ITRM980392A1 - Plasmide per la produzione di peptidi antimicrobici in batteri ricombinati - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: “Plasmide per la produzione di peptidi antimicrobici in batteri ricombinanti”

La presente invenzione concerne un vettore plasmidico per la produzione di peptidi antimicrobici. Più in particolare l'invenzione riguarda plasmidi per la produzione in batteri ricombinanti di peptidi antimicrobici quali l'esculentina (1).

Le infezioni batteriche sono combattute con antibiotici classici prodotti da batteri o funghi, capaci di inibire la sintesi della parete baterica (U-lattamici, cefalosporine), delle proteine (eritromicine, tetracicline, aminoglicosidi), o del DNA (chinoioni) dell’agente patogeno. L'insorgenza di ceppi batterici resistenti agli antibiotici costituisce una seria minaccia per la salute (2). Il fenomeno ha anche negativamente influenzato lo sviluppo di nuovi antibiotici da parte delle industrie farmaceutiche negli ultimi anni.

L’immunità innata, che rappresenta la capacità intrinseca di tutti i sistemi viventi, compresi quelli provvisti di un sistema immunitario complesso con cellule T o B, immunoglobuline e complemento, di difendersi da organismi patogeni, è basato principalmente sulla produzione di peptidi antimicrobici come prima linea di difesa (3).

Molecole di questo tipo sono state inizialmente isolate negli insetti (cecropine), e successivamente nei mammiferi (defensine), nei crostacei (tachiplesine) e nelle piante. Ad oggi sono conosciute più di 150 molecole peptidiche ad attività antimicrobica, strutturalmente molto diverse tra loro.

Gli autori della presente invenzione hanno già isolato e caratterizzato dalla secrezione cutanea di anfìbi molti peptidi antimicrobici, appartenenti a diverse famiglie strutturali (1, 4-6). Tutti i peptidi sono codificati da geni nucleari e sintetizzati sui ribosomi come pre-proproteine, successivamente proteolizzate in forma attiva, a differenza dei classici antibiotici, prodotti da complessi multienzimatici per addizione sequenziale delle varie componenti.

Nonostante la comune attività antimicrobica, i peptidi hanno sequenze completamente diverse. Alcuni sono lineari, altri contengono uno o più ponti disolfuro, o sono ricchi di specifici amminoacidi (arginina, pralina, triptofano), alcuni formano strutture secondarie ad aelica, spesso antipatica, altri strutture β. Nonostante la diversità strutturale il meccanismo d'azione sembra essere unico, provocando la permeabilizzazione selettiva della membrana batterica e la conseguente morte cellulare. I peptidi sono compartimentalizzati per un uso intracellulare (fagocitosi), o secreti all'esterno (nella pelle degli anfibi, in vari tipi di mucose, nella cicatrizzazione delle ferite, ecc.).

A differenza dei classici antibiotici che agiscono in un periodo lungo di tempo (giorni), i peptidi dell'immunità innata sono capaci di agire in pochi minuti, tenendo sotto controllo la crescita batterica.

Inoltre, e più importante, non sembra che queste molecole inducano quei meccanismi di selezione che portano all'insorgere dei fenomeni di resistenza. Infine, date le piccole dimensioni, essi non hanno proprietà immunogeniche.

Nonostante gli indubbi vantaggi, i costi di produzione e le difficoltà di somministrazione di tali molecole per la loro bassa biostabilità hanno reso difficile la loro produzione su scala industriale.

Tra i diversi peptidi descritti, sono quindi di particolare interesse quelli che, dotati di potenti attività antimicrobiche, sono di piccole dimensioni, come ad esempio le temporine, peptidi di 13 amminoacidi isolati da Rana temporaria (6), che possono essere sintetizzati per via chimica a bassi costi. Per quanto riguarda la biostabilità, le modifiche post-traduttive di molti peptidi naturali in posizioni critiche (amidazione dell’estremità C-terminale, presenza di un D-amminoacido in seconda posizione) aumentano la resistenza alla proteolisi in vitro. Più complesso è il caso della presenza di uno o più ponti disolfuro; in molti peptidi questa modifica è essenziale per l'attività e la loro presenza costituisce una notevole difficoltà aggiuntiva sia per la sintesi chimica che per quella biologica.

