ITTO20070608A1

ITTO20070608A1 - Combinazione di un agente antineoplastico e albumina per il trattamento del cancro

Info

Publication number: ITTO20070608A1
Application number: IT000608A
Authority: IT
Inventors: Gianfranco Merizzi; Giampiero Pescarmona; Antonio Ponzetto
Original assignee: Medestea Int Spa
Priority date: 2007-08-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2009-02-22
Also published as: EP2178555A1; US20110206732A1; WO2009024924A1

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Combinazione di un agente antineoplastico e albumina per il trattamento del cancro",

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda una nuova composizione farmaceutica per il trattamento del cancro .

E' noto l'uso di svariati agenti antineoplastici per il trattamento del cancro. Tra di essi vi è l'agente citostatico idrossiurea (HU), altresì detto idroxicarbamide. L'idrossiurea riduce la concentrazione intracellulare dei nucleotidi endogeni, necessari per la replicazione del DNA, mediante 1<1>inibizione dell<1>enzima ribonucleotide reduttasi .

Risposte terapeutiche significative al trattamento con idrossiurea si ottengono nella leucemia mieloide cronica e nelle altre sindromi mieloproliferative croniche (trombociternia essenziale, policitemìa vera e mielofibrosi idiopatica) con una terapia continua alla dose di 20-30 mg/Kg/die per os in una o due somministrazioni giornaliere per sei settimane di cura. Idrossiurea, agli stessi dosaggi terapeutici, è anche indicato nel trattamento di soggetti affetti da anemia falciforme omozigote e possiede una potenziale azione quale coadiuvante nella terapia antiretrovirale .

L'idrossiurea è un agente citostatico che penetra facilmente in vari tessuti, quali linfonodi e cervello. Il principale effetto collaterale in caso di terapia con HU è la depressione midollare, che determina leucopenia, anemia e talora piastrinopenia {riduzione di globuli bianchi, globuli rossi e piastrine) dovuta alla inibizione della replicazione cellulare. La depressione midollare si manifesta con anemia, con conseguente stanchezza; tendenza a sviluppare ecchimosi, ossia lividi o emorragie; accresciuto rischio di sviluppare infezioni. Questo effetto è generalmente lieve. La riduzione del numero di cellule ematiche può iniziare manifestarsi circa 7 giorni dopo la somministrazione del farmaco e il conteggio delle cellule ematiche raggiunge usualmente i valori minimi 10-14 giorni dopo la chemioterapia. Quindi il conteggio delle cellule ematiche ricomincia a salire costantemente e di solito si normalizza entro 21-28 giorni. Il conteggio delle cellule ematiche diminuisce in funzione della dose di idrossiurea. Qualora si verifichi una netta diminuzione del conteggio delle cellule ematiche, è consigliabile sospendere la somministrazione del farmaco per permettere il recupero della funzionalità del midollo osseo.

Inoltre alle comuni dosi utilizzate in terapìa oncologica, 1'idrossiurea può causare rash cutaneo, ossia un'eruzione cutanea, simile all'acne, che può dare prurito, secchezza o dolorabilità del cavo orale, vomito o nausea, infertilità.

Tali effetti sono evidenti con le dosi utilizzate in ambito oncologico.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire un medicamento avente attività antineoplastica, da utilizzarsi preferibilmente quale terapia neoadiuvante, che non presenti gli effetti collaterali tipici di tutti gli agenti antineoplastici, ivi inclusa 1'idrossiurea.

Tale scopo è raggiunto dalla presente invenzione, che mette a disposizione una composizione farmaceutica comprendente la combinazione di almeno un agente antineoplastico ed albumina .

Gli inventori hanno osservato che la combinazione di un agente antineoplastico con l'albumina incrementa notevolmente l'efficacia dell'agente antineoplastico, consentendo un riduzione .della dose di principio attivo, determinando di conseguenza la riduzione degli effetti collaterali più comuni.

L'agente antineoplastico utilizzato nella composizione farmaceutica dell'invenzione è preferibilmente un agente antiproliferativo, quale idrossiurea, un suo analogo, un suo precursore o un suo derivato.

Preferibilmente, la concentrazione di idrossiurea nella composizione farmaceutica dell'invenzione è compresa fra 10 e 1 mM, più preferibilmente fra 10 μΜ e 100 μΜ.

