ITTO20090648A1 - Inibitori di adam17 atti a modulare il rilascio di alcam (cd166) solubile in cellule tumorali e loro uso nel trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (eoc) - Google Patents

Inibitori di adam17 atti a modulare il rilascio di alcam (cd166) solubile in cellule tumorali e loro uso nel trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (eoc) Download PDF

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Francesca Casalini
Marina Fabbi
Silvano Ferrini
Elisa Nuti
Armando Rossello
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Istituto Naz Per La Ricerca Sul Cancro
Univ Pisa
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Description

"Inibitori di ADAM17 atti a modulare il rilascio di AL-CAM (CD166) solubile in cellule tumorali e loro uso nel trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (EOC) "
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a nuovi composti che sono degli inibitori della metalloproteasi e disintegrina ADAM17 (altresì denominata TACE, TNF alpha converting enzyme) atti a modulare il rilascio di ALCAM solubile (Activated leukocyte celi adhesion molecule) in cellule tumorali. L'invenzione si riferisce inoltre all'impiego di tali composti per il trattamento terapeutico e la diagnosi del carcinoma ovarico epiteliale (EOC).
Le metallo-proteasi di matrice extracellulare (MMP) sono una famiglia estremamente ampia di proteasi che svolgono importanti funzioni in vari processi fisiopatologici. I membri di una sottoclasse di questa famiglia sono denominati ADAM {metalloproteasi e disintegrina) poiché contengono un dominio metalloproteasico seguito da un dominio disintegrinico nella porzione animino-terminale, seguiti da una regione ricca in cisteina e da un dominio EGF (fattore di crescita epidermico)-simile. Si ritiene che le ADAM svolgano un ruolo importante nel microambiente tumorale, comportandosi come delle "sheddasì" di proteine di membrana coinvolte nella trasduzione di segnali chiave. Inoltre, alcune ADAM sono iperespresse o iperattive nei tumori, suggerendo ulteriormente che possano rappresentare un target farmacologico anti-tumorale. ADAM17 è stata inizialmente caratterizzata come la proteasi responsabile del rilascio della citochina proinfiammatoria TNFalfa ed è stata denominata TACE (TNFalpha converting enzyme). Successivamente è stato dimostrato che essa opera il rilascio di numerosi ligandi di EGFR, quali TGFalfa, anfiregulina, epigen ed altri. Queste molecole sono presenti sotto forma di un precursore di membrana, il cui taglio da parte di ADAMI7 determina la conversione in una forma solubile biologicamente attiva. Livelli elevati di ligandi attivi di EGFR stimolano la crescita di neoplasie EGF-R-positive e possono persino sovvertire l'efficacia di terapie che bersagliano EGFR. Questo rende ADAMI7/TACE un nuovo target nei tumori dipendenti da EGFR. Sia l'inibizione farmacologica sia il silenziamento stabile di ADAMI7/TACE mediante siRNA possono attenuare in modo significativo la crescita in vivo in modelli di xenotrapianto, rispettivamente di carcinoma mammario e carcinoma renale.
Un' altra attività biologica prò-invasiva di ADAM17 nei tumori è legata alla sua capacità di tagliare molecole di adesione di membrana appartenenti alla famiglia delle CAM (Cell adhesion molecules), quali L1-CAM, V-CAM-1, ICAM-1 e ALCAM . Il clivaggio di queste molecole di adesione può facilitare il distacco di cellule tumorali dal tumore primario e rappresentare un processo rilevante per la disseminazione metastatica.
ALCAM/CD166 (Acfcivated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) è un membro della superfamiglia genica delle Ig che media l'adesione intercellulare attraverso interazioni omofiliche (ALCAM/ALCAM) ed eterofiliche (AL-CAM/CD6) . ALCAM è espresso sulla superficie di cellule di vari carcinomi tra cui i carcinomi ovarici (EOC) dove può essere internalizzato . L' internalizzazione è massima nel solco mitotico durante la citocinesi, suggerendo che possa avere un ruolo nel riarrangiamento dei contatti cellula-cellula. Inoltre, la perdita di ancoraggio da parte di cellule di EOC è accompagnata da una perdita di espressione di ALCAM a livello della membrana cellulare e la diminuzione o mancanza di espressione di ALCAM a livello della membrana cellulare è un marcatore di prognosi infausta in pazienti affetti da EOC. ALCAM viene rilasciato in forma solubile (sAL-CAM) dalle cellule di EOC con un meccanismo che dipende dall 'attività della metalloproteasi ADAMI7/TACE. La molecola sALCAM contiene gran parte del dominio extracellulare di ALCAM. Inibitori della funzione di ADAM diminuiscono la motilità di cellule di EOC in un saggio di "wound healing", mentre un anticorpo ricombinante in grado di bloccare le interazioni molecolari di ALCAM e di indurre l'internalizzazione di ALCAM esercita l'effetto opposto. Il rilascio proteolitico di ALCAM di membrana potrebbe diminuirne 1'espressione in membrana, mentre la generazione per proteolisi di sALCAM nel microambiente tumorale potrebbe indurre l'endocitosi di ALCAM di membrana in seguito ad interazione omofilica. La rilocalizzazione di ALCAM dalla membrana cellulare al citoplasma potrebbe quindi incrementare le capacità migratorie delle cellule maligne. Precedenti studi hanno inoltre dimostrato che molecole ricombinanti chimeriche di sALCAM possono inibire la funzione adesiva di ALCAM attraverso un legame competitivo ed agire quindi come regolatori negativi dell'aggregazione cellulare.
La proteolisi di ALCAM può quindi agire per modulare 1'adesione intercellulare mediata da ALCAM, controllando così la transizione tra aggregazione e movimento cellulare .
Il rilascio di sALCAM da parte di ADAMI7 in cellule di carcinomi ovarici può essere facilmente misurato mediante test ELISA [Rosso 0, Piazza T, Bongarzone I, Rossello A, Mezzanzanica D, Canevari S, Orengo AM, Puppo A, Ferrini S, Fabbi M. The ALCAM shedding by thè metalloprotease ADAM17/TACE is involved in motility of ovarian carcinoma cells. Mol Cancer.Res. 2007, 5, 12, 1246-1255]. Pertanto questo sistema biologico può essere utilmente impiegato come test di screening per nuovi inibitori di ADAM17 in un sistema di cellule tumorali vitali, affiancandosi a screening di attività enzimatica.
Poiché altre ADAM, quali ADAM9, ADAM10 ed ADAM12, condividono la capacità di ADAM17 di "sheddare" molecole target coinvolte nella progressione tumorale e in alcuni di questi target {come esempio LI, pro-EGF e EGFR) sono comuni ad ADAM17, ADAM9, ADAM10 ed ADAM12, sembra importante identificare nuovi modulatori/inibitori "dual-taget", che siano provvisti comunque di uno spettro di attività limitato ad alcune ADAM/MMP, coinvolte in processi pro-tumorali.
ALCAM è coinvolto in numerosi processi biologici quali l'ematopoiesi, la risposta immunitaria, la migrazione neuronaie durante lo sviluppo del cervello e la migrazione transendoteliale dei monociti ed inoltre importanti ruoli sembrano legati all'attivazione e migrazione di cellule staminali a livello di vari tessuti ed a livello del sistema nervoso. Pertanto, l'inibizione o la modulazione specifica del rilascio di sALCAM da alcuni tipi di cellule del sistema cardiovascolare, emopoietico, ghiandolare, linfatico, mucosale, muscolare, nervoso , osteoarticolare, oculare, polmonare, genitourinario o da cellule tumorali, può essere utile per la terapia di patologie quali ad esempio quelle di origine tumorale , immuno-mediata o neurodegenerativa o possono essere utili per controllare ed indirizzare lo sviluppo e le attività di vari tipi di cellule staminali.
Esiste un'ampia letteratura brevettuale relativa agli inibitori delle metalloproteinasi. Gli inibitori di metalloproteasi più studiati e descritti presentano caratteristiche strutturali generali comuni alle varie classi, ossia la presenza di gruppi chelantì per l'atomo di zinco catalitico (ZBGs, Zinc binding groups} legati a scheletri principali (scaffolds} che caratterizzano la classe chimica degli inibitori e che sono in grado di dare legami ad idrogeno con lo scheletro (backbone) delle proteine bersaglio ed interazioni di natura idrofobica con le vicine tasche di riconoscimento per il substrato in SI, SI', S2' ed in alcuni casi in S3'.
Numerosi tipi di ZBGs sono stati studiati fino ad oggi, ma il più utilizzato è il gruppo idrossammato che , essendo in grado di dare due legami di coordinazione con lo zinco, porta ad inibitori molto potenti in confronto ad altri gruppi chelanti (a titolo di esempio si vedano W095/2982, W097/24117, W097/49679, EP0780386, W090/05719, W09 3/20047, W006074 , WOOO/46221, WOO0/44709, W099/25687, WO00/50396, WOOO/69821, W004/071384, W099/41246, US006750228, US2 0040127524, W02004/052840, WOOl/02369, W02 004/000811, US2003/007384 5).
Sono stati riportati anche altri gruppi chelanti quali, ad esempio, carbossilati, fosfonati, tioli (a titolo di esempio si vedano EP 1331224; EP0107736; W095/12389; WO96/11209; US00/6500811). Pubblicazioni recenti nello studio degli inibitori di queste zinco metalloproteinasi riguardano lo sviluppo di inibitori mechanism based e lo sviluppo di inibitori allosterici (a titolo di esempio si vedano US2003/0129672, US2005/0004177) .
Fra le strutture più ricorrenti nel campo degli inibitori sintetici di TACE ed altre ADAMs quali ADAM-10 ed ADAMI2 vi sono strutture ammidiche, solforiche e solfonamidiche. Strutture solfonamidiche quali inibitori di TACE sono descritte ad esempio in WO 00/44709 e US 6225311.
Fra le strutture solfonamidiche, la domanda di brevetto intemazionale WO 99/06340 riporta inibitori aciclici di metalloproteinasi (MMPs) aventi la seguente formula generale
in cui A è, fra gli altri, un gruppo S02Ar (arìlsolfonamidico) , un gruppo COAr {arilacetamidico), un gruppo CONHAr (arilureidico), un gruppo PORAr (arilfosfonamidico) ed X è un legame o un gruppo alchilico {C1-C6)e Y è, fra gli altri, un gruppo NZ in cui Z è, fra gli altri, un gruppo acilamidico. Fra le strutture descritte vi è la seguente struttura di tipo ftalimidico:
JP 01/163786 A, WO 99/51572 Al e US 6277987 descrivono, come inibitori di MMPs, l'analogo 4-fenossìfenilico (III) di (II) e le ftalimidi omologhe superiori IV, V e VI (X = C3, Y= 0) di (II):
(V) (VI)
US 6277987, JP 01/163786A e WO 99/15572 descrivono la struttura ftalimidica analoga di tipo (VII) per l'attività inibitrice per TACE ed MMPs:
W098/39329A1, WO 00/44709A2 e US 6225311 descrivono le ftalimidi di tipo (VII) e (VIII) come inibitori di MMPs e di TACE :
WO 00/4470 9A2 e US 6225311 descrivono le amidi di tipo (XI), (X) e (XI):
La solfonamide terziaria (XII), conosciuta anche come CGS27023A o MMI270, sviluppata come inibitore delle MMPs , si è dimostrata altrettanto attiva nell'inibizione di ADAM-17 (TACE):
Più recentemente, Rosso O. et al. hanno evidenziato la capacità di (XII) di inibire TACE, la principale A-DAM coinvolta nel rilascio di ALCAM solubile (sALCAM) nella ECM dalle membrane cellulari di cellule aggressive di carcinoma ovarico e quindi di ridurre significa tìvamente il rilascio di sALCAM riducendo di conseguenza la mobilità cellulare di questo tipo di cellule aggressive ed invasive (Rosso 0, Piazza T, Bongarzone I, Rossello A, Mezzanzanica D, Canevari S, Orengo AM, Puppo A, Ferrini S, Fabbi M. The ALCAM shedding by thè metalloprotease ADAM17/TACE is involved in motility of ovarian carcinoma cells . Mol Cancer Res. 2007, 5, 12, 1246-1255) .
E ' stato inoltre recentemente dimostrato che anche il succìnil-idrossammato (XIII) , altresì denominato BB94 , inibitore non selettivo di parecchie MMPs e di TACE , è in grado di ridurre il rilascio di sALCAM in alcune linee cellulari di tumore del seno (a titolo di esempio si vedano W09005719 e W09410990):
Le N-0 alchil solfonamidi terziarie di formule (XIV)-(XVII) sono state sviluppate recentemente da Rossello A. et al. quali inibitori di MMPs (si veda ad esempio WO2008113756 ):
(XVI) in cui R2è -(CH2)2-NHCOOCH2-C6H5
(XVIII)
(XVII) in cui R2 è -(CH2)NH2
Resta tuttavia la necessità di mettere a disposizione molecole che siano efficaci nel trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (EOC) e che mostrino valori di IC50sensibilmente minori rispetto all'inibitore di riferimento CGS27023A sopra identificato .
Tale necessità è soddisfatta dalla presente invenzione, che mette a disposizione un composto di formula generale (I):
in cui R è idrogeno o un gruppo alchile (C1-C4lineare o ramificato; R<1>è scelto nel gruppo che consiste di idrogeno, -(CH2)2NHCOCH3, -(CH2) 2Pht, in cui Pht è il gruppo ftalimide, -(CH2)2NHCbz, in cui Cbz è il gruppo carbobenzilossi ; e Y è scelto nel gruppo che consiste
Fra i significati di R sono preferiti l'idrogeno e il gruppo isobutile (i-Bu).
Fra i significati di Y sono preferiti
Strutture arilsolfonamidiche che rientrano nell'ambito della presente invenzione e che ne costituiscono forme di realizzazione preferite sono rappresentate qui di seguito dalla formula (II):
in cui R ed R<1>hanno i significati definiti in precedenza in relazione alla formula generale (I) ed R<2>è scelto fra bromo, -0-CH2-C≡C-CH3o fenile facoltativamente sostituito con un gruppo trifluorometile. Composti specifici che rientrano nella formula (II) e che costituiscono forme di attuazione particolarmente preferite della presente invenzione sono identificati nella Tabella 1 sottostante.
Tabella 1
I composti della Tabella 1 sono rappresentati dalle strutture 3-9 qui di seguito:
5 6
Ulteriori composti che rientrano nell'ambito della formula generale (I) sono i glicinil ìdrossammati (III) rappresentati nella Tabella 2 che segue.
Tabella 2
I composti di formula (I) dell'invenzione sono in grado di ridurre il rilascio di ALCAM solubile da vari tipi di cellule di mammifero sfuggite al controllo omeostatico tissutale, riducendo la mobilità cellulare di di cellule aggressive ed invasive modulandone alcune proprietà legate a mobilità, proliferazione, invasività e vitalità cellulari e riducendo quindi la degenerazione tissutale tipica di alcune patologie che iperesprimono livelli non fisiologici di ALCAM. Gli inventori hanno trovato che per questi composti i valori di inibizione (IC50) sul rilascio di ALCAM solubile dalle cellule sono compresi fra 100 e 10 nM e sono nettamente più bassi di quelli misurati in analoghe condizioni per altri inibitori solfonamidici delle MMPs quale CGS27023A, che al contrario mostra valori di IC50nel campo micromolare.