I peptidi di dimensioni maggiori possono essere prodotti su scala industriale solo sviluppando un .sistema efficiente di produzione per via ricombinante.

Gli autori della presente invenzione hanno isolato e caratterizzato numerosi peptidi dotati di attività antimicrobica presenti nella secrezione cutanea di anfibi. In particolare, l'esculentina, un peptide di 46 amminoacidi contenente un ponte disolfuro intramolecolare, è particolarmente attivo su batteri gram-positivi, gramnegativi e su funghi (concentrazione letale 0, 2-0,5 μΜ) (1). Per la lunghezza e per altre caratteristiche strutturali la sintesi per via chimica dell’esculentina non è conveniente.

Un primo tentativo di far esprimere direttamente il peptide di 46 amminoacidi esculentina-1b di sequenza:

in E. coli non ha avuto successo, nonostante analisi per Northern blot abbiano rivelato alti livelli del mRNA corrispondente, il peptide non è mai stato ritrovato nell'estratto, presumibilmente per una sua rapida degradazione.

Un secondo approccio ha consistito nell'espressione in E. coli di una proteina di fusione, codificante per il recettore del maltosio (7), con l'esculentina fusa al C-terminale. Poiché esperimenti precedenti hanno dimostrato che il fattore X, normalmente utilizzato per il taglio di proteine fuse, era in grado di degradare il peptide antimicrobico naturale, è stato disegnato un costrutto mutato per effettuare una digestione chimica della proteina di fusione con CNBr. Pertanto, un legame peptidico sensibile al taglio con CNBr è stato introdotto inserendo un codone Met prima del residuo Gly all’N-terminale dell'esculentina. Inoltre la Met 28 è stata sostituita da Leu, per prevenire un taglio interno dell'esculentina ricombinante dal trattamento con CNBr. Sebbene una banda delle dimensioni attese fosse evidente per SDS-PAGE, e la sequenza N-terminale corrispondesse a quella del recettore per il maltosio, la proteina era molto labile, e veniva rapidamente degradata al C-terminale.

Un terzo approccio è stato infine tentato, in cui il peptide di interesse è stato fuso all'estremità della proteina GABA transaminasi umana, il cui cDNA è stato clonato dagli stessi autori (8) e identificata nei corpi inclusi dei batteri di E. coli ricombinanti. Gli autori hanno pertanto utilizzato questo sistema di espressione per proteggere il peptide da degradazione di proteasi intracellulari, ottenendo una gran quantità della proteina desiderata.

Gli autori hanno fuso l’esculentina all’N-terminale della GABA in maniera da valutare il successo delle procedure di espressione e la resistenza ad attacchi proteolitici anche a stadi molto precoci di purificazione, per elettrotrasferimento dopo SDS-PAGE e sequenziamento diretto all’N-terminale della banda proteica di interesse.

La formazione di ponti disolfuro intramolecolari dell’esculentina sembra avvenire spontaneamente durante le procedure di purificazione. Infatti, il mutante di esculentina mancante dei residui di cisterna non veniva recuperato dopo taglio con CNBr, per ossidazione del residuo Met in posizione 47, impedendo l’azione del CNBr. Effettuando un’incubazione preliminare con β-mercaptoetanolo della proteina di fusione contenente il doppio mutante alle cisteine, il peptide veniva regolarmente scisso dal CNBr e poteva essere purificato usando le stesse condizioni dell’analogo contenente le cisteine. Si presume che la presenza di cisteine possa funzionare da trappola per l’ossigeno, prevenendo l'ossidazione della metionina.

