ITUB20154804A1 - Metodo e dispositivo per la tracciabilita elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari per la conservazione criogenica. - Google Patents

Description

Metodo e dispositivo per la tracciabilità elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari per la conservazione criogenica

La presente invenzione riguarda un metodo e un dispositivo per la tracciabilità elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari per la conservazione criogenica.

Più in particolare, l'invenzione concerne una soluzione tecnica per l'identificazione elettronica individuale e la tracciabilità mediante dispositivi a radiofrequenza dei contenitori capillari (le cosiddette paillette o straw) utilizzati per la conservazione criogenica di fluidi biologici (quali ad esempio linee cellulari, campioni di liquido seminale) senza interferire nel normale processo di riempimento, conservazione ed utilizzo delle paillette stesse.

È noto che, per la conservazione per lunghi periodi di materiale biologico o di origine biologica, vengono comunemente utilizzate tecniche di criogenesi che fanno uso di azoto liquido,

L'azoto è caratterizzato da un punto di ebollizione molto basso, a 77,35 K (-195,80 °C). Quindi, se è ridotto allo stato liquido per compressione, può in seguito essere trasportato sotto pressione e, quando è liberato, assorbe grandi quantità di calore per poter evaporare. In questo modo, l'azoto liquido risulta un potente refrigerante. Esso viene quindi adoperato per lo stoccaggio, in appositi dewar (contenitore che mantiene il proprio contenuto isolato dall'ambiente esterno frapponendo delle aree di vuoto che consentono un isolamento termico tra il contenuto e l'ambiente) dotati di particolari alloggiamenti, di linee cellulari adoperate nella ricerca scientifica, di campioni di liquido seminale o per la conservazione a lungo termine di proteine particolarmente labili.

Il processo di preparazione di un campione biologico per la crioconservazione in azoto liquido prevede che il campione venga inserito in particolari contenitori capillari detti “paillette" o “straw", tali da massimizzare la trasmissione del calore. Normalmente le paillette consistono in un cilindro plastico lungo 133 mm del diametro esterno di 2 mm (mini) o di 3 mm. Ciò consente di raffreddare velocemente ed in modo uniforme il campione. La forma e la dimensione di dette paillette è standardizzata a livello mondiale.

Si consideri a titolo esemplificativo il caso della crioconservazione del seme bovino. Per prima cosa il materiale seminale viene prelevato da maschi di elevato valore genetico e sanitariamente controllati mediante l'utilizzo di vagine artificiali o di manichini. Una volta raccolto, il materiale seminale viene valutato in laboratorio e quindi destinato al processo di crioconservazione. A tale scopo, il materiale seminale viene diluito con un diluitore, costituito da una sostanza biocompatibile che permette non solo di ottenere un numero elevato di dosi inseminative da un solo eiaculato, ma consente anche il congelamento dello stesso in azoto liquido a -196 °C, senza compromettere eccessivamente la vitalità degli spermatozoi. Il diluitore è isotonico con le cellule seminali, dotato di un sistema tampone che moderi la progressiva acidificazione del mezzo, dotato di capacità protettive nei confronti delle membrane cellulari, dotato di capacità nutritive, addizionato di antibiotici con potere batteriostatico/battericida, addizionato di un crioprotettore per controllare la formazione di cristalli di ghiaccio.

Alcune sostanze che, variamente combinate, possono costituire un diluitore per le diverse specie animali sono: citrato trisodico, acido citrico; latte scremato trattato termicamente (Laiciphos) ; TRIS (idrossimetilaminometano) ; tuorlo d'uovo (20%); zuccheri (fruttosio, lattosio); antibiotici (e.g. penicillina, streptomicina, lincomicina, spectinomicina) ; crioprotettori (glicerolo a diverse concentrazioni) .

Per ridurre al minimo l'incidenza dei danni da congelamento, oltre all'utilizzo del crioprotettore, si effettua il congelamento, seguendo determinate curve di discesa della temperatura (specifiche ed ottimali per ogni tipo di cellula).

