ITTO20080644A1 - Procedimento per la preparazione di cellule dendritiche caricate con cellule tumorali, cellule dendritiche caricate con cellule tumorali cosi' ottenute e loro utilizzazioni - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Procedimento per la preparazione di cellule dendritiche caricate con cellule tumorali, cellule dendritiche caricate con cellule tumorali così ottenute e loro utilizzazioni".

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce in generale alla preparazione di cellule aventi proprietà immunogeniche antitumorali, e più in particolare a un procedimento per la preparazione di cellule dendritiche caricate con cellule tumorali, nonché alle cellule dendritiche caricate con cellule tumorali ottenibili con il procedimento dell'invenzione .

Le cellule dendritiche caricate con cellule tumorali dell'invenzione sono particolarmente utili ed efficaci per l'impiego come vaccino antitumorale o composizione immunogenica antitumorale.

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti 1'antigene (APC) specializzate nella cattura e nella processazione degli antigeni in frammenti peptidici, i quali a loro volta vengono complessati con le molecole del sistema MHC espresse sulla superficie della membrana cellulare e presentati ai linfociti T per iniziare la risposta immune. Le DC esprimono infatti in grande quantità gli antigeni HLA di classe I E II e le molecole dì costimolazione CD80, CD86, CD40.

Le DC caricate con antigeni sono in grado di stimolare la risposta sia di linfociti T memoria sia di linfociti T naive. Le DC mostrano inoltre la capacità di produrre numerose citochine, tra le quali l'interleuchina 12 (IL-12) che favorisce le risposte immuni di tipo citotossico. Le DC sono presenti in tutto l'organismo umano, specialmente nei tessuti periferici che fungono da barriera nei confronti dell'ambiente circostante quali la cute e le mucose. In questi tessuti le DC si trovano in uno stato immaturo (iDC), caratterizzato da un'elevata capacità di cattura e processazione degli antigeni ma una scarsa capacità di attivazione dei linfociti T. La cattura dell'antigene induce la trasformazione delle iDC in cellule dendritiche mature (mDC), le quali sono al contrario caratterizzate dall'espressione di elevati livelli di molecole MHC sulla superficie di membrana e da una diminuita capacità di cattura e processazione dell'antigene.

Le proprietà immunogeniche delle cellule dendritiche caricate con antigeni tumorali e il loro possibile utilizzo in strategie di immunizzazione volte a stimolare una immunità specifica antitumorale sono noti nella tecnica anteriore .

Le cellule tumorali sono di per sé scarsamente immunogeniche. Il caricamento di antigeni tumorali in cellule dendritiche ha lo scopo di aumentare la loro l'immunogenicità.

Nello stato della tecnica sono descritte diverse strategie per caricare antigeni tumorali in cellule dendritiche. Per esempio è stata proposta una strategia basata sulla fusione fra DC murine e cellule tumorali, grazie alla quale sono state ottenute cellule tumorali dotate di caratteristiche funzionali tipiche delle DC.

L'individuazione di antigeni tumorali peptidici atti ad essere presentati ai linfociti T in associazione con antigeni HLA di classe I e a stimolare quindi risposte immuni citotossiche ha formato la base per una strategia di "pulsing" delle cellule dendritiche con singoli peptidi tumorali o con cocktail di peptidi derivanti da diversi antigeni tumorali. In alternativa all'uso di peptidi purificati è anche stato descritto l'impiego di frazioni proteiche non purificate, di cellule apoptotiche e di lisati tumorali.

La domanda di brevetto internazionale WO 2008/032153 di OBEID M S [1] descrive il trattamento di cellule tumorali con antracicline allo scopo di indurre la "morte cellulare immunogenica" delle cellule tumorali, accompagnata dalla traslocazione delle molecole calreticolina (CRT) e/o ERP57 alla superficie di membrana con il conseguente aumento della fagocitosi da parte delle cellule dendritiche.

Obeid M S et al., Celi Death and Differentiation (2007) 14, 1848-1850 (pubblicato on-line il 27 luglio 2007) [2] descrivono inoltre che l'apoptosi ed il conseguente aumento della fagocitosi da parte delle cellule dendritiche possono essere causati non solo da stimoli farmacologici, ma anche da radiazioni γ e dall'esposizione a luce UVC. Gli autori affermano che sia le cellule tumorali sottoposte a radiazioni γ sia quelle esposte a luce UVC espongono la molecola CRT sulla propria superficie e si dimostrano utili come vaccini anticancro.

I presenti inventori hanno ora sviluppato un procedimento estremamente vantaggioso per la preparazione di cellule dendritiche caricate con cellule tumorali, che consente di incrementare significativamente la percentuale di cattura degli antigeni tumorali nelle cellule dendritiche e che permette di ottenere una risposta immunogenica antitumorale particolarmente potente.

Un primo aspetto dell'invenzione è quindi un procedimento per la preparazione di cellule dendritiche caricate con cellule tumorali, comprendente i passaggi di:

(i) esporre cellule tumorali ad almeno 3 J/cm<2>di luce UVC in modo tale da determinare la necrosi secondaria delle cellule tumorali; e

(ii) co-incubare le cellule tumorali esposte a luce UVC con cellule dendritiche immature (iDC) in condizioni atte a favorire la cattura delle cellule tumorali esposte a luce UVC nelle cellule dendritiche e la successiva cross-presentazione degli antigeni tumorali sulla superficie di membrana delle cellule dendritiche.

Secondo una forma di realizzazione preferita, le cellule tumorali sono esposte a 3-100 J/cm<2>di luce UVC.

Secondo un'altra forma di realizzazione preferita, le cellule esposte a luce UVC come indicato in precedenza vengono co-incubate con cellule dendritiche immature (iDC) - ottenute per esempio dopo incubazione dei monociti per un periodo di tempo adatto, ad esempio 6 giorni - in un mezzo di coltura comprendente GM-CSF e interleuchina-4 (IL-4), così da ottenere cellule dendritiche immature (iDC). caricate con le cellule tumorali .

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione preferita, le iDC caricate con cellule tumorali ottenute come indicato sopra vengono fatte maturare mediante coltura in un mezzo comprendente uno o più fattori maturativi, ad esempio scelti fra TNF-α, PGE2, IL-Ιβ, IL-6, CD40 o qualsiasi loro combinazione, cosi da ottenere cellule dendritiche mature (mDC) presentanti efficacemente gli antigeni tumorali .

