribuzione del batterio sensibile dovute al.le caratteristiche del terreno solido: la necessita'*di ripetere l’esame dovuta a incertezze nella valutazione.

Esistono metodi strumentali per la valutazione della crescita di batteri, preferenzialmente realizzati con l’uso di terreni liquidi contenuti in adatte celle di misura .

Tali metodi si basano sulla rivelazione di segnali elettrici derivanti dalla variazione delle caratteristiche chimico fisiche del terreno di coltura quando i batteri in esso contenuti si replicano. Alcune di queste caratteristiche sono la torbidità' del terreno, la sua conducibilità' elettrica, la sua capacita' elettrica, la diffusione o scattering della luce incidente -light scattering- eccetera.

Come e' noto, le variazioni dei segnali elettrici derivanti dalle variazioni delle proprietà' chimico fisiche menzionate sono correlate alle variazioni del numero di batteri presenti per unita' di volume e permettono di seguire in funzione del tempo l’andamento della crescita batterica.

La velocita' di aumento della popolazione batterica risulta correlata essa stessa al numero di batteri inizialmente presenti e di conseguenza rilevare la velocita' di crescita equivale a rilevare il numero di batteri presenti.

Dalla pratica comune si ha che l’utilizzo dei terreni liquidi permette una piu' agevole manipolazione dei campioni da analizzare e la tecnica strumentale permette di ottenere un risparmio del tempo necessario per evidenziare la avvenuta crescita dei.batteri.

Si citano di seguito a titolo di esempio alcune tecniche già' in uso nella determinazione del nùmero di batteri in sospensioni liquide.

La tecnica fotometrica che misura la intensità' della luce che passa attraverso la cella di misura contenente il campione e la tecnica di light scattering che misura la intensità' della luce diffusa dal campione nella cella di misura risultano applicabili a campioni che non presentino un valore di torbidità' elevata.

La tecnica impedenzometrica , che misura la variazione di impedenza elettrica del terreno di coltura durante la crescita dei batteri. e' particolarmente utile in campioni torbidi dove le tecniche fotometriche non sono applicabili.

Per ovviare agli inconvenienti dovuti alla tecnica manuale ed ottenere ulteriori vantaggi il presente trovato permette l’applicazione alla tecnica strumentale di un procedimento analitico per la determinazione del potere antimicrobico in modo univoco, veloce e preciso. ESPOSIZIONE DEL TROVATO

Il presente trovato e' espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni principali mentre rivendicazioni secondarie espongono varianti all’idea di soluzione principale.

Scopo del presente trovato e' di concretizzare un procedimento analitico in grado di fornire risultati in termini di potere antimicrobico precisi, univoci e veloci.

Il presente trovato prevede l’utilizzo di tecniche strumentali per la rilevazione della crescita dei batteri.

Il presente trovato effettua il confronto della crescita di batteri presenti o meno in due' celle di misura esaminate contemporaneamente e contenenti entrambe lo stesso terreno liquido di coltura e nelle quali vengono introdotte aliquote uguali del campione liquido da analizzare.

Secondo il presente trovato solamente in una delle due celle viene inoculata in aggiunta anche una aliquota di una sospensione di un batterio sensibile alle sostanze antimicrobiche eventualmente presenti nel campione già' inoculato nelle celle di misura.

Secondo il presente trovato entrambe le celle di misura vengono termostatate ad una temperatura adatta a favorire la crescita dei batteri e nello stesso tempo viene rilevato l'andamento nel tempo delle crescite dei batteri nelle due celle per mezzo della rivelazione dei segnali elettrici prodotti da opportuni sensori e causati dalle variazioni chimico fisiche dei terreni di coltura mentre i batteri crescono.

Nella pratica, relativamente alla crescita dei batteri nelle celle di misura si potranno verificare i casi elencati di seguito e distinti per comodità' con un lettera alfabetica.

Caso A: il campione in esame e' sterile e non contiene sostanze antimicrobiche.

Caso B: il campione in esame e' sterile e contiene sostanze antimicrobiche.

