ITTO20080561A1 - Anticorpo specifico per una forma di prelamina a, peptide immunogeno e metodo per la preparazione dell'anticorpo e kit diagnostico utilizzante lo stesso - Google Patents

Anticorpo specifico per una forma di prelamina a, peptide immunogeno e metodo per la preparazione dell'anticorpo e kit diagnostico utilizzante lo stesso

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ITTO20080561A1
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Sabrina Dominici
Valentina Fiori
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Description

DESCRIZIONE
del brevetto per invenzione industriale dal titolo:
“ANTICORPO SPECIFICO PER UNA FORMA DI PRELAMINA A, PEPTIDE IMMUNOGENO E METODO PER LA PREPARAZIONE DELL'ANTICORPO E KIT DIAGNOSTICO UTILIZZANTE LO STESSO”
La presente invenzione è relativa ad anticorpi specifici per differenti forme di Prelamina A.
La Lamina A/C è uno dei principali componenti della lamina nucleare, la quale gioca differenti e non ancora pienamente compresi ruoli nelle dinamiche della membrana nucleare e della cromatina (Broers JL, Ramaekers FC, Bonne G, Yaou RB, Hutchison CJ. NUCLEAR LAMINS: LAMINOPATHIES AND THEIR ROLE IN PREMATURE AGEING. Physiol Rev. 2006 Jul; 86(3):967-1008; Vlcek S, Foisner R. LAMINS AND LAMIN-ASSOCIATED PROTEINS IN AGING AND DISEASE. Curr Opin Cell Biol. 2007 Jun;19(3):298-304). La Lamina A è codificata dal gene LMNA nel cromosoma 1q21, il quale è trascritto come differenti prodotti di splicing, quali Lamina A, Lamina C, Lamina A delta 10 e Lamina C2 (Arora P, Muralikrishna B, Parnaik VK. CELL-TYPE-SPECIFIC INTERACTIONS AT REGULATORY MOTIFS IN THE FIRST INTRON OF THE LAMIN A GENE. FEBS Lett.
2004 Jun 18;568(1-3):122-8).
Lamina A deriva da una proteina precursore detta prelamina A, la quale comprende una sequenza CaaX in posizione C terminale tipica delle proteine farnesilate. Nella prelamina A la sequenza CaaX è composta da Cisteina, Serina, Isoleucina e Metionina (CSIM) (Corrigan DP, Kuszczak D, Rusinol AE, et al. PRELAMIN A ENDOPROTEOLYTIC PROCESSING IN VITRO BY RECOMBINANT ZMPSTE24. Biochem J.
2005 Apr 1;387(Pt 1):129-38). La Metionina dirige la farnesilazione al residuo di Cisteina mediante l’enzima farnesil transferasi. A seguito della farnesilazione della Cisteina, la sequenza SIM è rimossa dalla endoproteasi ZMPSTE24 (Rusinol AE, Sinensky MS. FARNESYLATED LAMINS, PROGEROID SYNDROMES AND FARNESYL TRANSFERASE INHIBITORS. J Cell Sci. 2006 Aug 15;119(Pt 16):3265-72). Il residuo di Cisteina viene successivamente metilato mediante la metil transferasi Icmt e un taglio proteolitico finale realizzato da ZMPSTE24 rimuove ulteriori 15 residui C-terminali per produrre la Lamina A. Da quanto sopra riportato risulta che almeno quattro specie di prelamina A vengono a formarsi nel processo di formazione della Lamina A. Le quattro specie sono la prelamina A iniziale non farnesilata (PreLA-CSIM), la prelamina A farnesilata (PreLA-farnesyl-CSIM), la prelamina A farnesilata mancante della sequenza SIM (PreLA-farnesyl-C) e la prelamina A farnesilata e carbossimetilata (PreLA-farnesyl-C-CH3).
