ITTO20120722A1 - LABEL-FREE DEVICE AND PROCESS FOR DETECTION AND CHARACTERIZATION OF FLUIDS BY MEANS OF A SUSPENDED AND VIBRATING MICROFLUIDIC CIRCULATION SYSTEM - Google Patents
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Description
“Dispositivo e processo label-free per la rilevazione e la caratterizzazione di fluidi mediante un sistema di circolazione microfluidica sospeso e vibrante†“A label-free device and process for detecting and characterising fluids by means of a vibrating suspended microfluidic circulation system†⠀ œA label-free device and process for detecting and characterizing fluids by means of a vibrating suspended microfluidic circulation systemâ €
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Settore Tecnico Technical field
La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo, ed al relativo processo, per la rilevazione e la caratterizzazione di fluidi, preferibilmente biologici, mediante un sistema di circolazione microfluidica sospeso e vibrante. The present invention refers to a device, and to the related process, for the detection and characterization of fluids, preferably biological, by means of a suspended and vibrating microfluidic circulation system.
Precisamente, la presente invenzione si riferisce ad un dispositivo, ed al relativo processo, per la rilevazione e la caratterizzazione di fluidi, preferibilmente biologici, di tipo label-free, cioà ̈ senza marcatori fluorescenti o coloranti. More precisely, the present invention refers to a device, and to the relative process, for the detection and characterization of fluids, preferably biological, of the label-free type, ie without fluorescent or coloring markers.
Più precisamente, la presente invenzione si riferisce ad un dispositivo, ed al relativo processo, per la rilevazione e la caratterizzazione di campioni monodispersi o polidispersi in un fluido mediante un meccanismo per l’induzione alla vibrazione di un determinato segmento sospeso di un sistema di circolazione microfluidica. More precisely, the present invention refers to a device, and to the related process, for the detection and characterization of monodisperse or polydisperse samples in a fluid by means of a mechanism for inducing the vibration of a certain suspended segment of a microfluidic circulation.
Ancora più precisamente, la presente invenzione si riferisce ad un dispositivo, ed al relativo processo, in grado di rendere direttamente sensibile un segmento sospeso di un capillare microfluidico (nella presente descrizione anche denominato: linea microfluidica) attraverso l'applicazione di almeno due vincoli meccanici atti a comprendere e fissare detto segmento sospeso, detti vincoli potendo variare la loro posizione relativa lungo la direzione della linea microfluidica al fine di modificarne la lunghezza e le caratteristiche vibrazionali. Even more precisely, the present invention refers to a device, and to the related process, capable of making a suspended segment of a microfluidic capillary (in the present description also called: microfluidic line) directly sensitive through the application of at least two mechanical constraints able to understand and fix said suspended segment, said constraints being able to vary their relative position along the direction of the microfluidic line in order to modify its length and vibrational characteristics.
La presente invenzione à ̈ specificamente indirizzata al “sorting†di un campione misto di spermatozoi, preferibilmente di spermatozoi bovini, il quale viene fatto transitare in detto segmento sospeso posto in risonanza. The present invention is specifically addressed to the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa, preferably bovine spermatozoa, which is made to pass through said suspended segment placed in resonance.
Arte Nota Note Art
La necessità di sistemi di misura sempre più sensibili ed integrati ha indotto lo sviluppo di nuovi sensori, soprattutto nell’ambito delle nanotecnologie e più in generale nell’ambito delle tecnologie MEMS (Micro-Electro-Mechanical Systems, sistemi micro-elettro-meccanici). Tali nuovi sensori si prestano ad una serie di applicazioni fino a pochi anni fa impensabili ed, infatti, molti di essi hanno trovato larga applicazione nel campo della misura di masse infinitesime, caratterizzazione e differenziazione della densità dei fluidi, citometria, eccetera. Un esempio di dispositivo e metodo per misurare le proprietà dei fluidi mediante tecnologia MEMS à ̈ illustrato, ad esempio, nella domanda di Brevetto Internazionale pubblicata al n. WO 2009/102796 A1; il dispositivo secondo detta domanda, che intende specificamente risolvere il problema delle perdite meccaniche dovute alla dissipazione dell’energia meccanica della struttura risonante nel supporto a cui essa à ̈ collegata, comprende una struttura tubolare che, a sua volta, comprende almeno una coppia di porzioni tubolari geometricamente parallele, sostanzialmente piane e fluidicamente connesse, detta struttura tubolare essendo configurata per il movimento vibrazionale e detto movimento vibrazionale verificandosi allorché un fluido scorre attraverso la struttura tubolare. The need for increasingly sensitive and integrated measurement systems has led to the development of new sensors, especially in the field of nanotechnologies and more generally in the field of MEMS technologies (Micro-Electro-Mechanical Systems, micro-electro- mechanical). These new sensors lend themselves to a series of applications that were unthinkable until a few years ago and, in fact, many of them have found wide application in the field of measurement of infinitesimal masses, characterization and differentiation of fluid density, cytometry, etc. An example of a device and method for measuring the properties of fluids using MEMS technology is illustrated, for example, in the International Patent Application published under no. WO 2009/102796 A1; the device according to said application, which specifically intends to solve the problem of mechanical losses due to the dissipation of the mechanical energy of the resonant structure in the support to which it is connected, comprises a tubular structure which, in turn, comprises at least one pair of geometrically parallel tubular portions, substantially flat and fluidically connected, said tubular structure being configured for vibrational movement and said vibrational movement occurring when a fluid flows through the tubular structure.
La citofluorimetria, differentemente da altri campi di applicazione, non presenta al momento tecnologie alternative valide e competitive, in grado di differenziare e caratterizzare il contenuto cromosomico delle cellule spermatiche, preferibilmente dei bovini, ai fini delle attività di sessaggio; la citofluorimetria a flusso, infatti, rappresenta l’unico approccio tecnologico commercialmente utilizzabile per il sessaggio degli spermatozoi. Flow cytometry, unlike other fields of application, currently does not present valid and competitive alternative technologies, capable of differentiating and characterizing the chromosomal content of sperm cells, preferably of cattle, for the purpose of sexing activities; in fact, flow cytometry represents the only technological approach commercially usable for the sexing of spermatozoa.
Tale tecnologia consente di misurare l’unica differenza al momento accertata sperimentalmente tra gli spermatozoi portatori del cromosoma X e quelli portatori del cromosoma Y; tale differenza consiste nella diversa quantità di DNA, stimata nell’ordine del 3 - 5%, associata principalmente alla diversa grandezza dei cromosomi sessuali e variabile a seconda della specie a favore del cromosoma X. This technology allows to measure the only difference currently experimentally ascertained between the spermatozoa carrying the X chromosome and those carrying the Y chromosome; this difference consists in the different quantity of DNA, estimated in the order of 3 - 5%, mainly associated with the different size of the sex chromosomes and variable according to the species in favor of the X chromosome.
Il citofluorimetro a flusso à ̈ un dispositivo altamente tecnologico comprendente una o più sorgenti laser ed un sistema idrodinamico che immette le cellule campione in un flusso di liquido che incrocia un sistema di fasci laser e rivelatori di luce (fotodiodi e/o fotomoltiplicatori); il metodo di rivelazione della differenza di contenuto di DNA consiste nel colorare gli spermatozoi con un fluorocromo, che si lega stechiometricamente con il DNA, e nell’analizzare la quantità di luce che viene emessa per fluorescenza dalla cellula che incrocia il laser. The flow cytometer is a highly technological device comprising one or more laser sources and a hydrodynamic system that introduces the sample cells into a flow of liquid that crosses a system of laser beams and light detectors (photodiodes and / or photomultipliers); the method of detecting the difference in DNA content consists in staining the spermatozoa with a fluorochrome, which binds stoichiometrically with the DNA, and in analyzing the quantity of light that is emitted by fluorescence from the cell that crosses the laser.
Nel tempo si sono susseguite una serie di modifiche migliorative per aumentare le prestazioni del citofluorimetro a flusso, il quale tuttavia non à ̈ esente da problematiche, tra le quali: il numero di spermatozoi separabili per unità di tempo; la colorazione del DNA degli spermatozoi, che non esclude effetti mutageni sulla cellula; la rivelazione della fluorescenza, e quindi la qualità dei risultati, che può essere influenzata dall'orientamento degli spermatozoi lungo la linea di distribuzione. Over time, a series of improvements have been made to increase the performance of the flow cytometer, which, however, is not free from problems, including: the number of separable spermatozoa per unit of time; DNA staining of spermatozoa, which does not exclude mutagenic effects on the cell; the detection of fluorescence, and therefore the quality of the results, which can be influenced by the orientation of the spermatozoa along the distribution line.
Si sono sperimentati vari metodi per il sessaggio degli spermatozoi alternativi alla tecnica della citofluorimetria a flusso, i quali si basano sulle differenze fenotipiche note tra gli spermatozoi portatori del cromosoma X e quelli portatori del cromosoma Y. Various methods for the sexing of spermatozoa alternative to the flow cytometry technique have been tested, which are based on the known phenotypic differences between spermatozoa carrying the X chromosome and those carrying the Y chromosome.
Le procedure per il sessaggio che utilizzano tecniche di centrifugazione e sedimentazione si basano sull’assunzione che gli spermatozoi X e Y abbiano una differente densità . Sexing procedures using centrifugation and sedimentation techniques are based on the assumption that the X and Y spermatozoa have a different density.
Nel 1982 Meistrich (come riportato da Windsor et al., Reprod. Fertil. Dev., 5, 155-171, 1993) considerando la differenza di DNA nota tra spermatozoi bovini X e Y, ha stimato una differenza di densità uguale 7 x 10<-4>g cm<-3>, vale a dire lo 0,06% della densità di uno spermatozoo X. In 1982 Meistrich (as reported by Windsor et al., Reprod. Fertil. Dev., 5, 155-171, 1993) considering the known DNA difference between X and Y bovine spermatozoa, estimated a difference in density equal to 7 x 10 <-4> g cm <-3>, ie 0.06% of the density of a sperm X.
Schwiderski et al., 1991, e Blottner et al., 1993, hanno utilizzato la centrifugazione in una soluzione di Percoll ad alto gradiente di densità per separare spermatozoi X e Y bovini, ottenendo un arricchimento del 75% della frazione di spermatozoi X nella parte inferiore e del 75% di Y in quella superiore. Schwiderski et al., 1991, and Blottner et al., 1993, used centrifugation in a high density gradient Percoll solution to separate bovine X and Y spermatozoa, obtaining a 75% enrichment of the X sperm fraction in the lower and 75% of Y in the upper one.