I tipi di cellula tumorale che possono essere trattati con il procedimento dell'invenzione includono, senza limitazione, qualsiasi sarcoma e carcinoma umano, per esempio fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma , sarcoma osteogenico, condroma, angiosarcoma , endoteliosarcoma , linfangiosarcoma, linf angioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma di Ewing, leiomiosarcoma, rabdosarcoma , carcinoma del colon, cancro del pancreas, cancro della mammella, cancro dell'ovaio, cancro della prostata, carcinoma a cellule squamose, carcinoma a cellule basali, adenocarcinoma, carcinoma delle ghiandole sudoripare, carcinoma delle ghiandole sebacee, carcinoma papillare, adenocarcinomi papillari, cistadenocarcinoma , carcinoma medullare, carcinoma broncogeno, carcinoma delle cellule renali, epatoma, carcinoma del dotto biliare, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionale, tumore di Wilms, cancro della cervice, tumore del testicolo, carcinoma polmonare, carcinoma polmonare a cellule piccole, carcinoma della vescica, carcinoma epiteliale, glioma, astrocitoma, medulloblastoma, craniof aringioma , ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma , meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma ; leucemie, quali ad esempio leucemia linfocitica acuta (mieloblastica, mielomonocitica, monocitica e eritroleucemia) ; leucemie linfocitiche croniche; policitemia vera, linfoma (linfoma di Hodgkin e linfoma non Hodgkin), mieloma multiplo, macroglobulinemia di Waldenstróm, e malattia della catena pesante.

Gli inventori hanno verificato che con la dose sopra definita di luce UVC, le cellule tumorali vanno incontro non soltanto ad apoptosi, come già descritto in [2], ma anche a necrosi secondaria post-apoptotica, il che determina un incremento della immunogenicità superiore rispetto a ciò che si ottiene con i trattamenti convenzionali mediante radiazioni γ o antracicline.

Più in particolare, gli inventori hanno osservato che sottoponendo una linea cellulare K1 di carcinoma renale (RCC) al trattamento con luce UVC come definito nel passaggio a) del procedimento, dopo 4 ore dal trattamento viene indotta una combinazione di caratteristiche fenotipiche apoptotiche (mobilizzazione sulla membrana piasmatica della fosfatidilserina (PS) e della calreticolina) e necrotiche (incompetenza della membrana), che non si osservano dopo trattamento con radiazioni γ o antracicline. La heat shock protein Hsp-70 e la proteina HGMB1 (chromatin-bound high niobility box 1), tipiche della necrosi, vengono rilasciate nelle successive 20 ore e quindi rese accessibili alle DC immature (iDC) derivate da monociti co-coltivati. Le linee cellulari di carcinoma renale trattate con UVC che sono andate incontro a necrosi secondaria vengono cross-presentate con maggiore efficienza dalle mDC ottenute dopo trattamento con citochine rispetto alle loro controparti apoptotiche (ossia sottoposte a trattamento con radiazioni γ). Inoltre, alcuni eventi ancor più a monte - quali un'incrementata captazione del tumore, l'attivazione di geni coinvolti nel meccanismo di processazione dell'antigene , un'aumentata espressione di molecole di costimolazione e maturazione - si osservano solo dopo il caricamento delle iDC con cellule tumorali andate incontro a necrosi secondaria ma non dopo il caricamento con cellule tumorali apoptotiche. Infine, gli inventori hanno osservato che l'induzione della necrosi secondaria delle cellule tumorali, tramite ad esempio trattamento con UVC, ha l'effetto di invertire le proprietà immunosoppressorie del tumore.

Risultati analoghi sono stati ottenuti sperimentalmente anche con cellule di carcinoma prostatico e gastrico.

Queste ed altre caratteristiche, che saranno illustrate in maggiore dettaglio nella parte sperimentale e nella discussione che seguono, rendono le cellule dendritiche mature caricate con cellule tumorali andate incontro a necrosi secondaria, preferibilmente ottenute mediante il procedimento dell'invenzione, particolarmente adatte per l'uso come medicamento (vaccino o composizione immunogenica) antitumorale. Una metodologia alternativa per promuovere la necrosi secondaria del tumore potrebbe essere il riscaldamento delle cellule (ipertermia).

La preparazione del medicamento dell'invenzione, ivi inclusa la selezione di un veicolo farmaceuticamente accettabile e la scelta degli eccipienti e/o adiuvanti, rientra nelle capacità del tecnico medio del settore. Anche la selezione della dose in funzione di parametri quali la malattia da trattare, la forma farmaceutica, l'età, il sesso e il peso del paziente, rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

Il procedimento dell'invenzione potrebbe ugualmente essere applicato in vivo ad un paziente affetto da tumore, con lo scopo di promuovere la necrosi secondaria delle cellule tumorali, allo scopo di ridurre le proprietà immunosoppressorie del tumorale aumentando al contempo le sue proprietà immunogeniche.

L'invenzione verrà ora descritta in maggiore dettaglio nella parte sperimentale che segue, facendo riferimento ai disegni annessi in cui:

La figura 1 mostra come il trattamento con UVC induca il maggior numero di cellule esprimenti marcatori apoptotici e necrotici. La linea cellulare di carcinoma renale K1 è stata sottoposta ai seguenti trattamenti: incubazione con mezzo RPMI privo di siero (apoptosi), 70% acqua distillata (necrosi) , 25μΜ doxorubicina (DOXO), ΙμΜ mitoxantrone (MITOX) 8 nM camptotecina (CAMPTO), 90Gy (irr) e 3,6 J/cm<2>UVC (UVC). E' stata effettuata l'analisi delle cinetiche temporali dell'esposizione di PS (AnnV+), della permeabilizzazione della membrana (PI+), o di entrambi (AnnV+PI+). L'incompetenza della membrana era rivelabile a 4 ore solo nelle colture trattate con UVC o doxorubicina, la necrosi secondaria (AnnV+PI+) essendo molto più evidente nelle prime. I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti .

La figura 2 mostra che AnnV reagisce con PS esternalizzata . Le cellule K1 sono state trattate con UVC come descritto nella legenda della figura 1 e a tempi diversi dal trattamento sono state colorate con AnnV e PI o con il mAb anti-CRT 619 TO-11 e PI. Le cinetiche della doppia positività AnnV/PI (riquadro centrale della figura 1) sono confrontate (riquadro superiore) con quelle della doppia positività CRT/PI. La positività transitoria della popolazione PI+ per AnnV (A), in contrasto con la positività stabile per CRT (B), mostra che la prima non è dovuta alla mera colorazione della PS presente sulla faccia interna della membrana distrutta (PI+).

La figura 3 mostra che la percentuale di cellule CRT+ della popolazione PI- aumenta dopo trattamento con UVC. Le cellule K1 sono state: non trattate (un) o trattate con 90 Gy di radiazione γ (irr) o con 3,6 J/cm<2>di UVC (uve) e dopo 4 ore sono state colorate con PI e con il mAb anti-CRT 619 TO-11 o un anticorpo di conìglio anti-CRT umana (Stressgen) . La percentuale di cellule CRT+ vitali (popolazone PI-) era notevolmente aumentata dopo trattamento con UVC. I risultati sono la media ± deviazione standard di 2 esperimenti con mAb anti-CRT 619 TO-11. Risultati sovrapponibili sono stati ottenuti in altri 2 esperimenti utilizzando 1'anticorpo di coniglio anti-CRT umana (non mostrato) .

La figura 4 mostra che UVC e radiazioni γ sono stimoli rappresentativi dell'apoptosi e della necrosi post-apoptosi. Grafici a punti rappresentativi di 6 esperimenti mostrano la preponderanza di cellule Ann+PI- e di cellule Ann+PI+ rispettivamente dopo trattamenti con radiazioni γ e UVC. UN: non trattati.

