ITTO20100651A1 - PROCEDURE AND EQUIPMENT FOR THE CHARACTERIZATION AND SEPARATION OF SPERMFERCEE WITH SUSPENDED LEVER MICROMETRIC SENSORS - Google Patents
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Description
"Procedimento ed apparecchiatura per la caratterizzazione e la separazione di spermatozoo con sensori micrometrici a leva sospesa" "Procedure and apparatus for the characterization and separation of spermatozoa with micrometric sensors with suspended lever"
"A method and an apparatus for characterizing and separating spermatozoa with suspended lever micrometrie sensore " "A method and an apparatus for characterizing and separating spermatozoa with suspended lever micrometries sensor"
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Settore della Tecnica Technical sector
La presente invenzione ha per oggetto un metodo ed un'apparecchiatura per il sessaggio di spermatozoi animali. Per sessaggio dello sperma si intende l'operazione di discriminazione tra spermatozoi portatori del cromosoma X e spermatozoi portatori del cromosoma Y, che ha come finalità la determinazione del sesso del nascituro utilizzando la tecnica della fecondazione artificiale (FA). In ambito zootecnico la FA ha consentito di ottimizzare la selezione degli animali per caratteristiche utili e le tecniche di preselezione dei sessi rappresentano un ulteriore miglioramento per gli allevatori interessati sia alla produzione di latte sia alla produzione di carne. In questo modo, infatti, diventa possibile la programmazione delle inseminazioni delle vacche da cui ottenere le vitelle da destinare alla rimonta aziendale o dei vitelli da introdurre in centri genetici, consentendo l'inseminazione delle altre vacche con tori da carne, che permettono di ottenere vitelli da ristailo di maggior valore. The present invention relates to a method and an apparatus for sexing animal spermatozoa. For sperm sexing we mean the operation of discrimination between sperm carrying the X chromosome and sperm carrying the Y chromosome, which has the purpose of determining the sex of the unborn child using the artificial fertilization (AF) technique. In the zootechnical field, the FA has made it possible to optimize the selection of animals for useful characteristics and the techniques of preselection of the sexes represent a further improvement for farmers interested in both milk production and meat production. In this way, in fact, it becomes possible to program the inseminations of the cows from which to obtain the calves to be destined for the company recovery or of the calves to be introduced in genetic centers, allowing the insemination of the other cows with beef bulls, which allow to obtain calves from restyling of greater value.
Arte Nota Note Art
Nel tempo si sono susseguiti vari approcci tecnologici al sessaggio, ma lo sviluppo di tipo industriale delle metodiche di preselezione degli spermatozoi è stato reso possibile dalla citofluorimetria a flusso, che rappresenta oggi l'unica tecnica commercialmente utilizzabile. L'elevata sensibilità del citof luorimetro consente di misurare l'unica differenza accertata sperimentalmente fra gli spermatozoi portatori del cromosoma X e quelli portatori del cromosoma Y: la diversa quantità di DNA, associata alla diversa grandezza dei cromosomi sessuali (differenza di circa il 3 - 5%, variabile secondo la specie a favore del cromosoma X). Over time, various technological approaches to sexing have followed, but the industrial-type development of sperm preselection methods has been made possible by flow cytometry, which today represents the only commercially usable technique. The high sensitivity of the cytofluorimeter allows to measure the only difference experimentally ascertained between the spermatozoa carrying the X chromosome and those carrying the Y chromosome: the different quantity of DNA, associated with the different size of the sex chromosomes (difference of about 3 - 5%, variable according to the species in favor of the X chromosome).
Il citofluorimetro a flusso è un sistema che consiste di una o più sorgenti laser, di un sistema idrodinamico che immette le cellule del campione da analizzare in un flusso di liquido isotonico che incrocia il raggio laser, di rilevatori di luce (fotodiodi e/o fotomoltiplicatori) e di un elaboratore per l'analisi dei dati in tempo reale. The flow cytometer is a system consisting of one or more laser sources, of a hydrodynamic system that introduces the cells of the sample to be analyzed in a flow of isotonic liquid that crosses the laser beam, of light detectors (photodiodes and / or photomultipliers ) and a computer for real-time data analysis.
L'analisi si basa sulla valutazione della quantità di luce emessa dalle cellule che incrociano il raggio laser. Le cellule sono preventivamente colorate con fluorocromi, che emettono fluorescenza quando investiti dalla luce di una data lunghezza d'onda (in questo caso rappresentata dal raggio laser). La fluorescenza, dopo essere stata amplificata dai fotomoltiplicatori e convertita in segnale digitale, è analizzata da un software. The analysis is based on the evaluation of the amount of light emitted by the cells that cross the laser beam. The cells are previously stained with fluorochromes, which emit fluorescence when hit by light of a given wavelength (in this case represented by the laser beam). The fluorescence, after being amplified by photomultipliers and converted into a digital signal, is analyzed by software.
Dopo l'incrocio con il raggio laser, dal fluido di trascinamento sono generate gocce che inglobano singoli spermatozoi ed ogni goccia è caricata elettricamente in modo positivo o negativo in funzione della misura della fluorescenza dello spermatozoo ivi contenuto. Quindi le gocce cariche passano attraverso due piastre ad alta tensione, dove saranno deviate in due raccoglitori (insieme allo spermatozoo in esse contenuto) in base al segno della carica. After the crossing with the laser beam, drops are generated from the entrainment fluid that incorporate single spermatozoa and each drop is electrically charged in a positive or negative way according to the measurement of the fluorescence of the spermatozoon contained therein. The charged drops then pass through two high voltage plates, where they will be diverted into two collectors (along with the sperm they contain) based on the charge sign.
