ITTO20010517A1

ITTO20010517A1 - Cellule progenitrici vascolari umane.

Info

Publication number: ITTO20010517A1
Application number: IT2001TO000517A
Authority: IT
Inventors: Arnaldo Caruso; Giulio Alessandri
Original assignee: Giulio Alessandri; Arnaldo Caruso
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2001-05-31
Publication date: 2002-12-01
Also published as: WO2002097066A2; WO2002097066A8; WO2002097066A3; AU2002314526A1; ITTO20010517A0

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo "Cellule progenitrici vascolari umane

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda cellule nitrici vascolari umane ottenibili mediante isola mento da espianti di aorta fetale umana.

Tali cellule sono in grado, se coltivate i n una matrice tridimensionale di collagene, di forma re ex vivo nuove strutture vascolari del tipo ca piilari.

Un oggetto dell'invenzione sono pertanto cel lule progenitrici vascolari umane come definit nella rivendicazione 1.

Le cellule dell'invenzione sono inoltre, su scettibili di essere espanse in vitro rimanendo in una forma indifferenziata, il che le rende partico larmente adatte per l'impiego in una serie di ap plicazioni mediche che prevedono la rige

e/o la riparazione di strutture o tessuti

ri.

Le cellule progenitrici dell'invenzione sori state isolate da espianti di aorta fetale umana nel corso di esperimenti volti a studiare la capei cità dell'aorta fetale umana di dare origine a nuo ve strutture vascolari in vitro.

Un secondo oggetto dell'invenzione è quindi un procedimento per l'isolamento di cellule progenitrici vascolari come definito nella rivendicazione 5.

Per studiare la capacità dell'aorta fetal umana di dare origine a nuove strutture vascolari espianti di anello aortico da embrioni di 10-12 giorni inclusi in gel di collagene (Elsdale e Bare; 1972, J. Celi. Biol. 54:626-637; Nicosia e Ottinet ti, 1990, Lab. Invest. 63:115-122) sono stati os servati per 10 giorni.

Durante le prime 24 ore non vi erano cambia menti significativi, anche se alcune cellule affu solate del tipo fibroblasti migravano nella matri ce. Nel corso delle successive 24 ore, cordoni cel lulari coesivi iniziarono a crescere dagli anelli aortici. Il numero di strutture cordonali era molto variabile e difficile da quantificare a causa della complessità tridimensionale del materiale cresciuto e dell'abbondanza delle cellule del tipo fibroblà sti. Alcuni cordoni sembravano derivare dai borei tagliati dell'espianto, ma la maggior parte emerge va dalle superfici avventizie o intimali.

Entro il terzo giorno, i cordoni erano cré sciuti in modo casuale, dividendosi in rami e for mando disegni ramificati complessi. A questo stéi dio, alcuni dei cordoni formatisi erano regredit: mentre altri erano ancora in corso di formazione si stavano sviluppando in strutture del tipo capi-tari. Il massimo allungamento dei cordoni (2-3 mn|i) fu osservato dopo cinque giorni, dopodiché segijiì una rapida regressione, che si completava verso la fine della settimana. Questi risultati furono reg strati nel 70% delle colture (N = 15).

Un altro oggetto dell'invenzione è quindi iln procedimento per la formazione di nuove strutture vascolari come definito nella rivendicazione 9.

Caratterizzazione dell'aorta embrionale

Per caratterizzare il tessuto aortico embrici naie prima della coltivazione in vitro in gel di collagene, furono effettuate analisi istologiche éd immunoistochimiche.

La parete dell'aorta embrionale consisteva ,1 un rivestimento endoteliale, una lamina elastica interna e molti strati di cellule mesenchimali affusolate. Queste cellule erano disposte in fasci compatti ed avevano le caratteristiche ultrastrutturali del muscolo liscio scarsamente differenziato, includendo piccoli fasci di miofilamenti circondati da fibre elastiche. A questo punto dello sviluppo embrionale erano assenti vasa vasorum.

L'immunoistochimica mostrò che soltanto le cellule rivestenti il lume si coloravano fortemente per CD31 e per il fattore di von Willebrand (vWF) il che confermava il loro fenotipo endoteliale maturo. Nessuna delle altre cellule costituenti la parete aortica presentava una immunoreattività splecifica per questi anticorpi.

La colorazione con CD34, un antigene espresso tipicamente nelle cellule progenitrici endoteliali, ma anche in cellule staminali di altra origine, mostrava chiaramente che non soltanto il lume ma anche le cellule più periferiche/para-aortichb, esprimevano questo antigene. In una sezione seriale dello stesso espianto utilizzata per l'analisi di CD31, CD34 sembra essere espressa dal tessuto paraaortico, mentre in diverse sezioni di differenti anelli essa sembra essere espressa costitutivamente e specificamente dalle cellule esterne della parete aortica, il che suggerisce che questa non è, o non è soltanto, una caratteristica delle cellule paraaortiche. Lo strato cellulare esterno, inoltre, mostrava una forte reattività con anticorpi per il recettore 2 del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGFR2), anche conosciuto come "flk-1", un altro marcatore di immaturità endoteliale, che era anche espresso dalle cellule endoteliali rivestenti il lume.