La composizione farmaceutica dell'invenzione è adatta ad essere somministrata come terapia per il cancro a qualsiasi mammifero, ivi incluso l'essere umano. In una forma di realizzazione preferita, l'albumina utilizzata nella composizione farmaceutica è l'albumina specifica della specie a cui appartiene il soggetto da trattare.

La composizione farmaceutica dell'invenzione è preferibilmente una combinazione di un agente antineoplastico ed albumina in soluzione fisiologica. La concentrazione preferita di albumina è compresa fra 2% e 50% (p/v), più preferibilmente 10-20% (p/v).

La composizione farmaceutica dell'invenzione può ad esempio essere somministrata per via iniettiva, per infusione direttamente in quelle arterie che alimentano il territorio connesso con un tumore o per infusione endotumorale, riducendo la massa tumorale in un breve intervallo temporale con un regime di somministrazione giornaliera. Possono essere previste altre vie di somministrazione, come ad esempio endovenosa, orale o topica.

La dose da somministrare è determinata in dipendenza da vari fattori tra cui la specie a cui appartiene il soggetto da trattare, il peso corporeo del soggetto, la morfologia, l'istotipo, l'estensione e la classificazione del tumore da trattare, e può essere determinata dal tecnico medio del settore utilizzando le sue normali conoscenze.

La combinazione di agente antineoplastico e albumina dell'invenzione è preferibilmente utilizzata come terapia antiproliferativa neoadiuvante . Per terapia neoadìuvante, o primaria, si intende la somministrazione di farmaci antiproliferativi che precede la terapìa locoregionale (chirurgia e/o radioterapia) nei pazienti portatori di tumori voluminosi o localmente avanzati. Gli obiettivi del trattamento farmacologico pre-chirurgìco o pre-radioterapico sono (i) rendere radicalmente operabile una neoplasia localmente avanzata; (ii) consentire l'esecuzione di un intervento chirurgico conservativo, se le dimensioni della neoplasia impongono un intervento demolitivo; (iii) monitorare in vivo la responsività ai trattamenti; (iv) somministrare precocemente i farmaci antiproliferativi allo scopo di eradicare le micrometastasi responsabili della ripresa della malattia .

Numerosi studi hanno dimostrato che è possibile ridurre le dimensioni della neoplasia con la somministrazione preoperatoria di alcuni cicli di chemioterapia, e dati recenti indicano anche l'efficacia a tale scopo di endocrìnoterapie in pazienti con recettori ormonali positivi. Tale riduzione delle dimensioni del tumore rende possibile un intervento chirurgico radicale in pazienti con malattia localmente avanzata. Inoltre il tumore primitivo ridotto di dimensioni con la terapia sistemica primaria consente una chirurgia conservativa (quadrantectomia) in neoplasie operabili ma che per le dimensioni tumorali iniziali dovrebbero essere sottoposte a mastectomia. Un ulteriore obiettivo del trattamento sistemico primario sarebbe quello di interferire precocemente con la proliferazione di eventuali micrometastasi già presenti al momento della diagnosi. Nonostante l'elevata percentuale di risposte terapeutiche che hanno consentito di effettuare una chirurgia conservativa in molte donne, la sopravvivenza libera di malattia e quella globale non è mutata rispetto al trattamento standard (chirurgia seguita da chemioterapia adiuvante). Il trattamento sistemico primario dovrebbe essere riservato ai pazienti con la possibilità reale di trarre vantaggio dalla riduzione delle dimensione del tumore primario e, eventualmente, dell'estensione delle metastasi omolaterali. Per quel che concerne la chemioterapia da utilizzare, può essere applicato qualsiasi tipo di regime che abbia dimostrato efficacia nella terapia della malattia avanzata.

Gli inventori hanno osservato che, affinché la combinazione di agente antineoplastico ed albumina dell'invenzione sia efficace, ad esempio nella terapia antiproliferativa sopra descritta, non è necessario che i due componenti vengano somministrati sotto forma di miscela fisica dei due. I due componenti possono essere somministrati simultaneamente, separatamente od in sequenza, in qualsiasi ordine.

Un altro oggetto dell'invenzione è quindi un corredo comprendente almeno un agente antineoplastico ed albumina come preparazione combinata per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nella terapia del cancro.