Lo stoccaggio del seme avviene nelle specie bovine tramite l'uso di pailette del volume di 0,25 e 0,50 mi, le quali, dopo esser state riempite, vengono sigillate ed esposte ai vapori di azoto liquido.

Al fine di comprendere importanza e criticità della tracciabilità individuale delle paillette, si consideri a titolo esemplificativo la normativa Italiana. In Italia l'attività di Controllo ufficiale del seme (CUS), da parte dell'Istituto sperimentale italiano “Lazzaro Spallanzani", prevede due tipi di verifiche, quella della corretta autocertificazione {VCA) e quella della corretta identificazione (VOI).

La VCA prevede che i centri di produzione del seme (CPS) e gli importatori accompagnino le paillette di seme congelato da loro commercializzate con delle autocertificazioni che ne attestino la qualità. Tali autocertificazioni devono contenere i valori relativi alle seguenti variabili: concentrazione totale (CT) {espressa come numero di spermi in milioni/paillette), motilità progressiva (MP) (%) e numero di spermi progressivamente mobili (NSPM) (numero di spermi in milioni/paillette) .

L'Istituto Spallanzani, quindi, a campione deve verificare la congruità di tali autocertificazioni, effettuando un'analisi qualitativa del materiale seminale, dopo scongelamento, per quanto concerne la concentrazione e la motilità progressiva, al fine di determinare il numero di spermatozoi progressivamente mobili {NSPM), che rappresenta il parametro di riferimento qualitativo. I NSPM ottenuti vengono quindi confrontati con le autocertificazioni.

La valutazione del materiale seminale congelato prevede quindi le seguenti fasi: scongelamento del seme; determinazione della concentrazione; determinazione della motilità; analisi dei dati. Il CUS prevede che, per ogni partita, venga analizzato 1 mL di seme, che viene scongelato in acqua a 37 °C per 10 minuti e poi miscelato in un'unica provetta. La concentrazione comporta la misura del numero di spermi per unità di volume. La valutazione della motilità consente di misurare le variabili di tipo cinetico, delle quali quella di maggior interesse è la motilità progressiva. I dati vengono caricati in un apposito database ed analizzati utilizzando procedure automatiche, che confrontano il valore di NSPM determinato dall'Istituto con il valore minimo stimato in base all'autocertificazione rilasciata dal CPS.

La verifica della corretta identificazione del campione è cruciale per l'intero processo di controllo. Attualmente, questa verifica viene effettuata mediante un codice a barre stampato sul bordo della paillette.

Come illustrato in figura 1, in molti paesi è in uso un sistema di identificazione delle paillette contenenti materiale biologico (per esempio liquido seminale), mediante stampa sul bordo della paillette (indicate con il riferimento p) delle seguenti informazioni: numero 1 di riferimento del campione e/o del lotto, codice 2 del centro di produzione, data 3 di produzione, numero 4 identificativo nazionale del toro, codice a barre 5, contenuto 6 del codice a barre in chiaro, razza 7, e nome 8 del toro.

La tracciabilità mediante codice stampato sul bordo della paillette presenta criticità legate alla leggibilità di detto codice a barre a valle del processo criogenico. Infatti, nel momento stesso in cui la paillette viene estratta dall'azoto liquido, si innesca sulla sua superficie un processo di brinamento del vapore acqueo presente in atmosfera. Ciò non rende leggibile ciò che è stato stampato sul bordo della paillette. Nella pratica comune, se quanto stampato sul bordo della paillette non risulta leggibile, si hanno due scelte: scongelare il materiale seminale nel bagno di acqua termostatata e poi utilizzarlo, oppure pulire il bordo della paillette con un panno, o più frequentemente con un dito, per rimuovere la brina e verificare se il codice estratto è effettivamente quello desiderato. In tale procedimento di pulizia avvengono frequentemente due eventi avversi: in primo luogo quanto stampato viene spesso asportato o parzialmente danneggiato durante questa operazione, risultando illeggibile,- inoltre, passando un qualsiasi oggetto posto a temperatura ambiente su una paillette estratta dall'azoto liquido, avviene un repentino innalzamento della temperatura superficiale e di parte del contenuto. Ciò può provocare il deterioramento del materiale conservato in criogenesi.