Oltre alla capacità di ridurre il rilascio di ALCAM solubile dalle cellule che lo sovraesprimono, i composti dell'invenzione presentano valori di inibizione (IC50o KA) di ADAM-17 nel livello micro-molare/subnano-molare e sono contemporaneamente in grado di inibire altre ADAM quali ADAM-10 o/e ADAM12 od ancora ADAM8 o/e ADAM9.
I composti dell'invenzione sono inoltre inattivi o poco attivi su alcune MMPs, quali MMP1 ed MMP14, con valori di ICS0o di Ki di 1-3 ordini di grandezza magglori rispetto a guanto misurato per ADAMI7.
Date le loro caratteristiche biologiche e chimico fisiche, i composti della presente invenzione sono adatti ad essere impiegati nella terapia di processi patologici che coinvolgono la liberazione di sALCAM e conseguentemente, in fenomeni specifici di adesione, migrazione e trasmissione intercellulare, nonché in alcune attività intracellulari regolatorie dei fenomeni vitali cellulari in vari tipi di tessuti. Come sarà descritto in maggiore dettaglio nella sezione relativa alla parte sperimentale, gli inventori hanno osservato che i composti dell'invenzione sono atti ad essere efficacemente impiegati nella terapia e nella diagnosi del carcinoma ovarico epiteliale, un carcinoma particolarmente aggressivo per il quale non esistono attualmente farmaci sufficientemente efficaci.
Un aspetto della presente invenzione è quindi una composizione farmaceutica comprendente una quantità farmaceuticamente efficace di un composto di formula (I) come sopra definita ed un veicolo farmaceuticamente accettabile .
Una quantità farmaceuticamente efficace di un composto di formula (I) è ad esempio una concentrazione nel mezzo di coltura compresa tra 0,1 e 5 microM.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione è l'impiego di un composto di formula (I) come sopra definita per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (EOC). Schemi di sintesi
Lo Schema 1 riporta la sintesi dei composti 3,4 della Tabella 1.
Il bifenilsolfonil cloruro 10 e il 4-bromobenzensolfonilcloruro 11 sono stati fatti reagire con O-benzil-idrossilamina cloridrato in presenza di N-metilmorfolina per dare le solfonammidi protette 12 e 13. Queste sono state fatte condensare mediante reazione di Mitsunobu con l'estere a-idrossi-tert-butilico 14, per dare gli esteri tert-butilici 15, 16. I derivati acetammidici 19 e 20 sono stati ottenuti mediante idrogenazione catalizzata da Pd di 15, 16, seguita da acetilazione con cloruro di acetile utilizzando DIPEA come base. L'idrolisi acida degli esteri 19 e 20 ha portato agli acidi carbossilici 21,22 che sono stati convertiti negli acidi idrossamici desiderati per condensazione con O-tert-butildimetilsililidrossilammina in presenza di EDCI e successiva idrolisi acida del gruppo silìlico con acido trifluoroacetico.
Schema 1. Sintesi dei composti 3,4
"“Reagenti e condizioni : (a) BnONH2·HC1, NMM, THF; (b) PPh3, DIAD, THF; (c) H2, Pd/C 10%, MeOH, AcOH; (d) Acetil cloruro, DIPEA, DMF; (e) TFA, CH2C12, 0°C; ( f ) TBDMSiONH2, EDCI, CH2C12; (g) TFA, CH2C12, 0°C.
Gli idrossamati 5 e 9 (Schema 2) sono stati ottenuti partendo dal 4 -bromobenzensolfonilcloruro 11, il quale è stato convertito nella Boc-solfonammide 23 per reazione con ammoniaca acquosa seguita da acilazione per trattamento con di-(tert-butil) dicarbonato in CH2Clautilizzando 4-(dimetilamino)piridina come catalizzatore d'acilazione. Il carbammato 23 così ottenuto è stato sottoposto a reazione di Mitsunobu con l'alcol 24, in precedenza descritto, per dare 1'estere tertbutilico 25 che per idrolisi acida ha portato al carbossilato NH solfonammidico 26, il quale è stato convertito nell'idrossammato 5 per condensazione con 0-tert-butildimetilsililidrossilammina e successiva idrolisi acida con TFA.
L 'arilbromuro 25 è stato convertito nel derivato biarilico 27 mediante coupling di Suzuki Pd-catalizzato con 1'acido 2-{trifluorometil)fenillboronico in presenza di K3P04. L'idrolisi acida con TFA di 27 ha portato al carbossilato 28, che è stato convertito nell'idrossamato corrispondente 9, come descritto in precedenza .
Schema 2. Sintesi dei composti 5,9
“Reagenti e condizioni: (a) NH3aq, CH3CN, 0°C to rt;{b) (Boc)20, Et3N, DMAP, CH2C12; (c) PPh3, DLAD, THF; (d) TFA, CH2C12, 0°C; (e) TBDMSiONH2, EDCI, CH2Cl2; (f) TFA, CH2C12, 0°C; (g) Acido 2-(Trifluorometil)fenilboronico, Pd (PPh3)4, K3P04, H20, diossano, 85°C.
g li idrossamati solfonamidici 6-8 {Schema 3) sono stati sintetizzati a partire dal 4-butinilossibenzensolfonilcloruro 29, il quale è stato ottenuto seguendo una procedura sintetica riportata in letteratura. 29 è stato convertito nella corrispondente Boc-solfonammide per trattamento con ammoniaca seguito da trattamento con di-(tert-butil) dicarbonato. La sofonammide 31 è stata quindi sottoposta a reazione di Mitsunobu in presenza di DIAL e trifenilfosfina con gli alcoli otticamente attivi 24, 14, 32 per dare rispettivamente gli esteri di configurazione (R) 33-3S. Gli esteri tertbutilici 33 e 34 sono stati trasformati per idrolisi acida nei carbossilati NH-solfonamidici 36,37 e poi convertiti nei rispettivi acidi idrossamici 6 e 7, mentre l'estere benzilico 35 è stato N-deprotetto e alchilato per trattamento con 1-Iodio-2-metilpropano in DMF utilizzando carbonato di cesio come base. Il derivato isobutilico 39 è stato quindi sottoposto a idrolisi alcalina per dare il carbossilato 40, il quale è stato infine convertito nell'idrossammato 8 nelle condizioni descritte in precedenza.
Schema 3. Sintesi dei composti 6-8
<a>Reagenti e condizioni: (a) NH3aq-, CHjCN, 0°C-ta; (b) (BOC)20, Et3N, DMAP, CH2Cl2 ;(c) 32 (Schema 4 ) , PPh3, DIAD, THF; (d) TFA, CH2Cl2, 0°C; (e) TBDMSiONHj, EDCI, DCM; (f) TFA, CH2Cl2, 0°C; (g) l-ìodo-2-metil propano, K2C03DMF; (h) KOH, H20, 80°C.
Nello Schema 4 è riportata la sintesi dell'(S)-aidrossiestere 32, il quale è stato ottenuto per trattamento dell' α-idrossi acido commerciale 41 con benzilbromuro, in presenza di carbonato di cesio.
Schema 4. Preparazione dell' (S)-a-idrossiestere 32
Reagenti e condizioni: (a) BnBr, Cs2C03, DMF, 0°C-t.a.
Nello Schema 5 è riportata la sintesi dei derivati della glieina variamente sostituiti in Y riportati in Tabella 2.
Partendo dall'opportuno solfonil cloruro per reazione con la glicina in presenza di trietilammina in una miscela di acqua e diossano sono stati ottenuti gli acidi carbossilici 42a-7la, i quali sono stati convertiti nei rispettivi idrossamati per condensazione con 0-tert-butildimetilsililidrossilammina in presenza di EDCI e successiva idrolisi acida con TFA. Per i derivati 58a-67a i solfonil cloruri di origine non commercia-le sono stati ottenuti per alchilazione dell'4-idrossibenzensolfonato sale sodico con gli opportuni benzil bromuri condotta in isopropanolo in presenza di NaOH come base. I derivati salini così ottenuti sono stati convertiti nei solfonilcloruri desiderati 69a-i per reazione con cloruro di ossalile e N,N-dimetilformammide in CH2C12anidro .
Schema 5. Sintesi dei composti 42-71b<a>
42a-71a 42b-71b<a>Reagenti e condizioni : (a) Et3N, 3⁄40, diossano; (b) TBDMSiONH2, EDCI, CH2C12an; (c) TRA, CH2C12an, 0°C.
Schema 6. Sintesi dei solfonilcloruri non commerciali 69a-i<a>
68a-i 69a-i
R: a= -Bn
b= 3-OCF3-Bn
c= 4-OCF3-Bn
d= 3-F-Bn
e= 4-F-Bn
f= 3,5-F'Bn
g= 4-Br-Bn
h= 3-Ph-Bn
i= 8-metilchinolina
<a>Reagenti e condizioni: (a) RBr, NaOH, isopropanolo, 70°C; (b) (C0C1)S, DMFan, DCM, 0°C a r.t.
Metodi generali
I prodotti di partenza e i solventi di origine com-merciale sono stati utilizzati tal quali e non ulteriormente purificati. Le soluzioni contenenti i prodotti sono state seccate su solfato di sodio anidro {Na2SO4. I punti di fusione sono stati determinati con l'apparato di Kofler e non sono stati ulteriormente corretti . Gli spettri<1>H NMR e<13>C NMR sono stati registrati con uno strumento Varian Gemini 200 (200 MHz) utilizzando, CDCl3-dsAcetone-de, MeOd -d6o DMSO-decome solventi . I valori di Chemical shift (δ) sono stati riportati in ppm e le costanti di accoppiamento (J) in Hertz (Hz). Le reazioni sono state costantemente monitorate mediante cromatografia su strato sottile (TLC) su lastre di gel di silice di 0,25 mm di spessore {Merck 60 F254) e gli acidi idrossamici sono stati visualizzati mediante una soluzione acquosa di FeC13. La flash cromatografia è stata condotta in colonne di vetro contenenti gel di silice 60 (Merck 230-400 Mesh) o RP-18 {Merck 40-63 μm), o mediante colonne preimpaccate Isolute<®>Si (II) (Biotage).
Procedura generale per la sintesi dei composti 12, 13.
Ad una soluzione di O-benzilidrossilamina cloridrato (5,00 g, 31,32 mmol) in THF anidro (78,5 mL) è stata aggiunta l' N-metilmorfolina (6,9 mL, 62,64 mmol) e la soluzione è stata fatta agitare a 0°C in atmosfera inerte di azoto. In un altro pallone a due colli i solfonilcloruri 10, 11 {31,32 mmol) sono stati disciolti nell'altra metà di THF (78,5 mL). La seconda soluzione è stata poi aggiunta goccia a goccia alla prima e la miscela è stata lasciata in agitazione sotto N3per tutta la notte. La reazione è stata poi diluita con AcOEt, lavata con acqua, seccata su Na2S04ed evaporata.
N- (benzilossi)bifenil-4-solfonammide (12). Il derivato bifenilico è stato ottenuto dopo 3 giorni dì agitazione e la solfonammide 12 (3,62 g, 10,66 mmol, 85%) è stata ottenuta come un solido bianco. Pf = 130-132°C.
<1>H-NMR (CDC13) δ: 5,01 (s, 2H); 7,01 (s, IH); 7,35 (m, 5H); 7,44-7,51 (m, 3H); 7,57-7,62 (m, 2H); 7,70-7,75 (m, 2H); 7,97-8,01 (m, 2H).
N- (benzilossi)-4-bromobenzene solfonammide (13). Solido bianco (7,00 g, 20,45 mmol, 65%).
<1>H-NMR (CDClj) δ: 4,98 (s, 2H); 6,93 (br S, IH); 7,35 (s, 5H); 7,63-7,64 (m, IH); 7,68-7,69 (m, IH); 7,.75-7,.76 (m, IH); 7,79-7,80 (m, IH).
Procedura generale per la sìntesi dei composti 15, 16.
Le solfonammidi 12, 13 (1,608 mmol) sono state disciolte in THF anidro (16,5 mL) e vi sono stati aggiunti l'alcol 14 (331,6 mg, 1,072 mmol), la trifenilfosfina (843,52 mg, 3,216 mmol) e il diisopropilazodicarbossilato (0,527 mL, 2,68 tnmol), Le miscele sono state lasciate in agitazione sotto azoto per 4 ore, dopodiché il THF è stato evaporato in vacuo.
(R)-tert-butil 3- (bifenil-4-ilsolfonil)-8-osso-1,10-difenil-2 , 9-diossa-3,7-diazadecano-4-carbossilato (15).
Il grezzo ottenuto è stato purificato per flash chromatografiacromatografia su gel di silice {n-Esano 3 :AcOEt 1) per dare 15, come un olio giallo (950 mg, 1,55 mmol, 58%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 1,25 (s, 9H); 1,90-2,04 (m, 2H); 3,16-3,40 (m, 2H); 4,16 (t, J=7,l Hz, IH); 4,93-5,00 (m, IH); 5,07-5,19 (m, 4H); 7,33-7,37 (m, 10H); 7,41-7,59 (m, 5H); 7,66-7,70 (m, 2H); 7,92-7,97 (m, 2H).
<13>C-NMR (CDC13) δ: 22,09; 27,87; 37,59; 62,75; 66,76; 80,87; 82,56; 127,43; 127,67; 128,16; 128,56; 128,72; 128,92; 129,14; 129,89; 129,94; 133,89; 134,80; 139,17; 146,84; 156,27.
(R)-tert- butil 3- (4-bromofenilsolfoni1)-8-osso-1,10-difenil-2,9-diossa-3 ,7- diazadecano-4-carbossilato (16). Il grezzo ottenuto è stato purificato per flash chromatografiacromatografia (n-Esano 3: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio giallo (428,6 mg, 0,68 mmol, 63%).
<1>H-NMR (CDC1<3>) δ: 1,26 (s, 9H); 1,57-1,67 (m, IH); 1,85-2,05 (m, IH); 3,14-3,27 (m, 2H); 4,09 {t, J=7,3 Hz, IH); 4,95 (br S, IH); 5,02-5,17 (m, 4H); 7,36 <S, 10H); 7,59-7,63 (m, 2H); 7,70-7,75 (m, 2H).
Procedura generale per la sintesi dei composti 17, 18.
Le solfonammìdi protette 15,16 (0,677 mmol) sono state sciolte in una miscela 1:1 di metanolo (48 mL) e acido acetico (48 mL) ed infine vi è stato aggiunto 10% (P/P) di palladio su carbone. La miscela è stata idrogenata per tutta la notte, e poi la soluzione è stata filtrata su celite ed evaporata in vacuo.
(R)-3-(bifenil-4-ilsolfonammido )-4-tert-butossi-4-ossobutan-1 -ammonio acetato (17). Solido chiaro (563 mg, 1,25mmol, 98%).
<1>H-KMR (CDC13)δ: 1,18 (s, 9H); 3,10-3,30 (m, 2H); 3,93 (br S, IH); 5,0 (br S, IH); 7,39-7,57 (m, 5H); 7,65-7,69 (m, 2H); 7,90-7,94 (m, 2H); 8,51 (br s, IH).
(R)-3-(4-bromo fenilsolfonammido) -4-tert-butossi-4-ossobutan-1- ammonio acetato (18), Olio giallo (257,2 mg, 0,65 mmol, 96,4%).