Senza voler essere legati ad alcuna teoria, gli inventori ritengono che l'incremento dell'efficacia della terapia antineoplastica osservato con la combinazione di agente antineoplastico ed albumina possa essere legata alla funzione dell'albumina come veicolo selettivo di aminoacidi. In altre parole, l'albumina ha l'effetto di fornire alle cellule un nutrimento con gli stessi aminoacidi che la compongono, in modo proporzionale a tale composizione, inducendo un metabolismo ossidativo mitocondriale pro-differenziante . L'albumina viene infatti catabolìzzata da tutti i tessuti extraepatici ed la sua fuoriuscita dal compartimento intravascolare verso 1'extravascolare è favorito, da piccoli danni delle pareti vascolari, dall'ipossia e dall'insulina. L'iperinsulinemia post-prandiale, stimolando la sintesi di albumina, facilita il temporaneo deposito nella proteina degli aminoacidi essenziali ingeriti con la dieta. Una volta degradata, 1'albumina mette a disposizione del muscolo e degli altri tessuti gli aminoacidi che la compongono, quindi selettivamente sopratutto alcuni aminoacidi come da Tabella 1, ingeriti circa 20 giorni prima.

La senescenza si associa ad una riduzione della massa magra. L'albuminemia è più bassa nell'anziano si correla positivamente con la riduzione della massa muscolare. Questa osservazione suggerisce un ruolo svolto dall'albumina:

a favore dell'anabolismo muscolare nutrizionale ed antiossidante in quanto, durante l'assorbimento del pasto, la sua velocita' di sintesi aumenta del 50% favorendo l'incorporazione di una rilevante quota di aminoacidi essenziali ingeriti con la dieta ed evitando la loro ossidazione irreversibile;

l'effetto di fornire alle cellule un nutrimento con gli stessi aminoacidi che la compongono in modo proporzionale a tale composizione e quindi selettivo inducendo un metabolismo ossidativo mitocondriale pro-dif ferenziante

Tabella 1: sequenza aminoacidica dell'albumina (585 aa; PM = 66 kDa)

L'albumina umana è un costituente normale del plasma umano ed ha la stessa attività dell'albumina fisiologica. Il controllo della tossicità dopo somministrazione singola ha scarsa importanza clinica e non permette la valutazione della dose tossica o letale o di stabilire un rapporto dose/effetto. In condizioni normali l 'emivita dell'albumina è in media di 19 giorni e la sua concentrazione è di 4-5 g/kg di peso corporeo, dei quali il 40-45% è presente nello spazio intravascolare ed il 55-60% in quello extravascolare. In certi casi si può avere però una abnorme distribuzione, come ad esempio durante le prime 24 ore dopo ustioni gravi e durante lo shock settico. In condizioni normali l'emivita dell'albumina è in media di 19 giorni. L'equilibrio fra la sintesi ed il catabolismo avviene secondo una regolazione a feed-back. L'eliminazione avviene per la maggior parte in sede intracellulare ad opera di proteasi lisosomiche. Meno del 10% dell'albumina infusa lascia il compartimento intravascolare durante le prime due ore che seguono l'infusione; ne risulta che il volume circolante aumenta dalla 1 alla 3" ora dopo la somministrazione. Quando l'albumina umana è usata nella terapìa di reintegro, il dosaggio richiesto è dettato dai comuni parametri circolatori .

A tutt'oggi non sono riportate potenzialità embrio-feto-tossiche, oncogeniche o mutagene associate all'albumina umana. Nei modelli animali non sono descritti segni di tossicità acuta.

Diverse sostanze bio-attive, farmaci o vaccini possono essere legati e combinati con albumina per uso umano, veterinario o agricolo.

L'albumina induce una stabilizzazione dell'attività di farmaci e vaccini.

Quando combinati o legati all'albumina, alcuni farmaci esercitano il loro effetto anche a concentrazioni più basse rispetto alla formulazione priva di albumina.

L'entità della distribuzione dei farmaci nei tessuti dipende dall'entità del legame con le proteine piasmatiche (es. i farmaci acidi in genere tendono a legarsi prevalentemente all'albumina) e con i tessuti stessi.

Per dimostrare l'efficacia della combinazione di agente antineoplastico ed albumina dell'invenzione gli inventori hanno condotto sperimentazioni sia in vitro sia in vivo.

Esperimenti condotti in vitro su differenti tipologie cellulari neoplastiche in adesione {quali linee cellulari di epatocarcinoma Hep-G2, cellule primarie di epatocarcinoma canino, cellule primarie di tumore mammario umano, cellule primarie di tumore mammario canino, cellule di glioblastoma umano) hanno evidenziato come l'uso di albumina disciolta in soluzione fisiologica ad una concentrazione espressa come peso su volume finale in un campo dal 2% al 50%, e preferibilmente dal 10% al 20%, possa indirizzare circa il 50%-100% delle cellule in coltura alla morte cellulare in 8-24 ore di incubazione .