Ulteriore criticità consiste nel fatto che il numero di informazioni stampabili sul bordo della paillette è modesto in relazione alla scarsa densità di informazioni di un codice a barre ed in relazione alla modesta superficie disponibile.

Inoltre, le dimensioni della paillette richiedono l'utilizzo di caratteri e codici a barre di piccolo formato (come mostrato in figura 1), difficilmente leggibili mediante uno scanner.

Per comprendere come il codice a barre ponga seri limiti all'automazione, difficoltà gestionali nel laboratorio, tempi più lunghi, e di conseguenza maggiori rischi di rottura della catena del freddo e maggiori costi generali di gestione del processo, è necessario considerare il processo di produzione, conservazione, distribuzione ed utilizzo nel suo insieme. Infatti nel momento della composizione dell'ordine effettuato da un cliente, l'operatore di laboratorio deve in successione: estrarre dal contenitore criogenico un mazzetto di paillette, prelevare quelle richieste per la composizione dell'ordine, verificarne il numero, identificarle individualmente, registrare il tutto in una apposita banca dati in modo che venga sottratto dal magazzino e aggiunto all'ordine, eseguendo il tutto cercando di alterare il meno possibile la temperatura delle paillette. Per aiutare l'operatore in questo compito di smistamento e gestione del magazzino, vengono utilizzate paillette di colore differente, associando il colore ad un lotto di produzione contenuto nella specifica posizione di un determinato contenitore criogenico. Tutto ciò che, attualmente, può fare l'operatore è contare manualmente le paillette e sottrarre il numero dello specifico lotto identificato per posizione e colore nel contenitore criogenico.

In questo contesto viene ad inserirsi la soluzione secondo la presente invenzione, che si propone di implementare una soluzione per la tracciabilità a radiofrequenza delle paillette per la crioconservazione di materiale biologico che superi le criticità poste dalla tecnica nota.

Questi ed altri risultati sono ottenuti secondo la presente invenzione proponendo un metodo e un dispositivo per l'identificazione elettronica individuale e la tracciabilità mediante dispositivi a radiofrequenza dei contenitori capillari (le cosiddette paillette) utilizzati per la conservazione criogenica di fluidi biologici (quali ad esempio linee cellulari, campioni di liquido seminale) senza interferire nel normale processo di riempimento, conservazione ed utilizzo delle paillette stesse.

Scopo della presente invenzione è quindi quello di fornire un metodo e un dispositivo per la tracciabilità elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari per la conservazione criogenica che permettano di superare i limiti delle soluzioni secondo la tecnologia nota e di ottenere i risultati tecnici precedentemente descritti.

Ulteriore scopo dell'invenzione è che detti un metodo e un dispositivo possano essere realizzati con costi sostanzialmente contenuti, sia per quanto riguarda i costi di produzione che per quanto concerne i costi di gestione.

Non ultimo scopo dell'invenzione è quello di proporre un metodo e un dispositivo per la tracciabilità elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari per la conservazione criogenica che siano semplici, sicuri ed affidabili.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un dispositivo per la tracciabilità elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, che comprende un transponder, racchiuso in un involucro in materiale biocompatibile, atto ad essere inserito all'interno di un contenitore capillare per la conservazione criogenica di materiale biologico senza interferire con il suo normale processo di riempimento, conservazione ed utilizzo.

Preferibilmente, secondo la presente invenzione, detto transponder è atto ad operare a frequenze nell'ordine dei 100 Hz (LF o Low Frequency) e nell'ordine dei 10 MHz (HF o High Frequency), più preferibilmente a frequenze nell'ordine dei 100 Hz (LF o Low Frequency).

