ITTO20080759A1

ITTO20080759A1 - USE OF OATP AS AN IMMUNODEPRESSIVE DRUG

Info

Publication number: ITTO20080759A1
Application number: IT000759A
Authority: IT
Inventors: Gianfranco Merizzi
Original assignee: Medestea Res & Production S R L
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2008-10-15
Publication date: 2010-04-16

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Impiego di oATP come farmaco immunodepressivo" DESCRIPTION of the industrial invention entitled: "Use of oATP as an immunodepressive drug"

DESCRIZIONE DESCRIPTION

La presente invenzione si riferisce ad un nuovo impiego di adenosina-5'-trifosfato-2',3'-dialdeide (nel seguito oATP) come farmaco ad attività immunodepressiva, nonché all'impiego di tale composto per la preparazione di medicamenti utili nel trattamento terapeutico di condizioni che beneficiano della somministrazione di principi attivi ad attività immunodepressiva, ed in particolare nel trattamento terapeutico di malattie autoimmunitarie e nel trattamento antirigetto di trapianti d'organo. The present invention refers to a new use of adenosine-5'-triphosphate-2 ', 3'-dialdehyde (hereinafter OATP) as an immunosuppressive drug, as well as to the use of this compound for the preparation of medicaments useful in the treatment therapeutic of conditions that benefit from the administration of active ingredients with immunosuppressive activity, and in particular in the therapeutic treatment of autoimmune diseases and in the anti-rejection treatment of organ transplants.

La molecola oATP è derivata dall'ATP per ossidazione degli idrossili presenti nelle posizioni 2' e 3' del ribosio a dialdeidi. Tale ossidazione può essere effettuata con un sale dell'acido periodico, come descritto in P. N. Lowe et al., Biochemical Society Transactions, vol. 7:1131-1133, 1979. The molecule oATP is derived from ATP by oxidation of the hydroxyls present in the 2 'and 3' positions of ribose to dialdehydes. Such oxidation can be carried out with a salt of the periodic acid, as described in P. N. Lowe et al., Biochemical Society Transactions, vol. 7: 1131-1133, 1979.

WO02/11737 descrive l'impiego di oATP come principio attivo avente attività antinfiammatoria e analgesica. WO02 / 11737 describes the use of oATP as an active ingredient having anti-inflammatory and analgesic activity.

WO2005/077383 descrive l'impiego di oATP come agente farmacologico, utile nel trattamento di malattie che richiedono l'inibizione di angiogenesi, come ad esempio aterosclerosi e tumori. WO2005 / 077383 describes the use of oATP as a pharmacological agent, useful in the treatment of diseases that require the inhibition of angiogenesis, such as for example atherosclerosis and tumors.

La sperimentazione su cui si fonda la presente invenzione ha messo in evidenza che oATP presenta un'elevata attività immunodepressiva che ne permette l'impiego come farmaco antirigetto nei trapianti d'organo, nonché come farmaco per il trattamento terapeutico di malattie autoimmunitarie. In particolare, gli studi su cui si fonda l'invenzione hanno dimostrato che oATP è efficace nel dilazionare in modo significativo il rigetto di cellule pancreatiche trapiantate in animali diabetici. The experimentation on which the present invention is based has shown that oATP has a high immunodepressive activity which allows its use as an anti-rejection drug in organ transplants, as well as as a drug for the therapeutic treatment of autoimmune diseases. In particular, the studies on which the invention is based have shown that oATP is effective in significantly delaying the rejection of transplanted pancreatic cells in diabetic animals.

Inoltre, a seguito della dimostrazione preclinica dell'efficacia di oATP come farmaco utile nel prevenire il rigetto dei trapianti, è stata verificata l'utilità della molecola in generale nel trattamento di malattie autoimmunitarie, come ad esempio, lupus eritematoso sistemico (SLE), sclerosi multipla, sclerodermia, sindrome di Sjogren e di Erdheim-Chester, psoriasi, morbo di Crohn, arterite di Takayasu, artrite reumatoide, diabete di tipo I e II, patologie tutte di origina autoimmunitaria. E' pertanto oggetto della presente invenzione l'impiego di oATP nella preparazione di medicamenti utili nei trattamenti sopra citati e definiti in dettaglio nelle rivendicazioni che seguono. Furthermore, following the preclinical demonstration of the efficacy of oATP as a drug useful in preventing transplant rejection, the usefulness of the molecule in general in the treatment of autoimmune diseases, such as, for example, systemic lupus erythematosus (SLE), sclerosis, has been verified. multiple disease, scleroderma, Sjogren's and Erdheim-Chester's syndrome, psoriasis, Crohn's disease, Takayasu's arteritis, rheumatoid arthritis, type I and II diabetes, all diseases of autoimmune origin. Therefore, the object of the present invention is the use of oATP in the preparation of medicaments useful in the treatments mentioned above and defined in detail in the following claims.