Caratterizzazione dei cordoni vascolari

Il fenotipo cellulare dei cordoni e dei tubi capillari nascenti dagli anelli aortici fu investigato mediante microscopia ottica, immunoistochimica e microscopia elettronica. Il materiale cresciuto consisteva di cellule mesenchimali affusolate, che talvolta formavano aggregati con zone centrali necrotiche. La formazione incipiente di strutture del tipo capillari era spesso evidente nelle aree in cui le cellule mesenchimali erano densamente impaccate. Il lume di queste formazioni del tipo capillari era rivestito di cellule coesive con citoplasma abbondante e nuclei importanti. Queste cellule, del tipo endoteliale, tendevano a formare delicate reti di lunghi canali rettilinei che talvolta si ramificavano ad angolo acuto. L'immunoistochimica mostrò che tutte le cellule rivestenti i canali si coloravano fortemente per CD31 e CD34. Esse erano anche immunoreattive per vWF, anche se meno intensamente. Le cellule mesenchimali circostanti, che non erano organizzate in strutture vascolari, erano costantemente negative per tutti questi marcatori.

Inoltre, le cellule formanti i neovasi, e anche le cellule endoteliali che rivestivano il lume, si coloravano fortemente per Flk-l/VEGFR-2. In alcuni rari casi i microvasi sembravano originarsi sia dallo strato interno endoteliale che dalla periferia della sezione aortica. Questo fenomeno è stato registrato in circa 1 sezione sulle 20 analizzate. In un numero molto elevato di sezioni istologiche, infatti, la maggior parte della proliferazione neovascolare si verificava principalmente nelle parti esterne degli anelli aortici, mentre in un numero molto limitato di casi, essa sembrava verificarsi nel rivestimento endoteliale del lume aortico.

Queste osservazioni, insieme alle caratteristiche dell'aorta embrionale non trattata, suggeriscono che i neovasi si formino principalmente da precursori endoteliali immaturi (CD34+/Flkl+) del mesenchima aortico esterno, cioè che la formazione di vasi in queste colture si verifichi principalmente grazie al processo della vasculogenesi piuttosto che dell'angiogenesi.

Come è noto, infatti, la vasculogenesi consiste nella formazione de novo di nuovi vasi sanguigni da precursori non differenziati o angioblasti.

Mediante studi di microscopia elettronica è stato trovato che il materiale originatosi dal l'aorta era composto da una miscela di cellule mesenchimali primitive, neovasi rivestiti con endotelio e cellule con un fenotipo misto mesenchimale/endoteliale, il che suggerisce una differenziazione del mesenchima in endotelio. Il rivestimento dei neovasi era composto di cellule endoteliali differenziate connesse attraverso complessi giun zionali. Le cellule endoteliali esibivano una polarità luminale/abluminale ben definita e poggiavano su una lamina basale sottile e discontinua. Il citoplasma endoteliale conteneva reticolo endoplasmatico ruvido abbondante con cisterne dilatate focalmente complessi del Golgi, vescicole pinocitotiche, mitocondri, ribosomi liberi, e lisosomi secondari includenti figure di mielina osmiofila. Le cellule mesenchimali immature contenevano glicogeno abbondante, mitocondri e fasci di microfilamenti con ad densamenti fusiformi, che erano particolarment evidenti appena al disotto del plasmalemma. Le cel lule con un fenotipo di transizione mesenchima le/endoteliale tendevano ad allinearsi a formar strutture ordinate longitudinali e a stabilire con nessioni giunzionali l'una con l'altra. Ciò causav la separazione di nuovi spazi luminali dalla matri ce cellulare circostante. Le cellule sequestrati all'interno dei lumi vascolari come risultato d questi cambiamenti morfogenetici perdevano il lor ancoraggio con la matrice circostante e morivano lasciando residui citoplasmatici che alla fine s ritrovavano nei neovasi differenziati.

Isolamento delle cellule progenitrici vascolar CD34+

Una sospensione cellulare da aorte fetali ap pena dissecate è stata utilizzata per isolare 1 cellule progenitrici vascolari (CD34+CD31-) presen ti nella parete aortica.

A questo scopo, le aorte possono essere dige rite con una soluzione di collagenasi-dispasi. L sospensione cellulare risultante viene analizzat per la presenza di cellule CD34+CD31- mediante re azione con anticorpi che riconoscono specificament tali antigeni di superficie.

A questo scopo, la sospensione può essere incubata con biglie magnetiche rivestite con anticorpo anti-CD31 per rimuovere le cellule endoteliali differenziate, e poi con biglie rivestite con un anticorpo contro CD34.