Caso C-. il campione in esame contiene batteri e non contiene sostanze antimicrobiche.

Caso D: il campione in esame contiene sia batteri che sostanze antimicrobiche.

Esaminando la cella contenente sia il campione che il batterio sensibile alle sostanze antimicrobiche, si rileva che:

nel caso A si avra' la crescita del batterio sensibile aggiunto;

nel caso B non si avra' crescita del batterio sensibile aggiunto;

nel caso C cresceranno sia il batterio aggiunto che quello inizialmente presente nel campione;

nel caso D siavra' la crescita del batterio inizialmente presente se esso non e' sensibile alle sostanze antimicrobiche e non si avra' la crescita del batterio sensibile, oppure non si avra' la crescita del batterio inizialmente presente e neppure la crescita del batterio sensibile.

In funzione di tali casi ottenibili, per mezzo di una qualsiasi tecnica che rilevi l'evoluzione nel tempo del segnale strumentale dovuto alla variazione del numero di batteri, con il presente trovato si può' valutare se tra le due celle esaminate contemporaneamente esìstono differenze nelle velocita' di crescita batterica e quindi stabilire se il batterio sensibile aggiunto ad una sola delle due celle stia crescendo oppure no.

La valutazione di tale informazione corrisponde alla determinazione del potere antimicrobico in termini di presenza/assenza nel campione esaminato; tale risultato viene comunemente espresso rispettivamente anche come potere antimicrobico POSITIVO/NEGATIVO.

Viene di seguito descritto il procedimento per la valutazione delle varie possibilità' espresse nei casi A-B-C-D-, per chiarezza di esposizione viene denominata VI la cella contenente solo il terreno di coltura ed il campione e viene denominata V2 la cella contenente i terreno di coltura, sia- il campione, sia la aliquota della sospensione di batterio sensibile.

Nel caso A non si ha crescita batterica in Vi e si ha crescita del batterio sensibile in V2: tale caso corrisponde al risultato di potere antimicrobico presente, in breve NEGATIVO.

Nel caso B non si ha crescita batterica in VI e non si ha crescita in V2; tale caso corrrisponde al risultato di potere antimicrobico presente, in breve POSITIVO.

Nel caso C si ha crescita batterica sia VI che in V2 ; la velocita' di crescita rilevata in V2 risulta maggiore della velocita' in VI in quanto e' data dalla somma delle velocita' di crescita dei batteri già' presenti nel campione e di quello sensibile aggiunto; tale caso corrisponde al risultato di potere antimicrobico non presente, in breve NEGATIVO.

Nel caso D si verificano due ulteriori possibilità'. Caso DI: i batteri presenti nel campione in esame sono sensibili alle sostanze antimicrobiche per cui non si ha crescita batterica in VI e non si ha crescita nemmeno in V2; tale caso corrisponde al risultato di potere antimicrobico presente, in breve POSITIVO.

Caso D2: i batteri presenti nel campione in esame non sono sensibili alle sostanze antimicrobiche e quindi la velocita' di crescita e' identica sia in VI che in V2; tale caso corrisponde al risultato di potere antimicrobico presente, in breve POSITIVO.

In entrambe le situazioni del caso D il batterio sensibile inoculato in V2 non da' alcun contributo alla crescita batterica in quanto risulta inibito dalle sostanze antlmicrobiche presenti nel campione in esame. I risultati ottenuti con il presente trovato nei casi elencati, che sono tutti quelli possibili nell'ambito del procedimento descritto, hanno il vantaggio di determinare il risultato di potere antimicrobico in modo univoco, preciso ed affidabile.

Per quanto riguarda il tempo di analisi si ha che il presente trovato viene applicato vantaggiosamente alla tecnica strumentale indipendentemente dalla sensibilità' della tecnica usata per la valutazione del numero di batteri presenti nella cella di misura e tale tecnica e' di norma sempre piu' veloce della corrispondente tecnica manuale.