^-NMR (DMSO-d*) δ: 1,18 (s, 9H); 1,73*2,01 (m, IH); 2,10 (d, IH, J=8 Hz); 2,74-2,89 (m, 2H); 3,84-3,90 (m, IH); 7,29-7,34 (m, IH); 7,47-7,86 (m, 3H); 8,15 (br s, 3H). Procedura generale per la sintesi dei composti 19, 20.
I sali ammonici 17 e 18 (0,652 mmol) sono stati disciolti in DMF anidra (6,75 mL) e sono stati aggiunti la N,N-Diisopropiletilammina (0,23 mL, 1,304 mmol) e il cloruro di acetile (0,06 mL, 0,782 mmol). La reazione è stata lasciata in agitazione per tutta la notte a t.a, lavata con acqua ed infine estratta con AcOEt.
(R)-tert-butil 4-acetammido-2- (bifenil-4-ilsolfonammido) butanoato (19). Il prodotto oleoso grezzo è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 3: AcOEt 2) ed è stato ottenuto un olio giallo (88 mg, 0,2 mmol, 51 %).
<1>H-NMR (CDC1<3>) δ: 1,18 (s, 9H); 1,47-1,65 (m, IH}; 2,03 (s, 3H); 2,05-2,17 (m, IH); 3,16-3,33 (m, IH); 3,66-3,83 (m, 2H); 5,41 (d, J=9,3 Hz, IH); 6,27 (t, J=5,5 Hz, IH); 7,41-7,58 (m, 5H); 7,68-7,72 (m, 2H); 7,88-7,92 (m, 2H).
(R)-tert-butil 4-acetammido-2-(4-bromofenilsolfonammido) butanoato (20). Il derivato acetammidico, dopo purificazione per flash cromatografia (CH2C1298 : MeOH 2), è stato ottenuto come olio giallo (57 mg, 0,13 mmol, 20%).
<1>H-NMR (CDC1<3>) δ: 1,18 (s, 9H); 1,51-1,65 (m, IH); 1,99 (s, 3H); 1,96-2,12 (m, IH); 3,13-3,31 (m, IH); 3,61-3,79 (m, 2H); 5,54 (d, J=9 Hz, 2H); 6,29 (br s, IH); 7,44-7,57 (m, 3H); 7,80-7,86 (m, IH).
Procedura generale per la sìntesi dei composti 21, 22.
Ad una soluzione degli esteri tert-butilici 19, 20 (0,126 mmol) in CH2C12anidro (1 mL), è stato aggiunto a 0 °C goccia a goccia il TFA (0,55 mL, 7,17 mmol). Le miscele sono state agitate per 5 ore a 0°C, dopodiché il TFA è stato evaporato .
Acido (R)-4-acetanunido-2 -(bifenil-4-ilsolfonammido) butanoico (21). Dall'idrolisi è stato ottenuto un solido chiaro (63 mg, 0,16 mmol, 84%).
<1>H-NMR (DMSO-de) 6: 1,57-1,70 (m, 2H); 1,72 (s, 3H); 3,00 (dd, 2H, Jl=6 Hz, J2=13,2 Hz); 3,80 (dd, IH, Jl=8 ,8 Hz, J2=14 ,2 Hz); 7,39-7,56 (m, 3H) ; 7,72-7,84 (m, 7H); 8,24 (d, J=8,8 Hz, IH).
Acido (R)-4-acetamido-2 - (4-bromofenilsolfonamido) butanoico (22). L'olio giallo ottenuto è stato triturato con Et20 ed il prodotto desiderato è stato ottenuto come solido beige (37 mg, 0,097 mmol, 77,4%).
<1>H-NMR (Acetone-de) 5; 1,77-1,97 (m, 2H); 1,86 (s, 3H); 3,03-3,24 (m, IH) ; 3,29-3,48 (m, IH); 3,98 (dd, Jl=7 Hz, J2= 15 Hz, IH); 6,92 (d, J=9 Hz, IH); 7,20 (br s, IH); 7,51-7,63 (m, 3H); 7,85-7,89 (m, IH)-Procedura generale per la sintesi dei composti 3, 4.
Gli acidi carbossilici 21, 22 (0,087 mmol) sono stati sospesi in CH2Cl2anidro (2,25 mL) e vi sono stati aggiunti 1' O-{tert-butildimetil-silil) idrossilammina (12,82 mg, 0,087 mmol) e l'N-Etil-N' -(3-dimetilamminopropil )carbodiìmide clor idrato (25,02 mg, 0,130 mmol). Le reazioni sono state lasciate in agitazione a t.a. per tutta la notte, e poi sono state diluite con CH3Cl2, lavate (x3) con acqua, seccate su Na2S04and evaporate. I precursori sililici (0,05 mmol) sono stati poi disciolti in CH2C12anidro (0,4 mi) e il TFA (0,22 mL, 2,8 mmol) è stato aggiunto 0°C . dopo 5 ore d'agitazione il TFA è stato evaporato per dare gli idrossamati desiderati 3 e 4.
(R)-4-acetammido-2 - (bifenil-4-ilsolfonammìdo) -N-idrossibutanammide (3). Il sililidrossi derivato è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 3: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio giallo chiaro (35 mg, 0 ,095 mmol, 60%).
<1>H-NMR (CDC1<3>) 6: -0,02 (s, 6H); 0,85 (s, 9H); 1,85-2,00 (m, 2H); 2,05 (s, 3H); 3,00-3,10 (m, IH); 3,49-3,63 (m,IH); 3,69-3,81 (m, IH); 6,19 (d, J=7,7 Hz, IH); 6,37 (t, J=7,1 Hz, IH); 7,41-7,60 (m, 5H); 7,67-7,71 (m, 2H) ; 7,85-7,89 (m, 2H); 10,39 (s, IH).
L'acido idrossamico 3 è stato ottenuto come un solido bianco (24 mg, 0,061, 87%) dopo triturazione con Et20.
<1>H-NMR (DMSO-ds) δ: 1,43-1,67 (m, 2H); 1,72 (s, 3H); 2,87 (dd, Jl=6,9 Hz, J2=13,l Hz, 2H); 3,61 (dd, Jl=7,3 Hz, J2= 15,2 Hz IH); 7,43-7,55 (m, 3H) ; 7,69-7,76 (m, 3H) ; 7,84 (s, 4H); 8,19 (d, J=8,4 Hz, IH); 8,90 (br s, IH) ; 10,59 (s, IH).
<13>C-NMH (CD3OD-d<) δ: 23,30, 27,72, 33,96, 46,71, 127,89, 129,31, 136,45, 138,62, 139,67, 168,53, 170,22.
(R)-4-acetammido -2-(4-bromofenilsolfonammido)- idrossibutanammide (4).
L 'intermedio silil idrossi è stato recuperato sotto forma di olio giallo (25 mg, 0,05 mmol, 57%).
<l>H-HMR (CDC13) δ: 0,01 (s, 6H); 0,87 (s, 9H); 1,86-2,01 (m, 2H); 2,01 (s, 3H); 3,02-3,15 (m, IH); 3,43-3,61 (m, IH); 3,72-3,79 (m, IH); 6,25 (br s, IH); 6,55 (br s IH); 7,45-7,60 (m, 3H); 7,81-7,84 (m, IH); 10,44 (br s, IH). La triturazione con Et20 ha fornito l'acido idrossamico 4 come un solido beige (20 mg, resa quantitativa).
<1>H-NMR (DMSO-df) δί 1,40-1,68 (m, 2H); 1,73 (s, 3H); 2,75-2,90 (m, 2H); 3,58 (dd, Jl=7 Hz, J2=15 Hz, IH); 7,56 (m, 2H); 7,76 (m, 2H); 8,09-8,14 (d, J=9 Hz, IH); 10,54 (br S, IH).
<13>C-NMR (CD3OD-d«) ò: 23,14, 35,21, 36,45, 36,58, 53,47, 127,93, 130,07, 133,55.
tert-butil 4-bromofenilsolfonilcarbammato (23). Ad una soluzione a 0°C del solfoni1cloruro 11 (6,00 g, 23,48 mmol) in CH3CN (2,35 mL), sono stati aggiunti goccia a goccia 7,5 mL di una soluzione di NH3acquosa al 30%. La sospensione è stata agitata per 10' a temperatura ambiente ed è stata poi diluita con acqua ed estratta con AcOEt . Le fasi organiche sono state seccate su Na2SO^ e concentrate in vacuo per dare la solfonammide come un solido bianco (5,13 g, 21,70 tnmol, 92%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 7,47 (br s, 2H);7,72-7,76 (m, 2H);
7,78-7,83 (m, 2H).
La solfonamide primaria (2,43 g, 10,30 mmol) è stata poi sospesa in CH2Cl2anidro (12,88 mL), contenente la DMAP (125,84 mg, 1,03 mmol) e la EtsN (1,59 mL, 11,33 mmol) . In seguito una soluzione di (Boc)20 (2,587 g, 11,85 mmol) in CH2C12anidro (20,62 mL) è stata aggiunta goccia a goccia alla solfonammide, e la reazione è stata lasciata in agitazione a t.a. per tutta la notte. La soluzione è stata concentrata in vacuo e il residuo è stato trattato con AcOEt e HCl IN. L'AcOEt è stato lavato con acqua e brine, seccato su Na2S04e evaporato. Il grezzo è stato ulteriormente purificato per flash cromatografia (n-Esano 4: AcOEt 1) utilizzando una colonna Isolute<®>Si (II) (20 g) (Biotage). Il composto 23 è stato ottenuto come un solido bianco (2,65 g, 7,86 mmol, 76%).
<1>H-NMR (CDCl3) δ: 1,40 (s, 9H); 7,27 (br S, IH); 7,69-7,71 (m, 2H); 7,87-7,91 (m, 2H).
(R)-tert-butil 2-(4-bromo-N-(tert-butossicarbonil) fenilsolfonammido) -4-(1,3-diossoisoindolin-2-il)butanoato (25). La solfonammide protetta 23 (550,3 mg, 1,637 mmol), è stata sciolta in THF anidro (16,37 mL) e vi sono stati aggiunti l'alcol 24 ( 500 mg, 1,637 mmol), la trifenilfosfina (l,2g, 4,6 mmol) ed infine il diisopropil azodicarbossilato. La reazione è stata agitata in atmosfera di azoto per 4 ore, dopodiché il THF è stato evaporato e il prodotto 25 è stato ottenuto dopo purificazione per flash cromatografia (n-Esano 5: AcOEt 1) come un solido spumoso (477mg, 0,765 mmol, 46%).
<1>H-KMR (CDC13) δ: 1,38 (s, 9H); 1,43 (s, 9H); 2,21-2,36 (m, IH); 2,53-2,71 (m, IH); 3,90 {t, J= 7,14 Hz, 2H); 4,99-5,06 (t, J= 7,0 Hz IH); 7,63-7,75 (m, 4H); 7,83-7,91 (m, 4H).
Acido (R)-2-(4-bromofenilsolfonammido)-4-(1,3-diossoisoindolin-2 -il) butanoìco (26). L'acido carbossìlico 26 è stato ottenuto seguendo la stessa procedura riportata per i composti 21,22 ed è stato purificato mediante triturazione con n-Esano (solido bianco, 220mg, 0,47 mmol, 98%).
H-NMR (DMSO-d6) δ: 1,74-1,89 {m, IH); 1,99-2,06 (m, IH); 3,56-3,64 (m, 2H); 3,77-3,88 (m, IH); 7,65-7,76 (m, 4H); 7,84 {s, 4H); 8,41-8,46 (m, 2H).
(R)-2- (4-bromofenilsolfonammido)-4-(1,3-diossoisoindolin-2 -il)-N-idrossibutanammide (5).
L'intermedio O-Sililico e 1'acido idrossamico 5 sono stati ottenuti come riportato per 3,4. L'estere tertbutil sililico è stato purificato per flash chromatografiacromatografia (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto come un solido chiaro {139 mg, 0,233 mmol, 51%).
<1>H-KMR (CDClj) δ: 0,10 (s, 3H); 0,11 (s, 3H); 0,94 (s, 9H) ; 1,96-2,05 (m, 2H); 3,50-3,83 (m, 3H); 5,71-5,75 (m, 2H); 7,49-7,61 (m, 4H); 7,77-7,92 (m, 4H). L'acido idrossamico 5 è stato triturato con n-Esano and acetone per dare il prodotto desiderato sottoforma di solido bianco (67 mg, 0,14 mmol, 59%).
<1>H-NMR (DMSÓ-di) δ; 1,73-1,92 (m, 2H); 3,44-3,53 (m, 2H); 3,64-3,75 (m, IH); 7,65-7,78 (m, 4H); 7,84 {s, 4H); 8,37-8,42 (m, 2H); 8,89 (s, IH); 10,61 (br S, IH).
<13>C-NMR (CDC13) 5; 30,70, 34,42, 51,89, 122,89, 126,10, 128,.30, 131,78, 131,93, 134,18, 140,47, 166,03, 167,70. (R)-tert-butil 2- (N-(tert-butossicarbonil)-2<1>-(trifluorometil)bifenil-4-ilsolfonammido )-4-(1,3-diossoisoìndolin-2 -il)butanoato (27). Ad una soluzione di 25 (177 mg, 0,284 mmol) in acqua (0,62 mL) e diossano (2,84 mL), sono stati aggiunti l'acido 2-(Trifluorometil)fenilboronico (59,3 mg, 0,312 mmol), Κ-,ΡΟ, (138,7 mg, 0,653 mmol) e Pd(PPh3}4(13,13 mg, 4%). La reazione è stata scaldata a 85°C per 20' e poi guenciata con una soluzione satura di NaHC03. Il prodotto è stato estratto con AcOEt, seccato su Na2S04, e concentrato in vacuo. Il grezzo è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 5: AcOEt 1) per dare 27 come un solido giallo (139 mg, 0,202 mmol, 71%).
<l>H-NMR (CDCl3) 5: 1,36 (s, 9H); 1,44 (s, 9H); 2,23-2,38 (m, IH); 2,63-2,78 (m, IH); 3,91-3,99 (m, 2H); m (t, IH); 7,27-7,31 (m, IH); 7,44-7,49 (m, 2H); 7,53-7,88 (m, 7H); 8,05-8,08 (m, 2H).
Il composto 9 e il suo precursore 28 sono stati ottenuti seguendo la stessa procedura riportata per 3-4.
Acido (R)-4-(1,3-diossoisoindolin-2-il)-2-(2'-(trifluorometil)bifenìl-4 -ilsolfonammido )butanoico (28) . Il prodotto grezzo è stato triturato con n-Esano e Et20 per dare l'acido carbossilico puro come un solido bianco (77mg, 0,144 mmol, 70%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) δι 1,74-1,88 (m, IH); 1,95-2,08 (m, 1 H); 3,50-3,55 (m, 2H); 3,85-3,95 (m, IH); 7,40-7,49 (m, 3H); 7,62-7,87 (m, 9H); 8,41-8,45 (m, 2H).
(R)-4- (1,3-diossoisoindolin-2-il)-N-idrossi-2-(2'-(trifluorometil) bifenil-4-ilsolfonammido) butanammide (9). L'idrossamato protetto è stato ottenuto sottoforma di olio giallo (36 mg, 0,11 mmol 85%), dopo purificazione per flash cromatografia (n-Esano 3: AcOEt 1).