Mediante questa procedura, è stato dimostrato che meno dell'1% delle cellule presenti nella sospensione erano CD31-positive (CD31+), mentre il 29,5 ± 2,5% delle cellule erano CD34-positive (CD34+).

Questo risultato fu confermato da analisi mediante citofluorimetria di flusso (FACS).

Per caratterizzare meglio queste cellule al momento del loro isolamento, alcune di esse sono state seminate su piastre rivestite con collagenefibronettina e coltivate, per un breve periodo di tempo (24 ore) per evitare la differenziazione, in terreno basale per colture endoteliali ("Basai Endothelial Medium") (EBM) supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS) e supplemento di crescita per cellule endoteliali (Alessandri et al., 1998, Lab. Invest. 78:127-128). Il giorno successivo, le cellule venivano fissate e colorate con anticorpi contro CD31 e vWF, non mostrando alcuna imraunoreattività.

Inoltre, per determinare se le cellule CD34+/CD31- selezionate potessero differenziarsi in endotelio maturo, esse furono seminate e coltivate per 7 a 10 giorni nelle stesse condizioni descritte sopra. Le cellule furono poi staccate con tripsina e incubate con biglie rivestite con anticorpo anti-CD31.

Il risultato di questo trattamento fu che il 25% ± 6,5% (media di 5 esperimenti) della popolazione cellulare CD34+/CD31- iniziale si differenziava in cellule CD34+/CD31+, che esprimevano il marcatore vWF, dimostrando così la formazione di un fenotipo endoteliale più maturo. Nelle stesse condizioni di coltura, nessuna delle cellule CD31-CD34- si differenziava in cellule CD34+/CD31+, né acquisiva una immunoreattività specifica per vWF (dati non mostrati). Per confermare ulteriormente il processo di maturazione, le cellule CD34+ erano coltivate per 2 a 3 settimane e poi seminate su Matrigel per valutare la loro capacità di formare strutture tubolari del tipo capillari. Oltre alle cellule endoteliali mature (CD31+) isolate dal lume aortico e coltivate nelle stesse condizioni, anche le cellule CD34+/CD31+ erano in grado di formare una rete di strutture del tipo capillari dopo 24 ore di incubazione.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione sono quindi cellule endoteliali umane mature come de nite nella rivendicazione 8.

Discussione

Anche se di recente i meccanismi molecolari che regolano la vasculogenesi e l'angiogenesi embrionali sono stati meglio compresi, vi è ancora molto da imparare, in particolare in relazione agli esseri umani. Per colmare questa lacuna abbiamo utilizzato il saggio dell'anello aortico (Nicosia e Ottinetti, 1990) per analizzare le proprietà di vasculogenesi di aorte embrionali umane di 10-12 settimane.

In breve, i risultati di questo studio hanno dimostrato che gli espianti aortici embrionali umani producono una intensa crescita di strutture capillari quando coltivati in una matrice tridimensionale di collagene, la cui formazione in vitro somiglia al processo fisiologico in vivo della vasculogenesi embrionale. I nostri risultati immunoistochimici e ultrastrutturali indicano che questo materiale può derivare dal differenziamento di cellule CD34+ immature e non da cellule endoteliali preesistenti (CD31+).

Infatti, come è dimostrato dai dati immunpistologici, le cellule CD34+ immature esprimono fèniche Flk-l/VEGFR-2, un altro marcatore altamente espresso nelle cellule progenitrici endoteliali, Queste cellule sono localizzate nello strato cellulare mesenchimale più esterno che costituisce la parete aortica, in stretta correlazione con il tessuto para-aortico, che tuttavia non contiene cellule endoteliali mature in questo stadio dello sviluppo, come dimostrato dalla loro colorazione negativa per CD31.

Da quanto ci è dato di conoscere, la presente invenzione descrive per la prima volta la formazione ex vivo di microvasi umani mediante vasculogenesi. Uno studio precedente condotto da altri autori su frammenti di vasi sanguigni di placenta umana fetale non aveva messo in evidenza questo meccanismo di formazione di nuovi capillari.

I nostri dati indicano anche che il processo di differenziazione delle cellule endoteliali (EC) negli esseri umani è diverso da quello che si verifica utilizzando cellule staminali embrionali di topo. Effettivamente, contrariamente alle cellule staminali di topo, l'acquisizione dell'antig ene CD31 nella vasculogenesi umana si verifica dopi la maturazione delle cellule CD34+ in coltura. I

tre, i nostri risultati indicano che l'aorta embrionale umana è una ricca fonte di cellule pi genitrici vascolari CD34+/CD31- (angioblasti), che sono localizzate lungo lo strato esterno del mesenchima dell'aorta, probabilmente in stretto contatto con il tessuto para-aortico, che a questo stadio dello sviluppo non contiene endotelio maturo.