La figura 5 mostra che il trattamento con UVC incrementa il cross-priming di precursori di CTL. Le iDC incubate per 20 ore con cellule tumorali non trattate (UN), irradiate con radiazioni γ (IRR) o irradiate con UVC sono state fatte maturare ulteriormente in presenza di un cocktail di citochine e sono state usate come stimolatori di linfociti autoioghi. La stimolazione è stata ripetura 2 volte e 5 giorni dopo la terza stimolazione è stata valutata la risposta antitumorale specifica. (A) Il rilascio di IFN-γ è stato valutato con un saggio ELISPOT a 24 ore contro mDC caricate con lisato di K1 (DC+LysKl) come bersagli. La restrizione MHC I della risposta è stata valutata pre-incubando i bersagli con il mAb anti-MHC di classe I W6/32 (25 pg/ml) o una quantità eguale di mAb irrilevante isotype-matched. La differenza della risposta MHC I-ristretta in colture di linfociti stimolati con DC caricate con K1UN rispetto a colture di linfociti stimolate con DC caricate con K1UVC era statisticamente significativa (p<0,003, risultati di 6 esperimenti) . Gli spot nelle colture con PMA-ionomicina erano 180 ± 15. (B) La citometria a flusso della colorazione intracellulare mostrava che il numero maggiore di cellule CD8<+>anti-IFN-y<+>si sviluppava in colture stimolate con DCK1UVC (media ± deviazione standard di 2 esperimenti). (C) La colorazione intracellulare con il mAb anti-CDl07a, un marcatore associato ai lisosomi dell'attività di degranulazione, era anch'essa maggiore in linfociti stimolati con DC-K1UVC rispetto ai linfociti stimolati con DCK1UN (p>0,05) (media ± deviazione standard di 4 esperimenti). (D) Il trattamento con UVC della linea cellulare HLA-A2+ RCC53 di carcinoma renale induceva anch'esso un crosspriming dei CTL, come valutato nel saggio ELISPOT del rilascio di IFN-γ. La specificità dei CTL è stata dimostrata usando come bersagli delle mDC autologhe non caricate, pulsate con lisato di Kl, o pulsate con il peptide MUC-1 STAPPVHNV. Dati rappresentativi di 2 esperimenti.

La figura 6 mostra che il rilascio di molecole DAMP (Damage Associated Molecular Pattern) si verifica durante la coincubazione iDC-KlUVC. L'analisi Western blot dei surnatanti di K1UVC mostra che il rilascio di Hsp70 e HMGB1 è virtualmente non rilevabile all'inizio della coincubazione iDC-tumore (4 ore dopo il trattamento) ma si sviluppa successivamente (cioè dopo 24 ore dal trattamento). I risultati sono rappresentativi di almeno 3 esperimenti con 1'anticorpo policlonale 4872 anti-Hsp70. Risultati similari sono stati ottenuti con il mAb W27 SC-24 (non mostrato).

La figura 7 mostra che le cellule K1 trattate con UVC vengono catturate dalle iDC con efficienza maggiore. Cellule tumorali K1 non trattate (Klun), sottoposte a radiazioni γ (irr) e trattate con UVC (Kluvc) sono state colorate di verde con PKH2, incubate con iDC e dopo 20 ore testate con il mAb PE-anti-CD80 . (A) La citometria a flusso di un esperimento rappresentativo mostra un numero incrementato di iDC fagocitanti quando le cellule K1 vengono trattate con UVC. Non si osservano cambiamenti quando le iDC-tumore vengono coltivate a 4°C. (B) La microscopia a fluorescenza mostra un numero incrementato di iDC fagocitanti (frecce) in presenza del tumore trattato con UVC (destra) rispetto al tumore non trattato (sinistra). (ingrandimento X200: ciascuna immagine è rappresentativa di almeno 10 campi da vetrini in duplicato) . (C) Media ± deviazione standard captazione netta percentuale (valori a 37°C meno valori a 4° C) da 4 esperimenti p<0,05. (D) captazione di cellule K1 in presenza di mAb anti-RAGE (media di 2 esperimenti).

La figura 8 mostra che la fagocitosi di cellule K1 trattate con UVC induce eventi maturativi nelle iDC. Le iDC sono state incubate per 20 ore con cellule K1 non trattate o trattate con UVC. Dopo incubazione per altre 48 ore con TNF-α, PGE2, IL-Ιβ e IL-6, le mDC sono state testate per l'espressione dei marcatori di maturazione CD80, CD83 e CCR7. Il possibile coinvolgimento di HMGB1 nella maturazione di DC indotta da K1 è stato valutato pre-incubando le iDC con il mAb diretto contro il recettore RAGE (A, colonna di destra) o con la IgG di controllo (A, colonna di sinistra) prima di essere caricate con le cellule non trattate o trattate con UVC. A: un esperimento rappresentativo. B media ± deviazione standard di 3 esperimenti che mostra un incremento significativo dei marcatori CD80, CD83 e CCR7 su DC caricate con UVC-K1 trattate (IgG Kluvc) rispetto alle stesse DC caricate con Kl non trattate (IgG Kl) e nessuna differenza fra DC caricate con UVC-K1 che erano state pretrattate con 1'isotipo IgG (IgG Kluvc) e DC caricate con UVC-K1 che erano state pretrattate con il mAb anti-RAGE (RAGE Kluvc).

PARTE SPERIMENTALE MATERIALI E METODI

Reagenti

Il fattore di crescita dei granulociti e dei macrofagi umano ricombinante (GM-CSF) è stato acquistato da Sigma-Aldrich (Milano, Italia). IL-4, IL-Ιβ, IL- 6 e TNF-α sono state acquistate da Preprotech, IL-2 da Chiron (Milano, Italia) e PGE2 da Cayman Chemical Company (Inalco s.p.a., Milano, Italia .

Cellule tumorali

Le linee di cellule RCC Kl [3] e RCC53 (un dono della dottoressa Dolores J. Schendel, Istituto di Immunologia Molecolare, Monaco, Germania) sono state fatte crescere come colture in sospensione in mezzo RPMI 1640 (Sigma-Aldrich), 10% FCS inattivato al calore (Life Technologies Ltd, Paisley, Scozia, Regno Unito) e 1 mg/ml L-glutammina e subcoltivate ogni 2-3 giorni. Le cellule aderenti sono state staccate grattando con cautela per l'analisi in citometria a flusso o trattando con tripsina per l'uso in coltura.

Ottenimento di iDC

Le iDC sono state generate come descritto in [4]. Cellule mononueleate di sangue periferico (PBMC) sono state isolate da sangue eparinizzato di donatori della banca del sangue mediante centrifugazione su gradiente di densità standard (Histopaque-1077 , Sigma-Aldrich), lavate con mezzo RPMI 1640 integrato con 5 mM EDTA (Sigma-Aldrich) e 2% FCS inattivato al calore (Life Technologies) e sospese a 5x10<6>/ml in mezzo RPMI 1640 integrato con 10% FCS. Dopo 2 ore di incubazione a 37°C in un incubatore umidificato con 5% C02, le cellule non aderenti sono state rimosse e congelate per il successivo utilizzo come linfociti autoioghi. Le cellule aderenti sono state coltivate nel mezzo completo di cui sopra, integrato con GM-CSF (1.000 U/ml) e IL-4 (1.000 U/ml). Le citochine sono state sostituite il giorno 3 e le iDC sono state raccolte il giorno 6.