Nell’ambito della presente invenzione, gli autori hanno pertanto messo a punto un vettore di espressione che permette la sintesi in E. coli di una proteina di fusione formata dal peptide antimicrobico di interesse nella regione N-terminale e dalla GABA transaminasi umana o parti di essa, nella zona C-terminale. La proteina di fusione, una volta prodotta dal batterio ricombinante, viene sequestrata nei corpi inclusi, caratteristica vantaggiosa per il successivo processo di purificazione del peptide. Il procedimento di purificazione del peptide di interesse comprende una scissione specifica della proteina di fusione con bromuro di cianogeno e successiva purificazione cromatografica.

I plasmidi ottenuti comprendono un vettore che dirige l'espressione di un analogo dell'esculentina che possiede la stessa attività biologica della controparte naturale, ma anche un vettore che dirige l'espressione di un mutante, in cui le due cisteine coinvolte nella formazione del ponte disolfuro sono state mutate in serina.

II vettore può inoltre essere vantaggiosamente utilizzato per l’espressione di altri peptidi antimicrobici del tipo delle bombinine, bombinine H o brevinine.

La resa di peptide esculentina è stata di almeno 50 nmoli di peptide puro per litro di coltura.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un vettore ricombinante comprendente una componente plasmidica in grado di dirigere la replicazione autonoma in un batterio, una componente codificante per un marcatore selezionabile, un promotore in grado di dirigere la corretta e efficace espressione di una proteina esogena, in cui la proteina esogena è costituita all’N-terminale da un peptide antimicrobico e al C-terminale dalla GABA-transaminasi umana, e in cui la proteina esogena è scindibile nel peptide antimicrobico e in frammenti della GABA-transaminasi umana, senza alterare sostanzialmente l'attività del peptide antimicrobico stesso. Preferibilmente il peptide antimicrobico appartiene alla famiglia delle esculentine, delle bombìnine, delle bombinine H o delle brevinine. Più preferibilmente il peptide antimicrobico è l'esculentina 1b selvatica di sequenza:

Alternativamente l’esculentina 1b è mutata in posizione 28 da Met a Leu e ha una Met aggiuntiva in posizione 47. Alternativamente l'esculentina è mutata sia in posizione 40 che 46 da Cys a Ser e ha una Met aggiuntiva in posizione 47.

Costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione un procedimento per la’ produzione per via ricombinante di un peptide antimicrobico in cui viene utilizzato il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti e in cui il peptide viene recuperato dai corpi inclusi batterici.

La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi in cui si farà riferimento alle seguenti figure:

La Figura 1, sezione I descrive la strategia usata per la mutagenesi dell’esculentina 1. A: sostituzione della Met28 con Leu. B: sostituzione della Met28 con Leu e delle Cys 40-46 con Ser. La sezione II illustra la costruzione del vettore per l’espressione della proteina di fusione. A: esculentina 1/GABA transaminasi (Esd/GABA). B: esculentina 1 mutante/GABA transaminasi (Esci mut/GABA).

La Figura 2 mostra la sequenza nucleotidica e amminoacidica della GABA transaminasi.

La Figura 3 mostra un'analisi elettroforetica della frazione solubile e dei corpi inclusi di E. coli dopo induzione della proteina Escmut2 GABA-T. A: frazione solubile dopo 4 ore di induzione; B: marcatori; C-E: estratto di corpi inclusi (1:100, 1:10, 1:1, rispettivamente); F: estratto crudo delle proteine di E. coli dopo induzione.

I peptidi che appartengono alla famiglia delle esculentina 1 (1), peptidi antimicrobici di 46 amminoacidi isolati dalla secrezione cutanea di Rana esculenta. Le esculentine sono particolarmente convenienti per questa procedura poiché sono tra i più grandi peptidi antimicrobici isolati, sono ricuperabili in quantità minime dalla secrezione cutanea dell'anfibio e sono stati isolati solo da questa specie di Rana. Inoltre, le esculentine sono molecole antimicrobiche molto potenti, con un vasto spettro di azione, il cui cDNA è stato già isolato (1).