Per l'uso nelle terapie e nei trattamenti oggetto dell'invenzione, il composto oATP può essere formulato in forme farmaceutiche di per sé note e descritte nella letteratura brevettuale sopra citata. La somministrazione può essere orale, topica o parenterale. Forme farmaceutiche idonee alle diverse vie di somministrazione comprendono compresse, pastiglie, capsule, granulati, polveri, supposte, sciroppi, soluzioni, sospensioni, creme, pomate, gel, paste, lozioni, emulsioni e spray. Le composizioni farmaceutiche possono essere preparate come descritto in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook Mak Pub. Co., NY, USA, XVII ed. For use in the therapies and treatments object of the invention, the oATP compound can be formulated in pharmaceutical forms per se known and described in the aforementioned patent literature. Administration can be oral, topical or parenteral. Pharmaceutical forms suitable for the different routes of administration include tablets, tablets, capsules, granules, powders, suppositories, syrups, solutions, suspensions, creams, ointments, gels, pastes, lotions, emulsions and sprays. The pharmaceutical compositions can be prepared as described in Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook Mak Pub. Co., NY, USA, 17th ed.

La quantità di sostanza attiva per unità di dosaggio è generalmente compresa tra 0,01 mg e 100 mg per kg di peso corporeo, da somministrare una o più volte al giorno, a seconda del tipo e gravità della patologia e dello stato di salute del paziente trattato. Generalmente, la dose giornaliera per paziente potrà essere compresa tra 1 mg e 1000 mg, preferibilmente tra 5 mg e 500 mg. The quantity of active substance per dosage unit is generally between 0.01 mg and 100 mg per kg of body weight, to be administered one or more times a day, depending on the type and severity of the disease and the patient's state of health. treaty. Generally, the daily dose per patient may be between 1 mg and 1000 mg, preferably between 5 mg and 500 mg.

I nuovi impieghi di oATP e di composizioni farmaceutiche che lo contengono sono supportate dalle prove che seguono: The new uses of oATP and pharmaceutical compositions containing it are supported by the following evidence:

Esempio 1 Example 1

Prolungamento della sopravvivenza di insule pancreatiche trapiantate in topi diabetici, dopo somministrazione di oATP Prolonging the survival of pancreatic islets transplanted into diabetic mice after administration of oATP

Topi di ceppo C57BL/6 resi diabetici mediante somministrazione di streptozotocina (170 mg/kg) sono stati trattati con oATP. Ai topi diabetici sono state inoculate insule pancreatiche (contenenti cellule beta produttrici di insulina) ottenute da topi di ceppo BALB/c. L'isolamento delle insule è stato eseguito con il metodo descritto da Abdi R et al. in Diabetes, agosto 2002; 51(8):2489-95. In breve, i pancreas dei donatori venivano perfusi attraverso il dotto biliare comune con collagenasi di roditore (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e digerite a 37°C per 30 minuti. Mice of the C57BL / 6 strain rendered diabetic by administration of streptozotocin (170 mg / kg) were treated with oATP. The diabetic mice were injected with pancreatic islets (containing insulin-producing beta cells) obtained from mice of the BALB / c strain. Isolation of the islets was performed with the method described by Abdi R et al. in Diabetes, August 2002; 51 (8): 2489-95. Briefly, donor pancreases were perfused through the common bile duct with rodent collagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) and digested at 37 ° C for 30 minutes.

Le insule venivano purificate su gradiente di Ficoll discontinuo (Sigma) e prelevate con l'ausilio di uno stereomicroscopio. Almeno 500 insule venivano trapiantate nei topi riceventi, posizionandole al di sotto della capsula del rene sinistro. The islets were purified on a discontinuous Ficoll gradient (Sigma) and collected with the aid of a stereomicroscope. At least 500 islets were transplanted into recipient mice, placing them below the left kidney capsule.

Veniva quindi eseguito giornalmente il monitoraggio della glicemia, attraverso la valutazione dei livelli di glucosio del sangue prelevato da una vena della coda degli animali, al fine di controllare la funzionalità del trapianto di insule. Il rigetto veniva dichiarato quando veniva evidenziato il ritorno all'iperglicemia, ovvero quando i livelli di glucosio ematico risultavano > 250 mg/dl in due misurazioni successive. Inoltre, al termine della sperimentazione, le insule trapiantate venivano rimosse per l'esame istopatologico mediante asportazione della capsula renale, sotto guida microscopica. Blood glucose monitoring was then performed daily, by evaluating the glucose levels of the blood taken from a tail vein of the animals, in order to check the functionality of the islet transplant. Rejection was reported when return to hyperglycemia was shown, i.e. when blood glucose levels were> 250 mg / dl in two subsequent measurements. Furthermore, at the end of the experimentation, the transplanted islets were removed for histopathological examination by removal of the renal capsule, under microscopic guidance.