Analisi in citometria a flusso dei marcatori di membrana delle PC

L'espressione delle varie molecole sulle DC è stata analizzata con i seguenti anticorpi monoclonali (mAb): anti-CD80 coniugato con PE (Becton Dickinson, Milano, Italia), anti-CD107a mAb (Becton Dickinson), anti-CCR7 (R&D Systems), anti-CD83 (Ancell Bayport, MN, Stati Uniti d'America), anti-CD36 coniugato con FITC (e-Bioscience, San Diego, CA, Stati Uniti d'America) e anti-CD80 coniugato con APC (Genetex, San Antonio, TX, Stati Uniti d'America), usando gli appropriati controlli isotipici . Il mAb purificato diretto contro il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzata (RAGE) (R&D Systems Minneapolis, MN, Stati Uniti d'America) è stato usato a 10 ug/1x10<6>cellule in 50 μ1, seguito da PE capra anti-topo (Abcam, Cambridge Science Park, Cambridge, Regno Unito). Le cellule sono state lavate, fissate in PBS 1% paraformaldeide e analizzate con un FACSCalibur (Becton Dickinson). Per ciascun campione sono stati analizzati 10.000 eventi in totale.

Uccisione delle cellule tumorali

Le cellule K1 hanno ricevuto i seguenti trattamenti: irraggiamento γ (90 Gy), UVC (3,6 j/cm<2>) (lampada UVC PLS 9W/2P, W 2,3 Philips, Milano, Italia), 60% acqua distillata (come controllo per la necrosi), RPMI privo di siero (come controllo per l'apoptosi), le antracicline doxorubicina (25μΜ) (Sigma-Aldrich) e mitoxantrone (ΙμΜ) (Sigma-Aldrich) o 1'inibitore della topoisomerasi camptotecina (8 nM) (Sigma-Aldrich).

Analisi dei parametri di morte tumorale mediante citometria a flusso

Dopo 4, 24 o 48 ore dai trattamenti di cui sopra le cellule K1 sono state colorate con Annexina V-FITC (AnnV) (Becton Dickinson) che lega la fosfatidilserina (PS) o con mAb anti-CRT 619 TO-11 (un dono di S. Ferrone, Roswell Park Center University of Buffalo, NY, Stati Uniti d'America) o anti- CRT umano di coniglio (Stressgen, Temaricerca, Bologna, Italia) (seguito da FITC anti-topo) , come marcatori di apoptosi e ioduro di propidio che lega il DNA (PI) (Dako, Milano Italia). L'analisi citometrica è stata effettuata come descritto sopra.

Analisi del rilascio delle molecole DAMP (Hsp>70 e HMGB1}

Il rilascio di Hsp70 e HMGB1 è stato studiato mediante iminunoblot. Ai tempi indicati, le cellule sono state centrifugate (1.200 rpm) e i surnatanti sono stati raccolti e trattati con tampone RIPA e inibitori delle proteasi. Volumi uguali (10 μ1) sono stati separati mediante SDS-PAGE (gel di risoluzione al 12%) e trasferiti su nitrocellulosa. I filtri sono stati incubati con mAb anti-Hsp70 clone W27 SC-24 (Santa Cruz Biotechnology, DBA Italia Segrate, Milano, Italia), policlonale 4872 anti-Hsp70 (Celi Signalling Celbio Pero, Milano, Italia), policlonale di coniglio anti-HMGBl (ab 18256; Abcam) o policloonale di coniglio antitubulina N357 (GE Healthcare, Milano, Italia). I mAb/Abs primari sono stati riconosciuti rispettivamente con anticorpo anti- IgG di topo legato a HRP (Biorad, Milano, Italia) e anticorpo anti-IgG di coniglio legato a HRP (ab 7074; Celi Signaling) . Le proteine sono state rivelate mediante ECL (Amersham, Milano, Italia). Le immagini sono state catturate con CanoScan FB1210U Canon e processate con Adobe Photoshop Microsoft Office Picture e Manager ScanGear CS-U.

Cattura dei tumori in fase di morte da parte delle iDC

Le cellule tumorali sono state colorate di verde con PKH2 (Sigma-Aldrich) secondo le istruzioni del produttore, prima di ricevere i trattamenti letali. Dopo 4 ore le cellule tumorali sono state lavate e incubate per 20 ore a 37° C con 1x10<5>iDC in rapporto 2:1 e la coltura mista è stata colorata con il mAb CD80 PE (20 minuti a 4°C). La fagocitosi delle cellule tumorali da parte delle iDC è stata valutata mediante citometria a flusso ed è stata valutata la percentuale di cellule con doppia colorazione rispetto alle cellule rosse (CD80 PE) su un totale di 10.000. In alcuni esperimenti le modificazioni maturative delle DC coltivate con il tumore non colorato sono state studiate sulla popolazione cellule CD80+ (APC anti-CD80) usando il mAb CCR7 PE (R&D) e il mAb CD83 PE (Ancell). Per l'analisi della fagocitosi del tumore in microscopia, le DC e le cellule tumorali coltivate e colorate come descritto sopra sono state montate su un vetrino coprioggetto in Acqueous Gel Mounting (Sigma-Aldrich) e la fluorescenza è stata valutata con filtri FITC e TRIC con un microscopio a fluorescenza (Olympus BX41) equipaggiato con una fotocamera Leica DFC320 e software Leica Qwin . Le immagini sono state processate con Adobe Photoshop 5.0.

Cross-priming di linfociti con PC autologhe caricate con tumore

Quattro ore dopo i trattamenti indicati, le cellule K1 sono state mescolate con iDC in rapporto 2:1 e l'incubazione è stata fatta procedere per 20 ore in un mezzo contenente GM-CSF e IL-4. Le iDC sono poi state esposte per altre 48 ore ad un altro mezzo contenente un cocktail di citochine maturative TNF-α (10 ng/ml), PGE2 (1 mg/ml), IL-Ιβ (1 ng/ml) e IL-6 (10 ng/ml) e aggiunte a linfociti T autoioghi in rapporto 1:10. rIL-2 (20 U/ml) è stato aggiunto alle colture dopo 24 ore e la procedura è stata ripetuta ogni settimana fino ad un totale di 3 stimolazioni. L'ottenimento di una risposta antitumorale specifica è stato valutato 5 giorni dopo l'ultima stimolazione come descritto sotto .