La proteina fusa ricombinante è costituita da una parte all'N-terminale di 47 residui amminoacidici, corrispondente all’esculentina-1 b con una Leu che sostituisce Met in posizione 28, e una Met aggiuntiva in posizione 47, e da una parte C-terminale corrispondente alla GABA transaminasi umana (GABA-T) (8).

MATERIALI e METODI

Mutagenesi dell’esculentina 1 b

ll DNA che codifica per l’analogo dell’esculentina-1b è stato ottenuto per PCR da pBlueScript-KS-Escl-17-1 (1) utilizzando due coppie di oligonucleotidi. La regione 1-28 dell’esculentina è stata amplificata e modificata utilizzando due oligonucleotidi:

che introduce un sito EcoRI e un codone Met al terminale 5' del gene, e

che introduce la mutazione Met28Leu.

La regione 29-46 è stata amplificata utilizzando gli oligo

che introducono un codone Met in posizione 47 e un sito Sali. La reazione di amplificazione è stata effettuata con un apparato Perkin Elmer modello 480, usando la Vent polimerasi (New England Biolabs). I prodotti di PCR sono stati fosforilati per 30 min a 37°C con polinucleotide chinasi (Boehringer). I frammenti al 5' e 3' sono stati digeriti con EcoRI e Sali (Boehringer), rispettivamente. Entrambi i frammenti sono stati purificati per filtrazione su gel di agarosio micropure 30 (Amicon) e poi iigati nei siti di restrizione corrispondenti di pBlueScript-SK (Fig. 1 ). Un’aliquota è stata usata per trasformare E. coli DH10B. I cloni positivi sono stati analizzati per PCR in situ. La correttezza del costrutto di intera lunghezza era confermata dal sequenziamento del DNA. Il costrutto è stato ulteriormente amplificato usando gli oligonucleotidi:

che introduce un sito Ndel, e Esc-dw (si veda sopra).

Subclonazione nel vettore di espressione

Per l'espressione dell'analogo dell’esculentina, il costrutto di espressione pHGT, codificante per la GABA transaminasi umana (8) la cui sequenza è mostrata in Fig. 2, è stato utilizzato per clonare nei siti Ndei-Sall la sequenza codificante ingegnerizzata dell’esculentina-lb, a monte della sequenza per la GABA-T, deleta per i primi 7 amminoacidi. Il costrutto è stato sequenziato per verificare la correttezza.

Espressione della oroteina e isolamento dei corpi inclusi

Circa 10 ng di pET-Esc-GABA sono stati utilizzati per trasformare E. coli BL21(DE3)pLys; una singola colonia è stata inoculata in 100 mi di 2xYT (Difco) contenente 50 mg/l ampicillina (Sigma) e 34 mg/l cloramfenicolo (Boehringer), e incubata a 37°C. Quando la coltura aveva raggiunto OD di 1 a 590 nm, venivano aggiunti due litri dello stesso terreno e divisi in fiasche da 1 litro. L’incubazione era continuata fino a OD di 0.5. Quindi 1mM (concentrazione finale) di isopropil-P-D-tiogalattopiranoside (IPTG) erano aggiunti.

L'andamento dell’espressione della proteina era seguito con una SDS-PAGE al 12%. Dopo 4 ore a 30°C, le cellule venivano prelevate per centrifugazione (Sorvall CS-3, 10,000 g, 10 min) e congelate per la notte. Le cellule venivano scongelate in ghiaccio aggiungendo 10 ml/g di cellule di tampone CB (20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 1 mM EDTA, 200 mM NaCI, 1mM DTT e 1mM PMSF) e poi rotte per sonicazione. I corpi inclusi venivano separati per centrifugazione (27,000g, 15 min). Il pellet era lavato con 1 M urea e 1% Triton X-100 (15,000g, 20 min), poi con 2 M urea e 2% Triton X-100, e infine con acqua distillata. L’espressione della proteina fusa nei corpi inclusi veniva evidenziata con SDS-PAGE al 12% (Fig.3).