<1>H-NMR (CDClj) δi 0,16 (s, 6H); 0,95 (s, 9H); 1,44 (s, 9H); 2,01-2,07 (m, 2H); 3,49-3,58 (m, IH); 3,70-3,77 (m, 2H); 5,77-5,81 (m, 2H); 7,32-7,38 (m, 3H); 7,52-7,61 (m, 2H); 7,72-7,88 (m, 7H); 9,39 (s, IH).
L'idrossamato 2 stato ottenuto dopo triturazione con rissano e Et30 come solido bianco (15 mg, 0,027 mmol, 60%).
<1>H-NMR (CD3OD-d<) δ: 1,72-1,91 (m, IH); 1,94-2,11 (m, IH); 3,53-3,62 (m, 2H); 3,79-3,85 (m, IH); 7,41-7,46 (m, 3H); 7,55-7,72 (m, 2H); 7,77-7,92 (m, 7H).
<13>C-NMR (CD30D-d4) δι 30,94, 33,87, 52,19, 122,36, 125,40, 125,80, 127,71, 129,13, 131,25, 131,54, 133,54, 139,71, 143,90, 167,70.
4-(but-2-inilossi)benzenesolfonammide (30). Ad una soluzione a 0°C di solfonilcloruro 293 (3,00 g, 11,59 mmol) in CH3CN (1,16 mL), è stata aggiunta goccia a goccia una soluzione di NH3al 30 % (3,71 mL). La sospensione è stata lasciata in agitazione a t.a. per 10' ed è stata diluita con acqua e estratta con CHCl3. Le fasi organiche sono state seccate su NaaS04e concentrate in vacuo per dare la solionammide primaria 4 come un solido bianco (2,6 g, 10,86 mmol, 94%).
<1>H-NMR (DMSO-df) δ: 1,83 (t, J=2,2 Hz, 3H); 4,84 (q, J=2,2 Hz, 2H); 7,09-7,13 (m, 2H); 7,23 (br s, 2H); 7,73-7,77 (m, 2H).
tert-butil 4-(but-2-inilossi)fenilsolfonilcarbammato (31). Ad una soluzione della solfonammide 30 (1,6 g, 6,68 mmol) in CH2C12anidro (8,35 mL) contenente la DMAP (81,6 mg, 0,668 mmol) e la Et3N (1,02 mL, 7,35 mmol) è stata aggiunta goccia a goccia una soluzione di di tert-butil dicarbonate (1,679 g, 7,69 mmol) in CH2Cl2anidro (11,6 mL), e la miscela è stata agitata a t.a . per tutta la notte . La soluzione è stata concentrata in vacuo ed il residuo è stato trattato con AcOEt e HCl IN. L' AcOEt è stato poi lavato con acqua e brine, seccato su Na2SO4ed evaporato . Il prodotto grezzo è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 3: AcOEt 1) ed 1 'intermedio 31 è stato ottenuto come olio giallo (1,757g, 5,39 mmol, 81%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 1,39 (s, 9H); 1,86 (t, J=2,2 Hz, 3H); 4,73 (q, J=2,2 Hz, 2H); 7,04-7,09 (m 2H); 7,93-7,97 (m, 2H). Procedura generale per la sintesi dei composti 33,34,35.
La Boc-solfonammide 31 (750 mg, 2,30 mmol) è stata sciolta in THF anidro (15,3 mL) e vi sono stati aggiunti rispettivamente gli alcol 24, 14, 32 (1,53 mmol), la trifenilfosfina (l,2g, 4,57 mmol) ed il diisopropil azodicarbossilato (0,75 mmol, 3,82 mmol). Le reazioni sono state lasciate in agitazione a t.a. sotto atmosfera di N2per 4 ore.
(R) -tert-butil 2-(4- (but-2-inilossi) -N- (tertbutossicarbonìl) fenilsolfonammido) -4- (1,3-diossoisoindolin-2 -il) butanoato (33). Dopo aver rimosso il THF per evaporazione, il grezzo è stato purificato per flash chromatografiacromatografia (n-Esano 3: AcOEt 1) per dare 33 sottoforma di olio giallo (392 mg, 0,32 mmol, 40%).
<1>H-NME (CDC13)δ: 1,38 (s, 9H); 1,41 (s, 9H); 1,85 (t, J=2,2 Hz, 3H); 2,20-2,31 (m, IH); 2,56-2,66 (m, IH); 3,90 (t, J=7,14 Hz, 2H); 4,72 (d, J= 2,2 Hz, 2H); 5,04 (t, J= 7 Hz, IH); 7,00-7,05 (m, 2H); 7,68-7,72 (m, 2H); 7,81-7,87 (m, 2H); 7,93-7,97 (m, 2H).
(R)-tert-butil 8- (4-(but-2-inilossi)fenilsolfonil)-11,11-dimetil-3 ,9-diosso-l-fenil-2,10-diossa-4,8-diazadodecano-7 -carbossilato (34). Il prodotto grezzo è stato purificato per flash chromatografiacromatografia (n-Esano 5: AcOEt 2) per dare 34 come olio incolore (591,4 mg, 0,96 mmol, 63%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 1,33 (s, 9H); 1,40 (s, 9H); 1,85 (t, J=2,2 Hz, 3H); 2,12-2,21 (m, IH); 2,34-2,48 (m, IH); 3,13-3,30 (m, IH); 3,55-3,66 (m, IH); 4,73 (q, J= 2,2 Hz, 2H); 4,96 (dd, Jl=4,4 Hz, J2=10,7 Hz, IH); 5,11 (s, 2H); 5,47 (m, IH); 7,02-7,06 (m, 2H); 7,35 (s, 5H); 7,94-7,99 (m, 2H).
(R)-benzil 2- (4-(but-2-inilossi)-N-(tertbutossicarbonil) fenilsolfonammido)-4 -(1,3-diossoisoindolin-2 -il)butanoate (35). Il prodotto grezzo è stato purificato per flash cromatografia (r-Esano 5: AcOEt 2) e 35 è stato ottenuto come olio giallo (476 mg, 0,73 mmol, 48%).
<l>H-NMR (CDClj) δ: 1,29 (s, 9H); 1,85 (s, 3H); 2,28-2,39 (m, IH); 2,62-2,72 (m, IH); 3,93 (t, J=7,7 Hz, 2H); 4,64-4,66 (m, 2H) ; 4,88-5,04 (m, IH); 5,12 (s, 2H); 6,79-6,83 (m, 2H); 7,20-7,23 (m, 2H); 7,30-7,33 (m, 3H) ; 7,67-7,72 {m, 2H); 7,83-7,87 (m, 2H).
Gli acidi carbossilici doppiamente deprotetti 36, 37 e gli acidi idrossamici 6, 7 sono stati ottenuti seguendo le procedure riportate precedentemente per i conposti 21-22, 3-4. Acido (R)-2-(4- (but-2-inilossi) fenilsolfonammido )-4-(1,3-diossoisoindolin- 2-il)butanoico (36).
L'acido carbossilico 36 è stato ottenuto come un solido verde (278,3 mg, 0,59 mmol , 94%).
<1>H-NMR (DMSO-de) 5: 1,84 (s, 3H); 1,93-2,08 {m, 2H); 3,56-3,60 (m, 2H); 3,77 {dd, Jl=8,42 Hz, J2=14,46 Hz, IH); 4,82 (s, 2H); 7,03-7,07 (m, 2H); 7,67-7,72 (m, 2H) ; 7,80-7,88 (m, 4H): 8,12-8,17 {m, 2H).
(R) -2-(4- (but-2-inilossi) fenilsolfonammido) -4- (1,3-diossoisoindolin-2-il) -N-idrossibutanamide (6), L'intermedio sililico è stato ottenuto dopo purificazione per flash cromatografia (n-Esano 3: AcOEt 2} come un olio incolore (21,5 mg, 0,037 mmol, 25%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,12 (d, J=2,56 Hz, 6H); 0,94 (s, 9H); 1,86-1,88 (t, J=2,2 Hz, 3H); 1,99-2, 05 (m, IH); 2,63 (s, IH); 3,50-3,78 (m, 3H); 4,65-4,68 (d, J=2,2 Hz, 2H) ; 5,62-5,67 (m, IH); 6,89-6,93 (d, J=9 Hz, 2H); 7,64-7,68 {d, J=9 Hz, 2H); 7,78-7,90 (m, 4H); 9,38 (br s, IH). L'acido idrossamico è stato ottenuto come un solido giallo chiaro (14 mg, 0,03 mmol, 92%).
<1>H-NMR (DMSO-de) δ: 1,67-1,75 (m, 2H); 1,83 (s, 3H); 3,40-3,60 (m, 2H); 3,61-3,72 (m, IH); 4,81 {d, 2H, J=2,2 Hz ); 7,03-7,07 (m, 2H); 7,68-7,77 {m, 2H); 7,84 (s, 4H); 8,05-8,1 (m, IH) 10,60 (s, IH).
“C-NMR (CDC13) 5: 1,82, 31,38, 33,89, 51,88, 55,76, 88,38, 114,27, 122,20, 128,30, 131,57, 133,43, 143,83, 167,04 .
Acido (R)-4-(benzilossicarbonilamino)-2-(4-(but-2-inilossi)fenilsolfonammido )butanoico (37). L'olio viola ottenuto dall'idrolisi è stato purificato per triturazione con π-Esano per dare l'acido carbossilico 37 puro sottoforma di solido bianco (350 mg, 0,76 mmol, 79%).<1>H-KMR (CDC13) δi 1,85 (t, J=2,2 Hz, 3H); 2,12-2,21 (m, IH); 2,34-2,45 (m, IH); 3,13-3,45 (m, 2H); 3,81-3,93 (m, IH); 4,67 (q, J=2,2 Hz, 2H); 5,09 (s, 2H); 5,39 (m, IH); 6,57 (m IH); 6,97-7,04 (m, 2H); 7,34 (s, 5H); 7,74-7,78 (m, 2H).
(R)-benzil 3- (4-(but-2-inilossi)fenilsolfonammido)-4-(idrossiamino) -4-ossobutilcarbammato (7). Il precursore O-Sililico è stato purificato mediante flash cromatografia (n-Esano 2: AcOEt 1) utilizzando una colonna Isolute<®>Si (II) (5 g) (Biotage). {olio incolore, 138,7 mg, 0,24 mmol, 43%).
<1>H-NMR (CDClj) δ: 0,03 (s, 6H); 0,90 (s, 9H); 1,63 (s, 2H) ; 1,85 (t, J=2,2 Hz, 3H); 3,07-3,23 {m, IH); 3,29-3,45 (m, IH); 3,62-3,74 (m, IH); 4,65 (q, J=2,2 Hz, 2H) ; 5,11 (d, J=3,8 Hz, 2H); 5,30-5,38 {m, 1H); 5,80-5,88 (m, IH); 6,91-6,95 (m, 2H); 7,37 (s, 5H); 7,66-7,70 (m, 2H); 9,77 (s, IH).
L'acido idrossamico grezzo 7 (138 mg, 0,234 mmol) è stato triturato con Et20 e n-Esano ed è stato raccolto come un solido bianco (80 mg, 0,17 mmol, 72%).
^-NMR (DMSO-de)δ: 1,50-1,66 (m, 2H); 1,83 (t, J=2,2 Hz, 3H); 2,81-2,90 (m, 2H); 3,50-3,60 {m, IH); 4,82 (s, 2H); 4,99 (s, 2H); 7,05-7,09 (m, 2H); 7,34 {s, 5H); 7,67-7,71 (m, 2H); 7,98-8,02 (m, IH); 8,90 (br S, IH); 10,53 (s, IH).
<13>C-NMR (CDC13) δ: 3,80, 33,22, 37,19, 56,88, 67,18, 73,17, 84,90, 115,36, 128,03, 128,62, 129,25, 131,40, 136,25, 161,39.
R)-benzil 2- (4-(but-2-inilossi)fenilsolfonammido)-4-(1,3-diossoisoindolin-2 -il)butanoato (38). L'estere benzilico 38 è stato ottenuto per deprotezione della Boc-solfonamide 35 con TFA come riportato per i composti 36, 37. Il prodotto grezzo è stato purificato per flash cromatografia {n-Esano 4: AcOEt 1) Isolute<®>Si (II) (10 g) (Biotage) per dare 38 come un composto bianco (248 mg, 0,45 mmol, 63%).
^-NMR (CDCI3) δ: 1,83 (t, J=2,2 Hz, 3H); 2,09-2,20 (m, 2H); 3,65-3,78 (m, IH); 3,84-3,98 (m, IH); 4,03-4,17 (m, IH); 4,66 (d, J=2,2 Hz, 2H); 4,78 (dd, Jl= 12,09 Hz, J2=21,61 Hz, 2H); 5,48 (d, J= 9 Hz, IH); 6,92-6,96 (m, 2H); 7,12-7,17 (m, 2H); 7,29-7,34 (m, 3H);7,68-7,85 {m, 6H).
(R)-benzil 2- (4-(but-2-inilossi)-N-isobutilf enilsolfonammido)-4-(1,3-diossoisoindolin-2-il) butanoato (39)
Ad una soluzione della solfonammide 38 (248 mg, 0,453 mmol) in DMF anidra (7,25 mL), sono stati aggiunti il K2C03(626 mg, 4,53 mmol) e l' 1-iodo-2-metil-propano (0,06 mL, 0,499 mmol). La miscela di reazione è stata agitata per 2 giorni e mezzo, dopodiché è stata diluita con acqua, ed il prodotto è stato estratto con AcOEt. Le fasi organiche sono state poi lavate con brine, seccate su Na2S04ed evaporate, il grezzo è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 2: AcOEt 1) e l'isobutil solfonammide 39 è stata ricavata come un olio giallo (42 mg, 0,07 mmol, 15 %).
<l>H-HMR (CDCI3) δ: 0,73 (d, J=6,5 Hz, 3H); 0,82 (d, J=6,5 Hz, 3H); 1,85 (t, J=2,2 Hz, 3H); 1,96-2,12 (m, 2H); 2,35-2,49 (m, IH); 2,70-2,81( m, IH); 2,93-3,04 ( m, IH); 3,79 (t, J=6,9 HZ, 2H); 4,03-4,17 (m, IH); 4,65 (d, J=2,2 Hz, 2H) ; 4,97 (s, 2H); 6,84-6,88 (m, 2H); 7,33-7,35 {m, 5H); 7,65-7,73 (m, 4H); 7,83-7,85 (m, 2H).
Acido (R)-2-(4-(but-2-inilossi) -N-isobutilfenilsolfonammido )-4- (1,3-diossoisoindolin- 2-il) butanoico (40). Una sospensione di estere benzilico 39 (42 mg, 0,07 mmol) e KOH (11,7 mg, 0,21 mmol) in acqua (1 mL) è stata scaldata a riflusso (80°C) per 4 ore . Dopo raffreddamento la soluzione è stata acidificata con HCl IN, ed il prodotto è stato estratto con CHClj, seccato su Na2SO„ e concentrato in vacuo, per dare l'acido carbossilico puro 40 sottoforma di olio giallo (34,3 mg, 0,07 mmol, 96%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,85 (d, J=6,5 Hz, 3H); 0,94 (d, J=6,5 Hz, 3H) ; 1,85 (t, J=2,2 Hz, 3H); 1,69-2,08 (m, 2H); 2,61-3,21 (m, 4H); 3,77-3,84 (m, IH); 3,92-4,09 (m, IH); 4,65 (d, J=2,2 Hz, 2H); 6,91-6,95 (m, 2H); 7,34-7,42 (m, 3H); 7,58-7,75 (m, 3H).