Colorando gli spermatozoi con un fluorocromo che si lega stechiometricamente con il DNA (quale p. es. Bisbenzimide Hoechst 33342 che si lega alle regioni ricche di adenina e timina del DNA) e definendo la selezione ("sorting") in funzione della bimodalità della distribuzione di frequenza del contenuto di DNA degli spermatozoi (Johnson et al., 1989, Biol. Reprod. 41:199-203), è possibile dividerli in due popolazioni, quelli portatori del cromosoma X e quelli portatori del cromosoma Y (Garner et al, 1983, Biol. Reprod. By staining the spermatozoa with a fluorochrome that binds stoichiometrically with the DNA (such as eg Bisbenzimide Hoechst 33342 that binds to the adenine and thymine-rich regions of the DNA) and defining the selection ("sorting") as a function of the bimodality of the distribution frequency of the DNA content of spermatozoa (Johnson et al., 1989, Biol. Reprod. 41: 199-203), it is possible to divide them into two populations, those carrying the X chromosome and those carrying the Y chromosome (Garner et al, 1983, Biol. Reprod.
28:312-321; Johnson, 1991, Reprod. Dom. Anim. 26:309-314; Johnson et al., 1989, Biol. Reprod. 41:199-203; Morell et al., 1988, Vet. Ree. 122:322-324). 28: 312-321; Johnson, 1991, Reprod. Sun. Anim. 26: 309-314; Johnson et al., 1989, Biol. Reprod. 41: 199-203; Morell et al., 1988, Vet. Ree. 122: 322-324).
Nel brevetto francese FR 2699678 è descritto un metodo di sessaggio in cui la selezione ("sorting") delle cellule avviene senza caricamento elettrico delle stesse in funzione delle particolari caratteristiche del citofluorimetro utilizzato (PAS III, Partec). In the French patent FR 2699678 a sexing method is described in which the selection ("sorting") of the cells takes place without electric loading of the same according to the particular characteristics of the cytofluorimeter used (PAS III, Partec).
Nel brevetto inglese GB 2145102 è descritto un metodo di sessaggio mediante citofluorimetria a flusso che sfrutta il caricamento elettrico degli spermatozoi effettuato in un liquido di trascinamento adatto. In the British patent GB 2145102 a method of sexing by flow cytometry is described which exploits the electrical loading of the spermatozoa carried out in a suitable entrainment liquid.
Un metodo di sessaggio del seme mediante citofluorimetria a flusso, basato sullo stesso principio di separazione in base alla carica, è descritto nella domanda di brevetto internazionale WO 90/13303, che utilizza un citofluorimetro a flusso Epics V (RTM, Coulter). La metodica di sessaggio proposta si basa su una serie di modifiche migliorative dello strumento (modificazione dell'ago della cella a flusso) tali da creare un flusso con una maggior percentuale di cellule orientate con la superficie maggiore perpendicolare al raggio laser. Inoltre viene sostituito il fotodiodo normalmente deputato alla valutazione della luce diffratta a 0°- 18° (valutazione dimensionale delle particelle) con un fotomoltiplicatore in grado di rilevare anche bassi livelli di fluorescenza (Johnson e Pinkel, 1986 (Cytometry, 7:268-273). E' stata quindi approntata una seconda serie di modifiche strumentali comprendenti una nuova cella a flusso (Johnson e Welch, 1999, Theriog. 52:1323-1341) con un conseguente aumento della percentuale di cellule correttamente orientate dal 25% al 70%. L'applicazione di tale cella ad un citofluorimetro ad alta velocità di selezione, ottenuta applicando pressioni fino a 60 PSI alle cellule nel flusso (MoFlo® Cytomation Ine. - high speed celi sorter), ha permesso di ottenere uno strumento in grado di selezionare e separare teoricamente fino a 9 milioni di spermi per ora con una purezza del 75-80% (Brevetti USA n. A method of sexing the semen by flow cytometry, based on the same principle of separation based on the charge, is described in the international patent application WO 90/13303, which uses an Epics V flow cytometer (RTM, Coulter). The proposed sexing method is based on a series of improvements to the instrument (modification of the flow cell needle) such as to create a flow with a greater percentage of cells oriented with the greater surface perpendicular to the laser beam. Furthermore, the photodiode normally used for evaluating diffracted light at 0 ° - 18 ° (dimensional evaluation of particles) is replaced with a photomultiplier capable of detecting even low levels of fluorescence (Johnson and Pinkel, 1986 (Cytometry, 7: 268-273 A second set of instrumental modifications was then prepared including a new flow cell (Johnson and Welch, 1999, Theriog. 52: 1323-1341) with a consequent increase in the percentage of correctly oriented cells from 25% to 70% . The application of this cell to a high speed selection cytofluorimeter, obtained by applying pressures up to 60 PSI to the cells in the flow (MoFlo® Cytomation Ine. - high speed celi sorter), allowed to obtain an instrument capable of selecting and theoretically separate up to 9 million sperms per hour with a purity of 75-80% (US Patents No.
5150313, 5602039, 5602349, 5643796 e domanda internazionale WO 25 96/12171). Il materiale seminale raccolto deve poi essere lavato tramite centrifugazione, opportunamente diluito, confezionato in "paillettes" da 0,25 mi e congelato secondo protocolli molto dettagliati, come descritto nella domanda internazionale PCT/US2003/5 030814. Utilizzando in FA dosi di seme congelato bovino sessato (Seidel et al., 1999, Theriog. 52:1407- 1420) sono stati ottenuti valori di fertilità accettabili, pur dovendo operare con opportune accortezze in termini di strumentazione, sito di deposito del seme nell'apparato genitale femminile e tipologia di animali (manze) (domanda internazionale WO 99/33956). 5150313, 5602039, 5602349, 5643796 and international application WO 25 96/12171). The collected semen must then be washed by centrifugation, suitably diluted, packaged in 0.25 ml "paillettes" and frozen according to very detailed protocols, as described in the international application PCT / US2003 / 5 030814. Using doses of frozen semen in AF sexed bovine (Seidel et al., 1999, Theriog. 52: 1407- 1420) acceptable fertility values were obtained, although it was necessary to operate with appropriate precautions in terms of instrumentation, site of deposition of the semen in the female genital system and type of animals (heifers) (international application WO 99/33956).