Inoltre, secondo l'invenzione, detto transponder può essere di tipo passivo, detto involucro in materiale biocompatibile è realizzato in bioglass, composto di SÌO2, Na20, CaO e P2O5.

In particolare, secondo l'invenzione, i componenti di detto dispositivo, integrati e discreti, utilizzati all'interno del transponder, e il materiale di giunzione fra i componenti integrati ed i componenti discreti vengono realizzati con materiali che hanno coefficienti di dilatazione termica lineare dello stesso ordine di grandezza.

Ancora, sempre secondo l'invenzione, il circuito elettronico di detto transponder può essere protetto con una sostanza termicamente isolante e crioprotettrice, preferibilmente scelto tra glicerolo e/o polimeri, e detto transponder T è protetto esternamente mediante una ulteriore protezione isolante e traspirante.

Infine, forma un secondo oggetto specifico della presente invenzione un contenitore capillare per la conservazione criogenica di materiale biologico comprendente un dispositivo per la tracciabilità elettronica come precedentemente definito.

La presente invenzione verrà ora descritta, a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo una sua forma preferita di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:

- la figura 1 mostra una pailette di tipo IMV dotata di un inserto secondo una soluzione della tecnica nota,

la figura 2 mostra una rappresentazione schematica di un transponder secondo la presente invenzione,

la figura 3 mostra una rappresentazione schematica illustrativa del funzionamento del dispositivo atto all'installazione del transponder secondo la presente invenzione all'interno della paillette, e

la figura 4 mostra una rappresentazione schematica di un transponder secondo la presente invenzione all'interno di una paillette.

Facendo riferimento preliminarmente alla figura 1, rappresentativa di una soluzione secondo la tecnica nota, ai fini del presente brevetto, in via preferenziale ma non esclusiva, si farà riferimento alle paillette del tipo IMV, descritte nella domanda di brevetto europeo N. EPOS17862 Al del 26 maggio 1999 e simili. Tali paillette sono caratterizzate dall'integrare al proprio interno, in prossimità di una delle estremità, un inserto in materiale termoplastico elastomerico, caratterizzato dal fatto di divenire sostanzialmente isolante al passaggio di aria e liquidi una volta bagnato. In figura 1 è rappresentata la paillette p dotata di detto inserto b. Questa soluzione semplifica la fase di riempimento delle paillette capillari: nel momento in cui il fluido biologico, aspirato mediante una pompa a vuoto all'interno della paillette, raggiunge l'inserto, questo ultimo diventa ermetico; un sensore rileva la variazione di pressione sulla linea del vuoto, interrompendo il riempimento della paillette, la quale passa al successivo processo di saldatura.

Secondo la presente invenzione, la tecnologia ritenuta più idonea alla tracciabilità elettronica delle paillette di ogni genere, ed in particolare di quelle del tipo IMV, risulta essere quella dei transponder a radiofrequenza. In via preferenziale si farà riferimento ai transponder operanti a frequenze nell'ordine dei 100 Hz {LF o Low Frequency) e nell'ordine dei 10 MHz (HF o High Frequency). Tuttavia, non è esclusa la possibilità di utilizzare transponder operanti a frequenze superiori, come UHF {ultra high frequency, dai 300 MHz ai 3 GHz) o in tecnologia UWB {ultra wide band), ma bisogna considerare che, all'aumentare della frequenza, la dimensione del campo vicino (near field) si riduce molto rispetto alle dimensioni dell'oggetto da identificare e alle distanze di lettura desiderate. Ciò implica che, ad esempio, in presenza di fluidi biologici, risulti impossibile leggere tali transponder, se non a contatto. Infatti, a tali frequenze il decadimento della componente elettrica del campo elettromagnetico implica il pressoché contemporaneo decadimento della componente magnetica. Al contrario, in LF si è in presenza di campi che, in prima approssimazione, possono essere considerati quasi stazionari, caratterizzati cioè da una sostanziale indipendenza del campo magnetico da quello elettrico. Per questa ragione, i transponder LF sono più idonei all'utilizzo in presenza di liquidi biologici o in generale di liquidi ionici.