Saggio ELISPOT del rilascio di INF-γ MHC classe I-ristretto

La frequenza di linfociti T secernenti IFN-y nelle colture è stata valutata con un saggio ELISPOT, come descritto precedentemente [4]. Piastre da microtitolazione a 96 pozzetti con membrana di nitrocellulosa (Multiscreen, Millipore, Vimodrome, Milano, Italia) sono state rivestite con mAb anti-IFN-γ (PharMingen). 10<5>cellule T (numero iniziale in coltura) sono state seminate in triplicato in pozzetti contenenti mezzo da solo, forbolo miristato acetato (50 ng/ml, Sigma-Aldrich) e ionomicina (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), le mDC non caricate, caricate con lisato di cellule K1 o caricate con peptide MUC-1 STAPPVHNV come bersagli in rapporto 1:2. I bersagli sono stati tenuti a 4°C per 20 minuti con il mAb bloccante anti MHC di classe I umane W6/32 (Serotec, DBA Italia s.r.l., Milano, Italia) o un mAb dello stesso isotipo (Becton Dickinson) (25 μg/ml per entrambi) prima di essere usati come bersagli. Dopo 24 ore, le cellule sono state lisate con acqua distillata e un mAb biotinilato anti-IFN-γ (PharMingen) è stato aggiunto ai pozzetti, seguito da coniugato streptavidinaperossidasi di rafano (PharMingen). La soluzione del substrato (3-ammino-9-etilcarbazolo) (Sigma-Aldrich) è stata poi aggiunta e dopo 30 minuti la reazione è stata fermata risciacquando con acqua di rubinetto. Le piastre sono state lasciate asciugare per una notte, dopodiché sono stati rivelati degli spot rossi (indicativi di linfociti reattivi) con il lettore AID Elispot-Reader (Bioline Amplimedical , Milano, Italia).

Colorazione intracellulare per citometria a flusso Le cellule sono state fissate con 4% paraformaldeide e permeabilizzate con un tampone contenente 0,1% di saponina (Sigma). L'analisi di IFN-γ è stata effettuata con anti-INF-γ coniugato con FITC (Becton Dickinson) sulle cellule CD8+. La degranulazione da parte dei linfociti (come segno di attivazione indotta dal bersaglio) è stata rivelata con il mAb antì-CD107a.

Isolamento dell'RNA totale

Le cellule sono state omogeneizzate con un omogeneizzatore e l'RNA totale è stato isolato secondo il protocollo TriReagent standard (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, Stati Uniti d'America).

Analisi con microarray

Per ciascun campione, l'mRNA è stato amplificato a partire da 1 ug di RNA totale per campione utilizzando il kit Amino Allyl MessageAmp II aRNA (Ambion Inc. Austin TX, Stati Uniti d'America) per ottenere RNA ammino-allìl antisenso secondo il procedimento sviluppato da Eberwine e collaboratori [5], E' stato effettuato un solo ciclo di amplificazione, secondo il protocollo del produttore e con modificazioni minime. In breve: l'mRNA è stato retrotrascitto in cDNA singolo filamento; dopo la sintesi del secondo filamento, il cDNA è stato trascritto in vitro in aaRNA includente un nucleotide ammino-allil -modificato (aaUTP). Sia ccDNA sia aaRNA sono stati sottoposti ad un passaggio di purificazione su colonna fornita insieme al kit. La marcatura è stata effettuata usando coloranti Cy3 o Cy5 estere NHS (GE Healthcare Europe GMBH, Uppsala, Svezia) capaci di reagire con l'RNA modificato. Almeno 5 μg di mRNA, per ciascun campione, sono stati marcati e purificati su colonne. L'ibridazione con replica tecnica con fluorescenti invertiti, è stata effettuata per confrontare i campioni e il riferimento. La stessa quantità di campione e di riferimento marcati differenzialmente (0,75 μ per array 44K e 0,825 ug per array 4X44K) è stata messa insieme, frammentata e ibridata con array oligonucleotidici di vetro con sequenze che rappresentano oltre 37.000 geni umani completi ben caratterizzati (Human Oligo Whole Genome Microarray 44K e 4X44K, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Tutti i passaggi sono stati effettuati seguendo il protocollo "60-mer oligo microarray processing protocol" (Agilent Technologies) per gli array 44K e il protocollo "Two-Color MicroarrayBased Gene Expression Analysis" per gli array 4X44K. Poi i vetrini sono stati lavati con la procedura di lavaggio SSPE, Acetonitrile e Soluzione di ascugatura, (Agilent Technologies) e scansionati con lo scanner dual-laser microarray Agilent G2505B (Agilent Technologies). La qualità dell'RNA totale e dell'mRNA sono state verificate con saggi RNA 6000 nano chip (Agilent Technologies) e con il bioanalizzatore Agilent 2100. Le concentrazioni e la marcatura sono stati verificati con lo spettrofotometro NanoDrop ND-1000.

Analisi statistica

La significatività statistica dei risultati dei trattamenti è stata calcolata usando il test t di Student per i dati parametrici (percentuale di cellule con doppia colorazione) e il test di Wilcoxon per i dati non parametrici (saggi ELISA ed ELISPOT) .

Risultati

Il trattamento con UVC è il miglior induttore di necrosi secondaria

La capacità dei diversi stimoli applicati di indurre apoptosi, necrosi o marcatori misti di apoptosi e necrosi è stata valutata nell'arco in un periodi di osservazione di 4-48 ore. La citometria a flusso con AnnV e PI (figura 1) ha mostrato che l'esternalizzazione di PS in assenza di permeabilizzazione di membrana (il fenotipo AnnV+PI- indicativo di una fase precoce di apoptosi) veniva indotta dallo stimolo apoptotico di controllo (ossia la deprivazione di insulinaselenio- transf errina) , mitoxantrone, camptotecina e irraggiamento γ e veniva osservata solo a 4 ore, poi diminuendo. Al contrario, l'incompetenza di membrana in assenza di esternalizzazione di PS (il fenotipo PI+AnnV- indicativo di necrosi primaria) era rivelabile a 4 ore solo in colture trattate con doxorubicina e a livelli minori con UVC, ed aumentava in tutte le colture dopo 24 ore. E' importante il fatto che la luce UVC produceva entro 4 ore una proporzione molto maggiore di cellule esprimenti entrambi i marcatori (il fenotipo PI+AnnV+ indicativo di necrosi secondaria) , il che suggerisce una progressione delle cellule apoptotiche (AnnV+) verso l'incompetenza di membrana (confermata dal fatto che queste cellule non sono in grado di escludere il colorante tripan blue, dati non mostrati) . In questo contesto è necessario sottolineare che una colorazione intracellulare non specifica dovuta alla permealizzazione dì membrana potrebbe aver avuto luogo prima dell'esternalìzzazione della PS e potrebbe essere responsabile della colorazione per PS sulla membrana piasmatica interna. Tuttavia è possibile sostenere che questo non è accaduto, in quanto la colorazione per PS (cioè la positività per AnnV) scompariva quasi (2,33%) a 48 ore quando la maggior parte (97,12%) delle cellule era danneggiata sulla membrana (cioè era PI+) (figura 2A) . La natura transitoria e quindi specifica di AnnV contrasta con l'espressione stabile di un altro marcatore di apoptosi (CRT) (figura 2B), che viene traslocato sulla membrana cellulare dal reticolo endoplasmatico (ER) dopo l'applicazione di stimoli apoptotici [6].

Il trattamento con UVC è il miglior induttore dell 'esternalìzzazione della CRT

La valutazione dell'esternalìzzazione della CRT su cellule vitali (PI-) (2 esperimenti) ha mostrato una maggior percentuale di CRT+PI- nelle cellule K1 vive trattate con UVC (23% di cellule PI-) rispetto alle cellule K1 irraggiate con radiazioni γ (3,3%) o non trattate (1,2%) (figura 3).