La metodologia citofluorimetrica tuttavia non è scevra da inconvenienti, dei quali il principale riguarda il numero di spermatozoi separabili per unità di tempo che, pur avendo avuto notevoli incrementi, rimane ancora sostanzialmente basso. Infatti, se si vuole ottenere un livello di purezza dell'arricchimento pari al 90% con spermatozoi di buona vitalità, adatti per il congelamento, non è possibile ottenere più 5000 spermatozoi per secondo. Questo valore comporta una limitata produzione di dosi di seme sessato congelato, anche utilizzando una ridotta concentrazione totale per dose. However, the flow cytometric methodology is not free from drawbacks, of which the main one concerns the number of separable spermatozoa per unit of time which, despite having had considerable increases, still remains substantially low. In fact, if you want to achieve a purity level of enrichment equal to 90% with sperms of good vitality, suitable for freezing, it is not possible to obtain more than 5000 spermatozoa per second. This value results in a limited production of frozen sexed semen doses, even using a reduced total concentration per dose.
Inoltre, l'uso di sostanze fluorescenti non esclude a priori possibili azioni mutagene rispetto al contenuto di DNA degli spermatozoi. Furthermore, the use of fluorescent substances does not exclude a priori possible mutagenic actions with respect to the DNA content of the spermatozoa.
Infine, la rilevazione della fluorescenza, e quindi la qualità dei risultati, può essere influenzata dall'orientamento degli spermatozoi lungo la linea di distribuzione . Finally, the detection of fluorescence, and therefore the quality of the results, can be influenced by the orientation of the spermatozoa along the line of distribution.
Metodi per il sessaggio dello sperma, alternativi alla citofluorimetria, devono basarsi sulla differenza di contenuto di DNA tra gli spermatozoi portatori del cromosoma X e gli spermatozoi portatori del cromosoma Y. Tale differenza di contenuto suggerisce, in particolare, una differenza nelle dimensioni e nella massa delle due tipologie di spermatozoi che è stimabile intorno al 3-5%. Methods for sperm sexing, alternative to flow cytometry, must be based on the difference in DNA content between the sperm carrying the X chromosome and the sperm carrying the Y chromosome. This difference in content suggests, in particular, a difference in size and mass. of the two types of spermatozoa which is estimated at around 3-5%.
Allo stato attuale sono stati effettuati studi sperimentali atti a verificare l'effettiva esistenza di differenze morfologiche tra le teste, in cui è contenuto il DNA, di spermatozoi portatori del cromosoma X e le teste di spermatozoi portatori del cromosoma Y. Le ricerche sono state incentrate soprattutto sullo studio delle dimensioni attraverso tecniche di analisi delle immagini (van Munster et al., 1999, Cytometry 35:125-128). Ad oggi, però, non sono stati riscontrati risultati sperimentali sulla differenza di massa tra le due tipologie di spermatozoo, con l'uso di metodologie dirette. At present, experimental studies have been carried out to verify the actual existence of morphological differences between the heads, in which the DNA is contained, of spermatozoa carrying the X chromosome and the heads of sperm carrying the Y chromosome. especially on the study of dimensions through image analysis techniques (van Munster et al., 1999, Cytometry 35: 125-128). To date, however, no experimental results have been found on the mass difference between the two types of spermatozoon, with the use of direct methods.
Nonostante ciò, gli inventori proponenti hanno effettuato la prima misura sperimentale sulla massa di un singolo spermatozoo, attraverso l'uso di microbilance a cristalli di quarzo (QCM - Quartz Crystal Microbilances). Il valor medio di massa di un singolo spermatozoo bovino, dopo una serie di pesate di popolazioni di spermatozoi, è risultato pari a 1.95±0.04x10-11 g Considerando il valore di massa misurato, la differenza di massa tra spermatozoi portatori del cromosoma X e spermatozoi del cromosoma Y è valutabile intorno ad un valore compreso tra 0.5 pg e 1 pg (1 pg = 10-12 g)· Despite this, the proposing inventors carried out the first experimental measurement on the mass of a single spermatozoon, through the use of quartz crystal microbalances (QCM - Quartz Crystal Microbilances). The mean mass value of a single bovine spermatozoon, after a series of weighings of sperm populations, was equal to 1.95 ± 0.04x10-11 g Considering the measured mass value, the mass difference between spermatozoa carrying the X chromosome and spermatozoa of the Y chromosome can be evaluated around a value between 0.5 pg and 1 pg (1 pg = 10-12 g)
Inoltre, nel documento IT T020080101 (Al) è stato già descritto un procedimento e apparecchiatura per il sessaggio di spermatozoi animali, basato sull'utilizzo di microcantilever come sensori di massa. Il presente brevetto mostra diversi miglioramenti rispetto al precedente, principalmente per quanto riguarda la metodologia di impiego del sensore microcantilever: tale metodologia assicura una maggiore sensibilità in massa, come è stato dimostrato da misure sperimentali effettuate utilizzando un microcantilever commerciale. Furthermore, in the IT document T020080101 (A1) a procedure and apparatus for the sexing of animal spermatozoa has already been described, based on the use of microcantilevers as mass sensors. The present patent shows several improvements with respect to the previous one, mainly as regards the method of use of the microcantilever sensor: this methodology ensures greater mass sensitivity, as has been demonstrated by experimental measurements carried out using a commercial microcantilever.
Descrizione dell'Invenzione Description of the Invention
Alla luce di quanto discusso e dei risultati scientifici, l'invenzione fornisce, in un primo aspetto, un procedimento per il sessaggio di spermatozoi, in cui si determina la differenza di contenuto cromosomico tra gli spermatozoi di una popolazione mista con un metodo alternativo a quello citofluorimerico, in quanto si basa sulla differenza in massa tra gli spermatozoi dovuto a tale differenza di contenuto cromosomico. In un secondo aspetto, la differenziazione degli spermatozoi, secondo il metodo citato, è effettuata utilizzando un'apparecchiatura basata su strutture micrometriche a leva sospesa, i cosiddetti cantilever o microcantilever . In the light of what has been discussed and of the scientific results, the invention provides, in a first aspect, a procedure for the sexing of spermatozoa, in which the difference in chromosomal content is determined between the spermatozoa of a mixed population with an alternative method to that cytofluorimeric, as it is based on the difference in mass between the spermatozoa due to this difference in chromosomal content. In a second aspect, the differentiation of spermatozoa, according to the aforementioned method, is carried out using an apparatus based on micrometric structures with suspended lever, the so-called cantilever or microcantilever.