L'acido idrossamico 8 è stato ottenuto con la stessa procedura utilizzata per i composti 3,4.
(R)-2-(4- (but-2-inilossi )-N-isobutilfenilsolfonammido)-4- (1,3-diossoisoindolin- 2-il) -N-idrossibutanammide (8). L'estere sililico è stato ottenuto dopo purificazione mediante flash cromatografia (n-Esano 2: AcOEt 1) come olio incolore (6,3 mg, 0,01 mmol, 15%).
<1>H-NMR (CDC1,) 5t 0,26 (s, 6H); 0,73 (d, J=6,5 Hz, 3H); 0,83 {d, J=6,5 Hz, 3H); 1,00 (s, 9H); 1,84 (t, J=2,2 Hz, 3H); 1,97-2,07 (m, 2H); 2,35-2,45 (m, IH); 2,71-2,81 { m, IH); 2,93-3,04 (m, IH); 3,80 {t, J=6,9 Hz, 2H) ; 3,98-4,07 (m, IH); 4,66 {d, J=2,2 Hz, 2H); 6,84-6,88 (m, 2H); 7,33-7,35 (m, 4H); 7,66-7,70 (m, 2H); 9,08 (s, IH).
L'acido idrossamico è stato ottenuto come solido beige (3 mg, 0,006 mmol, 55 %) dopo cromatografia a fase inversa (H201: CH3CN 1).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,95 (d, J=6,5 Hz, 3H); 0,89 (d, J=6,5 Hz, 3H); 1,87 (t, J=2,2 Hz, 3H); 1,95-2,05 (m, 2H); 2,32-2,43 (m, IH); 3,01-3,46 (m, 4H); 4,06-4,13 (m, IH); 4,61 (d, J=2,2 Hz, 2H); 6,73-6,77 (m, 2H); 7,56-7,60 (m, 2H); 7,74-7,86 (m, 4H); 9,60 (br s, IH).
<13>C-NMR (CDC13) 5; 3,72, 20,65, 23,10, 25,12, 34,26, 49,41, 51,37, 54,45, 80,82, 83,12, 114,63, 128,12, 132,30, 163,81, 168,75, 169,23.
Analisi elementale ed HPLC
La purezza di tutti i composti finali è stata determinata mediante analisi HPLC utilizzando uno strumento a cromatografia liquida Merck Hitachi D-7000. La purezza HPLC riportata è al di sopra del 95% per tutti i prodotti finali, utilizzando una colonna C18 Discovery (250 ram X 4.6 mm i.d., dp=5 μm, Supelco, Bellefonte, PA, USA), con un gradiente 40% acqua/60% metanolo ad una velocità di flusso di 1.4 mL/min su un periodo di corsa totale di 15 min, monitorando all'UV alla lunghezza d'onda di 242 nm. (vedi dati in tabella sottostante).
(S)-benzil 4-(1,3 -diossoisoindolin- 2 -il)-2-idrossibutanoato (32). L'acido 41 (500 mg, 2,00 mmol) è stato sciolto in DMF anidra (4 mL) in atmosfera di e il Cs2C03{653,7 mg, 2,00 mmol) è stato aggiunto . La soluzione è stata agitata a 0°C per 30' e poi è stato aggiunto il bromuro di benzile (0,24 mL, 2,00 mmol). La reazione è stata mantenuta a 0°C per 30' e poi è stata portata a temperatura ambiente ed agitata per 20 ore . La reazione è stata quenciata conversata in acqua, ed il prodotto è stato estratto con Et20 . Le fasi organiche sono state lavate con acqua e brine , seccate su Na2SO„ ed evaporate. L'estere benzilico è stato ottenuto come olio giallo (570,9 mg, 1,68 mmol, 84%).
<1>H-NMR (CDCI3) 5: 1,99-2,26 (m, 2H); 3,06 (d, J=5,5 Hz, IH); 3,85-3,93 (m, 2H); 4,23-4,31 {m, IH); 5,13 (d, J=3 ,3 Hz, 2H); 7,34 (s, 5H); 7,69-7,76 {m, 2H); 7,81-7,86 (m, 2H).
Metodo generale per la preparazione dei composti 42b-67b .
Ad una soluzione di glicina {68,61 mg, 0,914 mmol) , in una miscela 1:1 di acqua {0,9 mL)e diossano {0,9 mL) contenente la trietilammina (0,25 mL, 1,828 mmol), è stato aggiunto l'opportuno solfonil cloruro (1,83 mmol). La miscela è stata lasciata in agitazione a t ,a . per tutta la notte, dopodiché il diossano è sta to evaporato e il residuo è stato ripreso con AcOEt, lavato con HCl I N, e con una soluzione satura di NaCl e poi con NaHC03soluzione satura. La fase acquosa è stata poi acidificata nuovamente con HCl 1 N fino a pH=4 ed estratta con AcOEt. La fasi organiche sono state raccolte, seccate su Na3S04ed evaporate.
Acido 2-(4-bromofenilsulfonamido)acetico (42a). Solido bianco {446,3 mg, 77%).
<1>H-NMR (DMSO-df) δ: 3,62 (d, J=5,7 Hz, 2H); 7,79-7,74 (m, 2H); 7,77-7,81 (m, 2H); 8,16 (t, J=5,7 Hz, IH).
Acido 2-(4-bromofenil)metilsulfonamido)acetico (43a). Solido bianco (56 mg, 12%).
<1>H-NMR (DMSO-de) 5: 3,66 (d, J=5,9 Hz, 2H); 4,37 {s, 2H); 7,34-7,38 (m, 2H); 7,51 (t, J=5,9 Hz, IH); 7,56-7,60 (m, 2H).
Acido 2-(4-bromo-2-(trifluorometossi) fenilsulfonamido) acetico (44a). Solido bianco (400 mg, 1,06 mmol, 73%).
<1>H-NMR (MeOD-di) δ: 3,85 (s, 2H); 7,64-7,69 (m, 2H); 7,88-7,92 (m, IH).
Acido 2-(4-bromo-3-metilfenilsulfonamido)acetico (45a). Solido bianco (460 mg, 1,49 mmol, 81%).
<1>H-NMR (DMSO-ds) δ: 2,46 (s, 3H); 3,72 (s, 2H); 7,53-7,59 (m, IH); 7,71-7,78 (m, 2H).
Acido 2-(4-acetilfenilsulfonamido)acetico (46a). Solido bianco (360 mg, 1,40 mmol, 61%).
<1>H-NMR (DMSO-ds) δ: 2,63 {s, 3H); 3,64 (d, J=5,68, 2H); 7,90-7,4 (m, 2H); 8,09-8,13 (m, 2H); 8,27 (t, J=5,68, IH) .
Acido 2-(3- (2-metiltiazol-4 -il) fenilsulfonamido) acetico (47a). Solido bianco (73,2 mg, 0,234 mmol, 59%).
^ -NMR (DMSO-d6) δ: 2,74 (s, 3H); 3,62 (d, J=6,23, 2H); 7,59-7,76 (m, 2H); 8,10-8,18 (m, 2H); 8,36 (s, IH).
Acido 2-(5-acetamidopiridin- 2-sulfonamido) acetico (48a). Solido beige (156 mg, 0,57 mmol, 60%).
^ -NMR (DMSO-d^) δ : 2,12 (s, IH); 3,73 (d, J=6,22 Hz, 2H) ; 4,13 (br s, IH); 7,84-7,89 {m, IH); 8,08 (t, J=6 ,22 Hz, IH); 8,22-8,28 (m, IH); 8,76-8,77 (m, IH); 10, 54 (s, IH).
Acido 2- (1-metil -IH-indolo- 7-sulfonamido) acetico (49a). L'acido è stato purificato per triturazione con Et20. Solido verde chiaro (205 mg, 0,76 mmol, 59 %).
<1>H-NMR (MeOD-di) δ: 3,61 (s, 2H); 3,87 (s, 3H); 6,89-6,91 (m, 2H), 7,25-7,32 (m, IH); 7,36-7,37 (m, IH); 7,60 (s, IH); 7,63-7,65 (m, IH); 7,69 (s, IH).
Acido 2 -(1-metil -IH-indolo- 6-sulfonamido) acetico (50a). L'acido è stato purificato per triturazione con EtaO. Solido verde acceso (236 mg, 0,88 mmol, 68 %).
<1>H-NMR (MeOD-d6) δ i3,64 (s, 2H); 3,86 (s, 3H);6,60-6,62 (m, IH); 7,33-7,34 (m, IH); 7,52 (s, IH); 7,64 (m, IH); 7,69 (m, IH); 8,12 (s, IH).
Acido 2-(2,4-dimetossifenilsulfonamido)acetico (51a).
Solido bianco (358 mg, 1,3 mmol, 62%).
<A>H-NMR (DMSO-d6)δ: 3,59 (d, J=5,5 Hz, 2H); 3,83 (s, 3H); 3,85 (s, 3H); 6,56-6,62 (m, IH); 6,67-6,68 (m, IH); 7,30 (t, J=5,5 Hz, IH); 7,60-7,65 (m, IH).
Acido 2- (4-(lH-pirazol-1-il)fenilsulfonamido)acetico (52a). Solido bianco (191,4 mg, 0,68 mmol, 70%).
<1>H-NMR (DMSO-di) δ: 3,61-3,64 (d, J=6,04 Hz, 2H); 6,62 (S, IH); 7,84-7,86 (m, IH); 7,87-7,91 (m, 2H); 8,03-8,07 (m, 2H); 8,06-8,14 (t, J=6,04 Hz, IH); 8,64-8,65 (m, IH).
Acido 2- (4-(pirrolidin-1-ilsulfonil) fenilsulfonami -do)acetico (53a). Solido bianco (208 mg, 0,597 mmol, 62%) .
<1>H-NMR (DMSO-di) δ: 1,66 (s, 4H); 3,17 (s, 4H); 3,68 (d, J=5,31 Hz, 2H); 7,99 (s, 4H); 8,35 (t, J=5,31 Hz, IH).
Acido 2-(4-butossifenilsulfonamido)acetico (54a). Solido bianco, (479 mg, 1,66 mmol, 83%).
<1>H-NMR (DMSO-d*) δ: 0,93 (t, J=6,96 Hz, 3H); 1,38-1,49 (m, 2H); 1,68-1,75 (m, 2H); 3,52 (d, J=5,30 Hz, 2H); 4,04 (t, J=6,23 Hz, 2H); 7,05-7,09 (m, 2H); 7,68-7,72 (m, 2H); 7,83 (t, J=5,30 Hz, IH).
Acido 2-(4-fenossifenilsulfonamido)acetico (55a). Solido bianco, (163 mg, 0,53 mmol, 28%).
<1>H-NMR (DMSO-d*) δ: 3,56 {s, 2H); 7,07-7,15 {m, 4H); 7,21-7,29 {m, 2H); 7,43-7,50 (m, 2H); 7,76-7,80 {m, 2H); 7,91 (br S, IH).
Acido 2-(6-fenossipiridin-3 -sulfonamido)acetico (56a).
Solido bianco, {376,3 mg, 0,89 mmol, 58%).
Acido 2- (4-(5-metillpirazin-2-il-ossi) fenilsulfonamido)acetico (57a). Solido beige (74,6 mg, 0,23 mmol, 52%) .
<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 2,36 (s, 3H); 3,62 (d, J=5,5 Hz, 2H); 7,35-7,39 {m, 2H); 7,82-7,86 (m, 2H); 8,08 (t, J=5,5 Hz, IH); 8,36-8,38 (m, 2H).
Acido 2- {4-(fenossimetil)fenilsulfonamido)acetico (58a). Solido bianco {415 mg, 1,29 mmol, 73%).
^-NMR (DMSO-di) Si 3,59 (s, 2H); 5,19 (s, 2H); 6,93-7,05 {m, 3H); 7,28-7,34 (m, 2H9; 7,62-7,66 (m, 2H); 7,79-7,84 {m, 2H); 8,06 {m, IH).
Acido 2- (4-(benzilossi)fenilsulfonamido)acetico (59a).
Solido bianco (396 mg, 1,11 rranol, 87%).
<1>H-NMR (DMS0-de) 6: 3,53 {d, J=6,04 H2, 2H); 5,18 (s, 2H); 7,15-7,19 (m, 2H); 7,34-7,49 (m, 2H); 7,70-7,74 (m, 2H); 7,87 (t, J=6,04 Hz, IH).
Acido 2-(4-(3-(trifluorometossi) benzilossi) fenilsulfonamido) acetico (60a). Solido bianco {405 mg, 0,99 mmol, 75%).
<X>H-NMR (DMSO-di) δ: 3,53 (d, J=6,04 Hz, 2H); 5,25 (s, 2H) ; 7,16-7,20 (m, 2H); 7,34-7,37 (m, IH); 7,49-7,60 (m, 3H); 7,71-7,75 {m, 2H); 7,89 (t, J=6,04 Hz, IH). Acido 2-(4-(4-(trìfluorometossi) benzilossi) fenilsulfonamido) acetico (61a). Solido bianco {368 mg, 0,91 mmol , 80%).
<1>H-NKR (DMSO-de) S: 3,53 (d, J=5,67 Hz, 2H); 5,22 (s, 2H) ; 7,15-7,19 (m, 2H); 7,39-7,43 {m, 2H); 7,58-7,62 {m, 2H); 7,71-7,75 (m, 2H); 7,89 (t, J=5,67 Hz, IH). Acido 2- (4-(3-fluorobenzilossi)fenilsulfonamido)acetico (62a). Solido bianco {362 mg, 1,06 mmol, 76%).
<1>H-NMR (MeOD-d$) δ: 3,67 (s, 2H); 5,1 {s, 2H); 7,03-7,29 (m, 5H); 7,35-7,46 (m, IH); 7,78-7,82 {m, 2H).
Acido 2- (4-(4-fluorobenzilossi)fenilsulfonamido)acetico (63a). Solido bianco {428 mg, 1,26 mmol, 73%).
<1>H-NMH (DMSO-ds) δ: 3,53 (d, J=6,04 Hz, 2H); 5,16 (s, 2H); 7,14-7,18 (m, 2H); 7,24-7,28 (m, 2H); 7,49-7,56 (m, 2H); 7,70-7,74 (m, 2H); 7,89 (t, J=6,04 Hz, IH). Acido 2-(4-(3,5-difluorobenzilossi) fenilsulfonamido) acetico (64a). Solido bianco (428 mg, 1,20 mmol, 81%).
<1>H-NMR (DMSO-ds) δ: 3,53 {d, J=5,13 Hz, 2H); 5,22 (s, 2H); 7,16-7,22 (m, 5H); 7,72-7,75 (m, 2H); 7,89 (t, J=5,13 Hz, IH).
Acido 2-(4- (4-bromobenzilossi)fenilsulfonamido)acetico (65a). Solido bianco (214 mg, 0,54 mmol, 88%).
<1>H-NMR (DMSO-de) δ; 3,53 (d, J=5,86 Hz, 2H); 5,18 (s, 2H) ; 7,15-7,19 (m, 2H); 7,41-7,45 (m, 2H); 7,60-7,64 (m, 2H); 7,71-7,75 {m, 2H); 7,89 (t, J=5,86 Hz, IH). Acido 2- (4-(bifenil-3-ilmetossi) fenilsulfonamido)acetico (66a)*Solido bianco (254 mg, 0,64 mmol, 60%).