Abbiamo trovato che il 20-30% delle cellule CD34+ isolate da aorta dava origine a endotelio più maturo. Il resto delle cellule CD34+ non è stato studiato. Uno studio recente condotto utilizzando cellule staminali embrionali di topo (Yamashita et al., 2000, Nature 408:92-96) ha suggerito che cellule endoteliali e murali (periciti e muscolo liscio vascolare) possono originarsi dagli stessi precursori Flk-1+, ma non sappiamo se questo processo si verifichi anche negli esseri umani. Tuttavia suggeriamo che nell'aorta embrionale sia possibile trovare e isolare cellule CD34+ Flk-1+ primitive che possono differenziarsi in vari fenotipi vascolari. Questo può essere un risultato importante poiché potrebbe portare all'isolamento di cellule staminali vascolari, e numerosi studi pubblicati in precedenza hanno indicato le enormi potenzialità delle cellule staminali multipotenti in applicazioni cliniche.

Data la stretta correlazione tra la formazione e l'organizzazione del sistema ematopoietico/endoteliale e nervoso, la possibilità di combinare il trapianto di angioblasti/cellule staminali vascolari e cellule staminali neurali nelle malattie degenerative rappresenta una strategia molto attraente per migliorare il successo di questa terapia innovativa. Inoltre, le cellule staminali vascolari/angioblasti possono essere utilizzate per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella maturazione delle cellule endoteliali umane e nella vasculogenesi, e il nostro modello può pertanto essere utile per studi di rigenerazione vascolare. Infine, queste cellule offrono un'importante alternativa per il trattamento clinico dell'ischemia e di altre malattie vascolari e indicano la possibilità di applicazioni di bioingegneria tissutale e di terapia genica.

In sintesi, le cellule progenitrici vascolari CD34+/CD31- della presente invenzione, così come le cellule endoteliali ottenute dal differenziamento delle cellule progenitrici vascolari, possono essere impiegate in una serie di applicazioni mediche che possono essere schematicamente riassunte pel modo che segue:

- neovascolarizzazione di tessuti ischemici, a Seguito di fenomeni trombotici o traumatici;

- riparazione di danni vascolari dovuti a fenomeni traumatici o di origine aterosclerotica;

- rigenerazione di organi favorendo la vascolarizzazione del tessuto in crescita (fegato, ghiandola mammaria ecc.);

- trapianto di cellule staminali midollari e di dltra origine (quali cellule staminali neuronali) per favorire l'attecchimento e la crescita;

- attecchimento di tessuto osseo innestato;

in tutte quelle condizioni che richiedcjno l'attecchimento e la crescita di cellule e tessati nell'organismo umano;

- produzione di fattori di crescita e/o trofici er cellule di diversa origine e provenienza;

- produzione di fattori angiogenetici e/o vascuJjcogenetici a scopo terapeutico nell'uomo;

- terapia genica;

- bioingegneria tessutale;

- endotelizzazione di protesi vascolari e valvole cardiache.

ESEMPI

Preparazione degli espianti di aorta

Il permesso di utilizzare materiale fejtale umano è stato ottenuto dal Comitato Etico dell'ospedale neurologico "Carlo Besta" e dalla clinica di Ginecologia e Ostetricia "L. Mangiagalli" di Milano. Il tessuto fetale è stato prelevato da aborti terapeutici o legali previo consenso firmato della donatrice, seguendo le linee guida della Comunità Europea (NECTAR Network for European CNS Transplantation and Restoration).

Le aorte da embrioni umani (10-12 settimane) sono state accuratamente lavate con PBS (Phosphate Buffer Saline) e ripulite dal materiale paraortico facendo molta attenzione a non danneggiare la parete delle aorte. Utilizzando un microscopio a dissezione, le aorte sono state tagliate trasversalmente con un bisturi, in modo da ottenere numerosi anelli (rings) di circa 1 mm di spessore. Il materiale così ottenuto è stato mantenuto in DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) a 4°C per non più di 2-4 ore prima dell'uso.

Valutazione della proprietà vasculogenica delle aorte fetali

Per valutare la capacità dell'aorta fetale di dare origine a nuove strutture vascolari in vitro, una parte dei rings sono stati coltivati in una soluzione di collagene secondo una metodologia già standardizzata e pubblicata (Nicosia e Ottinetti, 1990, Lab. Invest. 63:115-122).

In breve, 7 volumi di soluzione di collagene del tipo I (4 mg/ml) preparato da coda di ratto (Elsdale and Bard, 1972), in ghiaccio, furono mescolati con 2 volumi di terreno EBM (BioWhittaker, Walkersville, Maryland), 5x e 1 volume di HEPES (0,2 M). Ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti fu riempito con 0,7 mi di soluzione di collagene e lasciato gelificare in un incubatore umidificato a 37°C per 1 ora. Sopra ogni gel fu posto un anello e furono aggiunti altri 0,5 mi di soluzione di collagene per coprire il materiale. Dopo che il secondo strato di collagene era gelificato, 1 a 2 ore dopo, fu aggiunto 1 mi di terreno di créscita EBM (Alessandri et al., 1998). Le piastre furono incubate fino a 10 giorni. Il terreno veniva cambiato ogni 2 giorni.