Esperimenti condotti in vitro su differenti tipologie cellulari neoplastiche in sospensione ed in adesione (in sospensione: linee cellulari di leucemia linfoblastica come H9, MT2, MT4, linee cellulari di leucemia monocitica THP- ed U937, linee cellulari di leucemia eritroide K562; in adesione: linee cellulari di epatocarcinoma Hep-G2, cellule primarie di epatocarcinoma canino, cellule primarie di tumore mammario umano, cellule primarie di tumore mammario canino, cellule di glioblastoma umano) hanno inoltre evidenziato come l'uso di albumina in soluzione fisiologica ad una concentrazione espressa come peso su volume finale in un campo dal 10% al 20% unitamente ad idrossiurea ad una concentrazione finale in un campo fra 10-lOOmicroMolare possa indirizzare circa il 80%-100% delle cellule in coltura alla morte cellulare in 4-12 ore di incubazione .

MATERIALI E METODI

Per gli esperimenti in vitro e in vivo la composizione farmaceutica dell'invenzione è stata preparata impiegando albumina specie-specifica e idrossiurea, nelle quantità indicate rispettivamente nelle Tabelle 2 e 3. Per tutte le formulazioni di seguito elencate le sostanze sono state pesate come richiesto dalla formula, ottenendo un litro finale di soluzione.

Tabella 2. Mezzo di coltura : uso in vitro

Tabella 3. Composizione farmaceutica : uso in vivo

Composizione farmaceutica per uso in vivo : protocollo d'intervento.

Al fine di prevenire casi di possibile shock anafilattico in seguito alla terapia infusionale intra-articolare , sì può adottare prima della somministrazione una profilassi con antistaminici e/o cortisonici, quali, ad esempio, Difenilidramina, antagonisti dei recettori di tipo 1 dell'istamina, Cetirizina, Loratadina, Fexofenadina, Betametasonedisodio-fosfato Idrocortisone, Metilprednisolone Linee cellulari

Per allestire gli esperimenti in vitro sono state utilizzate le seguenti cellule:

in sospensione: linee cellulari di leucemia linfoblastica come H9, MT2, MT4, linee cellulari dì leucemia monocitica THP- ed U937, linee cellulari di leucemia eritroide K562;

in adesione: linee cellulari di epatocarcinoma Hep-G2, cellule primarie di epatocarcinoma canino, cellule primarie di tumore mammario umano, cellule primarie di tumore mammario canino, cellule di glioblastoma umano.

Le cellule sono state lavate tre volte con centrifugazione a 160 g per 10 min a temperatura ambiente in tampone fosfato (PBS, pH 7.2) e risospese dentro tubi da 50 mi (Nunc, Kamstrup, Danimarca) alla concentrazione finale di 10 X IO<6>cellule/ml, sempre in tampone fosfato (PBS, pH 7.2).

Le cellule sono state risospese alla concentrazione finale di 1 X IO<6>cellule per mi in piastre da sei pozzetti (Lab-Tek chamber slides, Nunc, Kamstrup, Danimarca) in 4 mi per pozzetto di soluzione finale composta da comune terreno di coltura RPMI 1640{GIBCO) supplementato con:

10% FCS (Celbio, Milano, Italia);

100 unità/ml di penicillina;

100 ug/ml streptomicina;

160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milano, Italia);

2 mM L-glutammina (Life Technologies; growth medium) .

Le cellule sono state incubate per 3 giorni in un incubatore Heraeus termostaticamente controllato alla temperatura di 37°C con un'atmosfera contenente il 5% di apporto costante di C02{v/v in aria).

Trascorsa l'incubazione le cellule si presentavano tutte eutrofiche con morfologia specifica per ciascuna tipologia cellulare.

Ogni piastra da sei pozzetti è suddivisa come segue:

- CONTROLLO (controllo negativo) due pozzetti non sono stati destinati ad alcun trattamento e le cellule sono state coltivate nel medium di coltura sopra descritto;

- CAMPIONE-1 (campione trattato con la sola ALBUMINA al 20%) due pozzetti sono stati destinati al trattamento con la sola albumina al 20% di concentrazione espressa copme peso/volume finale di medium di coltura come sopra descritto;

- CAMPIONE-2 (campione trattato con la combinazione ALBUMINA/IDROSSIUREA, denominata BIN-ALB) due pozzetti sono stati destinati al trattamento con albumina al 10% ed IDROSSIUREA BOmicromolare, le concentrazioni sono espresse come peso/volume finale di medium di coltura come sopra descritto.