<l>H-NMR (MeOD-di) 5: 3,64 (s, 2H); 5,17 (s, 2H); 7,15-7,19 (m, 2H); 7,29-7,48 (m, 6H); 7,58-7,65 (m, 3H); 7,70 (s, IH); 7,79-7,83 (m, 2H).
Acido 2- (4-(chinolin-8-ilmetossi)fenilsulfonamido)acetico (67a). Solido bianco (142 mg, 0,64 mmol, 72%).
<1>H-NMR (Acetone-d*) 6: 3,65 (s, 2H); 5,84 (s, 2H); 7,18-7,22 (m, 2H); 7,57-7,67 (m, 2H); 7,77-7,81 (m, 2H); 7,92-7,97 (m, 2H); 8,40-8,45 (m, IH); 8,93-8,95 (m, IH).
Gli acidi carbossilici 42a-67a (0,325 mmol) sono stati sospesi in CH2C12anidro e vi sono stati aggiunti la 0-(tert-butildimetil-silil)idrossilammina (47,9 mg 0,325 mmol,) 1'N-Etil-N '-(3-dimetillamminopropil)carbodiimide cloridrato (93,5 mg, 0,488 mmol). Le reazioni sono state lasciate in agitazione a t.a. per tutta la notte, e poi sono state diluite con CH2C12, lavate (x3) con acqua, seccate su Na2S04and evaporate. I precursori sililicì (0,06 mmol) sono stati poi disciolti in CH2C12anidro (0,4 mi) e il TFA (0,22 mL, 2,8 mmol) è stato ag giunto 0°C. Dopo 5 ore d'agitazione il TFA è stato evaporato per dare gli idrossamati desiderati 42b-67b.
2- (4-bromofenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (42b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 4: AcOEt 1} ed è stato ottenuto un solido bianco (90 mg, 0,212 mmol, 26%)*
<:>H-NMR (CDC13) 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,71 (br
S, 2H);5,37 (br S, IH); 7,63-7,67 (m, 2H); 7,71-7,75 (m, 2H).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20. Solido bianco (53,8 mg, 0,17 mmol, 87%).
<1>H-NMR (Acetone-di) 5: 3,62 (s, 2H); 6,86 (br s, 2H) 7,74-7,84 (m, 4H), 10,11 (br S, IH).
<13>C-NMR (Acetone-df) δι 44,55, 130,04, 133,28, 165,80. 2-( (4-bromofeniI)metilsulfonamido )-N-idrossiacetamide (43b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio giallo (45 mg, 0,103 mmol, 33%).
<1>H-NMR (CDC1<3>) δ: 0,17 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,67 (br
S, 2H);4,27 (s, 2H); 4,94 (br s, IH); 7,30-7,34 (m, 2H); 7,50-7,54 (m, 2H).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20. Solido bianco (24,5 mg, 0,076 mmol, 84%).
<1>H-NMR (DMSO-di) δι 3,49 (s, 2H); 4,39 (s, 2H); 7,35-7,39 (m, 2H); 7,42 (br S,1H); 7,55-7,59 (m, 2H); 8,94 (br s, IH); 10,60 (br s, IH).
<13>C-NMR (DMSO-dfi) 5: 43,18, 57,38, 121,40, 129,74, 131,10, 132,93, 165,17.
2- (4-bromo-2-(trifluorometossi)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (44b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio giallo {114 mg, 0,224 mmol, 42%),
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g {CHCl39: MeOH 1). Solido bianco (44,5 mg, 0,113 mmol, 53%).<1>H-NMR (DMSO-dj) 5: 3,50 (s, 2H); 7,76-7,87 (m, 3H); 8,28 (br s, IH); 8,85 (br S, IH); 10,52 {br s, IH).
<13>C-NMR (MeOD-di) δ: 44,23, 118,96, 125,09, 128,66, 131,27, 132,70, 133,52, 147,47, 167,41.
2- (4-bromo-3-metilfenilsulfonami N-idrossiacetamide (45b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 3: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (137 mg, 0,313 mmol, 48%).
<1>H-NMR (CDC13) δϊ 0,14 (s, 6H); 0,93 (s, 9H); 2,45 (s, 3H) ; 3,59 (br S, IH); 3,82 (br 8, IH); 5,41 (br s, IH); 7,48-7,53 {m, IH); 7,76-7,70 (m, 2H); 8,42 (br S, IH). Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con n-Esano/Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHClj9: MeOH 1). Solido bianco (36 mg, 0,111 mmol, 38%).
<1>H-NMR (MeOD-de) δ: 2,46 (s, 3H); 3,50 (d, J=4,76, 2H); 7,50-7,58 (m, IH); 7,71-7,77 (m, 2H).
“C-NMR (MeOD-d*) δϊ 23,07, 4,49, 126,97, 130,05, 130,65, 134,14, 140,55, 167,46.
2- (4-acetilfenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (46b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (101 mg, 0,261 mmol, 35%).
<l>H-NMR (CDCI3)δ: 0,14 (s, 6H); 0,93 (s, 9H); 2,65 (s, 3H); 3,65 {br S, IH); 3,84 {br S, IH); 5,45 (t, J=5,13, IH); 7,93-7,98 (m, 2H); 8,06-8,10 (m, 2H).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 10 g (CHClj9: MeOH 1). Solido bianco (32 mg, 0,118 mmol, 45%).
<1>H-NMR (DMSO-di) δ: 2,63 (s, 3H); 3,37 (s, 2H); 7,90-7,94 (m, 2H); 8,10-8,14 (m, 2H); 8,86 (br s, IH); 10,54 (br s, IH).
<13>C-NMR (MeOD-ds) δ: 26,95, 44,43, 128,33, 130,00, 141,28, 145,25, 167,34, 198,98.
N-idrossi-2- (3-(2-metiltiazol-4-il) fenilsulfonamido) acetamide (471b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 5: AcOEt 2) ed è stato ottenuto un olio incolore (48,6 mg, 0,11 mmol, 49%).
<1>H-HMR (CDC13) δ: 0,12 (s, 6H); 0,91 (s, 9H); 2,77 (s, 3H); 3,62 (br s, IH); 3,87 {br S, IH); 5,44 (t, J=5,68, IH); 7,44 (s, IH); 7,52-7,93 (m, IH); 7,77-7,80 (m, IH); 8,08-8,12 (m, 1 H); 8,35 (s, IH); 8,68 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20. Solido bianco (26,2 mg, 0,08 mmol, 80%).
<1>H-NMR (Acetone-d6) δ: 2,75 (s, 3H); 3,61 (d, J=5,5 Hz, 2H); 6,84 (br S, IH); 7,60-7,68 (m, IH); 7,81-7,85 (m, IH); 7,94 (s, IH); 8,19-8,23 (m, iH); 8,48 (s, IH).
<13>C-NMR (Acetone-de) δ; 19,81, 40,7, 110,61, 124,02, 129,61, 130,72, 140,25, 151,93, 166,0, 170,21.
2-(5-acetamidopiridin-2-sulfonamido)-N-idrossiacetamide. (48b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia (CHC1318: MeOH 1) ed è stato ottenuto un solido beige (12 mg, 0,03 mmol, 5%).
<1>H-NME (CDC13) δ: 0,14 (s, 6H); 0,91 (s, 9H); 2,21 (s, 3H) ; 3,80 (br S, 2H); 6,46 (br S, IH); 7,83-7,87 (m, IH) ; 8,32-8,35 (m, IH); 8,60 (s, IH); 8,85 (br S, IH), 9,65 (br S, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHC139: MeOH 1). Solido bianco (4 mg, 0,014 mmol, 46%).
<1>H-NMR (MeOD-di) δ: 2,19 (s, 3H); 3,73 (s, 2H); 7,91-7,96 (m, IH); 8,27-8,33 (m, IH); 8,82-8,84 (m, IH).
<1Ì>C-NMR (MeOD-ds) δ: 22,91, 41,27, 120,73, 127,36, 141,25, 149,17, 154,91, 166,02, 168,94.
N-idrossi -2-(1-metil-IH-indolo-7-sulfonamido)acetamide (49b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 3: AcOEt 2) ed è stato ottenuto un olio giallo (136,6 mg, 0,343 mmol, 48%).
<1>H-NMR (CDCI3) δ: 0,11 (s, 6H); 0,92 (s, 9H); 3,52 (br S, 2H); 3,87 (s, 3H); 5,21 (br S, IH); 6,90 (s, IH); 7,24-7,34 (m, 2H); 7,56-7,60 (m, IH); 7,67-7,71 (m, IH); 8,50 (br S, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHCl312: MeOH 1). Olio giallo (36 mg, 0,127 mmol, 39%).
<1>H-NMR (MeOD-d*) δ: 3,31 (s, 2H); 3,74 (s, 3H); 6,78 (s, IH); 7,14-7,22 (m, IH); 7,25 (s, IH); 7,49-7,59 (m, 2H).
<13>C-NMR (MeOD-di) δ: 40,72, 42,13, 102,73, 120,93, 122,34, 122,77, 129,11, 136,21, 166,03.
N-idrossi-2 -(1-metil-lH-indolo-6-sulfonamido)acetamide (50b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 3: AcOEt 2) ed è stato ottenuto un olio incolore (60 mg, 0,15 mmol, 41%).
<L>H-NMR (CDClj) δ: 0,12 (s, 6H); 0,93 (s, 9H); 3,56 (br S, 2H); 3,85 (s, 3H); 5,15 (br S, IH); 6,60-6,62 (m, IH); 7,19-7,20 (m, IH); 7,39-7,43 (m, IH); 7,65-7,69 (m, IH); 8,18 (s, IH); 8,59 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 10 g (CHC139: MeOH 1) e a triturazione con Et20. Solido bianco (15 mg, 0,127 mmol, 37%).
<1>H-NMR (Acetone-ds) δ: 3,50 (s, 2H); 3,91 (s, 3H); 6,47 (br S, IH); 6,63-6,65 (m, IH); 7,42-7,43 (m, IH); 7,55-7,70 (m, 2H); 8,15 (s, IH).
<13>C-NMH (Acetone-df) 6s 33,45, 44,90, 103,26, 111,03, 120,75, 122,07, 128,90, 131,40, 132,75, 139,45.
2-(2,4-dimetossifenilsulfonamido) -N-idrossiacetamide (51b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (π-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (61 mg, 0,15 mmol, 24%).
<1>H-NMH (CDC13) δ: 0,16 (s, 6H); 0,95 (s, 9H); 3,53 (br
S, 2H); 3,95 (s, 3H); 3,96 (s, 3H); 6,29 (m, IH); 6,52-6,56 (m, 2H); 7,77-7,82 (m, IH); 8,57 (br s, IH).
11 prodotto finale è stato ottenuto in seguito purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHC139: MeOH 1). Solido bianco (17 mg, 0,06 mmol, 47%).
<1>H-NMR (Acetone-d$) S: 3,48 (br s, 2H); 3,89 (s, 3H); 3,96 (s, 3H); 6,12 (br s, IH); 6,61-6,66 (m, 2H); 6,71-6,72 (m, IH); 7,79-7,74 (m, IH).
<13>C-NMR (Acetone-de) 6: 44,79, 56,41, 56,95, 100,20, 105,81, 120,30, 132,54, 159,28, 166,04.
2- (4-(lH-pirazol-l-il)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (52b). L'intermedio 0-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 3: AcOEt 2) ed è stato ottenuto un solido bianco (147 mg, 0,36 mmol, 56%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 0,04 (s, 6H); 0,85 (s, 9H); 3,33 (s, 2H); 6,62 (s, IH); 7,83-7,90 (m, 4H); 8,03-8,07 (m, 2H); 8,64 (s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g {CH2Cl29: MeOH 1), Solido bianco (47 mg, 0,16 mmol, 49%).
<1>H-NMR (DMSO-di) δ: 3,35 (s, 2H); 6,62 (s, IH);7,83-7,86 (m, IH); 7,87-7,92 (m, 2H) ; 8,04-8,08 (m, 2H); 8,64-8,65 (m, IH); 8,79 (br s, 1 H).
<13>C-NMR (DMSO-ds) δ : 43,07, 108,73, 118,23, 128,29, 137,32, 141,99, 142,09, 164,19.
N-idrossi-2- (4-(pirrolidin-l-ilsulfonil) fenilsulfonamido) acetamide (53b) . L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (43 mg, 0,09 mmol, 15%).
<1>H-NMR (CDC13) 5:0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 1,77-1,84 (m, 4H) ; 3,24-3,31 (m, 2H); 3,70 (br s, IH); 3,89 (br s, IH); 5,45 (br S, IH); 7,94-7,98 (m, 2H>; 8,00-8,04 (m, 2H). Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20. (Solido bianco, 27,2 mg, 0,075 mmol, 94%).
1H-NMR (DMSO-dg) 5 : 1,60-1,77 (m, 4H); 3,14-3,20 (m, 4H) ; 3,40 (s, 2H); 8,00 (s, 4H); 8,30 (br S, IH); 8,85 (br s, IH); 10,54 (br S, IH).
<13>C-NMR (DMSO-df) 5: 24,77, 42,94, 47,89, 127,54, 127,98, 131,34, 139,43, 144,22, 163,99.
2- (4-butossifenilsulfonamido) -N-idrossiacetamìde (54b).
L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (224,7 mg, 0,54 trarrai, 57%).
<1>H-NMR (CDCl3) 5:0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 0,98 (t, J=7,32 Hz, 3H); 1,41-1,59 (m, 2H); 1,68-1,86 (m, 2H); 3,58 (br S, IH); 3,78 (br S, IH); 4,01 (t, J=6,4 Hz, 2H); 5,15 (br s, IH); 6,94-6,99 (m, 2H); 7,74-7,79 (m, 2H); 8,45 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et2O e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHaCla9: MeOH 1), Solido bianco (71 mg, 0,24 mmol, 45%).
<3>H-NMR (MeOD-d*) 5: 0,99 (t, J=7,32 Hz, 3H); 1,42-1,60 (m, 2H); 1,72-1,85 (m, 2H); 3,46 (s, 2H); 4,06 (t, J=6,23 Hz, 2H); 7,03-7,07 (m, 2H); 7,75-7,79 (m, 2H).<13>C-NMR (MeOD-d*) 5: 14,15, 20,25, 32,29, 44,63, 69,23, 115,73, 130,25, 164,02.
N-idrossi-2- (4-fenossifenilsulfonamido)acetamide (55b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 3: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco cristallino (64 mg, 0,15 mmol, 28%).
<l>H-KMR (CDC13) 5: 0,16 (s, 6H); 0,95 (s, 9H); 3,60 (brS, IH); 3,77 (br s, IH); 5,23 (br s, IH); 7,02-7,09 (m, 4H); 7,18-7,31 (m, IH); 7,38-7,43 (m, 2H); 7,77-7,81 (m, 2H); 8,43 (br S, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CH2C1218: MeOH 1). Solido bianco (15 mg, 0,05 mmol, 32%).
<1>H-NMR (Acetone-d6) δ: 3,58 (s, 2H); 3,93 (br S, IH); 7,08-7,16 (m, 4H); 7,22-7,29 (m, IH); 7,43-7,51 (m, 2H); 7,85-7,89 (m, 2H).
<13>C-NMR (Acetone-df) δ: 44,40, 118,44, 120,88, 125,58, 130,28, 131,04, 156,33, 162,03.