Attraverso questo metodo di coltivazione, abbiamo dimostrato che espianti di aorte fetali possiedono la proprietà di formare nuove strutture cordonali che sono composte da cellule che esprimono markers tipici di cellule endoteliali differenziate (CD31, CD34, Flk-l/kDR, vWF), pur mantenendo un'apparente stato di immaturità morfologica, dome risulta da un attento esame ultrastrutturale (vledere la sezione "Caratteristiche dei cordoni vascolari"), suggerendo quindi che le strutture vascolari originanti dalle colture dei rings aortici siano vasi formati attraverso un processo differenziktivo/vasculogenetico, piuttosto che angiogenefcico (cioè di derivazione da cellule endoteliali ditfferenziate/mature preesistenti nel lume dell'aortk). Localizzazione delle cellule progenitrici vascolari nel tessuto aortico

L'identificazione delle cellule progenitrici vascolari (angioblasti) nello stroma aortico è (stata effettuata mediante metodi di immunocitochimtLca. Utilizzando un anticorpo monoclonale che riconosce 1'antigene di membrana CD31 (PECAM), che è normalmente espresso sull'endotelio maturo differenziato, è stato possibile visualizzare che solo le cellule rivestenti il lume aortico sono positive a quésto antigene, mentre tutte le cellule mesenchimali dello stroma sono negative. Utilizzando invece un secondo anticorpo che riconosce 1'antigene di superficie CD34, un antigene tipicamente espresso nei progenitori di cellule endoteliali (il CD34 rappresenta un marcatore,delle cellule staminali anche di altra origine tessutale, come per esempio il midollo osseo), si è potuto evidenziare che una notévole quantità di cellule presenti nell'area periferica in prossimità del tessuto paraortico sono positive a questo marcatore. Mentre, quindi, le cellule endoteliali mature del lume sono positive sia al CD31 che al CD34, le cellule progenitrici/angioblasti sono positive solo al CD34. Inoltre il progenitore endoteliale/angioblasto non esprime il market: di maturazione come il Fattore Vili (vWF) che invece è tipicamente espresso nell'endotelio maturo.

Isolamento delle cellule progenitrici vascolari Una parte dei rings non utilizzati per la valutazione nel test di formazione neovascolarè ex vivo, dopo ripetuti lavaggi con PBS, vengono ulteriormente frazionati con forbici. I frammenti sono lavati mediante centrifugazione (1200 rpm x 10' a 4°C) e successivamente trasferiti in una soluzione di collagenasi/dispasi (Boehringer, Mannhein, Germania) allo 0,25% (peso su volume). Il materiali in provetta viene trasferito in un bagno termostatico a 37°C e lasciato in agitazione 16 ore (overnight). Alla fine dell'incubazione il materiale aortico è completamente digerito. Il pellet della aorta cosi ottenuto viene lavato con tampone fosfato salino(PBS) e risospeso in 1 mi di DMEM contenente lo 0,2% di BSA (sieroalbumina bovina). Le cellule deli' aorta vengono quindi contate: di solitp si ottengono circa 1,2 x IO<6 >per aorta. L'analisi fenotipica in citofluorimetria evidenzia generalmente una presenza intorno al 1-3% di cellule CD31+ qD34-ed una percentuale intorno al 30-40% di cellule CD34+ CD31-. La sospensione cellulare è quindi utilizzata per isolare i precursori vascolari. L'isolamento delle cellule progenitrici endoteliali viene eseguito mediante l'utilizzo di biglie magnjietiche trattate con anticorpi che riconoscono antigeni presenti sui precursori e assenti nelle cellule differenziate.

A questo scopo, la sospensione cellulare (circa IO<6 >cellule) viene inizialmente incubata (30' a 4°C su agitatore rotante) (rapporto cellule/biglie 1:1) con biglie (IO<6>) trattate con anticorpi contro il CD31 (DAKO, Carpenteria, California). le cellule mature endoteliali che esprimono il CD31 legano le biglie e possono essere rimosse dalle altre cellule mediante un magnete (Dynal, Oslo, Norvegia). In questa maniera è possibile rimuovere dalla sospensione cellulare tutte le cellule C D31+ presenti (la procedura di separazione può essere ripetuta più volte). Le restanti cellule sono successivamente incubate con altre biglie magnetiche trattate con anticorpi che riconoscono il CD34 oppure 1'antigene AC133 (anch'esso espresso sui precursori endoteliali ma assente sull'endotelio irjaturo) . Le cellule che legano il CD34 oppure l'AC133 possono essere facilmente recuperate attraverso un magnete. La percentuale di cellule CD34+AC133+ che si possono recuperare da circa IO<6 >cellule di ajorta è intorno al 30-40%, percentuali simili a qulelle quantificate nella sospensione cellulare mediante citofluorimetria di flusso