I cantilever (o microcantilever) sono sensori micromeccanici costituiti sostanzialmente da una leva sospesa di dimensioni micrometriche, composta da silicio monocristallino, da SiN, da materiali polimerici o altri materiali. Mediante opportuni sistemi di rivelazione, i cantilever trasducono una forza agente sulla loro estremità, dovuta p. es. alla presenza di una massa aggiuntiva, in una flessione (funzionamento statico). Se invece sono opportunamente stimolati per vibrare, la presenza della massa aggiuntiva sul cantilever induce una variazione sia della differenza di fase tra segnale di attuazione e segnale di risposta, sia della frequenza propria di risonanza (funzionamento dinamico). Come è noto dalla letteratura scientifica, i cantilever sono stati proposti come sensori di massa con sensibilità che permettono di apprezzare variazioni anche inferiori all'attogrammo (1 ag = 10-18), si veda per esempio Li et al., 2007, Nature Nanotechnology 2:114-120 e Burg et al. 2007, Nature 446:1066-1069. La sensibilità varia, generalmente, in funzione delle proprietà meccaniche e/o geometriche, quali ad esempio, la dimensione, la forma e i materiali costituenti il cantilever. Per l'uso dei cantilever per misure di massa in microbiologia si veda p. es. il brevetto WO 2008/045988 Al, incentrato sulla calibrazione della relazione tra massa e frequenza di risonanza di un così detto "Suspended MicroChannel Resonator", e i documenti US 2007/089515 Al, EP 1533611 Al e WO 2007/081902 A2. Cantilevers (or microcantilevers) are micromechanical sensors substantially consisting of a suspended lever of micrometric dimensions, composed of monocrystalline silicon, SiN, polymeric materials or other materials. By means of suitable detection systems, the cantilevers transduce a force acting on their extremity, due to p. ex. in the presence of an additional mass, in a bending (static operation). If, on the other hand, they are suitably stimulated to vibrate, the presence of the additional mass on the cantilever induces a variation both in the phase difference between the actuation signal and the response signal, and in the natural resonance frequency (dynamic operation). As is known from the scientific literature, cantilevers have been proposed as mass sensors with sensitivity that allow to appreciate variations even lower than the actogram (1 ag = 10-18), see for example Li et al., 2007, Nature Nanotechnology 2: 114-120 and Burg et al. 2007, Nature 446: 1066-1069. Sensitivity generally varies according to the mechanical and / or geometric properties, such as, for example, the size, shape and materials making up the cantilever. For the use of cantilevers for mass measurements in microbiology see p. ex. patent WO 2008/045988 A1, focused on the calibration of the relationship between mass and resonance frequency of a so-called "Suspended MicroChannel Resonator", and documents US 2007/089515 A1, EP 1533611 A1 and WO 2007/081902 A2.
Una rassegna sulle tecniche di costruzione, sui principi di funzionamento e sulle modalità di utilizzazione dei microcantilever soprattutto in ambito biologico, può essere trovata in Goeders et al., 2008, Chem. Rev. 108:522-542 e Lavrik et al., 2004, Rev. of Sci. Instr., 75:2229-2253. A review of the construction techniques, operating principles and methods of use of microcantilevers, especially in the biological field, can be found in Goeders et al., 2008, Chem. Rev. 108: 522-542 and Lavrik et al., 2004, Rev. of Sci. Instr., 75: 2229-2253.
I valori di sensibilità di un cantilever sono ben inferiori alle variazioni dovute alla stimata differenza di massa tra spermatozoi portatori del cromosoma X e portatori del cromosoma Y, pertanto essi possono essere posti alla base di una apparecchiatura di sessaggio. In particolare, secondo un primo aspetto dell'invenzione si fa circolare un fluido contenente una popolazione mista di spermatozoi in un canale di microcircolazione fluidica integrato con il microcantilever, e avente dimensioni tali da lasciar passare un solo spermatozoo per volta, e si separano gli spermatozoi portatori del cromosoma X e portatori del cromosoma Y dopo la loro uscita da tale canale, in seguito alla differente risposta del segnale proveniente dal sensore. Tale differenziazione può avvenire in funzionamento statico, rilevando variazioni di flessione del microcantilever, oppure può avvenire in funzionamento dinamico, rilevando le variazioni della differenza di fase tra segnale di attuazione e di risposta, oppure le variazioni della frequenza di risonanza del microcantilever. The sensitivity values of a cantilever are well below the variations due to the estimated difference in mass between spermatozoa carrying the X chromosome and carrying the Y chromosome, therefore they can be placed at the base of a sexing equipment. In particular, according to a first aspect of the invention, a fluid containing a mixed population of spermatozoa is circulated in a fluidic microcirculation channel integrated with the microcantilever, and having such dimensions as to allow only one spermatozoon to pass at a time, and the spermatozoa are separated. carriers of the X chromosome and carriers of the Y chromosome after their exit from this channel, following the different response of the signal coming from the sensor. This differentiation can take place in static operation, detecting flexion variations of the microcantilever, or it can occur in dynamic operation, detecting the variations in the phase difference between the actuation and response signals, or the variations in the resonance frequency of the microcantilever.
Secondo un altro aspetto dell'invenzione, si fornisce un'apparecchiatura per realizzare il procedimento di sessaggio, comprendente: una sorgente di una popolazione mista di spermatozoi; almeno un elemento sensibile atto a ricevere tali spermatozoi e a fornire una risposta diversa in presenza di uno spermatozoo portatore del cromosoma Y o di uno spermatozoo portatore del cromosoma X; mezzi di rilevamento e analisi di detta risposta e mezzi di separazione degli spermatozoi con diverso contenuto cromosomico. Nell'apparecchiatura, 1 'almeno un elemento sensibile è un elemento sensibile ad uno spermatozoo singolo, preferibilmente un elemento che impiega almeno una struttura micrometrica a leva sospesa con canale di circolazione microf luidica integrato. According to another aspect of the invention, an apparatus is provided for carrying out the sexing process, comprising: a source of a mixed population of spermatozoa; at least one sensitive element capable of receiving such spermatozoa and providing a different response in the presence of a sperm carrying the Y chromosome or a sperm carrying the X chromosome; means for detecting and analyzing said response and means for separating spermatozoa with different chromosomal content. In the apparatus, the at least one sensitive element is an element sensitive to a single spermatozoon, preferably an element employing at least a micrometric structure with a suspended lever with an integrated microfluidic circulation channel.