N-idrossi-2- (6-fenossipiridin-3-sulfonamido) acetamide (56b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (180 mg, 0,41 mmol, 51%).
<1>H-NMR (CDC13)δι 0,16 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,61 ((br S, IH); 3,85 (br s, IH); 5,52 (br S, IH); 6,99-7,03 (m, 2H); 7,12-7,17 (m, 2H);7,24-7,31 (m, IH); 7,41-7,48 (m, IH); 7,86 (br s, IH); 8,07-8,12 (m, IH); 8,39 (br s, IH); 8,61-8,62 (m, IH).
11 prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 ed n-Esano e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHC1318: MeOH 1). Solido bianco (36,8 mg, 0,05 mmol, 32%).
<1>H-NMR (DMSO-ds) δι 3,66 (s, 2H); 6,93 {br s, IH); 7,11-7,31 (m, 4H); 7,42-7,50 {m, 2H); 8,21-8,26 (m, IH); 8,54 {m, IH); 9,45 {br s, IH); 10,13 (br s, IH).
<13>C-NMR (Acetone-d() δ: 45,04, 113,23, 123,26, 126,92, 131,38, 140,53, 148,75, 155,17, 167,42.
N-ldrossi-2- (4-(5-metilpirazin-2-il-ossi) fenilsulfonamido) acetamide (57b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 2: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco {36 mg, 0,08 mmol, 37%).
<1>H-HMR (CDC13)δ: 0,17 (s, 6H); 0,95 (s, 9H); 2,44 (s, 3H) ; 3,63 {br s, IH); 3,85 (br S, IH); 5,24 {br S, IH); 7,27-7,32 {m, 3H); 7,87-7,92 (m, 2H); 8,25 (s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con n-Esano. Solido bianco (21,9 mg, 0,06 mmol, 65%).
<1>H-NMR (Acetone-di) δ: 2,39 (s, 3H); 3,60 {s, 2H); 6,78 {br s, IH); 7,38-7,42 (m, 2H); 7,93-7,97 {m, 2H); 8,31 {m, IH); 10,17 (br S, IH).
<13>C-NMR (Acetone-df) 6: 24,81, 40,73, 121,65, 128,32, 135, 63, 137,92, 142,61, 148,43, 155,81, 158,42, 166,01.
N-idrossi-2- (4-(fenossimetil)fenilsulfonamido)acetamide (58b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g {n-Esano 3: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (120,6 mg, 0,27 mmol, 34%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,60 (br S, IH); 3,82 (br S, IH); 5,14 (s, 2H); 5,35 (br S, IH); 6,94-7,03 (m, 3H); 7,31-7,35 (m, 2h); 7,58-7,62 (m, 2H); 7,85-7,90 (m, 2H); 8,45 (br S, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHC1318: MeOH 1). Solido bianco (38 mg, 0,113 mmol, 46%).<1>H-NMR (DMSO-de) δ: 3,32 (s, 2H); 5,20 (s, 2H); 6,92-7,04 (m, 3H); 7,27-7,35 (m, 2H); 7,62-7,66 (m, 2H); 7,80-7,84 (m, 2H); 8,83 (br S, IH); 10,15 (br S, IH).<13>C-HMR (DMS0-de) δ: 43,07, 68,21, 114,70, 120,89, 126,66, 127,74, 129,47, 139,54, 141,75, 157,95, 164,19.
2-(4- (benzilossi)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (59b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 3: AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (184,7 mg, 0,38 mmol, 45%).
<1>H-NMR (CDC13) δι 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,57 (br S, IH); 3,77 (br S, IH); 5,12 (s, 2H); 5,19 (br s, IH); 7,03-7,07 (m, 2H); 7,76-7,80 (m, 2H); 8,50 (br s, IH).
11 prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20. Solido bianco (117 mg, 0,35 mmol, 95%).<1>H-NMR (DMSO-dj) δ: 3,27 (d, J=5,31 Hz, 2H); 5,19 (s, 2H); 7,16-7,20 (m, 2H); 7,35-7,45 (m, 5H); 7,72-7,76 (m, 2H); 7,80 <t, J=5,31 Hz, IH); 10,10 (br s, IH); 10,53 (s, IH).
<13>C-NMR (DMSO-d6)5: 43,13, 69,62, 114,96, 127,81, 128,03, 128,45, 128,70, 132,04, 135,46, 136,28, 161,15. N-idrossi-2-(4-(3-(trifluorometossi) benzilossi) fenilsulfonamido) acetamide (60b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio incolore {187,7 mg, 0,35 mmol, 41%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,57 (br S, IH); 3,77 (br s, IH); 5,13 (s, 2H); 7,03-7,07 (m, 2H); 7,20-7,48 (m, 4H); 7,79-7,83 {m, 2H); 8,44 (brs, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CHCl336: MeOH l). Solido bianco (59 mg, 0,14 mmol, 42%).
<1>H-NMR (DMSO-di) δ: 3,27 (d, J=5,31 Hz, 2H); 5,25 (s, 2H); 7,17-7,21 (m, 2H); 7,31-7,38 (m, IH); 7,48-7,56 (m, 3H); 7,72-7,76 (m, 2H); 9,04 (br s, 2H).
<n>C-NMR (DMS0-de) δ: 3,65, 29,07, 75,44, 80,54, 80,96, 87,20, 89,19, 91,00, 92,77, 99,62, 108,83, 121,34, 124,67. N-idrossi-2-(4-(4-(trifluorometossi) benzilossi) fenilsulfonamido) acetamide (61b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 2 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (172 mg, 0,35 mmol, 52%).
<1>H-NMR (CDClj) δ: 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,58 (br S, IH); 3,79 (br s, IH); 5,11 (s, 2H); 7,03-7,07 (m, 2H); 7,24-7,27 (m, 2H); 7,44-7,48 (m, 2H); 7,78-7,82 (m, 2H); 8,41 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con n-Esano. Solido bianco (116 mg, 0,28 mmol, 87%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) δι 3,28 {d, J=6,04 Hz, 2H); 5,23 (s, 2H); 7,16-7,20 (m, 2H); 7,39-7,43 (m, 2H); 7,59-7,63 (m, 2H); 7,72-7,76 (m, 2H); 7,82 (t, J=6,04 Hz, IH); 8,88 (br s, IH); 10,54 (br s, IH).
<1Ì>C-NMR (DMSO-df) δ: 43,11, 68,65, 114,94, 121,06, 128,72, 129,69, 132,22, 135,82, 147,90, 160,95, 164,28.
2-(4- (3-fluorobenzilossi)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetaraide (62b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 3 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (284 mg, 0,61 mmol, 57%).
<X>H-NMR (CDC13) δ; 0,14 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,57 (br S, IH); 3,79 (br s, IH); 5,12 (s, 2H); 5,28 (br S, IH); 7,02-7,20 (m, 5H); 7,32-7,43 (m, IH); 7,77-7,82 (m, 2H), 8,53 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et30 e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 10 g {n-Esano 2 : AcOEt 3). Solido giallo {93 mg, 0,26 mmol, 45%).
<1>H-NMR (DMSO-de) δι 3,27 (s, 2H); 5,21 (s, 2H); 7,16-7,20 (m, 3H); 7,29-7,32 (m, 2H); 7,41-7,51 (m, IH); 7,72-7,76 (m, 2H); 9,04 (br s, IH).
<13>C-NMR (DMSO-d*) δ: 43,13, 68,73, 114,14, 114,57, 114,97, 123,61, 123,66, 128,70, 130,42, 130,58, 132,22, 139,12, 139,26, 159,64, 160,90, 164,50.
2- (4-(4-fluorobenzilossi)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (63b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g {n-Esano 2 : AcOEt l) ed è stato ottenuto un solido bianco (150 mg, 0,32 mmol, 26%).
<1>H-NMR (CDC13) 6: 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,57 (br S, IH); 3,79 (br S, IH); 5,08 (s, 2H); 5,28 (br s, IH); 7,02-7,14 (m, 4H); 7,37-7,43 (m, 2H); 7,77-7,82 (m, 2H); 8,43 (br S, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto puro in seguitoper purificazione mediante flash cromatografia eseguita consu cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2 : AcOEt 3), Solido bianco (38 mg, 0,11 mmol, 36%).
<1>H-NMR (DMSO-de) δ: 3,27 (d, J=5,9 Hz, 2H); 5,17 (s, 2H); 7,15-7,19 (m, 2H); 7,24-7,28 (m, 2H); 7,49-7,56(m, 2H); 7,71-7,75 (m, 2H); 7,81 (t, J=5,9 Hz, IH); 8,87 (br s, IH); 10,53 (br s, IH).
<13>C-NMH (DMSO-d*) δJ 40,71, 70,83, 114,61, 115,73, 128,34, 128,75, 132,09, 136,84, 161,82, 163,74, 166,68.
2- (4-(3,5-difluorobenzilossi)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (64b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 2 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (159 mg, 0,33 mmol, 53%).
<1>H-NMR (CDCla) δ: 0,15 (s, 6H); 0,94 {s, 9H); 3,59 (br S, IH); 3,79 (br S, IH); 5,10 (s, 2H); 5,23 {br S, IH); 6,74-6,83 (m, IH); 6,94-7,06 (m, 4H); 7,79-7,83 (m, 2H); 8,41 (br S, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et2O. Solido bianco (100 mg, 0,27 mmol, 85%).<1>H-NMR (DMS0-ds)δι 3,27 (d, J=6,04 Hz, 2H); 5,23 (s, 2H); 7,16-7,27 <m, 5H); 7,72-7,76 (m, 2H); 7,83 (t, J=6,04 Hz, 2H); 10,54 (br s, IH).
<n>C-NMR (DMSO-di) δ: 43,11, 68,18, 103,38, 110,33, 110,82, 114,99, 128,74, 132,42, 160,70, 164,26.
2-(4- (4-bromobenzìlossi)fenilsulfonamido)-N-idrossiacetamide (65b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 2 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco {115 mg, 0,33 mmol, 43%).
<1>H-NMR (CDClj) δ: 0,15 (s, 6H); 0,94 (s, 9H); 3,57 (br S, IH); 3,77 (br S, IH); 5,01 (s, 2H); 5,24 (br S, IH); 7,01-7,05 (m, 2H); 7,27-7,31 (m, 2H}; 7,51-7,55 {m, 2H} ; 7,77-7,81 (m, 2H);8,43 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20. Solido bianco (67 mg, 0,16 mmol, 85%).
<X>H-NMR (DMSO-d() 6: 3,27 (d, J=5,31 Hz, 2H); 5,18 (s, 2H); 7,15-7,19 (m, 2H); 7,41-7,45 (m, 2H); 7,59-7,63 (m, 2H); 7,71-7,75 (m, 2H); 8,86 (br s, IH); 10,53 (br S, IH).
<13>C-NMR (DMSO-d6) 5: 43,11, 68,78, 114,98, 121,15, 128,70, 129,91, 131,38, 132,18, 135,77, 160,93, 164,28.
2- (4-(bifenil-3-illmetossi)fenilsulfonamido )-N-idrossiacetamide (66b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 3 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio incolore (70 mg, 0,13 mmol, 21%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,14 (s, 6H); 0,93 (s, 9H); 3,58 (br S, IH); 3,78 (br S, IH); 5,17 (s, 2H); 5,61 (br s, IH); 7,05-7,09 (m, 2H); 7,36-7,51 (m, 5H); 7,57-7,64 (m, 4H) ; 7,77-7,81 (m, 2H);8,84 (br s, IH).
Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20/n-Esano e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (n-Esano 2 : AcOEt 3). Solido spumoso rosa (27 mg, 0,07 mmol, 50%).
<1>H-NMR (DMSO- d6) δ: 3,26 (s, 2H); 5,27 (s, 2H); 7,19-7,23 (m, 2H); 7,37-7,51 (m, 5H); 7,62-7,76 (m, 6H).
<13>C-NMR (DMSO-de) δ: 43,13, 69,58, 114,99, 126,19, 126,37, 126,68,126,86, 127,55, 128,72, 128,92, 129,12, 132,05, 137,03, 139,77, 140,34, 161,15, 164,26.
N-idrossi-2- (4-(chinolin-8-ilmetossi) fenilsulfonamido)acetamide (67b). L'intermedio O-sililato è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia I-solute Si (II) 10 g (n-Esano 1 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un olio incolore (26 mg, 0,05 mmol, 15%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 0,14 (s, 6H); 0,92 (s, 9H); 3,56 (br s, IH); 3,80 {br S, IH); 5,55 (br S, IH); 5,88 (s, 2H); 7,13-7,17 (m, 2H); 7,43-7,60 (m, 2H); 7,75-7,88 (m, 2H); 8,17-8,22 (m, IH); 8,85 (br s, IH); 8,92-8,95 (m, IH). Il prodotto finale è stato ottenuto in seguito a triturazione con Et20/n-Esano e purificazione mediante flash cromatografia eseguita con cartuccia Isolute Si (II) 5 g (CH2Cl318: MeOH 1). Solido bianco (14 mg, 0,04 mmol, 70%),<1>H-NMR (DMSO-di) δι 3,29 (s, 2H); 5,82 (s, 2H); 7,22-7,26 (m, 2H); 7,59-7,68 (m, 2H); 7,73-7,77 (m, 2H); 7,88-7,92 (m, IH); 7,99-8,02 (m, IH); 8,42-8,46 (m, IH); 8,91 (br S, IH); 8,96-8,98 (m, IH); 10,56 (br s, IH).
<13>C-NMR (DMSO-df) δ: 43,14, 66,05, 114,90, 121,73, 126,30, 128,25, 128,43, 128,80, 131,99, 133,78, 136,48, 145,18, 150,15, 161,41, 164,34.
Metodo generale per la preparazione dei solfonilcloruri 69a-i.
Ad una soluzione di 4-idrossi-benzensolfonato sale sodico {607 rag, 2,61 mmol) in isopropanolo (11,75 mL), contenente una soluzione dì NaOH IN preparata di fresco (2,61 mL) sono stati aggiunti gli opportuni benzilbromuri (3,92 mmol). Le reazioni sono state scaldate a riflusso (70°C) per tutta la notte. L'isopropanolo è stato poi evaporato, ed il precipitato è stato raccolto per filtrazione, lavato con isopropanolo ed il solido è stato seccato in vacuo per dare gli intermedi 68a-i. 4-benzilossibenzensolfonato sale sodico (68a). Solido bianco (958,4 mg, 2,97 mmol, 69%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) 6; 5,11 {s, 2H); 6,91-6,96 (m, 2H); 7,36-7,55 (m, 7H).
4-(Fenossimetil)-3-(trifluorometossi)benzensolfonato sale sodico (68b). Solido bianco (644 mg, 1,58 mmol, 61%).<1>H-NMR (DMS0-de) 6: 5,18 (s, 2H); 6,92-6,96 (m, 2H); 7,31-7,34 (m, IH); 7,44-7,54 (m, 5H).
4-(fenossimetil)-4-(trifluorometossi)benzensolfonato sale sodico (68c). Solido bianco (729 mg, 1,79 mmol, 69%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) 5: 5,14 (s, 2H); 7,36-7,42 (m, 4H); 7,50-7,59 (m, 4H).
4-(fenossimetil)-3 -(fluoro)benzensolfonato sale sodico (68d). Solido bianco {784 mg, 2,30 mmol, 65%).