Le laminopatie sono malattie genetiche caratterizzate da mutazioni a carico della Lamina A. Tra queste patologie le più severe sono le sindromi progeroidi che comprendono la Dermopatia Restrittiva, la progeria di Hutchinson-Gilford, e la Displasia Mandibulo-acrale. Queste laminopatie assieme alle Lipodistrofie Familiari Parziali sono caratterizzate da un accumulo di prelamina A. La conoscenza di quale delle forme di prelamina A è maggiormente rappresentata nelle cellule normali o accumulata nelle patologiche è di estrema importanza. Infatti, si ritiene che il meccanismo a cui è sottoposta la prelamina A debba giocare un ruolo funzionale ancora non chiarito. A tale riguardo, si è constatato che il precursore della Lamina A influenza in una certa misura l’individuazione da parte della membrana nucleare della proteina stessa (Hennekes H, Nigg EA. THE ROLE OF ISOPRENYLATION IN MEMBRANE ATTACHMENT OF NUCLEAR LAMINS. A SINGLE POINT MUTATION PREVENTS PROTEOLYTIC CLEAVAGE OF THE LAMIN A PRECURSOR AND CONFERS MEMBRANE BINDING PROPERTIES. J Cell Sci. 1994 Apr;107 ( Pt 4):1019-29), la traslocazione del fattore di trascrizione (Capanni C, Mattioli E, Columbaro M, et al. ALTERED PRE-LAMIN A PROCESSING IS A COMMON MECHANISM LEADING TO LIPODYSTROPHY. Hum Mol Genet.
2005 Jun 1;14(11):1489-502; Caron M, Auclair M, Sterlingot H, Kornprobst M, Capeau J. SOME HIV PROTEASE INHIBITORS ALTER LAMIN A/C MATURATION AND STABILITY, SREBP-1 NUCLEAR LOCALIZATION AND ADIPOCYTE DIFFERENTIATION. Aids. 2003 Nov 21;17(17):2437-44) e l’organizzazione della cromatina (Lattanzi G, Columbaro M, Mattioli E, et al. PRE-LAMIN A PROCESSING IS LINKED TO HETEROCHROMATIN ORGANIZATION. J Cell Biochem. 2007 Dec 1;102(5):1149-59.; Mattioli E, Columbaro M, Capanni C, et al. DRUGS AFFECTING PRELAMIN A PROCESSING: EFFECTS ON HETEROCHROMATIN ORGANIZATION. Exp Cell Res. 2008 Feb 1;314(3):453-62.).
Inoltre, è stato riscontrato che un accumulo di prelamina A mutata o wild-type è coinvolto nei processi dell’invecchiamento ed è noto il fatto che farmaci inibitori delle proteasi, usati per la cura di Hiv hanno effetti sull’enzima ZMPSTE24 provocando una laminopatia secondaria (Caron M, Auclair M, Donadille B, et al. HUMAN LIPODYSTROPHIES LINKED TO MUTATIONS IN A-TYPE LAMINS AND TO HIV PROTEASE INHIBITOR THERAPY ARE BOTH ASSOCIATED WITH PRELAMIN A ACCUMULATION, OXIDATIVE STRESS AND PREMATURE CELLULAR SENESCENCE. Cell Death Differ. 2007 Oct;14(10):1759-67.; De Sandre-Giovannoli A, Bernard R, Cau P, et al. LAMIN A TRUNCATION IN HUTCHINSON-GILFORD PROGERIA. Science. 2003 Jun 27;300(5628):2055.; Eriksson M, Brown WT, Gordon LB, et al. RECURRENT DE NOVO POINT MUTATIONS IN LAMIN A CAUSE HUTCHINSON-GILFORD PROGERIA SYNDROME. Nature. 2003 May 15;423(6937):293-8.; Filesi I, Gullotta F, Lattanzi G, et al. ALTERATIONS OF NUCLEAR ENVELOPE AND CHROMATIN ORGANIZATION IN MANDIBULOACRAL DYSPLASIA, A RARE FORM OF LAMINOPATHY. Physiol Genomics.
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Infine, è stato dimostrato che un accumulo di prelamina A è tossico per le cellule e che tale tossicità potrebbe non essere solo dipendente dalla quantità ma anche dalle modificazioni presenti nel precursore stesso (Yang SH, Qiao X, Farber E, Chang SY, Fong LG, Young SG. ELIMINATING THE SYNTHESIS OF MATURE LAMIN A REDUCES DISEASE PHENOTYPES IN MICE CARRYING A HUTCHINSON-GILFORD PROGERIA SYNDROME ALLELE. J Biol Chem. 2008 Mar 14;283(11):7094-9).