Caratterizzazione fenotipica dei progenitori ejndoteliali

Una parte delle cellule separate con le biglie magnetiche che legano il CD34 oppure l'AC133 vengono caratterizzate fenotipicamente per verificare ulteriormente l'assenza del CD31 e del vWF. Un'aliquota di cellule purificate (circa IO<4>) sono seminate su vetrini trattati con una soluzon^ di collagene e fibronettina (come descritto da Alessandri et al Lab. Invest. 1998, 78:127-128) e lasciate incubare a 37°C per circa 24 ore in un terreno di cultura composto da EBM (Endothelium Basai Medium, Biowittaker, Walkersville, Maryland) contenente il 10% di FCS (siero fetale di vitello) Alla fine dell'incubazione, le cellule adese sono fissate con 4% paraformaldeide in PBS, pH 7,4, per 10' a temperatura ambiente. Dopo 2-3 lavaggi con PBS (0,1% Triton-X), segue un lavaggio con un medium al 10% di siero di cavia (NGS) (Gibco, Grand Island, New York). Successivamente i vetrini sono incubati con un anticorpo monoclonale murino anti-CD31 o anti vWF umani (rispettivamente utilizzati alla diluizione 1:100 e 1:80) (acquistati dalla Ditta Sigma, St. Louis, Missouri) per circa 90' a 37°C. Dopo due lavaggi con PBS, le cellule sono incubate, rispettivamente, con una soluzione (1:300) di cyam:ine dye-labeled goat anti-topo o anti-coniglio immunoglobuline G (IgG) (Cy2, Jackson Immunoresearch, Pensylvania) per circa 45' a temperatura ambiente. Dopo essiccamento del preparato all'aria, le cellule fluorescenti sono visualizzate e fotografate con microscopio Zeiss Axiophot-2 (Zeiss, Oberkochen, Germania). Generalmente, dopo analisi immunocitochimica meno del 19% delle cellule CD34+/AC133+ sono positive CD31 e lo 0% sono positive al vWf entro le 24 ore dalla semina.

Valutazione sperimentale delle proprietà di differenziamento dei precursori in cellule endoteliali mature

Una volta stabilita la negatività della nostra preparazione di precursori endoteliali ai markers di maturazione CD31 e vWF, le cellule sono coltivate in un medium che induce differenziamento delle cellule progenitrici CD34+ in cellule endoteliali mature. Il medium di differenziamento (M-2) si compone dei seguenti elementi: MI 99 (Gibco) contenente il 20% di FCS, il 10% di Condimed (Boehringer, Mannhein, Germania), eparina (10μg/ml) (Sigma) basic Fibroblast Growth factor (bFGF) (20ng/ml) (Sigma) vascular endothelial growth factor (VEGF) (5ng/ml) (R&D System, Ine., Minneapolis, MN). Le cellule CD34+/AC 133+ sono seminate in fiasche di plastica per colture cellulari trattate con collagene tipo I (Cali Skin, Bohering Manhein, Germania) lDg/cm<2 >e fibronettina piasmatica bovina (SIGMA) lDg/cm<2>. Dopo adesione, le cellule sono coltivate a 37°C in 5% CO<2 >con M-2 per circa 5-7 giorni. Alla fine dell'incubazione le cellule sono staccate dalla plastica con tripsina, lavate con PBS e contate. Successivamente le cellule sono incubate (procedura come sopra descritta) con biglie magnetiche antiCD31 per isolare le cellule endoteliali mature. Generalmente circa il 25-35% delle cellule CD34+CD31-inizialmente seminate, differenziano in CD34+CD31+/vWF+.

Le culture di cellule endoteliali derivate per differenziazione in vitro da cellule progenitrici vascolari dell'aorta fetale esprimono alcune caratteristiche fenotipiche e funzionali classiche delle culture di cellule endoteliali mature isolate sia da tessuti fetali che da tessuti umani adulti. In particolare, come tutte cellule endoteliali quando vengono coltivate su Matrigel (Necton-Dickinson, Bedford, Massachussets), sono in grado di formare strutture capillari simili ai vasi capillari umani in vitro. Questa capacità di formare strutture simil-vascolari in vitro è una proprietà molto specifica delle cellule endoteliali.