Le cellule sono state monitorate ogni ora per tre giorni di coltura totali. Al terzo giorno di incubazione si registrava invariabilmente la morte di tutte le cellule in coltura.

Colorazione con trypan blue.

Il trypan blue è un colorante in grado di colorare selettivamente le cellule morte. Il motivo per cui questo colorante non colora le cellule vive è da ricercarsi nell'estrema selettività della membrana cellulare. Le cellule vitali, avendo la membrana intatta, non permettono la penetrazione di questo colorante nel citoplasma; al contrario, nelle cellule morte questo penetra facilmente, rendendole distinguibili dalle vive con una rapida analisi al microscopio. Il trypan blue non è in grado di distinguere cellule apoptotìche da cellule necrotiche. Le sospensioni cellulari vengono incubate con lo 5% di trypan blue per 5 minuti a temperatura ambiente; allo scadere dell'incubazione si prelevano lOmicrolitri di tale soluzione cellulare colorata e si depongono in camera per conteggio cellulare (ad es. camera di Burker) e si esegue una attenta osservazione al microscopio ottico con ingrandimenti in sequenza 20X, 40X. Si procede dunque al conteggio delle cellule vive e morte per mi. Le cellule morte appariranno intensamente colorate di blue, le cellule vitali non si coloreranno di blue.

Colorazione con MTT

Tale saggio valuta la vitalità delle cellule coltivate in determinate condizioni. Le cellule vive, infatti, sono in grado di ridurre chimicamente il composto MTT, un sale di tetrazolio solubile in acqua, il quale diviene un sale di formazano insolubile in acqua e di color violetto (Mosmann 1983; Hansen, Nielsen et al. 1989; Liu, Peterson et al. 1997; Liu and Schubert 1997). Il trattamento delle cellule è eseguito in una piastra da 96 pozzetti NUNC, dedicando 6 pozzetti per ciascuna condizione sperimentale, con una densità di 15000 cellule per pozzetto in un volume di 200microlitri finali per ciascun pozzetto contenenti MTT ad una concentrazione finale di 0.5mg/ml. La piastra viene posta in un incubatore Heraeus termostaticamente controllato alla temperatura di 37°C con una atmosfera contenente il 5% di apporto costante di C02{v/v in air) per 30 minuti. Al termine della incubazione si elimina dai pozzetti il terreno, aspirandolo delicatamente con una pipetta multicanale. Dopo essersi accertati che non siano rimaste tracce di soluzione nei pozzeti, si aggiungono 100 mi di DMSO a ciascuno di essi e si agita la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente allo scopo di sciogliere i cristalli del sale di formazano. Se le cellule sono metabolicamente vitali, effettuando quindi la riduzione dello MTT, quando viene aggiunto il DMSO si osserva la formazione di un colore violetto. La vitalità è quantificata mediante la lettura della assorbanza con uno spettrofotometro per lettura di piastre ELISA, ad una lunghezza d'onda di 570 nm. Ogni esperimento è stato ripetuto almeno 3 volte ed i dati sono stati espressi come percentuale rispetto al controllo in cui la capacità di riduzione del MTT è stata considerata il 100% di vitalità.

È la colorazione di base nello studio microscopico dei tessuti animali e ne consente un migliore studio morfologico al microscopio ottico. Colora in blu, grazie alla ematossilina o emallume di Mayer, le componenti cellulari cariche negativamente come acidi nucleici, proteine di membrana e membrane cellulari, elastina che sono quindi detti basofili. Colora in rosso tramite la eosina, i componenti carichi positivamente (acidi) come proteine cellulari in alcune cellule (eosinofili) e fibre collagene che sono quindi detti acidofili .