In generale, gli esperimenti noti in letteratura non garantiscono la ripetibilità del metodo e soprattutto non à ̈ discussa la possibilità di sviluppo di un sistema commerciale per il sessaggio degli spermatozoi. In general, the experiments known in the literature do not guarantee the repeatability of the method and above all the possibility of developing a commercial system for the sexing of spermatozoa is not discussed.
I progressi compiuti nel campo dei biosensori basati su dispositivi MEMS hanno mostrato la possibilità di misurare caratteristiche fisiche, quali per esempio massa e densità , anche di singole cellule. The advances made in the field of biosensors based on MEMS devices have shown the possibility of measuring physical characteristics, such as mass and density, even of single cells.
Godin et al., 2007, Appl. Phys. Lett., 91, descrivono le caratteristiche di un dispositivo capace di misurare la massa, la densità e la taglia di cellule e nanoparticelle, circolanti in un canale microfluidico incorporato in un microcantilever; i ricercatori hanno dimostrato la possibilità di misurare la densità con una risoluzione di 10<-4>g/cm<3>. Godin et al., 2007, Appl. Phys. Lett., 91, describe the characteristics of a device capable of measuring the mass, density and size of cells and nanoparticles, circulating in a microfluidic channel incorporated in a microcantilever; the researchers demonstrated the possibility of measuring density with a resolution of 10 <-4> g / cm <3>.
Nell’articolo di Burg et al. 2007, Nature 446:1066-1069 e nella domanda di Brevetto Internazionale pubblicata al n. WO 2008/045988 A1, si descrive in particolare la misura di massa con la risoluzione del femtogrammo (1 fg = 10<-15>g). In the article by Burg et al. 2007, Nature 446: 1066-1069 and in the International Patent Application published under no. WO 2008/045988 A1, the mass measurement with the resolution of the femtogram (1 fg = 10 <-15> g) is described in particular.
Nella domanda di Brevetto Italiano n. TO2008A101 si presenta un procedimento ed una apparecchiatura per il sessaggio degli spermatozoi in funzione della differenza di massa; l’apparecchiatura proposta consiste essenzialmente di un sensore micromeccanico cantilever con un sistema di fluidica integrato, indotto ad oscillare alla propria frequenza di risonanza: il passaggio di una cellula campione all’interno del canale fluidico altera l’oscillazione del risonatore e tale variazione risulta infine proporzionale alla massa, oppure alla densità , della particella. In the Italian patent application n. TO2008A101 presents a procedure and an apparatus for sexing spermatozoa as a function of the difference in mass; the proposed equipment essentially consists of a micromechanical cantilever sensor with an integrated fluidics system, induced to oscillate at its own resonance frequency: the passage of a sample cell inside the fluidic channel alters the oscillation of the resonator and such finally, the variation is proportional to the mass, or to the density, of the particle.
Inoltre nella domanda di Brevetto Internazionale pubblicata al n. WO 2012/014142 A1 viene mostrata una procedura per il sessaggio degli spermatozoi che non richiede una calibrazione del dispositivo, volta alla determinazione della relazione tra la variazione di una caratteristica dell’oscillazione del cantilever e la massa transitante. Furthermore, in the International Patent Application published under no. WO 2012/014142 A1 shows a procedure for sexing spermatozoa which does not require a calibration of the device, aimed at determining the relationship between the variation of a characteristic of the cantilever oscillation and the passing mass.
Altri esempi di dispositivi e metodi per la rilevazione e la caratterizzazione di fluidi biologici sono illustrati, ad esempio, nella domanda di Brevetto Statunitense pubblicata al n. US 2010/0015649 A1 e nel Brevetto Statunitense n. US 5,211,829. Other examples of devices and methods for the detection and characterization of biological fluids are illustrated, for example, in the US patent application published under no. US 2010/0015649 A1 and in US Patent No. US 5,211,829.
Il documento n. US 2010/0015649 A1 mostra un sensore atto a monitorare i cambiamenti di densità e/o viscosità di un campione di fluido prima, durante e dopo una reazione chimica, detto dispositivo comprendendo una pluralità di strati di cui uno dotato di un supporto di base, almeno due elementi lamellari uniti al supporto di base in corrispondenza di ciascuna loro estremità , almeno un elemento capace di indurre una vibrazione per provocare l’oscillazione selettiva di almeno uno degli elementi lamellari ed un elemento sensore per determinare la frequenza di oscillazione di almeno uno degli elementi lamellari. Document no. US 2010/0015649 A1 shows a sensor suitable for monitoring changes in density and / or viscosity of a fluid sample before, during and after a chemical reaction, said device comprising a plurality of layers, one of which is equipped with a base support, at least two lamellar elements joined to the base support at each of their ends, at least one element capable of inducing a vibration to cause the selective oscillation of at least one of the lamellar elements and a sensor element to determine the oscillation frequency of at least one of the lamellar elements.
Il documento n. US 5,211,829 descrive un’apparecchiatura analitica dotata di un tubo capillare attraverso cui può fluire un campione di fluido, detto tubo capillare essendo vincolato in corrispondenza di due suoi punti in modo da definire una sezione di rilevazione in grado di vibrare, di mezzi d’irraggiamento per indurre la vibrazione di detta sezione di rilevazione e di mezzi di rilevazione per rilevare la vibrazione meccanica del tubo capillare nella sezione di rilevazione. Document no. US 5,211,829 describes an analytical apparatus equipped with a capillary tube through which a sample of fluid can flow, said capillary tube being constrained at two of its points so as to define a detection section capable of vibrating, with means of ™ irradiation to induce the vibration of said sensing section and of sensing means for detecting the mechanical vibration of the capillary tube in the sensing section.
Le soluzioni finora proposte, tuttavia, non rispondono in maniera soddisfacente al problema di misurare e caratterizzare un campione di spermatozoi misti, che resta pertanto un’esigenza ancora irrisolta. The solutions proposed so far, however, do not satisfactorily answer the problem of measuring and characterizing a sample of mixed spermatozoa, which therefore remains an unresolved need.
In particolare resta un’esigenza ancora irrisolta quella di misurare e caratterizzare un campione di spermatozoi misti mediante una tecnica di tipo label-free. In particular, there is still an unresolved need to measure and characterize a sample of mixed spermatozoa using a label-free technique.
Inoltre, non sono ancora state individuate soluzioni in grado di rendere direttamente sensibile un segmento sospeso di un capillare microfluidico, anche modificandone la lunghezza e le caratteristiche vibrazionali. Furthermore, no solutions have yet been identified capable of making a suspended segment of a microfluidic capillary directly sensitive, even by modifying its length and vibrational characteristics.
Si intende qui precisare che, nella presente descrizione, l’espressione “direttamente sensibile†significa che un segmento sospeso di una linea capillare microfluidica viene reso sensibile senza l’aggiunta di ulteriori elementi sensibili, ma solo attraverso l’interfacciamento con opportuni attuatori, rivelatori e sistemi di controllo in grado di stimolare, il suddetto segmento e leggerne e controllarne le variazioni meccaniche; in tal modo à ̈ possibile utilizzare un unico dispositivo in grado di operare con diversi intervalli di sensibilità secondo diverse esigenze di misura senza dover, di volta in volta, riprogettare e realizzare il sensore dedicato. It is hereby intended to specify that, in the present description, the expression â € œdirectly sensitiveâ € means that a suspended segment of a microfluidic capillary line is made sensitive without the addition of further sensitive elements, but only through interfacing with suitable actuators, detectors and control systems capable of stimulating the aforesaid segment and reading and controlling its mechanical variations; in this way it is possible to use a single device capable of operating with different sensitivity ranges according to different measurement needs without having, from time to time, to redesign and build the dedicated sensor.
Infine, un ulteriore problema riguarda la disponibilità di un dispositivo adatto ad effettuare sia il “sorting†di un campione misto di spermatozoi sia il conteggio di microparticelle e nanoparticelle, la rivelazione e separazione di particelle mono/polidisperse, gas, misure di densità dei fluidi ed applicazioni citometriche in generale. Finally, a further problem concerns the availability of a device suitable for carrying out both the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa and the counting of microparticles and nanoparticles, the detection and separation of mono / polydisperse particles, gases, density measurements of fluids and cytometric applications in general.
Scopi e Descrizione Sintetica dell’Invenzione Aims and Brief Description of the Invention
La presente invenzione, partendo dalla nozione degli inconvenienti e delle carenze della tecnica nota, intende porvi rimedio. The present invention, starting from the notion of the drawbacks and shortcomings of the known art, intends to remedy them.
In particolare, la presente invenzione affronta i seguenti problemi che risultano essere irrisolti o risolti in maniera ancora non completa e soddisfacente dalle soluzioni tecniche precedenti: In particular, the present invention addresses the following problems which are still unsolved or solved in a way that is not yet complete and satisfactory by the previous technical solutions:
- misurare e caratterizzare un campione di spermatozoi misti, specificamente mediante una tecnica di tipo label-free; - measure and characterize a sample of mixed spermatozoa, specifically by means of a label-free technique;
- rendere direttamente sensibile un segmento sospeso di un capillare microfluidico, anche modificandone la lunghezza e le caratteristiche vibrazionali, senza l’aggiunta di ulteriori elementi sensibili, in tal modo potendo utilizzare un unico dispositivo in grado di operare con diversi intervalli di sensibilità secondo diverse esigenze di misura senza dover, di volta in volta, riprogettare e realizzare il sensore dedicato; - make a suspended segment of a microfluidic capillary directly sensitive, also by changing its length and vibrational characteristics, without adding additional sensitive elements, thus being able to use a single device capable of operating with different sensitivity ranges according to different measurement needs without having, from time to time, to redesign and build the dedicated sensor;
- controllare l’attuazione della vibrazione e la rivelazione della vibrazione stessa in modo integrato, al fine di ottenere un valore misurabile delle variazioni di almeno una delle caratteristiche dell’oscillazione, ad esempio causate dalla variazione della densità di massa del fluido compreso in un segmento di linea microfluidica; - control the actuation of the vibration and the detection of the vibration itself in an integrated way, in order to obtain a measurable value of the variations of at least one of the characteristics of the oscillation, for example caused by the variation of the mass density of the fluid included in a microfluidic line segment;
- effettuare il “sorting†di un campione misto di spermatozoi; - carry out the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa;
- effettuare anche il conteggio di microparticelle e nanoparticelle, la rivelazione e separazione di particelle mono/polidisperse, misure di densità dei fluidi ed applicazioni citometriche in generale. - perform also the counting of microparticles and nanoparticles, the detection and separation of mono / polydisperse particles, fluid density measurements and cytometric applications in general.