Dopo l'inoculo di insule (tempo 0) i topi diabetici sono stati trattati con iniezione intraperitoneale di 30 mg/kg (1 mg/topo) di oATP per 6 giorni dall'esecuzione del trapianto: tempo 0, 2°, 4°, 6°, 8° e 10° giorno. Come riportato nella fig. 1, il rigetto delle insule trapiantate è risultato significativamente dilazionato nei topi diabetici trattati con oATP, rispetto ai controlli non trattati. After the inoculation of islets (time 0) the diabetic mice were treated with intraperitoneal injection of 30 mg / kg (1 mg / mouse) of oATP for 6 days after transplantation: time 0, 2 °, 4 °, 6th, 8th and 10th day. As shown in fig. 1, rejection of transplanted islets was significantly delayed in diabetic mice treated with oATP compared to untreated controls.

Analoghi risultati sono stati successivamente ottenuti somministrando oATP alla dose di 0,25 mg/topo (n = 5) (fig. 2). Similar results were subsequently obtained by administering oATP at a dose of 0.25 mg / mouse (n = 5) (Fig. 2).

Esempio 2 Example 2

Prolungamento della sopravvivenza di insule pancreatiche trapiantate, indotto dalla somministrazione contemporanea di oATP e di rapamicina (rapa) Prolonged survival of transplanted pancreatic islets, induced by the simultaneous administration of oATP and rapamycin (turnip)

Utilizzando lo stesso modello sperimentale, è stato studiato l'effetto della somministrazione contemporanea di oATP (1 mg/topo) e del più attivo farmaco immunosoppressore, la rapamicina, utilizzata alla dose di 0,1 mg/topo. Come riportato nella fig. 3, il trattamento dei topi diabetici con o-ATP+rapamicina ha indotto un prolungamento altamente significativo della sopravvivenza delle insule pancreatiche se comparato ai due trattamenti singoli con solo oATP o con sola rapamicina. Con oATP 0,25 mg/topo e rapamicina a 0,1mg/topo si sono ottenuti risultati ancora migliori. Using the same experimental model, the effect of coadministration of oATP (1 mg / mouse) and the more active immunosuppressive drug, rapamycin, used at a dose of 0.1 mg / mouse, was investigated. As shown in fig. 3, treatment of diabetic mice with o-ATP + rapamycin induced a highly significant prolongation of pancreatic islet survival when compared to the two single treatments with oATP alone or rapamycin alone. Even better results were obtained with oATP 0.25 mg / mouse and rapamycin at 0.1 mg / mouse.

Questi risultati permettono di preconizzare l'impiego di oATP come sinergizzante dell'azione di farmaci immunosoppressori. Rientra perciò nell'ambito dell'invenzione l'impiego di oATP in terapia combinata con farmaci immunosoppressori, quali rapamicina, mediante somministrazione simultanea, separata o sequenziale; rientrano altresì nell'ambito dell'invenzione formulazioni farmaceutiche contenenti come principi attivi oATP e farmaci immuno soppressori. These results allow us to predict the use of oATP as a synergist of the action of immunosuppressive drugs. Therefore, the use of oATP in combined therapy with immunosuppressive drugs, such as rapamycin, by means of simultaneous, separate or sequential administration, falls within the scope of the invention; pharmaceutical formulations containing as active ingredients oATP and immuno-suppressive drugs also fall within the scope of the invention.

Esempio 3 Example 3

Utilizzo di oATP nell'artrite reumatoide L'artrite reumatoide è una malattia autoimmune, caratterizzata da importanti manifestazioni infiammatorie e dolorifiche a livello articolare. Use of oATP in rheumatoid arthritis Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease characterized by major inflammatory and painful manifestations in the joints.

La dimostrazione pre-clinica dell'efficacia di oATP come farmaco utile nel prevenire il rigetto dei trapianti ha indotto a verificare la possibilità di utilizzo di oATP nell'artrite reumatoide, che in clinica viene trattata con farmaci anti-rigetto, come la ciclosporina. The pre-clinical demonstration of the efficacy of oATP as a drug useful in preventing transplant rejection has led to investigate the possibility of using oATP in rheumatoid arthritis, which in the clinic is treated with anti-rejection drugs, such as cyclosporine.

Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una coltura di cellule endoteliali. Le cellule endoteliali (HUVEC = human umbilical vein endothelial cells) sono state ricavate da cordone ombelicale umano mediante trattamento con collagenasi, come descritto in Ferrero et al., Cancer Res., 15 luglio 1996, 56(14):3211-5), e coltivate in fiasche ricoperte di gelatina all'1% utilizzando medium 199 contenente il 20% di siero bovino fetale inattivato al calore, l'1% di fattore di crescita derivato dalla retina bovina, 90 μg/ml di eparina, 100 IU/ml di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina. Tutti gli esperimenti sono stati condotti su HUVEC ottenute dopo 1-4 passaggi. Il TNF alfa è utilizzato alla dose di 200 U/ml. Le HUVEC sono state incubate per 24 ore con oATP. The experiments were performed using an endothelial cell culture. Endothelial cells (HUVEC = human umbilical vein endothelial cells) were derived from human umbilical cord by collagenase treatment, as described in Ferrero et al., Cancer Res., 15 Jul 1996, 56 (14): 3211-5), and grown in flasks coated with 1% gelatin using 199 medium containing 20% heat inactivated fetal bovine serum, 1% bovine retinal-derived growth factor, 90 μg / ml heparin, 100 IU / ml of penicillin and 100 μg / ml of streptomycin. All experiments were conducted on HUVEC obtained after 1-4 passages. TNF alpha is used at a dose of 200 U / ml. The HUVECs were incubated for 24 hours with oATP.