Inoltre secondo un altro aspetto dell'invenzione, allo scopo di ottenere una resa elevata, si può utilizzare una pluralità di dette strutture, ognuna composta da un cantilever singolo o da una schiera integrata di cantilever disposte in parallelo, che ricevono simultaneamente il fluido contenente gli spermatozoi da sessare. Furthermore, according to another aspect of the invention, in order to obtain a high yield, a plurality of said structures can be used, each consisting of a single cantilever or an integrated array of cantilevers arranged in parallel, which simultaneously receive the fluid containing the spermatozoa to be sexed.
La struttura o la pluralità di strutture può essere fatta funzionare in modalità attiva o passiva, e il procedimento di differenziazione degli spermatozoi risulta identico a quello impiegato per singolo microcantilever . The structure or plurality of structures can be operated in active or passive mode, and the differentiation procedure of the spermatozoa is identical to that used for a single microcantilever.
Descrizione Sintetica delle Figure Brief Description of the Figures
L'invenzione sarà ora descritta con maggiori dettagli con riferimento ai disegni allegati, forniti a titolo di esempio non limitativo, in cui: The invention will now be described in greater detail with reference to the attached drawings, provided by way of non-limiting example, in which:
- la Fig. 1 è uno schema a blocchi dell'apparecchiatura di sessaggio secondo l'invenzione; - Fig. 1 is a block diagram of the sexing apparatus according to the invention;
- la Fig. 2 mostra un cantilever come utilizzato nella presente invenzione; - Fig. 2 shows a cantilever as used in the present invention;
- la Fig. 3 mostra una schiera di cantilever come utilizzata nella presente invenzione; - Fig. 3 shows a cantilever array as used in the present invention;
- le Figg. 4A e 4B mostrano le modalità di discriminazione tra spermatozoi portatori del cromosoma X o del cromosoma Y, in modalità statica; - Figs. 4A and 4B show the methods of discrimination between spermatozoa carrying the X chromosome or the Y chromosome, in static mode;
- la Fig. 5 mostra la modalità di discriminazione tra spermatozoi portatori del cromosoma X o del cromosoma Y, in modalità dinamica e in funzione della variazione della differenza di fase tra segnale di input e output; e - Fig. 5 shows the mode of discrimination between spermatozoa carrying the X chromosome or the Y chromosome, in dynamic mode and as a function of the variation of the phase difference between input and output signal; And
- la Fig. 6 mostra lo schema di principio della tecnica di misura della variazione della differenza di fase tra segnale di attuazione e segnale di risposta, oppure della variazione di frequenza , come realizzata nella presente invenzione. - Fig. 6 shows the basic diagram of the technique for measuring the variation of the phase difference between the actuation signal and the response signal, or of the frequency variation, as implemented in the present invention.
La Fig. 1 mostra uno schema a blocchi di un'apparecchiatura per l'identificazione e il sessaggio di spermatozoi. Fig. 1 shows a block diagram of an apparatus for the identification and sexing of spermatozoa.
L'apparecchiatura, indicata nel suo complesso con 1, consiste principalmente di: The equipment, indicated as a whole with 1, mainly consists of:
- una sorgente 2 di una popolazione mista di spermatozoi; - a source 2 of a mixed population of spermatozoa;
- un modulo di sessaggio 3 composto a sua volta da: - a sexing module 3 composed in turn of:
- uno o più elementi (due in figura) 30a, 30b sensibili alla massa di spermatozoi singoli; - one or more elements (two in the figure) 30a, 30b sensitive to the mass of single spermatozoa;
- un sistema di lettura 31 per la rilevazione della risposta degli elementi sensibili 30a, 30b al - a reading system 31 for detecting the response of the sensitive elements 30a, 30b al
passaggio degli spermatozoi; e passage of spermatozoa; And
- uno o più elementi 32a, 32b per la separazione, in base alla presenza del cromosoma X o Y, degli spermatozoi che sono passati attraverso gli elementi sensibili 30; - one or more elements 32a, 32b for the separation, based on the presence of the X or Y chromosome, of the spermatozoa that have passed through the sensitive elements 30;
- un sistema 4 per lo stoccaggio degli spermatozoi sessati; - un'unità di controllo 5. - a system 4 for the storage of sexed spermatozoa; - a control unit 5.
Nella figura, linee a doppio tratto indicano il percorso degli spermatozoi, mentre linee a singolo tratto indicano il percorso dei segnali di lettura e di comando. La sorgente 2 della popolazione mista di spermatozoi è costituita, come usuale nelle tecniche di sessaggio, da un fluido isotonico contenente gli spermatozoi, ed è collegata al modulo di sessaggio 3 mediante un sistema di distribuzione, schematizzato dalla linea di distribuzione 6, sulla quale è inserita una pompa 7 controllata dall'unità di controllo 5 in modo da regolare opportunamente la portata di fluido. In the figure, double-dashed lines indicate the path of the spermatozoa, while single-dashed lines indicate the path of the read and command signals. The source 2 of the mixed population of spermatozoa is constituted, as usual in sexing techniques, by an isotonic fluid containing the spermatozoa, and is connected to the sexing module 3 by means of a distribution system, schematized by the distribution line 6, on which it is inserted a pump 7 controlled by the control unit 5 so as to suitably regulate the flow rate of fluid.