Espansione del progenitori endoteliali

Le cellule CD34+AC133+ possono essere amplificate in vitro mediante coltivazione in un terreno di coltura che ne mantiene in parte lo stato di cellule immature. Il terreno di cultura definito, "medium-6" (M-6) è composto dei seguenti elementi: terreno EBM 10% FCS+ 10% Condimed 10% H-I (Hormone Mix; 400 mi di H-I sono composti da: 40ml di DMEM/F12 10X, 8ml di glucosio 30%, 6ml di Na2HC03 7,5%, 2ml di HEPES 1M, 322 mi di H20 apirogena sterile, 400mg di apotrasferrina (SIGMA), 100 mg di insulina (Sigma) sciolti in 2 mi di HC1 0,1 N, 38,64 mg di putrescina (Sigma), 40 μΐ di selenio 3X10<'3>M (Sigma), 40 μΐ di progesterone 2xlO<-3>M (Sigma)).

Le cellule CD34+ mantenute in M-6 conservano proprietà di cellule immature (CD34+CD31-) per almeno 3 settimane di coltura. Dopo questo periodo, una percentuale progressiva (50%) di CD34+ perde questo antigene e non è più in grado di differenziare in endotelio maturo, mentre la restante percentuale mantiene la capacità di differenziare. Fino ad oggi non sappiamo per quanto sia possibile mantenere le CD34+ in forma indifferenziata.

Analisi mediante citometria a flusso su aorte diqerite

L'analisi mediante citofluorimetria di flusso è stata effettuata su tutta la popolazione cellulare mista ottenuta dalla digestione del frammento aortico con collagenasi-dispasi. Circa 1 x IO<5 >cellule furono raccolte, colorate e incubate al buio per 30 minuti a 4°C con anticorpo fluoresceinato (FITC) anti-CD34, e con anticorpo ficoeritrinato (PE) anti-CD31 (Becton Dickinson, San Jose, Ca fornia) (diluizione 1:10). Le cellule dopo due lavaggi con PBS sono state analizzate mediante citofluorimetria di flusso utilizzando un FACSscan (Becton Dickinson, Mountain View, California).

Istologia e Immunochimica

I tessuti fissati in formalina sono stati ìnelusi in paraffina secondo tecniche istologiche standardizzate. Quattro sezioni seriali di quattro micrometri sono state trasferite su vetrini rìve stiti con polilisina e reidratate mediante immersione in 100% xilene e in una serie di soluzioni di etanolo a concentrazione decrescente (100%, 95%, 90%, 80% e 70%). Le sezioni venivano poi riscaldate in un forno a microonde per aumentare 1<1>antigenicità e per consentire l'esposizione dell'epitopo: due volte per 5 minuti ciascuna in EDTA ImM, pH 8, per gli antigeni CD31, CD34 e vWF, e tre volte 4 minuti ciascuna in tampone citrato 0,01 M, pH 6, per 1'antigene Flk-1. Le perossidasi endogene erano inibite per 15 minuti a temperatura ambiente con perossido di idrogeno al 3%. I campioni venivano poi blocjcati per 20 minuti con siero bloccante normale al 20% e successivamente colorati con una miscela di ^nticorpi primari prodotti in topo o coniglio e dirjetti contro i seguenti marcatori umani: anti-CD31 (Necton-Dickinson) diluito 1:10, 30 minuti a temperatura ambiente; anti-CD34 (Serotec, Raleigh, North Carolina) diluito 1:50, 30 minuti a 37°C; antivWF(Dako) diluito 1:20, 30 minuti a temperatura ambiente; e anti-Flk-1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) diluito 1:50, 45 minuti a temperatura ambiente. Dopo ripetuti lavaggi, le sezioni erano incubate per 30 minuti con gli anticorpi anti-immunoglobuline di specie coniugati con biotina e trattati secondo il procedimento del complesso avidina/biotina perossidasi con reagenti forniti sotto forma di corredo (IgG di topo e IgG di coniglio Vectastein; Vector Laboratories, Burlingane, California). L'attività della perossidasi era evidenziata con 3,3'-diamminobenzidina (Menarini-Biogenex, San Ramon, California) in PBS, e colorazione con ematossilina-eosina. Per escludere i falsi positivi prodotti dal legame non specifico dell'anticorpo secondario, tutti i tessuti erano trattati nello stesso modo con tampone al posto dell'anticorpo primario.

Formazione di cordoni su Matrigel

270 microlitri di Matrigel (12,5 mg/ml) (

ton Dickinson, Bedford, Massachusetts) a 4°C fu trasferiti a piastre per coltura a 24 pozzetti preraffreddate utilizzando puntali sterili che e rano stati raffreddati a -20°C prima dell'uso. Dopo agitazione delicata per assicurare un rivestim:e nto uniforme, le piastre furono incubate per 30 mi nuti a 37°C per consentire al Matrigel di solidific are. Le cellule CD34+/CD31- venivano quindi seminat e ad una concentrazione di 6 x 10<3>/pozzetto in ter reno EBM (Alessandri et al., 1998). La formazione di cordoni si evidenziava dopo 24 ore di incubazio he.