E' stata inoltre eseguita un'analisi citofluorimetrica per valutare l'espressione da parte delle HUVEC della molecola di adesione ICAM-1 e dei recettori per TNF alfa (TNFR1 e TNFR2). I campioni sono stati analizzati al FACScan con il supporto di un software CELLQuest. La sperimentazione eseguita ha permesso di mettere in evidenza i seguenti risultati: A flow cytometric analysis was also performed to evaluate the expression by HUVEC of the adhesion molecule ICAM-1 and of the TNF alpha receptors (TNFR1 and TNFR2). The samples were analyzed at FACScan with the support of a CELLQuest software. The experimentation carried out allowed to highlight the following results:

1) oATP inibisce in vitro la migrazione TNF alfadipendente di PBMC (peripheral blood mononuclear cells) attraverso le HUVEC, come riportato in fig. 1) oATP inhibits in vitro the TNF-dependent migration of PBMC (peripheral blood mononuclear cells) through HUVEC, as reported in Fig.

4; 4;

2) oATP inibisce la up-regolazione, indotta da ATP, dell'espressione della molecola di adesione ICAM1 sulle HUVEC, misurata con analisi al FACS: Δ mean di intensità di fluorescenza (media di 4 esperimenti)= 29±0,3 nelle HUVEC non trattate, 65±0,5 in quelle trattate con ATP, 26±0,1 in quelle trattate con oATP e 35±0,2 in quelle trattate con ATP+oATP. Tale dato indica che l'endotelio, dopo trattamento con oATP, risulta meno idoneo a legare (e quindi a favorire) la diapedesi dei leucociti; 3) oATP down-regola la espressione del recettore 1 per il TNF (TNFR1) da parte delle HUVEC (fig. 5). 2) oATP inhibits the ATP-induced up-regulation of the expression of the ICAM1 adhesion molecule on HUVEC, measured by FACS analysis: Δ mean of fluorescence intensity (mean of 4 experiments) = 29 ± 0.3 in HUVEC untreated, 65 ± 0.5 in those treated with ATP, 26 ± 0.1 in those treated with oATP and 35 ± 0.2 in those treated with ATP + oATP. This data indicates that the endothelium, after treatment with oATP, is less suitable for binding (and therefore favoring) the diapedesis of leukocytes; 3) oATP down-regulates the expression of TNF receptor 1 (TNFR1) by HUVECs (Fig. 5).

Si è inoltre dimostrato che, in un modello sperimentale di artrite reumatoide nel topo, in grado di "mimare" l'artrite reumatoide nell'uomo, il reclutamento di cellule immunitarie nella sede del processo autoimmune veniva ridotto dal trattamento con oATP. Ai fini della sperimentazione, l'artrite in topi del ceppo C57BL/6 è stata indotta utilizzando una miscela di anticorpi diretta contro il collagene di tipo II (Arthrogen CIA, i.e. Arthritis-inducing Monoclonal Antibody Cocktail, Chemicon International Inc., Temecula, CA). It was also shown that, in an experimental model of rheumatoid arthritis in mice, able to "mimic" rheumatoid arthritis in humans, the recruitment of immune cells to the site of the autoimmune process was reduced by treatment with oATP. For the purposes of the experiment, arthritis in mice of the C57BL / 6 strain was induced using a mixture of antibodies directed against type II collagen (Arthrogen CIA, i.e. Arthritis-inducing Monoclonal Antibody Cocktail, Chemicon International Inc., Temecula, CA ).

Venivano iniettati ai topi 400 μl di una miscela di anticorpi, contenente 10 mg/ml, al giorno 0. Nel giorno successivo venivano iniettati negli stessi topi 100 μl di una soluzione do 0,25 mg/ml di lipopolisaccaridi batterici (Chemicon International Inc.). Dopo 10 giorni dall'inoculo di lipopolisaccaridi, l'induzione dell'artrite veniva verificata attraverso una valutazione dei segni e sintomi clinici. The mice were injected with 400 μl of an antibody mixture, containing 10 mg / ml, on day 0. On the following day, 100 μl of a 0.25 mg / ml solution of bacterial lipopolysaccharides were injected into the same mice (Chemicon International Inc. ). After 10 days of inoculation of lipopolysaccharides, induction of arthritis was verified through an evaluation of clinical signs and symptoms.