Nella realizzazione preferita della presente invenzione, gli elementi sensibili 30 si basano sui cosiddetti cantilever o microcantilever, con sistema di microfluidica integrato all'interno del quale circolano gli spermatozoi proveniente dalla sorgente 2. L'elemento o ciascun elemento sensibile può essere costituito da un cantilever singolo, come quello rappresentato in Fig. 2, o da una schiera integrata di cantilever, come quella rappresentata in Fig. 3. I cantilever o le schiere di cantilever possono essere fatti operare in modalità attiva o passiva. Maggiori dettagli sul modo d'impiego dei cantilever nella presente invenzione saranno dati in seguito. In the preferred embodiment of the present invention, the sensitive elements 30 are based on the so-called cantilever or microcantilever, with an integrated microfluidic system inside which the spermatozoa coming from the source 2 circulate. The element or each sensitive element can consist of a cantilever single, such as the one shown in Fig. 2, or by an integrated array of cantilevers, such as the one represented in Fig. 3. The cantilevers or cantilever arrays can be operated in active or passive mode. More details on how to use the cantilevers in the present invention will be given below.
Il sistema di lettura 31 rileva le sollecitazioni meccaniche indotte dall'alterazione delle proprietà locali di equilibrio del cantilever al passaggio di uno spermatozoo all'interno del fluido circolante nel canale microfluidico integrato. In particolare, il sistema di lettura 31 rileva in modalità di funzionamento passiva la flessione dei cantilever, invece in modalità di funzionamento attiva rileva la variazione della differenza di fase tra segnale di input e segnali di output oppure la variazione della frequenza di risonanza. The reading system 31 detects the mechanical stresses induced by the alteration of the local equilibrium properties of the cantilever upon the passage of a spermatozoon inside the fluid circulating in the integrated microfluidic channel. In particular, the reading system 31 detects the cantilever bending in passive operating mode, while in active operating mode it detects the variation of the phase difference between the input signal and the output signals or the variation of the resonance frequency.
Per quanto riguarda la modalità di funzionamento attiva, in Fig. 6 si mostra lo schema di principio della tecnica di misura della variazione della differenza di fase, oppure della frequenza di risonanza, impiegata nella realizzazione preferita dell'invenzione. In tale realizzazione il microcantilever è attuato, utilizzando ad esempio un elemento piezoelettrico, ad una frequenza prossima a quella di risonanza. L'oscillazione del microcantilever viene rilevata attraverso un sistema di trasduzione, per esempio attraverso lettura ottica. I segnali di input (attuazione) e di output (vibrazione del cantilever) vengono inviati ad un comparatore di fase e successivamente ad un controller che passa una informazione in retroazione al dispositivo che comanda l'attuatore, ad esempio un generatore di funzioni. Il passaggio di un singolo spermatozoo nella fluidica del microcanale, determina la variazione temporanea delle condizioni di equilibrio del microcantilever, osservabile come una variazione transitoria della frequenza di oscillazione oppure della differenza di fase tra segnale di input e di output, la cui massima intensità è determinata dalle caratteristiche fisiche e geometriche della particella circolante nel canale. As regards the active operating mode, Fig. 6 shows the basic diagram of the technique for measuring the variation of the phase difference, or of the resonance frequency, used in the preferred embodiment of the invention. In this embodiment the microcantilever is implemented, for example by using a piezoelectric element, at a frequency close to the resonance one. The oscillation of the microcantilever is detected through a transduction system, for example through optical reading. The input (actuation) and output (cantilever vibration) signals are sent to a phase comparator and subsequently to a controller which passes feedback information to the device that controls the actuator, for example a function generator. The passage of a single sperm in the microchannel fluidics determines the temporary variation of the equilibrium conditions of the microcantilever, which can be observed as a transient variation of the oscillation frequency or of the phase difference between input and output signal, the maximum intensity of which is determined from the physical and geometric characteristics of the particle circulating in the channel.
Descrizione Dettagliata dell'Invenzione Detailed Description of the Invention
Nella presente invenzione si stabilisce che la tecnica di calibrazione del sistema di sessaggio, consiste nel misurare il valor medio della massima variazione della differenza di fase oppure della frequenza di risonanza, al passaggio di una popolazione campione di spermatozoi Y. Il passaggio di uno spermatozoo X, caratterizzato da un contenuto cromosomico maggiore, determinerà un segnale che supera la soglia stabilita in fase di calibrazione. In the present invention it is established that the calibration technique of the sexing system consists in measuring the average value of the maximum variation of the phase difference or of the resonance frequency, at the passage of a sample population of spermatozoa Y. The passage of a spermatozoon X , characterized by a higher chromosomal content, will determine a signal that exceeds the threshold established during the calibration phase.
Gli elementi di separazione 32a, 32b sono associati ognuno a un cantilever 30a, 30b. Essi ricevono dal cantilever associato, tramite una linea 8a, 8b, il fluido contenente la successione di spermatozoi sottoposti a misura e, a seconda che la misura abbia stabilito che uno spermatozoo presente su una linea 8 sia portatore del cromosoma X o Y, avvia tale spermatozoo al sistema di stoccaggio 4. The separation elements 32a, 32b are each associated with a cantilever 30a, 30b. They receive from the associated cantilever, through a line 8a, 8b, the fluid containing the succession of spermatozoa subjected to measurement and, depending on whether the measurement has established that a spermatozoon present on a line 8 carries the X or Y chromosome, initiates this sperm to storage system 4.
Gli elementi di separazione 32 sono per esempio elementi a valvola con un ingresso collegato alla linea 8 e due uscite collegate, tramite rispettive linee 9a, 9b e 10a, 10b, a due unità di stoccaggio 40, 41, rispettivamente per i cromosomi X e Y. Le unità 40, 41 formano nel loro insieme il sistema di stoccaggio 4. Per esempio, gli elementi di separazione 32 sono configurati in modo da collegare normalmente l'ingresso 8 all'uscita 10 che porta all'unità 41 di stoccaggio degli spermatozoi portatori del cromosoma Y, e da collegare l'ingresso 8 all'uscita 9 che porta all'unità 40 di stoccaggio degli spermatozoi portatori del cromosoma X ricevendo un esplicito comando dell'unità di controllo 5. The separation elements 32 are for example valve elements with one inlet connected to line 8 and two outlets connected, through respective lines 9a, 9b and 10a, 10b, to two storage units 40, 41, respectively for the X and Y chromosomes . The units 40, 41 together form the storage system 4. For example, the separation elements 32 are configured to normally connect the inlet 8 to the outlet 10 leading to the carrier sperm storage unit 41 of the Y chromosome, and to connect the input 8 to the output 9 which leads to the storage unit 40 of the spermatozoa carrying the X chromosome, receiving an explicit command from the control unit 5.