Microscopia elettronica

Gli espianti coltivati selezionati veni vano fissati in glutaraldeide 2,5% immediatamente dopo la preparazione, postfissati in tetrossido di osmio, e inclusi in Epon-Aaraldite, e osservati con un microscopio Zeiss CEM 902.

Claims

RIVENDICAZIONI Cellule progenitrici vascolari umane CD34+/CD31-, suscettibili di formare nuove stretture vascolari in vitro mediante coltivazione in una matrice tridimensionale di collagene, ottenibili mediante isolamento da espianti di aorta fqtale umana.
2. Cellule secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto che detto isolamento comprende le fasi di: a) ottenere una sospensione cellulare da un espianto di aorta fetale umana, a) identificare all'interno di detta sospensione cellulare le cellule che esprimono 1'antigene di superficie CD31 mediante reazione di detta sospensione cellulare con un primo anticorpo che lega specificamente 1'antigene CD31; b) rimuovere dalla sospensione cellulare le cellule esprimenti 1'antigene CD31 identificate nella fase precedente, ottenendo in tal modo una sospensione di cellule CD31-; c) identificare in detta sospensione di cellule CD31- le cellule che esprimono 1'antigene di superficie CD34 mediante reazione di detta sospensione di cellule CD31- con un secondo anticorpo che lega specificamente l'antigene CD34; e d) rimuovere dalla sospensione di cellule CD31- le cellule che esprimono 1'antigene CD34 identificate nella fase precedente, ottenendo in tal modo cellule CD31-/CD34+.
3. Cellule secondo la rivendicazione 1 oppurp 2, caratterizzate dal fatto di essere suscettibili di essere espanse in vitro in una forma indifferenziata mediante coltivazione su terreno basale per colture endoteliali (EBM) contenente in aggiunta siero fetale di vitello al 10%, Condimed al 10% ed Hormone-Mix al 10%.
4. Cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, caratterizzate dal fatto di essere suscettibili di essere espanse in vitro mediante coltivazione su detto terreno basale per colture éndoteliali (EBM) rimanendo in una forma indiffereqzlata per un periodo di almeno 3 settimane.
5. Procedimento per l'isolamento di cellule progenitrici vascolari secondo una qualsiasi dellp rivendicazioni 1 a 4, comprendente le fasi di: a) ottenere una sospensione cellulare da un espianto di aorta fetale umana, b) identificare all'interno di detta sospensione cellulare le cellule che esprimono l'antigenè di superficie CD31 mediante reazione di detta sospensione cellulare con un primo anticorpo che lega specificamente 1'antigene CD31; c) rimuovere dalla sospensione cellulare le cellule esprimenti 1'antigene CD31 identificate nella fase precedente, ottenendo in tal modo una sospensione di cellule CD31-; d) identificare in detta sospensione di cellule CD31- le cellule che esprimono 1'antigene di superficie CD34 mediante reazione di detta sospensione di cellule CD31- con un secondo anticorpo che lega specificamente 1'antigene CD34; e e) rimuovere dalla sospensione di cellule CD31- le cellule che esprimono 1'antigene CD34 identificate nella fase precedente, ottenendo in tal modo cellule CD31-/CD34+.
6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui detto primo anticorpo che lega specificamente 1'antigene CD31 è legato su un primo supporto solido e detto secondo anticorpo che lega specificamente 1'antigene CD34 è legato su un secondo supporlo solido.
7. Procedimento per la preparazione di cellule endoteliali mature CD31+vWf+ comprendente coltivare in vitro cellule progenitrici secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 su terreno MI 99 conte nente 20% di siero fetale di vitello, 10% di Condi med, lODg/ml di eparina, 20 ng/ml di bFGF e 5ng/m di VEGF.
8. Cellule endoteliali mature CD31+vWf+ ottenibi li mediante il procedimento secondo la rivendica zione 7.
9. Procedimento per la formazione in vitro dii nuove strutture vascolari comprendente coltivare cellule secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 ed 8 in una matrice tridimensionale di colla gene.
10. Cellule secondo una qualsiasi delle rivendici zioni 1 a 4 ed 8, per l'impiego nella rigenerazion di strutture vascolari.
11. Cellule secondo una qualsiasi delle rivendici zioni 1 a 4 ed 8, per l'impiego nella riparazione di danni vascolari.
12. Cellule secondo una qualsiasi delle rivendici zioni 1 a 4 ed 8, per l'impiego nel trapianto di cellule e/o tessuti per favorirne l'attecchimenlj: e/o la crescita.
13. Cellule secondo la rivendicazione 12, pè l'impiego nel trapianto di cellule staminali midol lari o neuronali.
14. Uso di cellule secondo una qualsiasi delle ri vendicazioni 1 a 4 ed 8 nella riparazione di d anni vascolari, e/o la rigenerazione di strutture va lari, e/o il trapianto di cellule e/o tessuti :»er favorirne l'attecchimento e/o la crescita.