Si è quindi somministrato oATP, alla dose di 4 mg/kg di peso corporeo, nel peritoneo degli animali. Dopo 6 ore dalla somministrazione del farmaco, i topi sono stati sacrificati e sono stati allestiti dei preparati istologici della zampa sede di artrite, eseguendo una colorazione con ematossilina ed cosina. I dati ottenuti, riportati nella fig. 6, che rappresentano un campione-tipo dei 3 eseguiti, dimostrano che il reclutamento di cellule infiammatorie nei topi trattati con oATP era ridotto rispetto a quello dei topi non trattati. OATP was then administered, at a dose of 4 mg / kg of body weight, into the peritoneum of the animals. After 6 hours from the administration of the drug, the mice were sacrificed and histological preparations of the paw site of arthritis were prepared, performing a staining with hematoxylin and cosine. The data obtained, shown in fig. 6, which represent a typical sample of the 3 performed, show that the recruitment of inflammatory cells in mice treated with oATP was reduced compared to that of untreated mice.

In vista dei risultati ottenuti, oATP può essere utilizzato nel trattamento dell'eziologia dell'artrite remautoide. In view of the results obtained, oATP can be used in the treatment of the etiology of rhemautoid arthritis.

Inoltre, sulla base della sperimentazione ottenuta, è preconizzabile l'impiego di oATP nel trattamento della malattia di Erdheim-Chester, che è una forma sistemica di istiocitosi, non a cellule di Langherans. In tale malattia, per la quale non esiste un trattamento farmacologico, è coinvolta l'elevata produzione di TNFα e di altre citochemochine da parte di cellule di tipo macrofagico attivate. Furthermore, on the basis of the experimentation obtained, the use of oATP in the treatment of Erdheim-Chester disease, which is a systemic form of histiocytosis, not in Langherans cells, is predictable. In this disease, for which there is no pharmacological treatment, the high production of TNFα and other cytochemokines by activated macrophage cells is involved.

Esempio 4 Example 4

Utilizzo di oATP nel lupus eritematoso sistemico (SLE) Use of oATP in systemic lupus erythematosus (SLE)

Anche questa patologia autoimmune risulta indicata per il trattamento con oATP. This autoimmune disease is also indicated for treatment with oATP.

Sono stati utilizzati topi femmine del ceppo MZB/NZW (Laboratori Jackson, Bar Harbor ME), capace di sviluppare spontaneamente SLE. Si sono valutati i livelli di proteinuria e di sopravvivenza negli animali (n=5) trattati con oATP oralmente, alla dose di 4 mg/kg, una volta al giorno, a partire dalla ventesima settimana di età dei topi. La sopravvivenza è stata osservata fino alla quarantesima settimana. La proteinuria è stata studiata utilizzando degli strips appositi per analisi urinarie (Bayer, Milano). I risultati, riportati nella fig. 7, dimostrano che il trattamento con oATP ha ridotto l'incremento della proteinuria, facilitando la sopravvivenza degli animali (fig. 8). Female mice of the MZB / NZW strain (Jackson Laboratories, Bar Harbor ME), capable of spontaneously developing SLE, were used. Proteinuria and survival levels were evaluated in animals (n = 5) treated with oATP orally, at a dose of 4 mg / kg, once daily, starting from the twentieth week of age of the mice. Survival was observed up to the fortieth week. Proteinuria was studied using special strips for urinary analysis (Bayer, Milan). The results, reported in fig. 7, show that treatment with oATP reduced the increase in proteinuria, facilitating the survival of the animals (Fig. 8).

Esempio 5 Example 5

Utilizzo di oATP nel trattamento della sclerosi multipla Use of oATP in the treatment of multiple sclerosis

La sperimentazione che segue, si riferisce all'utilizzo di oATP in un modello animale di encefalomielite sperimentale autoimmune, acuta e cronica, modello che viene utilizzato per la sclerosi multipla. The following experimentation refers to the use of oATP in an animal model of acute and chronic experimental autoimmune encephalomyelitis, a model that is used for multiple sclerosis.

A) Attività dell'oATP nel trattamento dei deficit sensomotori in un modello di Encefalomielite Sperimentale Autoimmune (EAE) cronica nel ratto Questo studio è stato condotto per verificare se il trattamento con oATP possa indurre il ripristino delle funzionalità sensomotorie in un modello di encefalomielite sperimentale (EAE) cronica nel ratto indotta dal trattamento con MOG. A) Activity of oATP in the treatment of sensorimotor deficits in a model of Chronic Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in the rat This study was conducted to verify whether treatment with oATP can induce the restoration of sensorimotor functions in a model of experimental encephalomyelitis ( EAE) in rats induced by MOG treatment.

Tale patologia è stata indotta in ratti femmina adulti Dark Agouti (DA) dal peso di 120-170 g tramite iniezione intradermica nella base della coda di 50 µg di MOG1-125 ricombinante sospesi in PBS ed emulsionati con CFA (complete Freund's adjuvant) contenente M. Tuberculosis inattivato con il calore. This pathology was induced in adult Dark Agouti (DA) female rats weighing 120-170 g by intradermal injection into the base of the tail of 50 µg of recombinant MOG1-125 suspended in PBS and emulsified with CFA (complete Freund's adjuvant) containing M Heat inactivated tuberculosis.