L'unità di controllo 5 effettua le elaborazioni dei segnali forniti dal sistema di lettura 31, necessarie per determinare il passaggio di uno spermatozoo portatore del cromosoma X o Y. Inoltre essa gestirà e sincronizzerà i tempi di azionamento degli elementi di separazione 32 in base alla portata del sistema, ai tempi di elaborazione delle risposte dei sensori 30 e alla velocità di transito degli spermatozoi attraverso le linee 8. The control unit 5 carries out the processing of the signals supplied by the reading system 31, necessary to determine the passage of a spermatozoon carrying the X or Y chromosome. Furthermore, it will manage and synchronize the activation times of the separation elements 32 according to the flow rate of the system, the processing times of the responses of the sensors 30 and the transit speed of the spermatozoa through the lines 8.
La Fig. 2 illustra un sensore a cantilever singolo a lettura ottica. Il sensore 30 può essere schematizzato da un supporto o parte fissa 300 a cui è fissata un'estremità della leva sospesa 301, la cui estremità libera 302 è resa riflettente nei confronti una radiazione laser 310 proveniente dal sistema di lettura 31. Fig. 2 illustrates an optical reading single cantilever sensor. The sensor 30 can be schematized by a support or fixed part 300 to which one end of the suspended lever 301 is fixed, whose free end 302 is made reflecting towards a laser radiation 310 coming from the reading system 31.
Lungo la periferia di una leva 301 è realizzato un canale di circolazione microfluidica 303, lungo cui transitano gli spermatozoi. Il canale 303 è isolato dall'ambiente esterno ed è dimensionato in modo da garantire il passaggio di un singolo spermatozoo per volta. Il canale 303 comprende un ramo d'ingresso 303A, collegato alla linea di distribuzione 6, ed un ramo d'uscita 303B, collegato alla linea 8 ( Fig. 1)· A microfluidic circulation channel 303 is formed along the periphery of a lever 301, along which the spermatozoa transit. The channel 303 is isolated from the external environment and is sized in such a way as to guarantee the passage of a single spermatozoon at a time. The channel 303 comprises an input branch 303A, connected to the distribution line 6, and an output branch 303B, connected to the line 8 (Fig. 1).
La Fig. 3 mostra una schiera 330 di sensori integrati su un supporto comune, ancora indicato con 300. Ciascun sensore della schiera è identico al sensore singolo di Fig. 2, ed elementi uguali nelle due figure sono indicati con gli stessi numeri di riferimento, con l'aggiunta di apici singoli o multipli per contraddistinguere elementi appartenenti a sensori diversi nella schiera. Fig. 3 shows an array 330 of sensors integrated on a common support, again indicated with 300. Each sensor of the array is identical to the single sensor of Fig. 2, and identical elements in the two figures are indicated with the same reference numbers, with the addition of single or multiple quotes to distinguish elements belonging to different sensors in the array.
Per fissare le idee, si descrive il meccanismo per il sessaggio di una popolazione mista di spermatozoi nel caso di funzionamento dinamico, in cui si deve misurare la variazione della differenza di fase tra segnale di input e output, come descritto nella Fig. 5 L'unità di controllo 5 ( Fig. 1) è tarata ad un determinato livello di soglia di risposta dei sensori, calibrato sul valor medio di picco del segnale indotto dal rilevamento di uno spermatozoo portatore del cromosoma Y. Tutti gli spermatozoi portatori del cromosoma Y, che circolano attraverso i singoli cantilever 30, saranno riversati nella rispettiva linea 9 di distribuzione degli spermatozoi Y (che è tenuta normalmente aperta, cioè collegata direttamente alla linea di uscita 8 del cantilever attraverso il rispettivo elemento di separazione 32) e attraverso tale linea giungeranno all'unità di stoccaggio 41. Il transito di uno spermatozoo portatore del cromosoma X, grazie alle sue diverse proprietà fisiche e geometriche, indurrà un aumento nella risposta del cantilever e un conseguente superamento del livello di soglia del segnale. In questa circostanza, l'unità di controllo 5 azionerà l'elemento di separazione 32 in modo da dirottare il flusso verso la linea 9 di prelevamento degli spermatozoi X, per l'invio all'unità di stoccaggio 40. To fix the ideas, we describe the mechanism for sexing a mixed population of spermatozoa in the case of dynamic functioning, in which the variation of the phase difference between input and output signal must be measured, as described in Fig. 5. control unit 5 (Fig. 1) is calibrated to a certain response threshold level of the sensors, calibrated on the average peak value of the signal induced by the detection of a spermatozoon carrying the Y chromosome. All spermatozoa carrying the Y chromosome, which circulate through the individual cantilevers 30, they will be poured into the respective sperm distribution line 9 Y (which is kept normally open, i.e. connected directly to the output line 8 of the cantilever through the respective separation element 32) and through this line they will reach the storage unit 41. The transit of a spermatozoon carrying the X chromosome, thanks to its different physical and geometric properties, will induce an increase in the cantilever response and a consequent exceeding of the signal threshold level. In this circumstance, the control unit 5 will operate the separation element 32 so as to divert the flow towards the line 9 for collecting the spermatozoa X, for sending to the storage unit 40.