Pertanto, uno scopo dell’invenzione à ̈ provvedere un dispositivo, ed il relativo processo, per misurare e caratterizzare un campione di spermatozoi misti, specificamente mediante una tecnica di tipo label-free. Therefore, an object of the invention is to provide a device, and related process, for measuring and characterizing a mixed sperm sample, specifically by a label-free technique.
Più precisamente la presente invenzione fornisce un dispositivo, ed il relativo processo, in grado di rendere direttamente sensibile un segmento sospeso di un capillare microfluidico di dimensione determinata grazie all'applicazione di almeno due vincoli meccanici atti a comprendere e fissare detto segmento sospeso, detti vincoli potendo distanziarsi mediante un sistema di movimentazione micrometrica manuale od automatico, lungo la direzione della linea microfluidica, al fine di modificarne la lunghezza e le caratteristiche vibrazionali e detto segmento essendo forzato ad oscillare meccanicamente da un dispositivo attuatore, mediante un opportuno sistema di feedback e controllo, alla frequenza propria di risonanza, detti vincoli meccanici potendo essi stessi anche agire da punti di trasmissione dell'attuazione. More precisely, the present invention provides a device, and the related process, capable of making a suspended segment of a microfluidic capillary of a given size directly sensitive thanks to the application of at least two mechanical constraints suitable for understanding and fixing said suspended segment, said constraints being able to distance themselves by means of a manual or automatic micrometric movement system, along the direction of the microfluidic line, in order to modify its length and vibrational characteristics and said segment being forced to oscillate mechanically by an actuator device, by means of an appropriate feedback and control system , at the natural resonance frequency, said mechanical constraints being themselves able to act as transmission points of the actuation.
Ancora più precisamente la presente invenzione fornisce un dispositivo, ed il relativo processo, di tipo label-free per il rilevamento e la caratterizzazione di campioni monodispersi o polidispersi in un fluido, mediante un meccanismo per l’induzione alla vibrazione di un determinato segmento preesistente di linea capillare microfluidica. Even more precisely, the present invention provides a device, and the related process, of the label-free type for the detection and characterization of monodisperse or polydisperse samples in a fluid, by means of a mechanism for inducing the vibration of a certain pre-existing segment. of microfluidic capillary line.
Un altro scopo della presente invenzione, conseguito parallelamente, à ̈ provvedere un dispositivo, ed il relativo processo, integrato ad un sistema di controllo e di rivelazione della vibrazione meccanica al fine di ottenere un valore misurabile delle variazioni di almeno una delle caratteristiche dell’oscillazione, ad esempio causate dalla variazione della densità di massa del fluido compreso in un segmento di linea. Another object of the present invention, achieved in parallel, is to provide a device, and the related process, integrated with a mechanical vibration control and detection system in order to obtain a measurable value of the variations of at least one of the characteristics of the oscillation, for example caused by the variation of the mass density of the fluid included in a line segment.
Più precisamente, un sistema di rivelazione della vibrazione meccanica à ̈ integrato al dispositivo al fine di ottenere un valore misurabile delle variazioni di almeno una delle caratteristiche dell’oscillazione, causate dalla variazione della densità di massa del fluido compreso nel segmento di linea. More precisely, a mechanical vibration detection system is integrated into the device in order to obtain a measurable value of the variations of at least one of the characteristics of the oscillation, caused by the variation of the mass density of the fluid included in the line segment.
La presente invenzione à ̈ in primo luogo finalizzata al “sorting†di un campione misto di spermatozoi, ma può essere impiegata anche in applicazioni quali il conteggio di microparticelle e nanoparticelle, la rivelazione e separazione di particelle mono/polidisperse, misure di densità dei fluidi ed applicazioni citometriche in generale. The present invention is primarily aimed at the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa, but it can also be used in applications such as the counting of microparticles and nanoparticles, the detection and separation of mono / polydisperse particles, density measurements of fluids and cytometric applications in general.
Più precisamente, in un caso di specifico interesse, l’elemento sensibile, realizzato attraverso l’applicazione del predetto meccanismo, permette di effettuare il “sorting†di un campione misto di spermatozoi, preferibilmente di spermatozoi bovini, che viene fatto transitare nel suddetto segmento sospeso posto in risonanza. More precisely, in a case of specific interest, the sensitive element, created through the application of the aforementioned mechanism, allows to carry out the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa, preferably of bovine spermatozoa, which is passed through in the aforementioned suspended segment placed in resonance.
La differenziazione degli spermatozoi può avvenire: 1) in modalità statica, tramite la rivelazione della deflessione del detto segmento al passaggio degli spermatozoi nel sistema di circolazione; 2) e ancor meglio in modalità dinamica, tramite la rilevazione della variazione della differenza di fase tra un segnale di attuazione per la messa in oscillazione del segmento e quello di risposta del trasduttore, oppure della variazione della frequenza di risonanza del suddetto segmento. The differentiation of the spermatozoa can take place: 1) in static mode, through the detection of the deflection of the said segment as the spermatozoa pass through the circulation system; 2) and even better in dynamic mode, by detecting the variation of the phase difference between an actuation signal for the oscillation of the segment and the response signal of the transducer, or the variation of the resonance frequency of the aforementioned segment.
Un non ultimo scopo della presente invenzione à ̈ provvedere un dispositivo, ed il relativo processo, economici e di semplice realizzazione. A not least object of the present invention is to provide a device, and the relative process, which are cheap and easy to manufacture.
In vista di tali scopi, la presente invenzione provvede un dispositivo ed il relativo processo aventi, rispettivamente, le caratteristiche delle allegate rivendicazioni 1 e 7, cui si rinvia per brevità espositiva; inoltre, la presente invenzione provvede anche l’uso di detti dispositivo e processo specificamente per il “sorting†di un campione misto di spermatozoi avente le caratteristiche dell’allegata rivendicazione 10, cui si rinvia per brevità espositiva. In view of these purposes, the present invention provides a device and the relative process having, respectively, the characteristics of the attached claims 1 and 7, to which reference is made for the sake of explanation; moreover, the present invention also provides for the use of said device and process specifically for the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa having the characteristics of the attached claim 10, to which reference is made for the sake of brevity.
È, dunque, un primo oggetto della presente invenzione, eventualmente indipendente ed utilizzabile autonomamente rispetto agli altri aspetti dell’invenzione, un dispositivo, ed il relativo processo, per misurare e caratterizzare un campione di spermatozoi misti, specificamente mediante una tecnica di tipo label-free. Therefore, a first object of the present invention, possibly independent and usable autonomously with respect to the other aspects of the invention, is a device, and the related process, to measure and characterize a sample of mixed spermatozoa, specifically by means of a label-type technique. -free.
È, dunque, un altro oggetto della presente invenzione, eventualmente indipendente ed utilizzabile autonomamente rispetto agli altri aspetti dell’invenzione, un dispositivo, ed il relativo processo, in grado di rendere direttamente sensibile un segmento sospeso di un capillare microfluidico di dimensione determinata grazie all'applicazione di almeno due vincoli meccanici atti a comprendere e fissare detto segmento sospeso, detti vincoli potendo distanziarsi mediante un sistema di movimentazione micrometrica manuale od automatico, lungo la direzione della linea, al fine di modificarne la lunghezza e le caratteristiche vibrazionali e detto segmento essendo forzato ad oscillare meccanicamente da un dispositivo attuatore, mediante un opportuno sistema di feedback e controllo, alla frequenza propria di risonanza, detti vincoli meccanici potendo essi stessi anche agire da punti di trasmissione dell'attuazione. Therefore, another object of the present invention, possibly independent and usable autonomously with respect to the other aspects of the invention, is a device, and the relative process, capable of making a suspended segment of a microfluidic capillary of a determined size directly sensitive thanks to to the application of at least two mechanical constraints suitable for understanding and fixing said suspended segment, said constraints being able to distance themselves by means of a manual or automatic micrometric movement system, along the direction of the line, in order to modify its length and vibrational characteristics and said segment being forced to oscillate mechanically by an actuator device, by means of an appropriate feedback and control system, at the natural resonance frequency, said mechanical constraints can themselves also act as actuation transmission points.
È, dunque, un altro oggetto della presente invenzione, eventualmente indipendente ed utilizzabile autonomamente rispetto agli altri aspetti dell’invenzione, un dispositivo, ed il relativo processo, integrato ad un sistema di controllo e di rivelazione della vibrazione meccanica al fine di ottenere un valore misurabile delle variazioni di almeno una delle caratteristiche dell’oscillazione, ad esempio causate dalla variazione della densità di massa del fluido compreso in un segmento di linea. Therefore, another object of the present invention, possibly independent and usable independently with respect to the other aspects of the invention, is a device, and the related process, integrated with a control and detection system of the mechanical vibration in order to obtain a measurable value of the variations of at least one of the characteristics of the oscillation, for example caused by the variation of the mass density of the fluid included in a line segment.
È, dunque, un altro oggetto della presente invenzione, eventualmente indipendente ed utilizzabile autonomamente rispetto agli altri aspetti dell’invenzione, l’uso di un dispositivo, ed il relativo processo, per effettuare il “sorting†di un campione misto di spermatozoi. Therefore, another object of the present invention, possibly independent and usable independently with respect to the other aspects of the invention, is the use of a device, and the related process, to carry out the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa.
Ulteriori caratteristiche tecniche vantaggiose di dettaglio del dispositivo e del relativo processo, nonché della loro specifica applicazione per il “sorting†di un campione misto di spermatozoi secondo la presente invenzione, sono descritte nelle corrispondenti rivendicazioni dipendenti. Further advantageous detailed technical characteristics of the device and of the related process, as well as of their specific application for the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa according to the present invention, are described in the corresponding dependent claims.
Le suddette rivendicazioni, nel seguito definite, si intendono parte integrante della presente descrizione. The aforementioned claims, defined hereinafter, are intended as an integral part of the present description.