I ratti sono stati trattati giornalmente con il placebo (veicolo) o con oATP 0,1 o 1 mg/kg per os iniziando subito dopo l'inoculazione del MOG. Gli animali sono stati posti sotto osservazione clinica giornaliera (neuroscoring) per valutare l'insorgenza e il decorso della EAE. Rats were treated daily with placebo (vehicle) or 0.1 or 1 mg / kg oATP orally starting immediately after MOG inoculation. The animals were placed under daily clinical observation (neuroscoring) to assess the onset and course of EAE.

L'indagine clinica ha rivelato un peggioramento dei sintomi neurologici a partire da 2-3 giorni dopo l'iniezione di MOG; il picco del deficit neurologico è stato raggiunto nel gruppo di controllo al giorno 13. Clinical investigation revealed a worsening of neurological symptoms starting 2-3 days after MOG injection; peak neurological deficit was reached in the control group on day 13.

Il trattamento con oATP ha mostrato un notevole effetto nel ridurre la sintomatologia neurologica durante il periodo di monitoraggio in confronto ai ratti trattati con il veicolo. Treatment with oATP showed a notable effect in reducing neurological symptoms during the monitoring period compared to vehicle-treated rats.

Gli animali trattati con oATP 0,1 e 1 mg/kg per os hanno mostrato sintomi meno invalidanti a partire dal giorno 10 e fino alla fine dello studio; tale effetto è stato dose-dipendente, ed il gruppo trattato con oATP 1 mg/kg ha mostrato il miglior profilo di neuroprotezione tra il giorno 15 e il giorno 30. Animals treated with oATP 0.1 and 1 mg / kg orally showed less disabling symptoms from day 10 until the end of the study; this effect was dose-dependent, and the group treated with oATP 1 mg / kg showed the best neuroprotection profile between day 15 and day 30.

In aggiunta a ciò, è stato osservato un ritardo nel raggiungimento del picco del deficit neurologico in entrambi i gruppi trattati con oATP rispetto al gruppo trattato con il veicolo. In addition to this, a delay in reaching peak neurological deficit was observed in both oATP-treated groups compared to the vehicle-treated group.

Tali risultati confermano che l'oATP possiede un effetto neuroprotettivo nei modelli di encefalomielite sperimentale. These results confirm that OATP possesses a neuroprotective effect in experimental encephalomyelitis models.

Materiali e metodi Materials and methods

60 ratti Dark Agouti (Harlan, Paesi Bassi) sono stati utilizzati in questo esperimento. 60 Dark Agouti rats (Harlan, The Netherlands) were used in this experiment.

Gli animali sono stati suddivisi nei seguenti gruppi di trattamento: The animals were divided into the following treatment groups:

- 20 ratti trattati giornalmente con oATP (0,1 mg/kg/die per os); - 20 rats treated daily with oATP (0.1 mg / kg / day orally);

- 20 ratti trattati giornalmente con oATP (1 mg/kg/die per os); - 20 rats treated daily with oATP (1 mg / kg / day orally);

- 20 ratti trattati giornalmente con il veicolo (gruppo placebo). - 20 rats treated daily with the vehicle (placebo group).

In tutti i gruppi la somministrazione è iniziata lo stesso giorno dell'inoculazione del MOG. In all groups, administration began on the same day as the MOG inoculation.

Ogni giorno è stato effettuato un esame clinico delle condizioni neurologiche di ciascun animale utilizzando una scala di valutazione con un range da 0 (nessun sintomo) a 5 (completa paralisi di tutti gli arti). A clinical examination of each animal's neurological condition was performed daily using a rating scale ranging from 0 (no symptoms) to 5 (complete paralysis of all limbs).

Il neuroscoring clinico è stato eseguito fino al giorno 50 (fine dello studio). Clinical neuroscoring was performed until day 50 (end of study).

Risultati Results

L'induzione dell'EAE cronica nei ratti DA ha prodotto significativi deficit sensomotori (rilevati tramite un'apposita scala di valutazione) con un picco durante il 13° giorno dopo l'iniezione di MOG. Induction of chronic EAE in DA rats produced significant sensorimotor deficits (detected by a dedicated rating scale) with a peak during the 13th day after MOG injection.

L'analisi degli score clinici ha rivelato una differenza significativa tra il gruppo trattato con il veicolo e quelli trattati con oATP (a due diversi dosaggi). Analysis of clinical scores revealed a significant difference between the vehicle group and those treated with oATP (at two different dosages).

Durante i primi 10 giorni dello studio a partire dall'induzione dell'EAE, tutti i gruppi hanno mostrato un andamento simile. A partire dal 13° giorno, invece, lo score clinico nel gruppo veicolo è risultato significativamente più alto rispetto ai gruppi trattati con oATP; questa differenza si traduce in un grado notevolmente più elevato di sintomatologia neurologica (vedasi fig. 9). During the first 10 days of the study starting from EAE induction, all groups showed a similar trend. However, starting from day 13, the clinical score in the vehicle group was significantly higher than in the groups treated with oATP; this difference translates into a considerably higher degree of neurological symptoms (see Fig. 9).