<1>H-NMR (DMSO-d*) δ: 5,14 (s, 2H); 6,92-6,96 (m, 2H); 7,11-7,20 (m, IH); 7,26-7,30 (m, 2H); 7,38-7,46 (m, IH) ; 7,50-7,54 {m, 2H).
4- (fenossimetil)-4-(fluoro)benzensolfonato sale sodico (68e). Solido bianco {797 mg, 2,62 mmol, 74%).
<l>H-Mffi (DMSO-d5) δϊ 5,08 {s, 2H); 6,90-6,96 (m, 2H); 7,18-7,26 (m, 2H); 7,37-7,52 (m, 4H).
3,5-difluoro-4 -(fenossimetil) benzensolfonato sale sodico (68f). Solido bianco (797 mg, 2,22 mmol, 69%).
<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 5,15 (s, 2H); 6,92-6,96 (m, 2H); 7,15-7,19 (m, 3H); 7,50-7,54 (m, 2H).
4- (fenossimetil)-4-(bromo)benzensolfonato sale sodico (68g). Solido bianco (854 mg, 2,13 mmol, 79%).
<1>H-NMR (DMSO-df)5: 5,10 (s, 2H); 7,38-7,42 (m, 4H); 7,49-7,60 (m, 4H).
4-(fenossimetil) -3-(fenil)benzensolfonato sale sodico (68h). Solido bianco (665 mg, 1,67 mmol, 62%).
<l>H-ram (DMSO-d^) δι 5,19 (s, 2H); 6,95-6,99 (m, 2H); 7,34-7,55 (m, 7H); 7,61-7,74 (m, 4H).
4- (chinolin-8-illmetossi)benzenesolfonato sale sodico (68i), Solido giallo (900 mg, 2,41 mmol, 80%).
‘H-NMR (MeOD-de) δ: 5,79 (s, 2H); 7,75-8,16 (m, 5H); 8,88-8,96 (m, IH); 9,01-9,09 (m, IH).
Ad una soluzione di cloruro di ossalile (0,47 mi, 5,58 mmol) in CH2Cl2anidro (2 mL) a 0°C in atmosfera di Ar gon, è stata aggiunta goccia a goccia la N,N-dimetilformammide anidra (0,43 mL, 5,58 mmol) e poi gli opportuni sali sodici dei benzilossìbenzen-derivati 68a-i (1,86 mmol). Le reazioni sono state mantenute in agitazione a 0°C per 10' e poi a t.a, per 2 giorni. Il grezzo di reazione è stato versato nel ghiaccio ed estratto con AcOEt, Le fasi organiche sono state lavate con acqua, seccate su Na2S04, filtrate ed evaporate in vacua , per dare i solfonilcloruri desiderati 69a-i.
4- (benzilossi)benzene-l-solfonilcloruro (69a). Solido bianco (430 mg, 1,52 mmol, 82%),
<1>H-NMR (CDC13) 5: 5,18 (s, 2H); 7,09-7,13 (m, 2H); 7,42 (s, 5H); 7,96-8,00 (m, 7H).
4- (3-(trifluorometossi)benzilossi)benzene-1-solfonilcloruro (69b). Solido bianco (494 mg, 1,35 mmol , 86%).
<1>H-NMR (CDCI3) 6: 5,19 (s, 2H); 7,10-7,14 (m, 2H); 7,22-7,50 (m, 4H); 7,98-8,02 (m, 2H).
4- (4-(trifluorometosi)benzilossi)benzene-1-solfonilcloruro (69c). Solido bianco (424 mg, 1,16 mmol, 65%).
<1>H-NMR (CDCI3) δ: 5,17 (s, 2H); 7,09-7,14 (m, 2H); 7,26-7,29 (m, 2H); 7,45-7,49 (m, 2H); 7,98-8,02 (m, 2H).
4-(3-fluorobenzilossi)benzene-1-solfonilcloruro (69d).
Solido bianco (630 mg, 2,09 mmol, 92%),
<1>H-NMR (CDClj) 5: 5,17 (s, 2H); 6,97-7,25 (m, 5H); 7,34-7,44 (m, IH); 7,91-8,01 (m, 2H).
4-(4-fluorobenzilossi)benzene-l-solfonilcloruro (69e). Il solfonilcloruro è stato purificato per flash cromatografia mediante cartuccia Isolute Si (II) 10 g (n-Esano 3 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (529 mg, 1,76 mmol, 68%).
<1>H-NMR (CDClj) δ: 5,13 (s, 2H); 7,07-7,15 (m, 4H); 7,37-7,44 (m, 2H); 7,95-8,02 (m, 2H).
4-(3,5-difluorobenzilossi)benzene- 1-solfonilcloruro (69f). Solido bianco (478 mg, 1,50 mmol, 68%).
<J,>H-NMR (CDClj) δ; 5,15 (s, 2H); 6,77-6,85 (m, IH); 6,94-6,97 (m, 2H); 7,08-7,13 (m, 2H); 7,97-8,02 (m, 2H).
4-(4-bromobenzilossi)benzene-1-solfonilcloruro (69g). Il solfonilcloruro è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 14 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (246 mg, 0,68 mmol, 32%).
<1>H-NMR (CDCI3) δ: 5,10 (s, 2H); 7,06-7,10 (m, 2H); 7,26-7,30 (m, 2H); 7,51-7,55 (m, 2H); 7,94-7,98 (m, 2H).
4- (bifenil-3-ilmetossi)benzene-1-solfonilcloruro (69h). Olio giallo (586 mg, 1,63 mmol, 98%).
<1>H-NMR (CDCI3) δ: 5,23 (s, 2H); 6,97-7,02 (m, 2H); 7,11-7,17 (m, 2H); 7,37-7,64 (m, 8H); 7,91-8,01 (m, 2H).
4-(chinolin-8-ilmetossi)benzene- 1-solfonilcloruro
(69i). Il solfonilcloruro è stato purificato per flash cromatografia (n-Esano 7 : AcOEt 1) ed è stato ottenuto un solido bianco (158 mg, 0,47 mmol, 15%).
<1>H-NMR (CDC13) δ: 5,96 (s, 2H); 7,22-7,26 (m, 2H); 7,46-7,63 (m, 2H); 7,83-7,89 (m, 2H); 7,95-7,99 (m, 2H); 8,20-8,25 (m, IH); 8,95-8,98 {m, IH).
Esempio 1 :Analisi dell'attività inibitoria in vitro di zinco metalloproteasi (MHPs) e TACE
Il dominio catalitico della MMP-14 umana ricombinante è stato fornito dalla Prof.ssa Gillian Murphy (Department of Oncology, University of Cambridge, UK). La pro-MMP-1, pro-MMP-2, pro-MMP-9, prò-MMP-13 e TACE (ADAM17) sono state acquistate dalla Calbiochem. I proenzimi sono stati attivati immediatamente prima dell'uso con acetato p-aminofenilmercurico (APMA 2 mM per 1 ora a 37 °C per MMP-2 e MMP-1, 1 mM per 1 ora a 37 °C per MMP-9 e MMP-13).
Per le misure del saggio, le soluzioni stock degli inibitori (in DMSO, 100 mM) sono state ulteriormente diluite a 7 diverse concentrazioni (0,.01 nM-300 μΜ) per ciascuna MMP nel tampone: Fluorimetrie Assay Buffer (FAB: Tris 50 mM, pH = 7,5, NaCl 150 mM, CaCl210 mM, Brij 35 0,05% e DMSO 1%). L'enzima attivato (concentrazione finale 2,9 nM per MMP-2, 2,7 nM per MMP-9, 0,3 nM per MMP-13, 1 nM per MMP-14cd, 2,0 nM per MMP-1 e 7,5 nM per TACE) e le soluzioni dell'inibitore sono stati incubati nel tampone per 4 ore a 25 °C. Il TACE è stato incubato per 20 min a 25 °C. Dopo l'aggiunta di una soluzione 200 μΜ del substrato fluorogano Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap (Dnp)-Ala-Arg-NH2(Bacherà) (Neumann, U.; Kubota, H.; Frei, K.; Ganu, V.; Leppert, D. Anal. Biochem. 2004, 328, 166.) in DMSO (concentrazione finale 2 μΜ), l'idrolisi è stata monitorata ogni 15 sec per 20 min registrando l'aumento della fluorescenza λex= 325 nm, λem= 395 nm) usando uno spettrofluorimetro a multipiastra (Molecular Device SpectraMax Gemini XS). I saggi sono stati effettuati in triplicato in un volume totale di 200 μΐ per pozzetto in una micropiastra a 96-pozzetti (Corning, black, NBS). I pozzetti dei bianchi usati come controllo sono privi dell 'inibitore. L'attività inibitoria sulle MMPs e su TACE è stata espressa in unità di fluorescenza relativa (RFU). La percentuale d'inibizione è stata calcolata rispetto alle reazioni di controllo, prive dell'inibitore. L'IC50è stata determinata usando la formula: Vi/V0= 1/(1 [I]/ IC50), dove Vi è la velocità iniziale d'idrolisi del substrato in presenza dell'inibitore alla concentrazione [I] e V0è la velocità iniziale in assenza dell'inibitore . I risultati sono stati analizzati usando i softwares SoftMax Pro e GraFit.
Esempio 2: Analisi dell'attività inibitoria in vitro di ADAM10
L'enzima ricombinante umano ADAM10, comprato alla R&D, è stato sciolto in tampone FAB a pH 9. Una soluzione dell'enzima (concentrazione finale 20 nM) è stata incubata con le soluzioni degli inibitori a diverse concentrazioni per 1 ora a 37 °C. Dopo l'aggiunta di una soluzione 100 μΜ del substrato fluorogeno Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap (Dnp)-Ala-Arg-NH2(Bachem) in DMSO (concentrazione finale 10 μΜ), l'idrolisi è stata monitorata ogni 15 sec per 20 min registrando l'aumento della fluorescenza (Xex= 325 nm, Χ^ = 395 nm) usando uno spettrofluorimetro a multipiastra (Molecular Device SpectraMax Gemini XS). I saggi sono stati effettuati in triplicato in un volume totale di 200 μΐ per pozzetto in una micropiastra a 96-pozzetti (Corning, black, NBS) . I pozzetti dei bianchi usati come controllo sono privi dell'inibitore. L'attività inibitoria sulle MMPs ADAMI0 è stata espressa in unità di fluorescenza relativa (RFU). La percentuale d'inibizione è stata calcolata rispetto alle reazioni di controllo, prive dell'inibitore. L'IC50è stata determinata usando la formula: Vi/V0= 1/(1 [I]/ IC50), dove Viè la velocità iniziale d'idrolisi del substrato in presenza dell'inibitore alla concentrazione [I] e V0è la veloci tà iniziale in assenza dell'inibitore. I risultati sono stati analizzati usando i softwares SoftMax Pro e Gra-Fit.
Esempio 3: Valutazione dell'attività su cellule vitali in vitro
L'attività dei composti in oggetto è stata valutata in vitro su cellule vitali. Sono state utilizzate linee cellulari tumorali umane A2774 di EOC. L'attività inibitoria su ADAMI7/TACE è stata valutata come capacità di modulare il rilascio nel terreno di coltura della forma solubile di ALCAM (sALCAM), dosata mediante test immunoenzimatico commerciale (Human ALCAM DuoSet RLISA Development System, R&D Systems, Minneapolis, MN), come descritto in Rosso et al. (Rosso 0, Piazza T, Bongarzone I, Rossello A, Mezzanzanica D, Canevari S, Orengo AM, Puppo A, Ferrini S, Fabbi M. The ALCAM shedding by thè metalloprotease ADAM17/TACE is involved in motìlity of ovarian carcinoma cells. Mol Cancer Res. 2007 Dee;5 {12):1246-53).
In breve: le cellule tumorali, che crescono in aderenza come monostrato, sono state coltivate in piastre da 24 pozzetti fino a subconfluenza. Il terreno è stato quindi rimosso e sostituito con terreno contenente 0,1% FCS (Fetal Calf Serum) e varie concentrazioni di inibitori o la quantità equivalente del loro solvente (DMSO). Dopo 30 minuti di incubazione a 37°C, alla coltura è stato aggiunto pervanadato (PV, concentrazione finale 200 μΜ) o PMA (Forbolo Acetato Miristato, 100 ng/ml) o EGF (Fattore di Crescita Epidermico, 100 ng/ml) e l'incubazione è proseguita rispettivamente per 1 ora, 2 ore e 18 ore. Ogni condizione è stata saggiata in duplicato. Il terreno condizionato delle cellule trattate e dei rispettivi controlli è stato quindi raccolto, centrifugato per 5 minuti a 1000 x g per rimuovere i detriti cellulari, e usato indiluito nel test ELISA di determinazione di ALCAM. Il test ELISA è stato svolto in duplicato e il background sottratto. I dati sono espressi come media ± SD e sono stati analizzati con il t test di Student a due code. La IC50è stata calcolata considerando i valori di sALCAM dei campioni trattati con stimolo DMSO come 100% di rilascio.
L'attività dei composti in oggetto è stata paragonata a quella del composto di riferimento CGS27023A (MM1270) all'interno dello stesso esperimento. In ogni condizione utilizzata, i composti 6 (FC130) e 7 (FC143) hanno mostrato una IC50compresa tra 100 e 10 nM, cioè almeno 10 volte inferiore a quella di CGS (compresa tra 1 μΜ e 100 nM).
Nella figura 1 sono riportati i valori di ALCAM solubile (sALCAM) misurati nel terreno di coltura di cellule di carcinoma ovarico A2774 dopo stimolazione con pervanadato in presenza di diverse concentrazioni (10 μΜ, 1 μΜ, 100 nM e 10 nM) degli inibitori dell'invenzione .
Nelle tabelle 3 e 4 qui di seguito sono indicati, per alcuni degli inibitori oggetto dell'invenzione, i valori di inibizione enzimatica riportati come valori di ICS0, nel range nM, misurati nei test enzimatici sui vari enzimi isolati, cataliticamenti attivi, in presenza dell'appropriato substrato fluorogeno.
Tabella 3
Tabella 4

Claims (7)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula generale (I):
    in cui R è idrogeno o un gruppo alchile (Ci-C,) lineare o ramificato; R<1>è scelto nel gruppo che consiste di idrogeno, - (CH2)2NHCOCH3, -(CH2)2Pht, in cui Pht è il gruppo ftalimide, - (CH2)2NHCbz(in cui Cbz è il gruppo carbobenzilossi ; e Y è scelto nel gruppo che consiste
  2. 2. Composto secondo la rivendicazione 1 avente la formula generale (il):
    in cui R ed R<1>hanno i significati definiti nella rivendicazione 1 in relazione alla formula generale (∑) ed R<2>è scelto fra bromo, -0-CH2-C≡C-CH3o fenile facoltativamente sostituito con un gruppo trifluorometile.
  3. 3. Composto secondo la rivendicazione 2 scelto dal gruppo che consiste di:
    5 6
  4. 4. Composto secondo la rivendicazione 1 avente la formula generale (III):
    in cui Y è scelto dal gruppo che consiste di:
  5. 5. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, per l'impiego come medicamento per il trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (EOC).
  6. 6. Impiego di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico del carcinoma ovarico epiteliale (EOC).
  7. 7. Composizione farmaceutica comprendente una quantità farmaceuticamente efficace di un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 ed un veicolo farmaceuticamente accettabile.
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