UVC e irraggiamento y come modelli di apoptosi precoce e tardiva (necrosi secondaria)

In base alle caratteristiche sopra menzionate, la luce UVC e le radiazioni γ sono state scelte come modelli rispettivamente di morte necrotica secondaria post-apoptotica e di morte apoptotica precoce. In figura 4 sono forniti i singoli dati rappresentativi di 6 esperimenti, che mostrano il fenotipo AnnV/PI di cellule trattate con luce UVC o radiazioni γ a 4 ore.

L'ottenimento di CTL risulta aumentato caricando le iDC con tumori trattati con luce UVC

Dopo 4 ore (il tempo necessario per indurre la necrosi secondaria mediante UVC come mostrato nelle figure 1 e 4), le linee cellulari K1 o RCC53 sono state incubate con le iDC. Dopo 20 ore di incubazione con le cellule tumorali trattate e non trattate, le iDC sono state esposte al cocktail di citochine di maturazione per ottimizzare la loro attività di presentazione dell'antigene e dopo 48 ore sono state usate come stimolatori di linfociti autoioghi . La stimolazione è stata ripetuta tre volte in totale. Cinque giorni dopo la terza stimolazione, la risposta antitumorale specifica è stata valutata contro mDC caricate con lisato di K1 da congelamento/scongelamento, come bersaglio esprimente gli antigeni. La risposta ottenuta dai linfociti coltivati con le cellule dendritiche non caricate diminuiva quando venivano coltivati con DC caricate con K1 non trattate (DC-K1UN) (figura 5A risultati medi di 6 esperimenti) . Tuttavia, il trattamento delle cellule K1 con UVC aveva l'effetto di invertire significativamente questa inibizione. (DC-K1UN vs DC-K1UVC p<0,05). La risposta aumentata era MHC classe I-ristretta, poiché essa veniva ridotta dal mAb W6/32 bloccante MHC classe I. Non è stato osservato rilascio di IFN-γ in presenza di cellule K562 NK-sensibili (non mostrato) . Anche se le cellule CD4<+>erano la popolazione predominante nelle colture (intervallo del 50-65% in 9 esperimenti) , la citometria a flusso ha mostrato che la maggior parte dei linfociti esprimenti IFN-γ avevano il fenotipo CD8<+>e che in colture stimolate con DC-K1UVC vi era una percentuale molto maggiore dì cellule CD8<+>IFN-y<+>(figura 5B, media di 2 esperimenti). La valutazione del fenotipo citolitico in un saggio di degranulazione con il mAb anti-CD107a ha anche mostrato che vi è un incremento significativo in linfociti stimolati con DC-K1UVC rispetto ai linfociti stimolati con DC-K1UN (figura 5C media ± deviazione standard di 4 esperimenti p<0,05). La linea cellulare HLA-A2+ CC53 è stata trattata nello stesso modo per corroborare l'amplificazione del cross-prìming dei CTL da parte della necrosi secondaria indotta mediante UVC. Per verificare la specificità della risposta, in alcuni esperimenti il rilascio di IFN-γ è stato testato contro DC autologhe donatrici di HLA-A2+ non caricate, caricate con il lisato di K1 o pulsate con un peptide HLA-A2-ristretto STAPPVHNV di MUC-1, che è espresso sulla maggior parte dei tumori epiteliali [7]. I risultati della figura 5D mostrano che sia le cellule K1 sia le cellule RCC53 erano più efficaci quando trattate con UVC. In aggiunta, la differenza di risposta ai differenti bersagli conferma che i CTL generati dalle RCC trattate con UVC mantengono la loro specificità. Gli antigeni derivati da K1UVC processati e presentati dalle DC autologhe venivano riconosciuti da linfociti sensibilizzati con K1UVC, ma non da linfociti sensibilizzati con RCC53UVC. Vice versa, le DC autologhe caricate con il peptide MUC-1 venivano riconosciute dai linfociti sensibilizzati con RCC53UVC ma non dai linfociti sensibilizzati con K1UVC . Pertanto, i tumori che vanno incontro a necrosi secondaria ottenuta con UVC mettono a disposizione un'ampia gamma di antigeni associati a tumori (TAAs, tumor-associated antigens) per il percorso di cross-presentazione da parte delle cellule dendritiche.

Il trattamento con UVC induce la migrazione extracellulare di HSD70 e HMGB1

Poiché le cellule K1 trattate con UVC erano apparentemente morte per necrosi e poiché le molecole DAMP (indicatori di necrosi) Hsp70 e HMGB1 sono coinvolte nell'attivazione delle cellule dendritiche, gli inventori hanno studiato il loro rilascio durante l'incubazione delle iDC con il tumore K1 non trattato o trattato con UVC. Come mostrato in figura 6 (risultati rappresentativi di 4 esperimenti) , né Hsp70 né HMGB1 sono state rivelate nel surnatante di K1 a 4 ore dal trattamento con UVC quando, secondo il programma sperimentale, esse sono state esposte alle iDC. Queste molecole tuttavia erano presenti dopo 20 ore di incubazione (cioè 24 ore dal trattamento). E' stato osservato un rilascio di HMGB1 molto maggiore di Hsp70. Vale la pena notare che la β-tubulina, una proteina del citoscheletro, non era presente nel surnatante dopo un tempo prolungato dal trattamento con UVC. Quindi, nonostrante la perdita di competenza della membrana, le cellule trattate con UVC mantengono ancora la loro architettura, come confermato dall'esame microscopico (non mostrato) .

Il trattamento con UVC aumenta, la fagocitosi del tumore da parte delle iDC

La citometria a flusso ha mostrato che le cellule K1 trattate con UVC venivano catturate dalle iDC con maggior efficienza rispetto alle cellule K1 non trattate o trattate con radiazioni γ (captazione del 50,4 11,4% per K1UVC rispetto a 22,3 ± 14,6% per K1UN e 20,7 ± 13,8% per K1IRR). La figura 7A rappresenta i dot blot ottenuti da un esperimento rappresentativo e la figura 7B rappresenta la media ± deviazione standard di 4 esperimenti . La microscopia a fluorescenza ha confermato un aumento della captazione di K1UVC da parte delle iDC (figura 7C). La percentuale di iDC che esprimono il recettore di PS CD36 [8] rimaneva invariata dopo 20 ore di incubazione con K1UVC (non mostrato) , il che permette di escludere la sua partecipazione all'aumento della captazione del tumore durante le 20 ore di incubazione. E' stata esclusa anche la partecipazione di HMGB1, presente nel surnatante di K1UVC, all'aumento della captazione, poiché non si è riscontrata inibizione quando le iDC sono state pre-trattate con il mAb contro il recettore RAGE per HMGB1 (figura 7D).