Come risulterà evidente dalla descrizione dettagliata che segue, il dispositivo ed il relativo processo secondo la presente invenzione, presentano significativi vantaggi in particolare rispetto alle tecnologie esistenti MEMS e della citofluorimetria a flusso. As will be evident from the detailed description that follows, the device and the related process according to the present invention have significant advantages in particular with respect to existing MEMS and flow cytometry technologies.
Descrizione delle Figure Description of the Figures
La presente invenzione, unitamente ai suoi scopi e vantaggi, risulterà maggiormente evidente dalla descrizione dettagliata che segue, relativa a forme di realizzazione preferite del dispositivo e del relativo processo qui rivendicati in esclusiva, date a titolo indicativo ed esemplificativo, ma non limitativo, con riferimento alle tavole di disegno allegate, anch’esse fornite a solo titolo di esempio, in cui: The present invention, together with its aims and advantages, will become more evident from the detailed description that follows, relating to preferred embodiments of the device and the related process claimed herein exclusively, given by way of example and by way of non-limiting example, with reference to the attached drawing tables, also provided for example only, in which:
- la Fig. 1 Ã ̈ una vista prospettica di un segmento di linea microfluidica funzionalizzato secondo la presente invenzione; - Fig. 1 is a perspective view of a functionalized microfluidic line segment according to the present invention;
- la Fig. 2A Ã ̈ una vista laterale di Fig. 1, in cui si evidenzia la direzione in cui i vincoli meccanici possono distanziarsi; - Fig. 2A is a side view of Fig. 1, showing the direction in which the mechanical constraints can be separated;
- la Fig.2B à ̈ una vista dall’alto di Fig.1; - Fig.2B is a top view of Fig.1;
- la Fig. 3 Ã ̈ una rappresentazione CAD (Computer-Aided Design) di un sistema ottico di rivelazione della vibrazione meccanica del segmento sospeso di linea microfluidica secondo la presente invenzione; - Fig. 3 is a CAD (Computer-Aided Design) representation of an optical system for detecting the mechanical vibration of the suspended segment of the microfluidic line according to the present invention;
- la Fig. 4A illustra una prima forma di realizzazione della presente invenzione, con configurazione in serie di segmenti di linea microfluidica funzionalizzati; - Fig. 4A illustrates a first embodiment of the present invention, with a series configuration of functionalized microfluidic line segments;
- la Fig. 4B illustra una seconda forma di realizzazione della presente invenzione, con configurazione in parallelo di segmenti di linea microfluidica funzionalizzati; - Fig. 4B illustrates a second embodiment of the present invention, with parallel configuration of functionalized microfluidic line segments;
- la Fig. 5 mostra una realizzazione prototipale di un segmento di microcapillare in oscillazione secondo la presente invenzione; - Fig. 5 shows a prototype embodiment of an oscillating microcapillary segment according to the present invention;
- la Fig.6 à ̈ un grafico riportante misure sperimentali relative alla variazione del ritardo di fase tra segnale di attuazione ed oscillazione al passaggio di una particella di calibrazione all’interno di un segmento di linea secondo la presente invenzione; e - Fig.6 is a graph showing experimental measurements relating to the variation of the phase delay between the actuation signal and the oscillation at the passage of a calibration particle inside a line segment according to the present invention; And
- la Fig. 7 à ̈ uno schema di funzionamento del sistema per il “sorting†di un campione misto di spermatozoi, comprendente il segmento di linea microfluidica funzionalizzato secondo la presente invenzione. - Fig. 7 is an operating diagram of the system for the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa, comprising the microfluidic line segment functionalized according to the present invention.
Questi disegni illustrano diversi aspetti e forme di realizzazione della presente invenzione e, se del caso, strutture, componenti, materiali e/o elementi simili sono indicati in figure differenti con gli stessi riferimenti numerici. These drawings illustrate different aspects and embodiments of the present invention and, if applicable, similar structures, components, materials and / or elements are indicated in different figures with the same numerical references.
Descrizione Dettagliata dell’Invenzione Detailed Description of the Invention
Mentre l’invenzione à ̈ suscettibile di varie modifiche ed implementazioni alternative, alcune sue forme di realizzazione verranno descritte nel seguito dettagliatamente, in particolare mediante alcuni esempi illustrativi. While the invention is susceptible of various modifications and alternative implementations, some of its embodiments will be described in detail below, in particular by means of some illustrative examples.
Si dovrebbe comprendere, tuttavia, che non vi à ̈ alcuna intenzione di limitare la presente invenzione alle forme specifiche descritte ma, al contrario, l’invenzione intende coprire tutte le modifiche, implementazioni alternative ed equivalenti che rientrano nell’ambito di protezione dell’invenzione come definito nelle annesse rivendicazioni. It should be understood, however, that there is no intention of limiting the present invention to the specific forms described but, on the contrary, the invention intends to cover all modifications, alternative and equivalent implementations that fall within the scope of the protection. € ™ invention as defined in the attached claims.
Nella seguente descrizione, pertanto, l’uso di "ad esempio", "ecc." ed "o" indica alternative non esclusive senza alcuna limitazione, salvo diversa indicazione. In the following description, therefore, the use of "for example", "etc." and "or" indicates non-exclusive alternatives without limitation, unless otherwise indicated.
L’uso di "anche" significa "tra cui, ma non limitato a," se non diversamente indicato. The use of "also" means "including, but not limited to," unless otherwise indicated.
Con riferimento alla Figura 1 viene descritta una forma di realizzazione preferita della presente invenzione e, precisamente, un dispositivo sensibile per il “sorting†di un campione misto di spermatozoi. With reference to Figure 1, a preferred embodiment of the present invention is described and, more precisely, a sensitive device for the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa.
Per “sorting†si intende la separazione di un campione misto nelle due popolazioni di spermatozoi portatori del cromosoma X e di quelli portatori del cromosoma Y, in base alla differenza di massa, oppure di densità , tra gli spermatozoi stessi. By â € œsorting 'we mean the separation of a mixed sample in the two populations of spermatozoa carrying the X chromosome and those carrying the Y chromosome, based on the difference in mass, or density, between the spermatozoa themselves.
Il procedimento di “sorting†consiste nel far fluire, all’interno del sistema di circolazione microfluidica, un campione misto di spermatozoi in sospensione in un liquido di trasporto. Tale sistema fluidico à ̈ disegnato in modo tale da permettere il transito di un singolo spermatozoo per volta all’interno del segmento di linea, funzionalizzato secondo il meccanismo descritto nel dettaglio precedentemente. Il passaggio di un singolo spermatozoo determina una variazione locale della densità di massa del liquido di trasporto, la quale determina la variazione di una caratteristica dell’oscillazione del segmento di linea. La selezione (“sorting†) del campione si determina in funzione della bimodalità della distribuzione delle occorrenze delle misure relative ad una delle variazioni caratteristiche dell’oscillazione. In particolare, la calibrazione del dispositivo su un valore di soglia, predeterminato dal passaggio di un campione di spermatozoi appartenenti ad una singola popolazione, permette separazione in tempo reale di un campione misto, dal confronto del segnale misurato con quello di soglia. The â € œsortingâ € procedure consists in making a mixed sample of spermatozoa suspended in a transport liquid flow inside the microfluidic circulation system. This fluidic system is designed in such a way as to allow the transit of a single spermatozoon at a time inside the line segment, functionalized according to the mechanism described in detail previously. The passage of a single spermatozoon determines a local variation of the density of mass of the transport liquid, which determines the variation of a characteristic of the oscillation of the line segment. The selection (â € œsortingâ €) of the sample is determined according to the bimodality of the distribution of the occurrences of the measurements relating to one of the characteristic variations of the oscillation. In particular, the calibration of the device on a threshold value, predetermined by the passage of a sample of spermatozoa belonging to a single population, allows the separation in real time of a mixed sample, from the comparison of the measured signal with that of the threshold.
Detto dispositivo 1 comprende una linea microfluidica 20 dotata di un ingresso 23A ed una uscita 23B, in cui fluisce un fluido di trasporto contenente in sospensione gli spermatozoi. Detta linea microfluidica 20 viene vincolata in corrispondenza di due punti 21A e 21B, in modo da selezionare un segmento 10 della stessa di lunghezza determinata, mediante i due vincoli 26, 28,. Said device 1 comprises a microfluidic line 20 equipped with an inlet 23A and an outlet 23B, in which flows a transport fluid containing the spermatozoa in suspension. Said microfluidic line 20 is constrained at two points 21A and 21B, so as to select a segment 10 of the same length of determined length, by means of the two constraints 26, 28 ,.
Detti vincoli 26, 28 garantiscono il serraggio con detta linea microfluidica 20 tra i punti 21A, 21B e l’interfaccia meccanica con l’intera struttura sottostante composta dalle parti 22, 27, 29A e 29B. Il suddetto segmento 10 può essere serrato ai vincoli attraverso diversi possibili sistemi di fissaggio quali, ad esempio: Said constraints 26, 28 guarantee tightening with said microfluidic line 20 between points 21A, 21B and the mechanical interface with the entire underlying structure composed of parts 22, 27, 29A and 29B. The aforementioned segment 10 can be tightened to the constraints through various possible fastening systems such as, for example:
a) microgripping meccanici, piezoelettrici o elettromeccanici, a) mechanical, piezoelectric or electromechanical microgripping,
b) pneumatici, b) tires,
c) magnetici, c) magnetic,
d) chimici (ad esempio utilizzando materiali adesivi). d) chemical (for example using adhesive materials).
È preferibile l’uso di vincoli con meccanismi di interfaccia come sopra identificati nei punti da a) a c) che permettono, inoltre, una facile intercambiabilità del microcapillare ed un riutilizzo del dispositivo in caso di degradazione della linea fluidica. It is preferable to use constraints with interface mechanisms as identified above in points a) to c) which also allow easy interchangeability of the microcapillary tube and reuse of the device in case of degradation of the fluidic line.