Purificazione dell’esculentina

I corpi inclusi erano risospesi in 70% di acido formico (0.1 g/ml) e trattati con CNBr (50 mg/ml). La miscela di reazione era incubata per la notte a temperatura ambiente e poi liofilizzata dopo dialisi in membrane Spectra/Por®3 membrane (esclusione di peso molecolare 3,500, Spectrum). Il materiale solubile in 10% acido acetico era frazionato su una colonna Sephadex G50 (2.5 x 60 cm), equilibrata e eluita con lo stesso solvente. L’effluente era raccolto in frazioni da 2 mi, e 1% di ciascuna frazione era saggiato per l’attività antibatterica. Le frazioni attive erano raccolte e ulteriormente purificate per HPLC utilizzando una colonna in fase inversa (Acquapore RP-300, 7.0 x 250 mm, Perkin Elmer), eluita per 60 min con un gradiente lineare di 5-75% acetonitrile/alcol isopropilico (4:1) in 0.2% (v/v) acido trifluoroacetico ad un flusso di 1.5 ml/min.

Analisi di sequenza

Un'analisi della sequenza N-terminale della proteina di fusione era effettuata con un sequenziatore Perkin Elmer AB476 su un campione elettrotrasferito su una membrana ProBlott (Perkin Elmer) dopo SDS-PAGE. L’analisi delle sequenze dei peptidi purificati era effettuata su campioni deposti su membrane ProBlott.

Saqaio antimicrobico

L’attività antibatterica era misurata usando un saggio zonale di inibizione su piastre di agarosio con E. coli D21, come riportato in (1). RISULTATI

Espressione di esculentina ricombinante

Il clone di cDNA Esci -17-1 codificante per il precursore dell'esculentina-1 b è stato isolato da una genoteca di cDNA da pelle di R. esculenta (1). Il clone è usato come stampo per produrre un gene per l’esculentina ingegnerizzato. Le regioni 5’ e 3’ di questo gene erano amplificate per PCR usando due coppie di oligonucleotidi, RX3/RY7, e RY13/Esc-dw, rispettivamente. La prima coppia introduce un sito EcoRI, un codone Met al 5' del gene, e la mutazione Met28Leu. La seconda coppia introduce un codone Met e un sito Sai I al 3’ del gene. Dopo digestione con gli enzimi di restrizione appropriati, i frammenti erano subclonati in pBlueScript-SK (Fig. 1) nella cornice di lettura corretta. Gli oligonucleotidi Esc-up e Esc-dw erano poi usati come inneschi per amplificare l'analogo dell’esculentina di intera lunghezza. Dal 5’ il prodotto di PCR conteneva un sito Nde I, un codone Met, l'analogo dell’esculentina, un secondo codone Met e infine un sito Sai I (Fig. 1 ). Il cDNA per l'esculentina mutata era inserito nei siti Nde I e Sai I del vettore pET-GABA, a monte della regione codificante per GABA-T. Il vettore di espressione era usato per trasformare E. coli e la proteina di fusione espressa veniva accumulata in corpi inclusi insolubili (Fig. 2). Questi contenevano due bande proteiche principali di circa 58 kDa, peso atteso della proteina di fusione, ed una seconda di circa 53 kDa che potrebbe corrispondere alla GABA-T (Fig. 2). La sequenza all’N-terminale di queste due bande confermava i dati. La produzione simultanea delle due proteine era dovuta alla presenza di una seconda sequenza Shine-Dalgamo (9) nella sequenza nucleotidica dell’esculentina. Tuttavia, il livello di espressione della GABA-T era più basso di quello della proteina di fusione.