Conclusioni Conclusions

Questi risultati suggeriscono che l'oATP (a dosi pari a 0,1 e a 1 mg/kg per os) possiede un sostanziale effetto nel ridurre i sintomi e nel favorire il ripristino della funzionalità sensomotoria in un modello di EAE cronica nel ratto. These results suggest that OATP (at doses of 0.1 and 1 mg / kg per os) has a substantial effect in reducing symptoms and promoting restoration of sensorimotor function in a chronic rat model of EAE.

Gli animali trattati con oATP hanno mostrato una sintomatologia notevolmente ridotta e ritardata rispetto al gruppo di controllo; tale effetto è stato dimostrato essere dose-dipendente, dato che il gruppo ad alto dosaggio ha mostrato il miglior profilo di neuroprotezione tra il giorno 15 e il giorno 30 post-inoculazione. The animals treated with oATP showed a markedly reduced and delayed symptomatology compared to the control group; this effect was shown to be dose-dependent, as the high-dose group showed the best neuroprotection profile between day 15 and day 30 post-injection.

B) Attività dell'oATP nel trattamento dei deficit sensomotori in un modello di Encefalomielite Sperimentale Autoimmune (EAE) acuta nel ratto B) Activity of oATP in the treatment of sensorimotor deficits in a model of acute Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in the rat

Questo studio è stato condotto per verificare se il trattamento con oATP possa indurre il ripristino della funzionalità sensomotoria in un modello di encefalomielite sperimentale acuta nel ratto (EAE). This study was conducted to investigate whether oATP treatment can induce restoration of sensorimotor function in an experimental rat acute encephalomyelitis (EAE) model.

L'EAE acuta è stata indotta in ratti Lewis adulti dal peso di 200-250 g tramite immunizzazione nella zampa posteriore con 100 µg di MBP (Guinea pig myelin basic protein) sospesi in 50 µl di soluzione salina ed emulsionati con 50 µl di CFA (complete Freund's adjuvant). Acute EAE was induced in adult Lewis rats weighing 200-250 g by immunization in the hind leg with 100 µg of MBP (Guinea pig myelin basic protein) suspended in 50 µl of saline and emulsified with 50 µl of CFA ( complete Freund's adjuvant).

I ratti sono stati quindi trattati ogni giorno per via orale con il placebo (veicolo) o con oATP (0,1 o 1 mg/kg) iniziando a partire da 5 giorni dall'inoculazione della MBP; gli animali sono stati posti sotto osservazione clinica quotidiana (neuroscoring) per valutare l'insorgenza e il decorso della EAE. The rats were then treated daily orally with placebo (vehicle) or oATP (0.1 or 1 mg / kg) starting 5 days after MBP inoculation; the animals were placed under daily clinical observation (neuroscoring) to assess the onset and course of EAE.

Lo scoring clinico ha rilevato un peggioramento dei sintomi neurologici a partire dal giorno 10 post-inoculazione, con un picco nel gruppo di controllo al giorno 13 e una parziale regressione dei sintomi a partire dai giorni 18-19. Clinical scoring revealed a worsening of neurological symptoms starting from day 10 post-injection, with a peak in the control group on day 13 and a partial regression of symptoms starting from days 18-19.

Il trattamento con oATP è stato in grado di ridurre significativamente la sintomatologia neurologica durante il periodo di monitoraggio in confronto ai ratti trattati con il veicolo. Treatment with oATP was able to significantly reduce neurological symptoms during the monitoring period compared to vehicle-treated rats.

Materiali e Metodi Materials and methods

Per questo esperimento sono stati utilizzati ratti Lewis femmina (Charles River, Germania) con un'età compresa tra 10 e 14 settimane e un peso di 200-250 g. Female Lewis rats (Charles River, Germany) with an age of 10 to 14 weeks and a weight of 200-250 g were used for this experiment.

- 15 ratti trattati giornalmente con oATP (0,1 mg/kg/die per os); - 15 rats treated daily with oATP (0.1 mg / kg / day orally);

- 15 ratti trattati giornalmente con oATP (1 mg/kg/die per os); - 15 rats treated daily with oATP (1 mg / kg / day orally);

- 15 ratti trattati giornalmente con il veicolo (gruppo placebo). - 15 rats treated daily with the vehicle (placebo group).

In tutti i gruppi la somministrazione è iniziata 5 giorni dopo l'inoculazione della MBP. In all groups, administration began 5 days after MBP inoculation.

Ogni giorno è stato effettuato un esame clinico delle condizioni neurologiche di ciascun animale utilizzando una scala di valutazione con un range da 0 (nessun sintomo) a 5 (completa paralisi di tutti gli arti). Il neuroscoring clinico è stato eseguito fino al giorno 21 post-iniezione (fine dello studio). A clinical examination of each animal's neurological condition was performed daily using a rating scale ranging from 0 (no symptoms) to 5 (complete paralysis of all limbs). Clinical neuroscoring was performed until post-injection day 21 (end of study).

Risultati Results

L'induzione di EAE acuta nei ratti Lewis ha prodotto significativi deficit sensomotori (rilevati tramite un'apposita scala di valutazione) a partire dal 10° giorno dopo l'iniezione di MBP, con un picco durante il 13° giorno. Induction of acute EAE in Lewis rats produced significant sensorimotor deficits (detected by a dedicated rating scale) starting on day 10 after MBP injection, peaking during day 13.