Come illustrato in Figura 2A, detti vincoli 26, 28 possono essere predisposti per la movimentazione secondo le direzioni indicate dalle frecce 24A e 24B, per esempio attraverso un meccanismo di movimentazione elettromeccanica; in una particolare configurazione i vincoli meccanici 26, 28 possono essere movimentati lungo un binario di scorrimento 27. In tal modo à ̈ possibile distanziare la coppia di vincoli meccanici 26, 28 lungo le direzioni 24A e 24B, mediante un sistema micrometrico automatico o manuale, in modo da predisporre diverse lunghezze del tratto di segmento sospeso 10 della linea microfluidica 20 e quindi diverse frequenze operative proprie di risonanza. As illustrated in Figure 2A, said constraints 26, 28 can be arranged for movement according to the directions indicated by the arrows 24A and 24B, for example through an electromechanical movement mechanism; in a particular configuration the mechanical constraints 26, 28 can be moved along a sliding track 27. In this way it is possible to space the pair of mechanical constraints 26, 28 along the directions 24A and 24B, by means of an automatic or manual micrometric system, so as to provide different lengths of the suspended segment portion 10 of the microfluidic line 20 and therefore different resonance natural operating frequencies.
Si ritiene qui utile evidenziare che, grazie all’accorgimento sopra descritto, à ̈ possibile utilizzare un unico dispositivo 1 comprendente il segmento sospeso 10 della linea capillare microfluidica 20 reso sensibile ed in grado di operare con diversi intervalli di sensibilità secondo diverse esigenze di misura senza dover, di volta in volta, riprogettare e realizzare il sensore dedicato. It is considered useful here to point out that, thanks to the solution described above, it is possible to use a single device 1 comprising the suspended segment 10 of the microfluidic capillary line 20 made sensitive and able to operate with different sensitivity ranges according to different measurement needs. without having to redesign and build the dedicated sensor from time to time.
Il segmento 10 di linea microfluidica 20 à ̈ sospeso tra i vincoli 26 e 28 per l’intera lunghezza del segmento; inoltre, detti vincoli sono connessi meccanicamente al dispositivo 22 che funge da attuatore meccanico ed à ̈ compreso tra i substrati 29A e 29B. Il suddetto dispositivo 22, induce l’oscillazione della struttura composta dal substrato 29A, dai vincoli 26, 28 e dal segmento 10 della linea microfluidica 20, determinando la vibrazione dell’elemento risonante 10. Il substrato 29B deve essere fissato, ad esempio ad una base di appoggio, al fine di garantire che l’escursione meccanica dell’attuatore 22 coinvolga solo la struttura al di sopra di detto attuatore e non disperda parte del moto verso il basso. L’attuatore 22 può consistere di un elemento piezoelettrico, indotto a vibrare nella direzione ortogonale rispetto alla lunghezza del segmento sospeso 10. The segment 10 of microfluidic line 20 is suspended between the constraints 26 and 28 for the entire length of the segment; moreover, said constraints are mechanically connected to the device 22 which acts as a mechanical actuator and is comprised between the substrates 29A and 29B. The aforementioned device 22 induces the oscillation of the structure composed of the substrate 29A, the constraints 26, 28 and the segment 10 of the microfluidic line 20, determining the vibration of the resonant element 10. The substrate 29B must be fixed, for example to a support base, in order to ensure that the mechanical excursion of the actuator 22 involves only the structure above said actuator and does not disperse part of the downward motion. The actuator 22 may consist of a piezoelectric element, induced to vibrate in the orthogonal direction with respect to the length of the suspended segment 10.
Il sistema descritto forza il segmento 10 di linea microfluidica 20 ad oscillare alla frequenza di attuazione, come viene di seguito chiarito. The system described forces the segment 10 of microfluidic line 20 to oscillate at the actuation frequency, as explained below.
Il dispositivo attuatore, che può essere disposto, integrato o configurato in modi differenti, rispetto a quanto riportato nelle figure, a seconda del principio di funzionamento, à ̈ scelto tra: The actuator device, which can be arranged, integrated or configured in different ways, compared to what is shown in the figures, according to the operating principle, is chosen from:
- almeno un elemento piezoelettrico solidale ai vincoli meccanici 26, 28; - at least one piezoelectric element integral with the mechanical constraints 26, 28;
- un dispositivo di attuazione elettromagnetica; - an electromagnetic actuation device;
- un dispositivo di attuazione elettrostatica; - an electrostatic actuation device;
- un dispositivo di attuazione termica; - a thermal actuation device;
- un dispositivo di attuazione ottica; - an optical actuation device;
- almeno una coppia dei suddetti vincoli 26, 28. - at least one pair of the aforementioned constraints 26, 28.
Considerando un segmento di linea microfluidica di forma cilindrica, caratterizzato da una lunghezza l, da un raggio esterno r<ext>e da un raggio interno r<int>, dalla equazione di Eulero -Bernoulli si ricavano le frequenze di risonanza del segmento: Considering a segment of a cylindrical microfluidic line, characterized by a length l, an external radius r <ext> and an internal radius r <int>, the resonance frequencies of the segment are obtained from the Euler-Bernoulli equation:
dove si à ̈ indicato con: λ<n>delle costanti note come parametri modali, E il modulo di Young del materiale costituente il segmento di linea microfluidica, Ï la densità , l’area della sezione trasversale e il momento secondo di inerzia . where it is indicated with: Î »<n> of the constants known as modal parameters, E the Young's modulus of the material constituting the microfluidic line segment, Ï the density, the cross-sectional area and the second moment of inertia .
Questo risultato comporta che la struttura può vibrare in determinati modi di vibrazione, ad ognuno dei quali corrisponde una determinata configurazione spaziale. Ogni modo di vibrazione à ̈ caratterizzato da un certo numero di nodi, che aumentano all’aumentare di n. Come visibile nelle Figure 2A e 2B, grazie alla soluzione tecnologica proposta secondo la presente invenzione, la linea microfluidica stessa diventa direttamente sensibile al passaggio di una particella, ad esempio di uno spermatozoo, 25 all’interno del fluido circolante nella linea. Infatti, il passaggio di una particella sospesa nel fluido di trasporto determina una variazione locale di almeno una caratteristica fisica del segmento di linea sospeso e oscillante. A titolo di esempio, una caratteristica fisica osservabile à ̈ la variazione locale della massa del segmento di linea, dovuta alla differenza di densità tra fluido di trasporto e particella in transito. La variazione locale della massa si esplicita nella variazione della frequenza di risonanza e nella variazione del ritardo di fase tra attuazione e oscillazione del segmento di linea microfluidica oscillante. This result implies that the structure can vibrate in certain modes of vibration, each of which corresponds to a certain spatial configuration. Each vibration mode is characterized by a certain number of nodes, which increase as n increases. As can be seen in Figures 2A and 2B, thanks to the technological solution proposed according to the present invention, the microfluidic line itself becomes directly sensitive to the passage of a particle, for example of a spermatozoon, 25 inside the fluid circulating in the line. In fact, the passage of a suspended particle in the transport fluid determines a local variation of at least one physical characteristic of the suspended and oscillating line segment. As an example, an observable physical characteristic is the local variation of the mass of the line segment, due to the difference in density between the transport fluid and the particle in transit. The local variation of the mass is expressed in the variation of the resonant frequency and in the variation of the phase delay between actuation and oscillation of the oscillating microfluidic line segment.
Considerando un modello “mass – spring†la frequenza di risonanza del segmento di linea microfluidica può essere scritto come: Considering a `` mass '' spring model, the resonant frequency of the microfluidic line segment can be written as:
dove con si indica la costante elastica e con si indica la cosiddetta massa efficace del segmento di linea microfluidica. Considerando invariata la costante elastica e differenziando rispetto alla massa, si ottiene la variazione della frequenza di risonanza f<n>secondo la relazione: where with indicates the elastic constant and with indicates the so-called effective mass of the microfluidic line segment. Considering the elastic constant unchanged and differentiating with respect to the mass, the variation of the resonance frequency f <n> is obtained according to the relation:
Tale relazione approssimata ha una validità pratica mettendo in relazione lineare la variazione, anche locale, della massa della linea microfluidica sospesa con la variazione della frequenza di risonanza. This approximate relationship has a practical validity by relating linearly the variation, even local, of the mass of the suspended microfluidic line with the variation of the resonance frequency.
La vibrazione meccanica del segmento 10 di linea microfluidica 20 viene misurata attraverso un sistema di rivelazione. The mechanical vibration of the microfluidic line segment 10 20 is measured through a detection system.
In Figura 3 viene fornito a titolo di esempio non limitativo un possibile sistema di rivelazione della vibrazione meccanica del segmento 10 di linea microfluidica 20. Tale sistema si compone di una sorgente laser 60, il cui fascio à ̈ indirizzato sulla superficie del segmento 10 di linea microfluidica 20 oscillante alla frequenza di risonanza. Il segmento 10 à ̈ vincolato dal sistema di fissaggio 21A e 21B e la vibrazione meccanica à ̈ indotta da un supporto piezoelettrico 22. Tale oscillazione determina la variazione della direzione del fascio laser trasmesso, riflesso, oppure deflesso. Dopo che il fascio ha incrociato il segmento 10 di linea oscillante, la posizione del laser viene rilevata da un sensore di luce, nell’esempio descritto il fotodiodo 61, in maniera tale da ottenere una tensione elettrica alternata, oscillante alla stessa frequenza di vibrazione meccanica del segmento 10 di linea microfluidica 20. In Figure 3 a possible system for detecting the mechanical vibration of the segment 10 of microfluidic line 20 is provided by way of non-limiting example. This system consists of a laser source 60, whose beam is directed on the surface of the line segment 10 microfluidics 20 oscillating at the resonant frequency. The segment 10 is constrained by the fixing system 21A and 21B and the mechanical vibration is induced by a piezoelectric support 22. This oscillation determines the variation of the direction of the transmitted, reflected or deflected laser beam. After the beam has crossed the oscillating line segment 10, the position of the laser is detected by a light sensor, in the example described the photodiode 61, in such a way as to obtain an alternating electric voltage, oscillating at the same vibration frequency mechanics of segment 10 of microfluidic line 20.