La tecnologia dei transponder è nota in telecomunicazioni e consiste in un dispositivo che risponde all'interrogazione a radiofrequenza da parte di un lettore con i dati contenuti al proprio interno. Nell'applicazione di tale tecnologia ai processi di tracciabilità elettronica (RFId o Radio Frequency Identification), il transponder risponde all'interrogazione da parte di un lettore con il proprio codice univoco. Ai fini della presente invenzione, in via preferenziale ma non esclusiva, il transponder è caratterizzato dall'essere passivo, cioè privo di una propria fonte di energia interna (e.g. batteria), utilizzando l'energia ricevuta del lettore per svolgere il proprio compito.

Evidentemente la novità del trovato non consiste nell'utilizzo della tecnologia dei transponder, ma nella sua specializzazione per l'applicazione nello specifico ambito della tracciabilità delle paillette per la conservazione criogenica di fluidi biologici (e.g. fluidi seminali).

Con riferimento alla figura 2, il trovato consiste in un transponder perfezionato T avente le seguenti caratteristiche .

Per prima cosa, il transponder T ha dimensioni tali da poter essere inserito all'interno delle paillette per la crioconservazione di materiale biologico senza interferire con il loro normale processo di riempimento, conservazione ed utilizzo. In particolare, il diametro complessivo del transponder è preferibilmente minore o uguale ad 1,4 mm. Tale dimensione ne consente l'inserimento all'interno del formato di paillette più sottili attualmente in commercio, caratterizzate da un diametro esterno di 2 mm ed un diametro interno di 1,6 mm.

In secondo luogo, il transponder T deve essere racchiuso in un involucro c in materiale biocompatibile, dal momento che potrebbe entrare in contatto con il materiale biologico. Una possibile soluzione consiste nell 'utilizzare un involucro in bioglass, una famiglia di vetri bioattivi, composti di SÌO2, Na20, CaO e P2O5in proporzioni specifiche.

Inoltre, nella fabbricazione dei componenti integrati (come ad esempio un microchip m) e discreti (per esempio un'antenna a) utilizzati all'interno del transponder, vengono utilizzati materiali con coefficienti di dilatazione termica lineare simili tra loro, ovvero dello stesso ordine di grandezza, come ad esempio il silicio (3*IO<-6>°C *) per i componenti integrati e leghe di diversi metalli per l'antenna, come ad esempio il platino (9*IO<-6>°C<_1>), il tugsteno {5<■>IO<-6>°C<_1>) ed il rame (17*IO<-6>°C<_1>).

Ancora, l'eventuale materiale di giunzione (s) fra i componenti integrati ed i componenti discreti ha un coefficiente di dilatazione termica simile a quelli dei componenti stessi. In particolare, non vengono utilizzati metalli di saldatura come lo stagno, il cui coefficiente di dilatazione termica lineare è dieci volte quello del silicio.

Inoltre, il circuito elettronico del transponder è protetto con una sostanza termicamente isolante e crioprotettrice il (e.g. glicerolo e/o polimeri); e il transponder T può essere protetto esternamente mediante una ulteriore protezione i2 isolante e traspirante (per esempio fiocco di cotone).

In particolare, detto transponder perfezionato T viene inserito all'interno della paillette, in modo tale da rimanere fissato (ad esempio per attrito) in una determinata posizione (ad esempio in una delle estremità della paillette), in maniera tale da non ostacolare il normale processo di riempimento, conservazione ed utilizzo delle paillette stesse.