MATERIALE UTILE

• vetrino con una sezione non colorata

• vetrino coprioggetto

• un supporto per vetrini con manico lungo almeno 5-10 cm

• 10 vaschette di vetro la cui dimensione sia compatibile con quella del portavetrini

o 7 di queste andranno a formare la scala di idratazione/deidratazione

o una serve per 1<1>ematossilina

o una per l'eosina

o una per i lavaggi

• xilene, 2 vaschette

• etanolo assoluto, 2 vaschette

• etanolo 90°, 2 vaschette

• Emallume di Mayer (Ematossilina)

• Soluzione alcoolica di eosina

• acqua distillata 1 litro

IDRATAZIONE

Mettere il vetrino in stufa 60°C fino a quando la paraffina non è diventata liquida.

Dopodiché il vetrino viene immerso:

1. 20 minuti in xilene 1

2 . 15 min in xilene 2

3 . 10 min in etanolo assoluto 1

4. 10 min etanolo assoluto 2 5. 5 min in etanolo 90° 1

6. 5 min in etanolo 90° 2

7. 20 min i acqua distillata EMATOSSILINA

1. immergere i vetrini 20 secondi nel colorante 2. lavare in acqua distillata 2 volte

3. mettere la vaschetta con i vetrini sotto l'acqua corrente di rubinetto per 5 min, possibilmente senza dirigere il getto diretamente sulle sezioni

4. lavare in acqua distillata

EPSINA

1. immergere il portavetrini nel la vaschetta con l'alcool 90° per 15 min

2. immergere i vetrini nell’eosina per 1 minuto 3. metterli poi nella vaschetta dei lavaggi piena di alcool 90°

DISIDRATAZIONE

1. Continuare con gli acooli e lo xilene, ed infine mettere una goccia di balsamo montante ed apporre il vetrino coprioggetto.

ESEMPIO 1. Microscopia ottica

I campioni a 12, 24, 48, 72 ore di incubazione mostravano, dopo colorazione con ematossìlinaeosina, una ingravescente morte cellulare sino al 100% delle cellule in coltura per tutte le tipologie cellulari testate dopo la settantaduesima ora.

I controlli mostravano un diffuso eutrofismo con una morfologia specifica e con una vitalità quantificabile fra il 90% ed il 100% per ogni tipologia cellulare testata.

I risultati hanno evidenziato come l'uso di albumina sciolta in soluzione fisiologica ad una concentrazione espressa come peso su volume finale in un range dal 2% al 50% e preferibilmente dal 10% al 20% possa indirizzare una parte delle cellule in coltura pari al 50%-100% di tutte le cellule presenti nella coltura alla morte cellulare in 8-24 ore di incubazione.

Inoltre i risultati hanno evidenziato come l'uso di albumina in soluzione fisiologica ad una concentrazione espressa come peso su volume finale in un range dal 10% al 20% unitamente ad Idrossiurea ad una concentrazione finale in un range fra 10-lOOmicroMolare possa indirizzare una parte di cellule in coltura pari al 80%-100% di tutte le cellule in coltura alla morte cellulare in 4-12 ore di incubazione.

ESEMPIO 2. Quantificazione della vitalità cellulare con trypan blue dei campioni trattati versus controlli non trattati

I risultati relativi alla vitalità e mortalità nei campioni e nei relativi controlli dopo una incubazione di ventiquattro ore sono stati espressi con una scala quantitativa in percentuale, come segue in:

- Tabella 4 (ovvero, trattamento con ALBUMINA al 20% di soluzione finale peso/volume),

- Tabella 5 (trattamento con il composto ALBUMINA al 10% ed IDROSSIUREA lOOuM espresse in una soluzione finale come peso/volume).

Tabella 4.

Tabella 5

ESEMPIO 3. Quantificazione della vitalità cellulare con MTT dei campioni trattati_versus controlli non trattati

I risultati relativi alla vitalità e mortalità nei campioni e nei relativi controlli dopo una incubazione di quarantotto ore sono stati espressi con una scala quantitativa in percentuale rispetto al controllo in cui la capacità di riduzione del MTT è stata considerata il 100% di vitalità.come segue in Tabella 6.

Tabella 6.

ESEMPIO 4. Composizione farmaceutica BIN-ALB - INFUS. STUDIO CLINICO SUL CANE.

PROTOCOLLO

1. Arruolamento

Dieci casi (specie canidì di razza, taglia, peso corporeo, sesso ed età diverse).

2. Criteri di inclusione

Tumori solidi (Ca Mammario etc....) con lesione da trattare non superiore a 3cm cubi.