Secondo una variante, ai fini del presente trovato la coppia di celle VI e V2 può' essere sostituita vantaggiosamente da una pluralità' N di coppie VI e V2 in ognuna delle quali viene inoculato un diverso campione da analizzare mentre nelle N celle V2 viene inoculato il medesimo batterio sensibile alle sostanze antimicrobiche permettendo l’analisi contemporanea di N campioni, ciò' in quanto il procedimento di valutazione descritto viene ripetuto per ogni coppia VI V2.

Secondo un’ulteriore variante, ai fini del presente trovato la coppia di celle VI e V2 può' essere sostituita vantaggiosamente da una moltitudine N di coppie VI e V2 in ognuna delle quali viene inoculato il medesimo campione da analizzare mentre in ciascuna delle N celle V2 viene inoculato un differente batterio sensibile solamente a determinate sostanze antimicrobiche permettendo la correlazione tra le sostanze antimicrobiche presenti nel campione ed i differenti batteri sensibili inoculati, ciò' in quanto il procedimento di valutazione descritto viene ripetuto per ogni coppia VI V2.

L’applicazione pratica del presente metodo prevede che la rilevazione e la valutazione delle velocita' di crescita batterica nelle celle esaminate venga effettuata automaticamente tramite l’utilizzo di dispositivi di rivelazione delle variazioni delle caratteristiche chimico fisiche dei terreni di coltura e loro trasduzione in segnali elettrici i quali vengano acquisiti ed elaborati da un elaboratore il quale sia corredato da un programma di elaborazione dati che incorpori tradotto in istruzioni informatiche il procedimento compreso nel presente trovato.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI 1 - Metodo per la determinazione del potere antimicrobico di sostanze in sospensione liquida caratterizzato dal fatto che comprende la distribuzione di una sospensione di batteri sensibili alle sostanze antimicrobiche in una prima cella di misura contenente terreno di coltura liquido ed una frazione del campione liquido della sostanza della quale si voglia determinare il potere antimicrobico, che utilizza come riferimento per la valutazione una seconda cella di misura contenente il medesimo terreno di coltura liquido ed una frazione del medesimo campione liquido, essendo la prima e la seconda cella costituenti una coppia, termostatate e sottoposte contemporaneamente alla rilevazione della velocita' di crescita dei batteri in esse contenuti tramite la misura delle variazioni delle proprietà' chimico fisiche del terreno di coltura contenuto nelle celle stesse, essendo dette variazioni correlate alla velocita' di crescita dei batteri presenti nelle celle e che determina il risultato di potere antimicrobico presente nel campione quando si verifica che la differenza tra le velocita' di crescita batterica nella prima e seconda cella e' nulla. 2 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la coppia di celle di misura e' costituita da una pluralità' N di coppie di analoghe celle di mi contenenti un numero N di campioni ed una aliquota del medesimo batterio sensibile per ognuna delle quali coppie viene ripetuto il procedimento di valutazione della velocita' di crescita batterica che determina il risultato di potere antimicroblco relativamente a detti N campioni. 3 - Metodo come alle rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che il batterio sensibile alle sostanze antimicrobiche utilizzato e' lo Staphi lococcus epidermidis ceppo ATCC12228. 4 - Metodo come alle rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che il batterio sensibile alle sostanze antimicrobiche e' di un ceppo adatto a crescere a temperatura superiore a 37 gradi centigradi. 5 - Metodo come alla rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la coppia di celle di misura e' costituita da una pluralità' N di coppie di analoghe celle di misura contenenti una aliquota del medesimo campione ed un numero N di differenti batteri ciascuno sensibile a determinate sostanze antimicrobiche per ognuna delle quali coppie viene ripetuto il procedimento di valutazione della velocita' di crescita batterica che determina il risultato di potere antimicrobico relativamente a dette N coppie e che conseguentemente correla detto risultato a ciascuno dei differenti batteri utilizzati. 6 - Metodo come ad una o l'altra delle rivendicazioni 1. 2 e 5, caratterizzato dal fatto che la tecnica utilizzata per la rivelazione della crescita dei batteri può' essere costituita dalla tecnica fotometrica di light-scattering, dalla tecnica fotometrica di assorbimento, dalla tecnica di misura di impedenza elettrica.