Da quanto sopra riportato risulta evidente come sia sentita la necessità di disporre di strumenti di indagine in grado di riconoscere le differenti forme di prelamina A allo scopo di favorire lo studio degli effetti correlati al suo accumulo , di conoscere le forme di prelamina A accumulate nelle diverse laminopatie; tali strumenti inoltre potrebbero essere utilizzati per monitorare gli effetti dei farmaci che agiscono sulla trasformazione della prelamina A inibendone la farnesilazione quali gli inibitori della farnesil transferasi (FTI) o gli inibitori della 3idrossi3metilglutarilCoA reduttasi (statine) e che rappresentano potenziali strumenti terapeutici per le laminopatie caratterizzate da accumulo di prelamina A e nella terapia del cancro.
Oggetto della presente invenzione è un anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici, caratterizzato dal fatto di essere specifico per almeno una forma del sistema maturativo prelamina A /lamina A.
Preferibilmente la detta forma del sistema maturativo prelamina A /lamina A è compresa nel gruppo costituito da preLA-CSIM, preLA-farnesyl-C e preLA-farnesyl-C-CH3.
Preferibilmente, l’anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici è realizzato mediante una risposta immunologica utilizzando come antigene il peptide LLGNSSPRTQSPQNCSIM (peptide 1188-1) e/o il peptide LLGNSSPRTQSPQNC-farnesyl (peptide 1188-2).
Gli esempi che seguono servono a scopo illustrativo e non limitativo, per una migliore comprensione dell'invenzione con l’ausilio delle figure del disegno annesso, in cui:
- le figure 1a-1d sono dei grafici che riportano la specificità e la sensibilità degli anticorpi oggetto della presente invenzione testati mediante tecnica ELISA;
- la figura 2 illustra i risultati della analisi Western blot su culture cellulari opportunamente trattate.
Preparazione degli anticorpi
Il peptide LLGNSSPRTQSPQNCSIM (peptide 1188-1) e il peptide LLGNSSPRTQSPQNC-farnesyl (peptide 1188-2), i quali rappresentano le sequenze di aminoacidi specifiche di forme di maturazione della lamina A, sono state realizzate da BIO-SYNTHESIS (Lewisville, USA). I peptidi sono stati convertiti in apteni attraverso la combinazione con KLH quale carrier. I peptidi sintetici KLH-coniugati sono stati iniettati in cavie costituite da conigli albini della specie ”New Zeland” seguendo uno schema di immunizzazione che prevede tre inoculi dell’aptene emulsionato ad adiuvante di Freund’s incompleto (IFA) e due richiami in soluzione fisiologica. Il plasma immune è stato raccolto mediante centrifugazione. Le frazioni di immunoglobulina sono state purificate su colonna di affinità, eluite con citrato di sodio (0,1M pH 3,0) e neutralizzate con 1M TRIS (100µl/ml). Gli anticorpi così ottenuti vengono denominati anticorpo 1188-1 e anticorpo 1188-2 a seconda del peptide utilizzato per la risposta immunologica.
Caratterizzazione degli anticorpi prodotti
La specificità degli anticorpi 1188-1 e 1188-2 è stata testata con il test ELISA in piastre da 96 pozzetti.
I peptidi sintetici 1188-1 e 1188-2 (5µg/ml) sono stati dissolti in 50mM di NaHCO3(pH 9,6) ed incubati a 4°C per 18 ore. Dopo aver allontanato i peptidi in eccesso, le piastre sono state bloccate con PBS contenente 0,05%(v/v) Tween 20 e 1% (w/v) BSA per 1 ora a 37°C. Dopo il lavaggio, 100µl di siero immune diluito in PBS contenente 1% (w/v) di BSA sono stati aggiunti ad ogni pozzetto e incubati a 37°C per 1 ora. Le piastre sono state lavate e gli anticorpi purificati sono stati aggiunti a varie diluizioni seriali ed incubati per 1 ora a 37°C. Dopo l’aggiunta di un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi di rafano come complesso enzimatico, l’immunocomplesso è stato rilevato con aggiunta di un substrato cromogenico,acido 2,2’-azo-bis 3-etilbenzotiazolo-6-solfonico (ABTS)in una soluzione di 50 mM di citrato di sodio pH 3,0 con 1µl/ml di H2O2). La colorazione che si è sviluppata, indicante la presenza del complesso antigene-anticorpo è stata rilevata e misurata come densità ottica alla lunghezza d’onda di 405nm.