Effetto della fagocitosi di tumori trattati con UVC sulla maturazione delle PC

Nello stato immaturo di riposo le cellule dendritiche catturano efficientemente gli antigeni, mentre dopo l'attivazione l 'aumento dell'espressione di MHC e di molecole costimolatorie permette loro di attivare le cellule T naive e di memoria e di modulare la risposta immune. L'effetto del caricamento delle DC con tumori trattati in modi diversi è stato studiato dopo incubazione di 20 ore con il tumore e altre 48 ore di incubazione con le citochine di maturazione TNF-α, PGE2, IL-Ιβ e IL-6, prima dell'impiego in esperimenti di cross-priming. La percentuale di iDC esprimenti le molecole di costimolazione CD80, CD83 e il recettore per le chemiochine CCR7 era già aumentata dopo 20 ore di incubazione con il tumore trattato con UVC (non mostrato) e l'aumento è stato confermato quando mDC caricate con K1UN sono state confrontate con mDC caricate con K1UVC (45% vs 75% p< 0,05 per CD80, 45% vs 100% p<0,05 per CD83, e 35% vs 90% p< 0,05 per CCR7) (figura 8A: dot blot della colonna di sinistra di un esperimento rappresentativo; figura 8B: media deviazione standard di 3 esperimenti). Poiché HMGB1 ha un forte effetto maturativo sulle cellule dendritiche [9, 10], il suo coinvolgimento nella maturazione delle DC indotta da K1UVC è stato valutato dopo aver bloccato il recettore RAGE per HMGB1 con un mAb antagonista. L'espressione di marcatori di maturazione non cambiava quando le iDCs venivano pretrattate con il mAb (figura 8A: dot blot della colonna di destra di un esperimento rappresentativo; figura 8B: media ± deviazione standard di 3 esperimenti) , il che indica che l'effetto non era dovuto a HMGB1.

Le iDC caricate con cellule K1 trattate con UVC esprimono molti trascritti di geni inumino-correlati L'analisi dell'mRNA è stata effettuata allo scopo di assicurare una conferma a livello genico dell'aumento dell'attività di presentazione dell'antigene di K1UVC-DC. I geni IFNA2 IFNA5 IFNA21, condiiicanti per l'interferone infiammatorio Tipo I, ma anche IFNG o CSF2 codificanti citochine correlate con le DC (IL12B (p40}) o con i macrofagi (GM-CSF) erano aumentati dopo incubazione sia con il tumore non trattato sia con il tumore trattato con UVC. Il prodotto di PSMB5 è presente nel proteasoma e nell 'immunoproteasoma è sostituito dal prodotto di PSMB8 (LMP7), indotto da IFN-γ. I geni IFNGR2, IL-1 A e TGFB2 erano espressi solo dopo il caricamento delle iDC con tumore non trattato, così come lo erano i geni PSMB5 e PSMB8. Una funzione essenziale di un proteasoma modificato, 1'immunoproteasoma, è il processamento dei peptidi MHC di classe I [il]. Il prodotto di PSMB5 è presente nel proteasoma e nell'immunoproteasoma viene sostituito dal prodotto di PSMB8 (LMP7), indotto da IFN-γ. Dieci geni i cui prodotti inducono o sono marcatori di maturazione delle cellule dendritiche (IFNGR1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA8, IFNB1, IFNW1, IL-1 B e IL-12A (p35)) erano up-modulati in modo differenziale su iDC incubate con cellule tumorali K1 trattate con UVC vs non trattate. TGFB3, TGFB2 e IL-4, che contrastano la maturazione delle cellule dendritiche, erano anch'essi up regolati. I geni codificanti per prodotti del percorso di processazione dell'antigene [11] seguivano la stessa espressione differenziale. Il gene PSMB1 beta tipo 10 indotto da IFN-γ, il cui prodotto genico sostituisce la subunità catalitica 2 (subunità beta 7 del proteasoma) nell 'immunoproteasoma, era up regolato sulle iDC incubate con K1UVC. Lo steso vale per TAP2, che codifica una subunità del trasportatore associato 'con il processamento dell'antigene (TAP), e per TAPBP , che codifica la proteina legante tapasina. TAP è necessario per il trasporto di peptidi antigenici attraverso la membrana del reticolo endoplasmatico, mentre TAPBP media l'interazione fra molecole MHC di classe I appena assemblate e TAP. Questa interazione è essenziale per un caricamento ottimale del peptide sulla molecola MHC di classe I. La up regolazione trascrizionale dei due geni delle MHC di classe II (HLA-DQA1 e HLADQA2) conferma che il tumore trattato con UVC trasforma le iDC in mDC [12].

In conclusione, la fagocitosi del tumore trattato con UVC induce l'espressione di nuovi geni nelle iDC. Alcuni dei geni i cui prodotti sono coinvolti nella maturazione delle DC e nei percorsi di processazione dell'antigene vengono up-regolati nelle iDC a seguito della captazione delle K1 RCC non trattate. Tuttavia, un numero molto maggiore di questi geni (inclusi quelli che codificano per le molecole MHC di classe II) sono over-espressi nelle iDC che hanno fagocitato il tumore trattato con UVC che era andato incontro a necrosi secondaria. Le variazioni complessive sono compatibili con la transizione delle DC dal fenotipo immaturo al fenotipo maturo. L'analisi è stata effettuata su cellule ottenute da 5 differenti donatori e unite prima dell'analisi.

Discussione

Le sperimentazioni effettuate dai presenti inventori e descritte in dettaglio nella parte sperimentale hanno permesso di identificare il pattern molecolare indotto in vitro da differenti trattamenti delle cellule tumorali, ivi inclusa la chemioterapia convenzionale, le radiazioni γ e la luce UVC, ed hanno consentito di verificare che il trattamento con luce UVC ad almeno 3 J/cm<2>produce una necrosi secondaria estremamente immunogenica.

Quando confrontata con il trattamento mediante deplezione di fattori di crescita, mezzo ipotonico, antracicline , inibitore della topoisomerasi campotecina e radiazione γ come agenti di morte cellulare, l'esposizione a 3,6 J/cm<2>UVC utilizzata negli esperimenti descritti induce la maggior coespressione di molecole necrotiche e apoptotiche.

La migrazione di PS sulla membrana esterna è un evento che si verifica precocemente dopo il segnale apoptotico. Nella sperimentazione effettuata, questa migrazione si verificava quando vi era una perdita della competenza di membrana nell'80-90% delle cellule tumorali.

Vale la pena notare che la maggior parte delle cellule vive (PI-) trattate con luce UVC erano positive alla colorazione per CRT. La CRT è presente nel reticolo endoplasmatico dove partecipa all'assemblaggio del complesso peptide-MHC I e viene traslocata sulla membrana piasmatica come evento pre-apoptotico prima dell'esposizione della PS [6]. Questa espressione sulla membrana piasmatica determina 1'immunogenicità della morte cellulare [6]. Tuttavia, l'esposizione della calreticolina da sola non è sufficiente per suscitare una risposta immune antitumorale, perché cellule vive che esprimono ecto-CRT sono incapaci di indurre la maturazione delle cellule dendritiche e la presentazione dell'antigene e quindi sono non immunogeniche [6].

Nel presente studio l'espressione della CRT da parte di cellule K1 PI- risultava significativamente aumentata dal trattamento con UVC, ma non da altri trattamenti, ad esempio con radiazioni γ, in accordo con la nozione secondo la quale differenti percorsi apoptotici inducono una differente esposizione della CRT.