Con riferimento alla figura 3, è mostrata una rappresentazione schematica ed il funzionamento del dispositivo atto all'installazione di detto transponder perfezionato T all'interno della paillette p. Il transponder T è posizionato all'interno di un applicatone k di dimensioni leggermente inferiori al diametro interno della paillette, così da potervi entrare senza difficoltà. Una volta inserito 1'applicatone k all'interno della paillette p, viene applicata una pressione sul transponder T mediante uno stantuffo h, così che il transponder entri nella paillette traslando l'inserto b verso il lato opposto della paillette, dalla posizione iniziale pi alla posizione finale p2 . Tale traslazione provoca una diminuzione del volume disponibile per lo stoccaggio di fluidi biologici all'interno della paillette, che passa dal volume iniziale vi al volume finale v2, dopo l'applicazione del transponder T. Tale riduzione di volume, generalmente, non pone alcun problema, poiché normalmente i fluidi biologici, come detto in precedenza, con riferimento alla descrizione delle soluzioni secondo la tecnica nota, vengono normalmente diluiti con sostanze crioprotettrici, quindi un'opportuna modulazione della diluizione permette di contenere la medesima quantità di fluido biologico {ad esempio liquido seminale) in un volume più piccolo. A titolo esemplificativo, ma non limitativo, facendo riferimento alla figura 4, in cui viene descritta l'interazione fra transponder T, paillette p ed il processo di riempimento della paillette. Tale processo produttivo prevede che, mediante una pompa a vuoto venga generata una depressione ad un estremo della paillette p mediante un ugello out, mentre all'altro estremo viene iniettato, mediante un iniettore in, il fluido biologico (ad esempio liquido seminale) opportunamente diluito. Il liquido seminale viene aspirato all'interno della paillette fino a bagnare l'inserto b, il quale, una volta bagnato, non consente più il passaggio dell'aria o del fluido. La variazione di pressione viene rilevata da un sensore sulla linea del vuoto, in modo da interrompere il processo di aspirazione e far avanzare la paillette allo stadio successivo. Il transponder T, pur provocando una strozzatura, non impedisce il passaggio dell'aria. L'ostacolo offerto al passaggio dell'aria risulta essere trascurabile rispetto alla potenza della pompa a vuoto e alle soglie di taratura del sensore di pressione. La presenza dell'isolante traspirante i2 (ad esempio fiocco di cotone) mantiene il transponder T lontano dalle pareti interne della paillette, come illustrato nella vista in sezione g, non ostacolando le linee del flusso d'aria f.

La presente invenzione è stata descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, ma è da intendersi che variazioni e/o modifiche potranno essere apportate dagli esperti nel ramo senza per questo uscire dal relativo ambito di protezione, come definito dalle rivendicazioni allegate.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1) Dispositivo per la tracciabilità elettronica a radiofrequenza di contenitori capillari caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un transponder (T), racchiuso in un involucro <c) in materiale biocompatibile, atto ad essere inserito all'interno di un contenitore capillare per la conservazione criogenica di materiale biologico senza interferire con il suo normale processo di riempimento, conservazione ed utilizzo.
2. 2) Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto transponder {T) opera a frequenze nell'ordine dei 100 Hz {LF o Low Frequency) e nell'ordine dei 10 MHz (HF o High Frequency), preferibilmente a frequenze nell'ordine dei 100 Hz {LF o Low Frequency).
3. 3) Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che detto transponder {τ) è di tipo passivo.
4. 4) Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto involucro (c) in materiale biocompatibile è realizzato in bioglass, composto di SÌO2, Na20, CaO e P2O5.
5. 5) Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che i componenti di detto dispositivo, integrati e discreti, utilizzati all'interno del transponder, e il materiale di giunzione <s) fra i componenti integrati ed i componenti discreti vengono realizzati con materiali che hanno coefficienti di dilatazione termica lineare dello stesso ordine di grandezza.
6. 6) Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che il circuito elettronico di detto transponder è protetto con una sostanza termicamente isolante e crioprotettrice (il), preferibilmente scelto tra glicerolo e/o polimeri.
7. 7) Dispositivo per la tracciabilità elettronica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che detto transponder T è protetto esternamente mediante una ulteriore protezione <i2) isolante e traspirante, preferibilmente del fiocco di cotone.
8. 8) Contenitore capillare per la conservazione criogenica di materiale biologico comprendente un dispositivo per la tracciabilità elettronica come definito nelle rivendicazioni 1-7.