Nelle figure 1a e 1b sono riportati in grafico i valori delle densità ottiche relative alle diluizioni seriali degli anticorpi 1188-1 e 1188-2 sui peptidi adesi alle piastre. Nello specifico, dal grafico di figura 1a risulta evidente come solo l’anticorpo 1188-1 e non l’anticorpo 1188-2 sia specifico per il peptide 1188-1, mentre dal grafico di figura 1b risulta evidente come l’anticorpo 1188-2 abbia una specificità molto maggiore per il peptide 1188-2.
Il procedimento di caratterizzazione degli anticorpi sopra riportato è stato ripetuto utilizzando come antigeni adesi su paistra le proteine ricombinanti prelamina A e lamina A (1µg/ml) dissolte in 50mM di NaHCO3(pH 9,6).
Nelle figure 1c e 1d sono riportati in grafico i valori delle densità ottiche relativi alle diluizioni degli anticorpi. Nello specifico, dal grafico di figura 1c risulta evidente come solo l’anticorpo 1188-1 abbia una specificità alta per la proteina ricombinante prelamina A, contrariamente all’anticorpo 1188-2 che rilascia un segnale molto debole. Dal grafico di figura 1d risulta evidente come né l’anticorpo 1188-1 né l’anticorpo 1188-2 abbiano specificità per la proteina ricombinante lamina A.
Culture cellulari e loro trattamento con farmaci
Le culture di fibroblasti cutanei sono state ottenute da biopsie di pazienti sani sottoposti a chirurgia ortopedica a seguito di consenso scritto.
Le cellule così ottenute sono state sottoposte all’azione di diverse sostanze farmacologiche in grado di influenzare il processo metabolico della prelamina A.
In particolare, rispettive porzioni di colture cellulari sono state sottoposte per 18 ore all’azione di FTI-277 (10µM) (Calbiochem, Merk Biosciences), mevinolin (20µM) (Sigma-Aldrich) e di AFCMe (10µM) (ALEXIS Biochemicals). FTI-277 e mevinolin inibendo la farnesilazione favoriscono un accumulo della prelamina A non farnesilata. Differentemente, AFCMe impedisce l’azione della endoproteasi ZMPSTE24 sulla prelamina A causando di conseguenza l’accumulo della prelamina A farnesilata e farnesilata carbossimetilata.
Altre sostanze farmacologiche, utilizzate per studiare gli accumuli delle diverse forme di prelamina A sono stati gli inibitori di proteasi utilizzati nella terapia antiretrovirale di HIV.
In particolare, le colture cellulari sono state incubate per 7 settimane con indinavir (10µM) (Merck Sharp & Dohme Laboratories – Clermont-Ferrand, Francia), nelfinavir (5µM) (Agouron Pharmaceuticals – San Diego, CA, USA), atazanavir (10µM) (Dr. S Azoulay – CNRS UMR 6001, University Nice-Sophia Antippolis, France), amprenavir (10µM) (Vertex Pharmaceuticals – Cambridge, Ma, USA) e le combinazioni di lopinavir (10µM) con ritonavir (2µM) e di atazanavir (5µM) con ritonavir (2µM). Lopinavir e ritonavir sono prodotti da Abbot (Rungis, Francia).
Le culture cellulari trattate come sopra descritto, unitamente a culture di fibroblasti HGPS ottenute da biopsia cutanea di un paziente di 5 anni, sono state testate mediante l’analisi Western blot.
Analisi Western blot
La specificità alla prelamina A e alla lamina A è stata testata mediante l’analisi Western bolt. Le proteine sono state prima separate su 10% SDS-PAGE e successivamente trasferite su di una membrana di nitrocellulosa dove sono state fatte reagire con gli anticorpi 1188-1 e 1188-2 con diluizione 1:100. Per una più corretta valutazione della specificità degli anticorpi oggetto della presente invenzione, le proteine sono state fatte reagire anche con anticorpi contro la lamina A/C con diluizione 1:100 e con anticorpi contro la βactina con diluizione 1:1000.