L'analisi degli score clinici ha rivelato una differenza significativa tra il gruppo trattato con il veicolo e quelli trattati con oATP (a due diversi dosaggi) nel periodo compreso tra il 12° e il 15° giorno. Analysis of clinical scores revealed a significant difference between the vehicle group and those treated with oATP (at two different dosages) in the period between the 12th and the 15th day.

Il valore medio più alto di deficit neurologico per il gruppo veicolo è risultato pari a 3 (giorno 13); tale valore si è ridotto a 2,3 nel gruppo oATP 0,1 mg/kg e a 1,5 nel gruppo oATP 1 mg/kg (vedasi fig. 10). The highest mean value of neurological deficit for the vehicle group was equal to 3 (day 13); this value decreased to 2.3 in the 0.1 mg / kg oATP group and to 1.5 in the 1 mg / kg oATP group (see Fig. 10).

Conclusioni Conclusions

Questi risultati suggeriscono che l'oATP (a dosi pari a 0,1 e a 1 mg/kg per os) ha un sostanziale effetto nel ridurre i sintomi e nel favorire il ripristino della funzionalità sensomotoria in un modello di EAE acuta nel ratto. These results suggest that OATP (at doses of 0.1 and 1 mg / kg orally) has a substantial effect in reducing symptoms and promoting restoration of sensorimotor function in an acute rat model of EAE.

Gli animali trattati con oATP hanno mostrato una sintomatologia notevolmente ridotta rispetto al gruppo di controllo; tale effetto è dose dipendente, dato che il gruppo ad alto dosaggio ha mostrato il miglior profilo di neuroprotezione. The animals treated with oATP showed significantly reduced symptoms compared to the control group; this effect is dose dependent, given that the high dose group showed the best neuroprotection profile.

I risultati ottenuti permettono inoltre di preconizzare l'impiego di oATP per il trattamento di pazienti diabetici sia di tipo I, sia di tipo II. The results obtained also make it possible to anticipate the use of oATP for the treatment of both type I and type II diabetic patients.

Il diabete di tipo I è una patologia autoimmune, come l'artrite reumatoide, ed i meccanismi alla base della patogenesi dell'autoimmunità possono essere efficacemente modulati dal trattamento con oATP, che riduce sia la diabetesi, che l'attivazione delle cellule immunocompetenti. Type I diabetes is an autoimmune disease, like rheumatoid arthritis, and the mechanisms underlying the pathogenesis of autoimmunity can be effectively modulated by treatment with oATP, which reduces both diabetes and the activation of immunocompetent cells.

L'impiego di oATP risulta utile altresì in pazienti diabetici che necessitano di un trapianto di insule pancreatiche. The use of oATP is also useful in diabetic patients who need a pancreatic islet transplant.

Anche il diabete di tipo II può giovarsi del trattamento con oATP, poiché l'insulite a carico del pancreas è caratterizzata da rilascio di molte citochemochine, la cui produzione può essere contrastata efficacemente dall’effetto immunosoppressivo indotto dalla somministrazione di oATP. Type II diabetes can also benefit from treatment with oATP, since insulitis affecting the pancreas is characterized by the release of many cytochemokines, the production of which can be effectively counteracted by the immunosuppressive effect induced by the administration of oATP.

Claims

CLAIMS 1. Compound adenosine-5'-triphosphate-2 ', 3'-dialdehyde for use as an immunosuppressive drug.

Compound according to claim 1, according to its use as an active principle having anti-rejection activity in organ transplants.

Compound according to claim 1, for use in the therapeutic treatment of autoimmune diseases.

4. Compound according to claims 1 or 3, for use in the therapeutic treatment of systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, scleroderma, Sjogren's syndrome, Erdheim-Chester syndrome, rheumatoid arthritis, psoriasis, Crohn's disease, Takayasu's arteritis, type I diabetes and type II diabetes.

5. Use of adenosine-5'-triphosphate-2 ', 3'-dialdehyde for the preparation of a medicament having immunosuppressive activity.

6. Use according to claim 5, for the preparation of a medicament useful for the therapeutic treatment of autoimmune diseases.

7. Use according to claims 5 or 6, for the preparation of a medicament for the therapeutic treatment of an autoimmune disease selected from the group consisting of systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, scleroderma, Sjogren's syndrome, Erdheim-Chester syndrome, psoriasis , Crohn's disease, Takayasu's arteritis, rheumatoid arthritis, type I diabetes and type II diabetes.

8. Use according to claims 5 or 6, for the preparation of a medicament with anti-rejection activity in organ transplants.

9. Pharmaceutical composition comprising adenosine-5'-triphosphate-2 ', 3'-dialdehyde in combination with an immunosuppressive drug.

10. Pharmaceutical preparation containing adenosine-5'-triphosphate-2 ', 3'-dialdehyde in combination with an immunosuppressive drug for simultaneous, separate or sequential use in the treatment of autoimmune diseases.