Gli inventori hanno inoltre dimostrato che la morte cellulare indotta da UVC è molto più immunogenica di quella indotta mediante irraggiamento γ, ossia induce il più elevato crosspriming delle cellule T da parte delle cellule dendritiche caricate con gli antigeni tumorali. La sua efficacia nel generare CTL tumore-specifici è stata confermata con un'altra linea cellulare RCC (cellule di carcinoma renale) . Lo studio del meccanismo alla base di questo effetto ha mostrato che le cellule K1 trattate con UVC fagocitavano più efficacemente rispetto alle loro controparti non trattate o trattate con irraggiamento γ.

L'aumento della fagocitosi delle cellule K1 di tumore renale trattate con UVC era molto maggiore di quello ottenibile con una linea cellulare di tumore gastrico trattata con doxorubicina/ epirubicina. In accordo con questi dati, CD36, il ligando di PS (fosfatidilserina) che ha un ruolo nella internalizzazione di tumori apoptotici da parte delle cellule dendritiche, non era aumentato.

Le iDC che avevano fagocitato in buona fede le cellule K1 trattate con luce UVC mostravano una maggiore espressione di geni codificanti per citochine infiammatorie {per la maggior parte della famiglia di IFN I) e di molecole coinvolte nei meccanismi della processazione dell 'antigene (sumbunità dell 'immunoproteosoma, TAP e proteina legante TAP) e nella presentazione dell'antigene (MHC classe II). La fagocitosi era anche seguita da up-regolazione delle molecole di costimolazione (CD80) e delle molecole maturative (CD83) e del recettore CCR7 dopo 20 ore di incubazione con il tumore (dati non mostrati), ma anche dopo successiva maturazione con IL-Ιβ, IL-6, TNF-α e PGE2. Questo indica che la maturazione delle cellule dendritiche ad opera del tumore trattato con UVC è indotta da un fattore/una citochina indipendente .

Le proteine DAMP sono rilasciate dalle cellule morte come conseguenza della permeabilizzazione della membrana. Nel presente studio Hsp70 e HMGB1 non erano rivelabili nel surnatante dì cellule K1 4 ore dopo il trattamento con UVC, nonostante segni di incompetenza di membrana (cioè positività a PI e a tripan blu) , ma venivano rilasciate nelle successive 20 ore di incubazione con iDC. Hsp70 trasporta peptidi antigenici alle DC e favorisce la maturazione delle DC [13-15]. Inoltre i trattamenti che inducono Hsp70 {per esempio il riscaldamento) aumentano il cross-priming [16].

HMGB1 è un potente fattore di maturazione delle cellule dendritiche [9, 10].

Il rilascio di molecole DAMP durante il contatto iDC-tumore può avere influenzato la captazione del tumore, la maturazione delle DC o entrambi .

Come ipotesi alternativa, l'incremento del tasso di fagocitosi (indotto da cambiamenti della membrana tumorale) potrebbe di per sé avere accelerato l'acquisizione di un fenotipo di DC matura .

Gli eventi moleoclari associati con il trattamento con luce UVC avevano profondi effetti sul comportamento immunogenico del tumore, al punto che l'inibizione della generazione di CTL risultava invertita .

In conclusione, i presenti inventori hanno dimostrato che il trattamento con luce UVC qui descritto induce una morte cellulare postapoptotìca altamente immunogenica. Queste osservazioni mettono a disposizione un mezzo per migliorare il caricamento ex-vivo di antigeni tumorali in protocolli di vaccinazione basati su DC.

RIFERIMENTI

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Claims (12)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la preparazione di cellule dendritiche caricate con cellule tumorali, comprendente i passaggi di: (i) esporre cellule tumorali ad almeno 3 j/cm<2>di luce UVC in modo tale da determinare la necrosi secondaria delle cellule tumorali, e (ii) co-incubare le cellule tumorali esposte a luce UVC con cellule dendritiche immature in condizioni atte a favorire la cattura delle cellule tumorali esposte a luce UVC nelle cellule dendritiche e la successiva cross-presentazione degli antigeni tumorali sulla superficie di membrana delle cellule dendrìtiche .
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui le cellule tumorali sono esposte a 3 - 100 J/cm<2>di luce UVC.
3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui le condizioni atte a favorire la cattura delle cellule tumorali esposte a luce UVC nelle cellule dendritiche comprendono la co-incubazione delle cellule tumorali esposte a luce UVC con cellule dendritiche immature in un mezzo di coltura comprendente GM-CSF e IL-4.
4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui le condizioni atte a favorire la cross-presentazione degli antigeni tumorali sulla superficie di membrana delle cellule dendritiche comprendono promuovere la maturazione delle cellule dendritiche immature caricate con le cellule tumorali esposte a luce UVC, mediante coltura in un mezzo comprendente uno o più fattori maturativi scelti fra TNF-α, PGE2, IL-Ιβ, IL-6, CD40 o qualsiasi loro combinazione,
5. 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazione 1 a 4, in cui le cellule tumorali sono selezionate dal gruppo che consiste di cellule di fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, condroma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma , liniangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, sarcoma di Ewing, leiomiosarcoma, rabdosarcoma, carcinoma del colon, cancro del pancreas, cancro della mammella, cancro dell'ovaio, cancro della prostata, carcinoma a cellule squamose, carcinoma a cellule basali, adenocarcinoma, carcinoma delle ghiandole sudoripare, carcinoma delle ghiandole sebacee, carcinoma papillare, adenocarcinomi papillari, cistadenocarcinoma, carcinoma medullare, carcinoma broncogeno, carcinoma delle cellule renali, epatoma, carcinoma del dotto biliare, coriocarcinoma , seminoma, carcinoma embrionale, tumore di Wilms, cancro della cervice, tumore del testicolo, carcinoma polmonare, carcinoma polmonare a cellule piccole, carcinoma della vescica, carcinoma epiteliale, glioma, astrocitoma, medulloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma; leucemie, quali ad esempio leucemia linfocitica acuta (mieloblastica, mielomonocitica , monocitica e eritroleucemia) ; leucemie linfocitiche croniche; policitemia vera, linfoma (linfoma di Hodgkin e linfoma non Hodgkin), mieloma multiplo, macroglobulinemia di Waldenstrom, e malattia della catena pesante.
6. 6. Cellula dendritica matura caricata con cellule tumorali in necrosi secondaria.
7. 7. Cellula dendritica matura secondo la rivendicazione 6, ottenibile mediante il procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5.
8. 8. Cellula dendritica matura secondo la rivendicazione 6 o 7, come medicamento.
9. 9. Cellula dendritica matura secondo la rivendicazione 8, come medicamento antitumorale.
10. 10. Cellula dendritica matura secondo la rivendicazione 9, come vaccino antitumorale o composizione immunogenica antitumorale.
11. 11. Composizione farmaceutica comprendente cellule dendritiche mature secondo la rivendicazione 6 o 7 in un veicolo farmaceuticamente accettabile.
12. 12. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, che è un vaccino antitumorale o una composizione immunogenica antitumorale.