Secondo un'altra tecnica di rivelazione, il laser incidente sulla superficie del segmento 10 di linea microfluidica 20 à ̈ focalizzato in modo da proiettare l’immagine occultata (ombra del microcapillare) del laser sull’area sensibile del fotodiodo 61. L’oscillazione del capillare indurrà una variazione della distribuzione dell’immagine sul fotodiodo determinando in uscita un segnale elettrico alternato. Il vantaggio di questa soluzione tecnica permette, in caso di microcapillari trasparenti, di evitare falsi segnali positivi dovuti a fenomeni di scattering del laser incidente su uno spermatozoo in transito. According to another detection technique, the laser incident on the surface of segment 10 of microfluidic line 20 is focused so as to project the hidden image (shadow of the microcapillary tube) of the laser onto the sensitive area of photodiode 61. The Oscillation of the capillary will induce a variation in the distribution of the image on the photodiode, resulting in an alternating electrical signal at the output. The advantage of this technical solution allows, in the case of transparent microcapillaries, to avoid false positive signals due to laser scattering phenomena incident on a spermatozoon in transit.
Detto sistema di rivelazione della vibrazione meccanica può però comprendere almeno una tra le seguenti alternative: Said mechanical vibration detection system may however include at least one of the following alternatives:
- almeno una sorgente laser ed almeno un fotodiodo; - at least one laser source and at least one photodiode;
- almeno un condensatore; - at least one capacitor;
- almeno un elemento piezoresistivo integrato con detto segmento sospeso 10; - at least one piezoresistive element integrated with said suspended segment 10;
- almeno un elemento piezoelettrico integrato con detto segmento sospeso 10. - at least one piezoelectric element integrated with said suspended segment 10.
La tecnologia proposta nell’invenzione permette inoltre di configurare segmenti di linea microfluidica in elementi multipli, atti alla rilevazione del passaggio di uno spermatozoo. In particolare, a titolo di esempio, si illustra in Figura 4A una configurazione in serie di segmenti di linea microfluidica tali da permettere misure in sequenza sullo stesso campione in esame. The technology proposed in the invention also allows the configuration of microfluidic line segments in multiple elements, suitable for detecting the passage of a spermatozoon. In particular, by way of example, Figure 4A illustrates a series configuration of microfluidic line segments such as to allow sequential measurements on the same sample under examination.
Inoltre in Figura 4B si illustra una configurazione in parallelo, che permette di aumentare il “rate†del numero di campioni da analizzare e trattare. Furthermore, Figure 4B illustrates a parallel configuration, which allows to increase the â € œrateâ € of the number of samples to be analyzed and treated.
In Figura 5 si riporta l’immagine fotografica di uno dei primi prototipi, realizzato per lo studio di fattibilità della presente invenzione. Figure 5 shows the photographic image of one of the first prototypes, created for the feasibility study of the present invention.
In Figura 6 si mostrano i primi dati sperimentali per la validazione della presente invenzione e relativi alle misure della variazione di fase tra segnale di attuazione e segnale di oscillazione di un prototipo di segmento di microcapillare sospeso e vincolato in due estremi. Figure 6 shows the first experimental data for the validation of the present invention and relating to the measurements of the phase variation between the actuation signal and the oscillation signal of a prototype of a segment of a microcapillary suspended and constrained in two extremes.
In particolare, il suddetto segmento microcapillare, di vetro borosilicato, ha una lunghezza di 500 ï m ed una sezione cava avente diametro interno pari a 8ï m e diametro esterno pari a 10 ï m. La frequenza fondamentale dell’elemento risonante, riempito di olio di paraffina, misurata sperimentalmente à ̈ risultata pari a circa 241 KHz. In particular, the aforesaid microcapillary segment, made of borosilicate glass, has a length of 500 ï m and a hollow section having an internal diameter of 8 ï m and an external diameter of 10 ï m. The fundamental frequency of the resonant element, filled with paraffin oil, measured experimentally was found to be approximately 241 KHz.
Il segmento di linea microfluidica à ̈ stato posto in risonanza mediante un attuatore piezoelettrico alimentato con un generatore di funzioni. Il generatore di funzioni à ̈ stato programmato per erogare una tensione sinusoidale tra 10V e -10V. Un laser incidente, con lunghezza d’onda di 635 nm, à ̈ stato fatto incidere trasversalmente alla lunghezza del segmento sospeso. La luce diffusa dal suddetto segmento, così come in Figura 3, à ̈ stata focalizzata sull’area sensibile di un fotodiodo PSD (Position Sensor Detector) a quattro quadranti. Il segnale in uscita dal PSD à ̈ stata confrontata con il segnale di attuazione, al fine di determinare la variazione del ritardo di fase tra i due segnali. The microfluidic line segment was resonated by means of a piezoelectric actuator fed with a function generator. The function generator has been programmed to deliver a sinusoidal voltage between 10V and -10V. An incident laser, with a wavelength of 635 nm, was incised transversely to the length of the suspended segment. The light scattered by the aforementioned segment, as in Figure 3, was focused on the sensitive area of a four-quadrant PSD (Position Sensor Detector) photodiode. The output signal from the PSD was compared with the actuation signal in order to determine the variation of the phase delay between the two signals.
La variazione del ritardo di fase à ̈ indotta dal passaggio di sfere calibratrici in resina di melammina, di densità e dimensioni note, in un fluido di trasporto costituito da olio di paraffina. The phase delay variation is induced by the passage of melamine resin calibrating spheres, of known density and size, in a transport fluid consisting of paraffin oil.
Come si osserva dai risultati riportati in Figura 6, il passaggio di una particella all’interno del segmento determina una variazione temporanea del ritardo di fase rispetto al segnale di attuazione. In alternativa à ̈ possibile determinare la variazione della frequenza di risonanza indotta dal passaggio del campione attraverso il segmento risonante. As can be seen from the results shown in Figure 6, the passage of a particle inside the segment determines a temporary variation of the phase delay with respect to the actuation signal. Alternatively, it is possible to determine the variation of the resonant frequency induced by the passage of the sample through the resonant segment.
Il dispositivo secondo la presente invenzione, pertanto, permette che la caratteristica dell'oscillazione misurata sia: The device according to the present invention, therefore, allows the characteristic of the measured oscillation to be:
- la variazione del ritardo di fase tra attuazione e oscillazione del segmento sospeso 10, oppure - the variation of the phase delay between actuation and oscillation of the suspended segment 10, or
- la variazione della frequenza di risonanza di detto segmento 10. - the variation of the resonant frequency of said segment 10.
Preferibilmente, il dispositivo secondo la presente invenzione, consente di rivelare la variazione densità di massa. Preferably, the device according to the present invention allows to detect the variation in mass density.
Inoltre, preferibilmente, il dispositivo secondo la presente invenzione à ̈ chiuso in una cella ermetica sotto vuoto per il controllo delle condizioni termodinamiche e la riduzione degli effetti di viscosità del mezzo in cui detto segmento 10 vibra. Furthermore, preferably, the device according to the present invention is closed in a hermetic cell under vacuum for the control of the thermodynamic conditions and the reduction of the viscosity effects of the medium in which said segment 10 vibrates.
Il “sorting†di un campione misto di spermatozoi si determina in funzione della bimodalità della distribuzione degli eventi relativi alla misura di una delle variazioni caratteristiche dell’oscillazione del segmento di linea causate dal passaggio di uno spermatozoo, quali per esempio la frequenza di risonanza o la variazione del ritardo di fase tra oscillazione e attuazione della stessa. The â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa is determined as a function of the bimodality of the distribution of events relating to the measurement of one of the characteristic variations of the oscillation of the line segment caused by the passage of a spermatozoon, such as the frequency of resonance or the variation of the phase delay between oscillation and actuation of the same.
In un altro aspetto l’invenzione fornisce un processo label-free per la rilevazione e la caratterizzazione di fluidi biologici mediante un sistema di circolazione microfluidica sospeso e vibrante. In another aspect, the invention provides a label-free process for the detection and characterization of biological fluids by means of a suspended and vibrating microfluidic circulation system.
Specificamente, la presente invenzione fornisce un processo in grado di rendere direttamente sensibile un segmento sospeso di un capillare microfluidico attraverso l'applicazione di almeno due vincoli meccanici atti a comprendere e fissare detto segmento sospeso, detti vincoli potendo variare la loro posizione relativa lungo la direzione della linea microfluidica al fine di modificarne la lunghezza e le caratteristiche vibrazionali. Specifically, the present invention provides a process capable of making a suspended segment of a microfluidic capillary directly sensitive through the application of at least two mechanical constraints suitable for understanding and fixing said suspended segment, said constraints being able to vary their relative position along the direction of the microfluidic line in order to modify its length and vibrational characteristics.
Detto processo, dunque, comprende le fasi di: This process, therefore, includes the phases of:
i. predisporre una linea microfluidica dotata di ingresso ed uscita; the. prepare a microfluidic line with inlet and outlet;
ii. predisporre un supporto dotato di almeno due vincoli meccanici; ii. prepare a support equipped with at least two mechanical constraints;
iii. intercettare un segmento sospeso di detta linea microfluidica tra detti due vincoli meccanici, così rendendo direttamente sensibile detto segmento sospeso; iii. intercepting a suspended segment of said microfluidic line between said two mechanical constraints, thus making said suspended segment directly sensitive;
iv. predisporre un fluido, preferibilmente biologico, e farlo fluire attraverso detto segmento sospeso di detta linea microfluidica; iv. preparing a fluid, preferably biological, and causing it to flow through said suspended segment of said microfluidic line;
v. indurre la vibrazione di detto segmento sospeso, così rilevando e caratterizzando detto fluido biologico. v. inducing the vibration of said suspended segment, thus detecting and characterizing said biological fluid.
Preferibilmente, detto fluido à ̈ un campione biologico di spermatozoi misti e detto processo à ̈ atto ad effettuarne il “sorting†. Preferably, said fluid is a biological sample of mixed spermatozoa and said process is suitable for carrying out the â € œsortingâ €.
Più precisamente, detto campione à ̈ scelto tra: More precisely, said sample is chosen from:
a. un fluido biologico consistente in una popolazione mista di spermatozoi, costituita di spermatozoi portatori del cromosoma X e spermatozoi portatori del cromosoma Y ed in cui la proprietà rivelata à ̈ la differenza di massa o di densità tra spermatozoi portatori del cromosoma X e spermatozoi portatori del cromosoma Y; to. a biological fluid consisting of a mixed population of spermatozoa, consisting of sperm carrying the X chromosome and sperm carrying the Y chromosome and in which the revealed property is the difference in mass or density between sperm carrying the X chromosome and sperm carrying the chromosome Y;
b. fluidi in cui siano presenti in sospensione cellule, batteri, virus, pollini in cui la proprietà rivelata à ̈ la variazione di massa o di densità ; b. fluids in which cells, bacteria, viruses, pollen are present in suspension in which the revealed property is the variation in mass or density;
c. fluidi in cui siano sospesi o diluiti micro e nano particelle, composti chimici, polveri e fluidi di diversa natura in cui la proprietà rivelata à ̈ la variazione di massa o di densità ; c. fluids in which micro and nano particles, chemical compounds, powders and fluids of different nature are suspended or diluted in which the revealed property is the variation in mass or density;
d. gas in cui la proprietà rivelata à ̈ la variazione di massa o di densità . d. gas in which the revealed property is the change in mass or density.