In particolare, le cellule sono state lisate in soluzione tampone Ripa. Le cellule lisate sono state diluite in tampone Laemlli, sottoposte a SDS-PAGE (7,5%) e trasferite su di una membrana di nitrocellulosa. Le membrane sono state saturate con 4% di BSA e incubate con gli anticorpi primari per un ora a temperatura ambiente, mentre gli anticorpi secondari sono stati applicati per 20 minuti a temperatura ambiente. Le bande di analisi sono state rilevate mediante il sistema di rilevamento Amersham ECL (GE Healthcare).
Come illustrato in figura 2 gli anticorpi 1188-1 e 1188-2 oggetto della presente invenzione presentano la specificità ricercata. In figura 2 con “control” ci si riferisce alle proteine di colture cellulari non trattate.

Claims (11)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici, caratterizzato dal fatto di essere specifico per almeno una forma del sistema maturativo prelamina A /lamina A.
  2. 2. Anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto la detta forma del sistema maturativo prelamina A /lamina A è compresa nel gruppo costituito da preLA-CSIM, preLA-farnesyl-C e preLA-farnesyl-C-CH3.
  3. 3. Anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto di essere stato ottenuto mediante una risposta immunologica utilizzando come antigene il peptide LLGNSSPRTQSPQNCSIM (peptide 1188-1) e/o il peptide LLGNSSPRTQSPQNC-farnesyl (peptide 1188-2).
  4. 4. Anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di essere diretto contro un antigene scelto nel gruppo consistente in: peptide LLGNSSPRTQSPQNCSIM (peptide 1188-1); peptide LLGNSSPRTQSPQNC-farnesyl (peptide 1188-2); loro miscele.
  5. 5. Antigene immunogeno per la generazione di un anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici specifico per una forma metabolica della prelamina A, caratterizzato dal fatto di essere scelto nel gruppo consistente in: peptide LLGNSSPRTQSPQNCSIM (peptide 1188-1); peptide LLGNSSPRTQSPQNC-farnesyl (peptide 1188-2); loro miscele.
  6. 6. Uso di un anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4 per lo studio degli effetti della prelamina A.
  7. 7. Uso di un anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, per la diagnosi di una patologia correlata alla presenza di una forma metabolica preLA-CSIM, preLA-farnesyl-C, e/o preLA-farnesyl-C-CH3.
  8. 8. Uso secondo la rivendicazione 7 per lo studio delle laminopatie.
  9. 9. Uso di un anticorpo o suoi derivati sintetici o biotecnologici secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, per lo studio di: - effetti in vivo ed in vitro dei farmaci inibitori della farnesilazione quali gli inibitori della farnesil transferasi (FTI)e gli inibitori della 3idrossi3metilglutarilCoA reduttasi (statine), utilizzati per il trattamento di laminopatie caratterizzate da accumulo di prelamina A quali le sindromi progeroidi (Dermopatia Restrittiva, Hutchinson-Gilford progeria, e Displasia Mandibulo-acrale)e le Lipodistrofie Familiari Parziali e nella terapia del cancro; - effetti collaterali degli inibitori delle proteasi utilizzati nel trattamento di HIV; - processi di invecchiamento che coinvolgono la prelamina A.
  10. 10. Kit diagnostico per la rilevazione di una patologia correlata alla presenza, in vitro o in vivo, di una forma metabolica preLA-CSIM, preLA-farnesyl-C, e/o preLA-farnesyl-C-CH3, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un anticorpo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4.
  11. 11. Metodo per l’ottenimento di un anticorpo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzato dal fatto di comprendere la fase di iniettare in cavie, preferibilmente in conigli bianchi della Nuova Zelanda un antigene scelto nel gruppo consistente in: peptide LLGNSSPRTQSPQNCSIM (peptide 1188-1); peptide LLGNSSPRTQSPQNC-farnesyl (peptide 1188-2); loro miscele; e, successivamente, raccogliere il plasma delle cavie mediante centrifugazione, isolare le frazioni di immunoglobulina e neutralizzare le stesse.
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