I corpi inclusi erano lavati con urea e Triton X-100 e erano ottenuti con una resa di circa 300 mg/l di coltura batterica. Questo materiale era poi disciolto in 70% acido formico e trattato con bromuro di cianogeno per tagliare l’analogo dell’esculentina dalla GABA-T. Dopo gel-filtrazione, le frazioni attive contro E. coli D21 erano raccolte e purificate per RP-HPLC (Fig. 3). L’analisi della sequenza del peptide confermava la struttura attesa dell’analogo dell’esculentina, con il residuo Met al C-terminale convertito in omoserina durante il taglio con CNBr. La presenza del ponte disolfuro tra Cys40 e Cys46 veniva controllata come riportato in (1).

Espressione dell’esculentina mutante

Per produrre un’esculentina mutante in cui le due cisteine erano sostituite con Ser e omo-Ser, rispettivamente, veniva ideato un costrutto differente, codificante per un peptide di 46 amminoacidi, con una Met al C-terminale. Dopo taglio con CNBr della proteina di fusione espressa, si doveva ottenere un analogo dell’esculentina contenente un residuo di serina in posizione 40 e una omoserina in posizione 46. L’espressione di questo costrutto produceva solo la proteina di fusione, ma non la GABA-T, forse a causa del fatto che delezione di un codone alterava la seconda sequenza Shine-Dalgamo. Sorprendentemente, in questo caso la proteina di fusione era solubile nel citoplasma e non erano evidenziabili corpi inclusi. Pertanto è stata prodotta una proteina di fusione GABA-T identica alla prima, ad eccezione che i residui di cisteina in posizione 40 e 46 erano sostituiti da Ser. Si formavano pertanto corpi inclusi che contenevano sia la proteina di fusione che l’enzima umano. La stessa procedura descritta era applicata per il taglio e la purificazione dei peptide mutante, ad eccezione che, prima del tratamento con CNBr, i campioni erano incubati per 2 ore a 45°C con β-mercaptoetanolo all’1%, per ridurre la metionina ossidata che può eventualmente essersi prodotta, come descritto precedentemente. Atività biologica di analoghi dell'esculentina ricombinante

I prodotti ricombinanti erano saggiati in vitro per l’attività inibitoria contro diversi microrganismi (Tab. 1). La concentrazione letale era identica a quella del peptide naturale.

La resa del peptide purificato per HPLC è di circa 50 nmol/l. Il peptide ricombinante ha la stessa attività dell’esculentina-l purificata da R. esculenta.

Un saggio emolitico era effettuato con eritrociti umani che non mostravano alcuna lisi dopo esposizione a esculentina 100 μΜ.

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1. Vettore ricombinante comprendente una componente plasmidica in grado di dirigere la replicazione autonoma in un batterio, una componente codificante per un marcatore selezionabile, un promotore in grado di dirigere la corretta e efficace espressione di una proteina esogena, in cui la proteina esogena è costituita all’N-terminale da un peptide antimicrobico e al C-terminale dalla GABA-transaminasi umana, e in cui la proteina esogena è scindibile nel peptide antimicrobico e nella GABA-transaminasi umana, senza alterare sostanzialmente l’attività di detto peptide antimicrobico.
2. 2. Vettore ricombinante secondo la rivendicazione 1 in cui il peptide antimicrobico appartiene alla famiglia delle esculentine, delle bombinine, delle bombinine H o delle brevinine.
3. 3. Vettore ricombinante secondo la rivendicazione 2 in cui il peptide antimicrobico è l'esculentina 1 b, mutata in posizione 28 da Met a Leu e ha una Met aggiuntiva in posizione 47.
4. 4. Vettore ricombinante secondo la rivendicazione 2 in cui il peptide antimicrobico è l’esculentina 1 b, mutata sia in posizione 40 che 46 da Cys a Ser e ha una Met aggiuntiva in posizione 47.
5. 5. Procedimento per la produzione per via ricombinante di un peptide antimicrobico in cui viene utilizzato il vettore secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti e in cui il peptide viene recuperato dai corpi inclusi batterici.