3. Iter clinico

In tutti i cani esaminati sono state adottate le seguenti procedure.

a. TEMPO ZERO

- Raccolta anamnestica e visita clinica comprendente esame ematochimico completo formula leucocitaria manuale (valutazione eventuale leucopenia), QPE (quadro proteico-elettroforetico), albuminemia, enzimi epatici e pancreatici, CPK, LDH ed i LATTATI per verificare l'ossidazione metabolica;

- Ecografia della lesione interessata;

- Esame istologico di un campione;

- Stadiazione tumorale(TNM);

Valutazione di flebiti e trombo-flebiti locoregionali, descrizione in scheda anamnestìca (rilevanza prognostica circa efficacia del trattamento) ;

- Valutazione e di lesioni multifocali e stazioni loco-regionali, descrizione in scheda anamnestìca (rilevanza prognostica circa efficacia del trattamento) ;

- Inoculazione ecoguìdata intra-lesionale (in ideale centro/i lesione) della soluzione testata pari alla quantità di 1 mL di liquido ogni cm cubo di diametro di lesione.

Settimanalmente e per quattro/otto volte, in dipendenza della gravità del quadro patologico iniziale, è stato effettuato l'esame clinico con valutazione loco-regionale ed eseguita ecografia della lesione con ripetizione della iniezione ecoguìdata intra-lesionale della soluzione.

b. FINE DEL CICLO DI TRATTAMENTO

- Ecografia e valutazione dimensionale della

lesione trattata;

- Esame istologico di un campione;

- Stadiazione tumorale(TNM);

Valutazione di flebiti e trombo-flebiti locoregionali, descrizione in scheda anamnestica (rilevanza prognostica circa efficacia del trattamento) ;

- Valutazione e di lesioni multifocali e stazioni loco-regionali, descrizione in scheda anamnestica (rilevanza prognostica circa efficacia del trattamento) ;

Visita clinica con refertazione, comprendente esame ematochimico completo formula leucocitaria manuale (valutazione eventuale leucopenia), QPE (quadro proteico-elettroforetico), albumìnemia, enzimi epatici e pancreatici, CPK, LDH ed i LATTATI per verificare l'ossidazione metabolica.

- Conclusioni circa EFFICACIA e TOSSICITÀ'.

NOTE

Il laboratorio utilizzato è riconosciuto dalla Regione Piemonte con AUT.G.R. del 10/12/1990 N. 193-2412. La casistica è stata raccolta nell'Ambulatorio Veterinario Associato di corso Traiano 99/d TO (DIR. SAN. Dott. C. Vercelli) quale Centro di riferimento ed eventuali Ambulatorio Veterinari Associati afferenti al Centro di riferimento.

CONCLUSIONI

L'uso della combinazione di albumina e idrossiurea negli studi clinici effettuati su 10 cani di varie razze e taglia ha dimostrato un'ottima tollerabilità in tutti i soggetti senza mostrare alcun effetto apparentemente di tipo sistemico, indipendentemente dalla differente età, taglia, sesso e localizzazione della patologia tumorale. La EFFICACIA del trattamento si è concretizzata nella riduzione cospicua della massa tumorale prima della rimozione chirurgica.

BIBLIOGRAFIA

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Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione farmaceutica comprendente almeno un agente antineoplastico ed albumina in un veicolo farmaceuticamente accettabile.
2. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 1, in cui l'agente antineoplastico è scelto fra idrossiurea, suoi analoghi, suoi precursori e suoi derivati attivi.
3. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 2, in cui l'agente antineoplastico è idrossiurea .
4. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 3, comprendente idrossiurea ad una concentrazione nel campo da 10 μΜ a 1 mM.
5. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, comprendente albumina ad una concentrazione nel campo di 2 a 50% (p/v).
6. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 5, comprendente albumina ad una concentrazione nel campo di 10 a 20% (p/v).
7. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, destinata ad essere somministrata ad un soggetto appartenente a una predeterminata specie, in cui l'albumina è l'albumina specifica di detta specie.
8. Corredo comprendente almeno un agente antineoplastico ed albumina come preparazione combinata per l'uso simultaneo, separato o sequenziale nella terapia del cancro, in cui l'agente antineoplastico e l'albumina sono come definiti in una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7.
9. Uso di almeno un agente antineoplastico ed albumina per la preparazione di un medicamento per il trattamento del cancro.
10. Uso secondo la rivendicazione 9, in cui medicamento è destinato ad essere somministrato per via infusionale, iniettiva, orale o topica.
11. Uso secondo la rivendicazione 9, in cui il trattamento è una terapia antiproliferativa neoadiuvante .