Secondo il processo della presente invenzione la caratteristica misurata à ̈ una tra: According to the process of the present invention, the measured characteristic is one of:
- la variazione del ritardo di fase tra attuazione e oscillazione di detto segmento sospeso; - the variation of the phase delay between actuation and oscillation of said suspended segment;
- la variazione della frequenza di risonanza di detto segmento sospeso; - the variation of the resonant frequency of said suspended segment;
- la flessione statica di detto segmento sospeso senza induzione della vibrazione. - the static bending of said suspended segment without induction of vibration.
In un altro aspetto l’invenzione à ̈ rivolta all’uso del dispositivo 1 e del relativo processo, in precedenza dettagliatamente descritti, per il “sorting†di un campione misto di spermatozoi; in particolare la presente invenzione fornisce una apparecchiatura 100, illustrata a titolo di esempio in Figura 7, per la separazione in tempo reale di un campione misto di spermatozoi nella popolazione degli spermatozoi portatori del cromosoma X e quelli portatori del cromosoma Y. Detta apparecchiatura 100 comprende un “reservoir†30 che contiene il fluido di trasporto, caratterizzato da un valore noto della densità , circolante nella linea microfluidica ed un “reservoir†31 che contiene una sospensione di un campione misto di spermatozoi immerso nello stesso fluido di trasporto. Le valvole 40 e 41 regolano il flusso rispettivamente della linea contenente il campione e della linea principale del fluido di trasporto, in modo da regolare la velocità di immissione dei campioni nella linea microfluidica. Un chip microfluidico per il mescolamento del fluido di trasporto e della sospensione con il campione di spermatozoi, 50 si compone di un ingresso principale 54B per il fluido di trasporto e di un ingresso secondario 54A per il campione misto di spermatozoi, nonché di una uscita 54C. La linea secondaria si innesta nel flusso principale, mescolando i due fluidi. Una volta in uscita dal punto 54C, il fluido attraversa il dispositivo 1, funzionalizzato secondo la soluzione tecnica descritta dettagliatamente in precedenza. Il passaggio di uno spermatozoo 25 viene rilevato dal segmento 10 di linea, poiché alterando le proprietà fisiche del segmento, per esempio la variazione locale della massa, ne determina una variazione delle caratteristiche della vibrazione. Successivamente il segnale proveniente dal rilevatore di vibrazione 6 viene elaborato da un sistema di analisi del segnale 7. Esso fornisce in uscita un comando per determinare l’apertura dello “switch†8 verso uno dei contenitori di stoccaggio 90 e 91, in modo tale che lo spermatozoo oggetto della misura, in uscita dall’output 23B della linea microfluidica 20, possa essere separato in base alle caratteristiche determinate. In another aspect, the invention is aimed at the use of the device 1 and the relative process, previously described in detail, for the â € œsortingâ € of a mixed sample of spermatozoa; in particular, the present invention provides an apparatus 100, illustrated by way of example in Figure 7, for the real-time separation of a mixed sample of spermatozoa in the population of spermatozoa carrying the X chromosome and those carrying the Y chromosome. Said apparatus 100 comprises a â € œreservoirâ € 30 that contains the transport fluid, characterized by a known density value, circulating in the microfluidic line and a â € œreservoirâ € 31 that contains a suspension of a mixed sample of spermatozoa immersed in the same transport fluid. Valves 40 and 41 regulate the flow of the line containing the sample and the main line of the transport fluid, respectively, in order to regulate the speed of introduction of the samples into the microfluidic line. A microfluidic chip for mixing the transport fluid and suspension with the sperm sample, 50 consists of a main inlet 54B for the transport fluid and a secondary inlet 54A for the mixed sperm sample, as well as an outlet 54C. The secondary line engages the main flow, mixing the two fluids. Once out of the point 54C, the fluid passes through the device 1, functionalized according to the technical solution described in detail previously. The passage of a spermatozoon 25 is detected by the line segment 10, since by altering the physical properties of the segment, for example the local variation of the mass, it determines a variation of the characteristics of the vibration. Subsequently the signal coming from the vibration detector 6 is processed by a signal analysis system 7. It outputs a command to determine the opening of the â € œswitchâ € 8 towards one of the storage containers 90 and 91, so such that the spermatozoon being measured, coming out from the output 23B of the microfluidic line 20, can be separated on the basis of the characteristics determined.
La separazione del campione misto, nell’insieme degli spermatozoi portatori del cromosoma X e del cromosoma Y, avviene attraverso un caratteristica fisica distintiva, per esempio la differenza di massa oppure la densità . Una particella che attraversa il segmento di linea microfluidica funzionalizzato secondo la tecnologia proposta nella presente invenzione, altera le proprietà della vibrazione della linea stessa. In particolare una variazione della massa, anche locale, all’interno del segmento determina una variazione della frequenza di risonanza, oppure della variazione del ritardo di fase tra l’attuazione dell’oscillazione e l’oscillazione stessa. Per maggior chiarezza si consideri di forzare il segmento di linea microfluidica alla sua frequenza di risonanza f<0>e di alterare le caratteristiche dell’oscillazione introducendo una particella di densità diversa rispetto al fluido circolante nella linea. Tale variazione di massa Δm determina una variazione della frequenza di risonanza Δf, e se essa à ̈ sufficientemente piccola rispetto alla frequenza di risonanza, si ha che il ritardo di fase tra segnale di attuazione e oscillazione varia di una quantità Δφ pari a: The separation of the mixed sample, in the whole of the spermatozoa carrying the X chromosome and the Y chromosome, occurs through a distinctive physical characteristic, for example the difference in mass or density. A particle that crosses the microfluidic line segment functionalized according to the technology proposed in the present invention, alters the properties of the vibration of the line itself. In particular, a variation of the mass, even local, within the segment determines a variation of the resonance frequency, or of the variation of the phase delay between the actuation of the oscillation and the oscillation itself. For greater clarity, consider forcing the microfluidic line segment to its resonance frequency f <0> and altering the characteristics of the oscillation by introducing a particle of different density than the fluid circulating in the line. This mass variation Î "m determines a variation of the resonance frequency Î" f, and if it is sufficiently small compared to the resonance frequency, the phase delay between the actuation signal and the oscillation varies by an amount Î " Ï † equal to:
dove la costante α à ̈ proporzionale alla frequenza di risonanza ed inversamente proporzionale alla massa efficace del segmento di linea sospesa. Tale relazione lineare permette di quantificare la variazione di massa all’interno del segmento misurando il ritardo di fase, forzando il segmento ad oscillare alla frequenza di risonanza. where the constant Î ± is proportional to the resonant frequency and inversely proportional to the effective mass of the suspended line segment. This linear relationship allows to quantify the mass variation within the segment by measuring the phase delay, forcing the segment to oscillate at the resonant frequency.
Per poter separare il campione di spermatozoi misto in base ad una determinata caratteristica fisica, come la differenza di densità esistente tra spermatozoi portatori del cromosoma X e Y, à ̈ necessario calibrare il segmento di linea microfluidica, facendo per esempio flussare al suo interno un campione di particelle calibratrici, la cui dimensione, massa e densità siano note. Sulla base della calibrazione effettuata e poi possibile poter effettuare l’operazione di “sorting†in tempo reale secondo la procedura sopraesposta. In order to be able to separate the mixed sperm sample based on a certain physical characteristic, such as the difference in density between sperms carrying the X and Y chromosome, it is necessary to calibrate the microfluidic line segment, for example by having a sample flow inside it. of sizing particles, whose size, mass and density are known. On the basis of the calibration performed, it is then possible to carry out the â € œsortingâ € operation in real time according to the above procedure.
Come risulta evidente da quanto precede, l’invenzione provvede un dispositivo, ed il relativo processo, che permettono di conseguire, rispetto alle tecnologie esistenti della citofluorimetria a flusso e MEMS, i vantaggi che vengono nel seguito evidenziati. As is evident from the foregoing, the invention provides a device, and the relative process, which allow to achieve, with respect to the existing technologies of flow cytometry and MEMS, the advantages which are highlighted below.
Rispetto alla tecnologia della citofluorimetria a flusso, il dispositivo, ed il relativo processo, oggetto dell’invenzione presenta dei notevoli miglioramenti: il dispositivo à ̈ label-free, non necessita di alcun marcatore per la rilevazione della differenza fenotipica tra spermatozoi portatori del cromosoma X e quelli portatori del cromosoma Y; esso à ̈ dimensionalmente scalabile e parallelizzabile in termini di configurazione, permettendo un aumento delle performance del numero di campioni sessati nell’unità di tempo; inoltre non consiste di un apparato complesso per la rilevazione delle caratteristiche distintive dello spermatozoo, e la qualità del segnale non dipende dalla orientazione della cellula all’atto della rilevazione. Il sistema citofluorimetrico, infatti, à ̈ affetto dal problema dell’orientamento della testa degli spermatozoi, rispetto al raggio laser incidente. Per tale ragioni e per ovviare a questo problema sono state sviluppate soluzioni efficaci, che però hanno aumentato di molto la complessità ed il costo dei sistemi. Compared to the technology of flow cytometry, the device and the related process, object of the invention, presents significant improvements: the device is label-free, it does not require any marker for the detection of the phenotypic difference between spermatozoa carrying the chromosome X and those carrying the Y chromosome; it is dimensionally scalable and parallelizable in terms of configuration, allowing an increase in the performance of the number of samples sexed in the unit of time; moreover, it does not consist of a complex apparatus for detecting the distinctive characteristics of the spermatozoon, and the quality of the signal does not depend on the orientation of the cell at the time of detection. The flow cytometric system, in fact, is affected by the problem of the orientation of the sperm head with respect to the incident laser beam. For this reason and to overcome this problem, effective solutions have been developed, which however have greatly increased the complexity and cost of the systems.