E' evidente che quanto descritto è dato unicamente a titolo di esempio non limitativo e che varianti e modifiche sono possibili senza uscire dal campo di protezione del'invenzione . Inoltre, anche se si è descritta in dettaglio una apparecchiatura per la discriminazione di spermatozoi portatori del cromosoma X da quelli Y, basata sulla misura della variazione della differenza di fase tra segnale di input e output, è evidente che il sistema di lettura 31 e l'unità di controllo 5 potranno operare su grandezze fisiche diverse secondo il tipo di sensore utilizzato e le modalità d'impiego. Ancora, si potranno impiegare metodi di lettura diversi dalla lettura ottica. It is clear that what has been described is given only by way of non-limiting example and that variations and modifications are possible without departing from the scope of the invention. Furthermore, even if an apparatus has been described in detail for the discrimination of spermatozoa carrying the X chromosome from the Y chromosome, based on the measurement of the variation of the phase difference between the input and output signal, it is evident that the reading system 31 and the The control unit 5 can operate on different physical quantities according to the type of sensor used and the methods of use. Furthermore, reading methods other than optical reading may be employed.
Queste alternative sono ben note ai tecnici. P. es., i tre documenti US 2007/089515, EP 1533611 e WO 2007/081902 citati sopra descrivono sistemi in cui si misurano le variazioni della frequenza di risonanza di cantilever funzionanti in modalità attiva, e US 2007/089515 ed EP 1533611 descrivono sistemi in cui si rileva una risposta di tipo elettrico. These alternatives are well known to technicians. For example, the three documents US 2007/089515, EP 1533611 and WO 2007/081902 cited above describe systems in which the variations in the resonant frequency of cantilevers operating in active mode are measured, and US 2007/089515 and EP 1533611 describe systems in which an electrical response is detected.
Per quanto riguarda i metodi di lettura alternativi a quello della leva ottica, si specifica che cambia solo il dispositivo di trasduzione ma non la tecnica di rilevazione del segnale, come descritta nella Fig. 6. I possibili metodi alternativi vengono di seguito descritti: As regards the alternative reading methods to that of the optical lever, it is specified that only the transduction device changes but not the signal detection technique, as described in Fig. 6. The possible alternative methods are described below:
- metodo piezoresistivo: si impiega un microcantilever con materiale piezoresistivo diffuso sulla superficie, il valore della resistenza elettrica dell'elemento piezoresisitivo viene misurato utilizzando un ponte di Wheatstone. Quando il microcantilever oscilla o si flette, la variazione della resistenza dell'elemento piezoresisitivo determina il fluire di una corrente nei due rami del ponte di Wheatstone, permettendo di quantificare la flessione oppure la frequenza di oscillazione del microcantilever ; - piezoresistive method: a microcantilever with piezoresistive material diffused on the surface is used, the value of the electrical resistance of the piezoresistive element is measured using a Wheatstone bridge. When the microcantilever oscillates or bends, the variation of the resistance of the piezoresisitive element determines the flow of a current in the two branches of the Wheatstone bridge, allowing to quantify the bending or the oscillation frequency of the microcantilever;
- metodo piezoelettrico: si attuano i microcantilever applicando una tensione alternata allo strato di materiale piezoelettrico che li ricopre. Le deformazioni del cantilever vengono rilevate perché inducono nel materiale piezoelettrico una variazione di corrente, a causa dell'effetto piezoelettrico diretto. - piezoelectric method: microcantilevers are implemented by applying an alternating voltage to the layer of piezoelectric material that covers them. The cantilever deformations are detected because they induce a current variation in the piezoelectric material, due to the direct piezoelectric effect.
- metodo capacitivo: si utilizza un condensatore formato da due elettrodi, uno dei quali montato su supporto fisso e l'altro montato sulla superficie mobile del microcantilever. Quando il cantilever si flette, la capacitanza tra i due elettrodi cambia permettendo di quantificare la deflessione del sensore. - capacitive method: a capacitor formed by two electrodes is used, one of which mounted on a fixed support and the other mounted on the mobile surface of the microcantilever. As the cantilever flexes, the capacitance between the two electrodes changes allowing the deflection of the sensor to be quantified.
I metodi appena descritti risultano vantaggiosi nella metodologia di sessaggio, sia perché il sensore microcant ilever e l'elettronica di lettura possono essere integrati in un unico chip e sia perché è possibile disporre facilmente i sensori in array. The methods described above are advantageous in the sexing methodology, both because the microcant ilever sensor and the reading electronics can be integrated in a single chip and because it is possible to easily arrange the sensors in arrays.
L'invenzione risolve effettivamente i problemi della tecnica nota indicati sopra. La metodologia proposta permette infatti di effettuare analisi sugli spermatozoi senza una preliminare preparazione dei campioni, come avviene nel caso della citof luorimetria . Gli spermatozoi non sono sottoposti ad alcun trattamento chimico, le cui conseguenze mutagene non sono ancora ben determinate. La tecnologia proposta non è affetta dai problemi di orientamento degli spermatozoi lungo la linea di distribuzione. The invention effectively solves the problems of the prior art indicated above. The proposed methodology makes it possible to carry out analyzes on spermatozoa without preliminary preparation of the samples, as occurs in the case of flow cytometry. The spermatozoa are not subjected to any chemical treatment, the mutagenic consequences of which are not yet well established. The proposed technology is not affected by sperm orientation problems along the distribution line.
Inoltre, a differenza dalla tecnica citofluorimetrica, il ritmo di sessaggio degli spermatozoi, cioè il numero di spermatozoi separabili per unità di tempo, non sarà determinato soltanto dalla velocità del fluido all'interno del sistema di sessaggio (per il quale esiste un limite) . Grazie alle dimensioni tipiche dei cantilever, l'invenzione permette, in linea di principio, un incremento illimitato della velocità di selezione, ottenuto semplicemente con l'impiego di un maggior numero di cantilever o di schiere di cantilever e un conseguente aumento delle linee di distribuzione . Furthermore, unlike the flow cytometric technique, the sexing rate of spermatozoa, i.e. the number of separable spermatozoa per unit of time, will not be determined solely by the velocity of the fluid within the sexing system (for which there is a limit). Thanks to the typical dimensions of cantilevers, the invention allows, in principle, an unlimited increase in the selection speed, obtained simply by using a greater number of cantilevers or cantilever arrays and a consequent increase in distribution lines. .
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