Rispetto ai dispositivi MEMS, inoltre, basati su tecnologia cantilever con sistema di circolazione microfluidica integrato, precedentemente citati, il dispositivo proposto nell’invenzione presenta un chiaro segno distintivo di miglioramento tecnico. Compared to MEMS devices, moreover, based on cantilever technology with integrated microfluidic circulation system, previously mentioned, the device proposed in the invention has a clear distinctive sign of technical improvement.
1. Principalmente, la configurazione di un segmento di linea microfluidica permette il transito naturale di uno spermatozoo, in sospensione all’interno di un fluido di trasposto. La configurazione cantilever necessita invece di un canale microfluidico a forma di U, la cui regione di curvatura sia localizzata intorno all’estremo libero, dove il dispositivo risulta più sensibile alle variazioni delle caratteristiche dell’oscillazione, per campioni discreti. Tale necessità di configurazione geometrica può risultare però un problema tecnologico quando il campione oggetto della misura à ̈ uno spermatozoo, il quale, sebbene abbia dimensioni variabili a seconda della specie, nel caso specifico degli spermatozoi bovini, consiste approssimativamente di una testa lunga circa 10 Î1⁄4m, larga circa 5 Î1⁄4m, con uno spessore dell’ordine di qualche centinaio di nanometri, e di un flagello di notevoli dimensioni: circa 60 Î1⁄4m. Tale morfologia causerebbe problematiche al transito della cellula nella zona di gomito del microcanale. Sarebbe, dunque, necessario ridurre la curvatura del gomito e conseguentemente incrementare la larghezza del microcantilever, a discapito del fattore di qualità (Q) del sensore. Con l’incremento del rapporto larghezza/lunghezza i microcantilever, operanti soprattutto in aria e nei liquidi, riducono il proprio fattore di qualità e conseguentemente la sensibilità a causa di una serie di effetti dispersivi, quali ad esempio la viscosità del mezzo in cui vibrano, come descritto nell’articolo di Z. Hao et al., Sensors and Actuators A 109 (2003) 156-164. Questo effetto à ̈ notevolmente meno pronunciato per sistemi vibranti in cui il rapporto larghezza/lunghezza à ̈ molto basso. Nel caso di un micro capillare vibrante, la larghezza dell’elemento risonante può essere ridotta al minimo e consistere quasi esclusivamente della sola sezione della linea di trasporto del fluido. Ciò rende l’invenzione adatta anche per operare in ambienti ordinari, e non soltanto nel vuoto. 1. Mainly, the configuration of a microfluidic line segment allows the natural transit of a spermatozoon, suspended within a transposed fluid. The cantilever configuration, on the other hand, requires a U-shaped microfluidic channel, whose curvature region is located around the free end, where the device is more sensitive to variations in the oscillation characteristics, for discrete samples. However, this need for geometric configuration can result in a technological problem when the sample being measured is a spermatozoon, which, although having variable dimensions depending on the species, in the specific case of bovine spermatozoa, consists approximately of a head about 10 Î1 long. ⁄4m, about 5 Î1⁄4m wide, with a thickness of the order of a few hundred nanometers, and a flagellum of considerable size: about 60 Î1⁄4m. This morphology would cause problems for the transit of the cell in the elbow area of the microchannel. It would therefore be necessary to reduce the curvature of the elbow and consequently increase the width of the microcantilever, to the detriment of the quality factor (Q) of the sensor. With the increase in the width / length ratio, the microcantilevers, operating above all in air and liquids, reduce their quality factor and consequently the sensitivity due to a series of dispersive effects, such as the viscosity of the medium in which they vibrate. , as described in the article by Z. Hao et al., Sensors and Actuators A 109 (2003) 156-164. This effect is noticeably less pronounced for vibrating systems where the width / length ratio is very low. In the case of a vibrating micro capillary, the width of the resonant element can be reduced to a minimum and consist almost exclusively of the only section of the fluid transport line. This makes the invention also suitable for operating in ordinary environments, and not only in a vacuum.
2. Una delle problematiche note nella manipolazione delle cellule spermatiche nasce, inoltre, dall’elevata capacità di sticking con le superfici. La circolazione in un canale ad alta curvatura, aumenta notevolmente le probabilità di accumulo delle cellule nel gomito del canale rendendolo in breve inutilizzabile. Un ulteriore problematica nasce dai tempi caratteristici di risposta del sensore. Per ovviare a tale problema sarebbe necessario incrementare notevolmente le pressioni interne della linea, aumentando la velocità di transito sull’area sensibile, a discapito della risoluzione temporale della misura e dell’accuratezza della stessa. La geometria lineare del segmento di linea microfluidica ed il gradiente del campo di velocità , così come già ampiamente testato, permettono l’allineamento della testa dello spermatozoo lungo l’asse maggiore del canale, riducendo al minimo il rischio di sticking delle cellule lungo le superfici interne del segmento sensibile, anche a basse portate. È possibile, dunque, ridurre notevolmente i tempi di attraversamento a vantaggio della risoluzione temporale della misura. 2. One of the known problems in the manipulation of spermatic cells also arises from the high ability of sticking with the surfaces. Circulation in a highly curved canal greatly increases the chances of cell accumulation in the elbow of the canal, making it unusable in a short time. A further problem arises from the characteristic response times of the sensor. To overcome this problem it would be necessary to significantly increase the internal pressures of the line, increasing the transit speed on the sensitive area, to the detriment of the temporal resolution of the measurement and its accuracy. The linear geometry of the microfluidic line segment and the gradient of the velocity field, as well as already extensively tested, allow the alignment of the sperm head along the major axis of the canal, minimizing the risk of cell sticking along the internal surfaces of the sensitive segment, even at low flow rates. It is therefore possible to significantly reduce the crossing times to the advantage of the temporal resolution of the measurement.
3. Le tecniche di fabbricazione di un dispositivo MEMS, come quello proposto nei riferimenti citati, sono complesse e presentano alcune limitazioni. Le tecniche tipicamente impiegate in microfluidica sono ampiamente meno costose e più facilmente realizzabili. Nel caso specifico, il vantaggio più evidente del dispositivo proposto, nasce dal fatto che le caratteristiche di sensibilità dell’elemento sono demandate alla semplice produzione del capillare microfluidico e nello specifico al dimensionamento delle sezioni interne ed esterne dello stesso. Una volta prodotto il micro capillare, esso viene applicato meccanicamente al dispositivo attraverso i vincoli opportunamente distanziati, determinando in base alla distanza dei vincoli e alle sezioni interne ed esterne del capillare la sensibilità caratteristica dell’elemento Secondo le tecnologie preesistenti, invece, à ̈ necessario dimensionare e produrre diversi sensori a seconda delle applicazioni e dell'intervallo di sensibilità richiesti, con processi complessi e costosi come quelli microlitografici. Nell’invenzione proposta, un volta realizzato il dispositivo, il problema della fabbricazione si trasferisce dunque, alla sola produzione del microcapillare. 3. The manufacturing techniques of a MEMS device, such as the one proposed in the cited references, are complex and have some limitations. The techniques typically employed in microfluidics are far less expensive and more easily achievable. In the specific case, the most evident advantage of the proposed device arises from the fact that the sensitivity characteristics of the element are delegated to the simple production of the microfluidic capillary and specifically to the sizing of the internal and external sections of the same. Once the micro capillary has been produced, it is mechanically applied to the device through suitably spaced constraints, determining the characteristic sensitivity of the element based on the distance of the constraints and the internal and external sections of the capillary. It is necessary to size and produce different sensors according to the applications and the required sensitivity range, with complex and expensive processes such as microlithography. In the proposed invention, once the device has been made, the problem of manufacturing is therefore transferred to the sole production of the microcapillary tube.
4. Il segmento microfluidico, reso sensibile attraverso il meccanismo descritto, à ̈ esso stesso parte della linea del sistema di circolazione, pertanto non presenta discontinuità e non necessita di giunzioni, ramificazioni o strozzature nelle sue vicinanze. Per tale ragione si risolvono i problemi derivanti dalla formazione di microbolle in prossimità dei punti di discontinuità o di variazione delle geometrie. 4. The microfluidic segment, made sensitive through the described mechanism, is itself part of the line of the circulation system, therefore it has no discontinuity and does not require junctions, ramifications or bottlenecks in its vicinity. For this reason the problems deriving from the formation of micro bubbles in proximity of the discontinuity or variation points of the geometries are solved.
Sulla base di quanto sopra esposto, si comprende quindi che il dispositivo, ed il relativo processo, oggetto della presente invenzione, raggiungono gli scopi e realizzano i vantaggi menzionati in precedenza. On the basis of the foregoing, it is therefore understood that the device and the related process, object of the present invention, achieve the purposes and achieve the advantages mentioned above.
E’ chiaro, infine, che numerose altre varianti possono essere apportate al dispositivo, ed al relativo processo in questione, senza per questo uscire dai principi di novità insiti nell’idea inventiva, così come à ̈ chiaro che, nella pratica attuazione dell’invenzione, i materiali, le forme e le dimensioni dei dettagli illustrati potranno essere qualsiasi, a seconda delle esigenze, e potranno essere sostituiti con altri tecnicamente equivalenti. Finally, it is clear that numerous other variations can be made to the device, and to the related process in question, without departing from the novelty principles inherent in the inventive idea, just as it is clear that, in the practical implementation of the invention, the materials, shapes and dimensions of the illustrated details may be any according to requirements, and may be replaced with other technically equivalent ones.
Ove le caratteristiche costruttive e le tecniche menzionate nelle successive rivendicazioni siano seguite da segni o numeri di riferimento, tali segni o numeri di riferimento sono stati introdotti con il solo obiettivo di aumentare l’intelligibilità delle rivendicazioni stesse e, di conseguenza, essi non presentano alcun effetto limitante sull’interpretazione di ciascun elemento identificato, a titolo puramente di esempio, da tali segni o numeri di riferimento. Where the construction features and techniques mentioned in the subsequent claims are followed by reference marks or numbers, these reference marks or numbers have been introduced with the sole aim of increasing the intelligibility of the claims themselves and, consequently, they do not present no limiting effect on the interpretation of each element identified, by way of example only, by such signs or reference numbers.
Claims (10)
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- 2012-08-10 IT IT000722A patent/ITTO20120722A1/en unknown
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