ITRM970417A1 - Microparticelle a base di materiali polimerici ibridi per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive, procedimento per la - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
a corredo di una domanda di brevetto per invenzione industriale avente per titolo: "Microparticelle a base di materiali polimerici ibridi per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive, procedimento per la loro preparazione e usi in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in vivo”.
La presente invenzione concerne microparticelle a base di materiali polimerici ibridi per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive, il procedimento per la loro preparazione e usi in terapia, profilassi e diagnostica in vitro e in vivo.
Più in particolare l'invenzione riguarda la preparazione di microparticelle chimicamente omogenee costituite da una componente di natura proteica e da un polimero naturale, sintetico, semisintetico.
La tecnica anteriore riporta numerosi esempi di preparazione (e di uso) di aggregati màcromolecolari e microparticelle costituiti da materiali polimerici, di natura proteica e non proteica, naturali, sintetici e semisintetici, si veda ad es. Carth W.Hastings; Paul Ducheyne Macromolecolar Biomaterials CRC Press.lnc. (1984).
La tecnica anteriore riporta anche esempi di preparazione di macroaggregati e microparticelle contenenti sia proteine (e polipeptidi) che polimeri naturali, sintetici, semisintetici.
Tra le proteine, particolare enfasi è stata dedicata all'Albumina poiché interagisce con numerose sostanze, tra cui quelle contenenti gruppi funzionali elettronegativi o gruppi acidi.
Oltre agli acidi grassi a catena lunga, Carr, C.W. Proc. Soc. Expl. Biol. Med. 89: 546 (1959), Bears A.G. - Am. J. Med. 22. 747 (1957), l’Albumina interagisce con: polielettroliti anionici quali l'Eparina, H.F.M. Cremers et al. J.Controlled Rel. H: 167:179 (1990), polielettroliti derivanti dalla copolimerizzazione dell'Anidride Maleica e Vinil Eteri o Vinil Esteri, H.Ohno et al. Makromol.Chem. 182: 1253 (1981); M.Brissova Makromol Rapid Comm. 15 : 211-216 (1994), con polielettroliti cationici quali il Chitosano, Y.Murat Elcin. Art. Cells Blood. Subs. & Immob. Biotech 24(3) 257-271 (1996).
La tecnica anteriore riporta inoltre numerosi esempi di incorporazione di proteine e polipeptidi in matrici polimeriche naturali ed artificiali. L'incorporazione di Albumina (umana, bovina) è stata tuttavia finalizzata esclusivamente a scopi analitici, T.Atkins, J.Biomat.Sci.Polymer Edn. 7: 1065-1073 (1996), per modulare il rilascio di molecole proteiche bioattive U.S. 5.102.872, quale stabilizzante delle proteine, M A. Hanson Introduction to formulation of protein pharmaceutical - Plenum Press 1992 pag. 209, quale sostanza idonea a stabilizzare microparticelle nei riguardi della fagocitosi ad opera di cellule polimorfonucleate, T.Verrecchia, J. Control. Rel. 36: 49-51 (1995).
In tutti i casi riportati, tuttavia, le microsfere vengono ottenute per interazione di proteine con polimeri di natura idrofoba. Questo comporta l’impiego di solventi organici per disciogliere il polimero sintetico, con conseguente denaturazione almeno parziale delle proteine. Inoltre le microsfere cosi ottenute sono costituite da un’aggregazione eterogenea di materiale proteico e polimero sintetico, generalmente da una massa proteica rivestita da un guscio di polimero sintetico idrofobo.
Gli autori dell'invenzione hanno scoperto che miscelando opportunamente soluzioni contenenti almeno una proteina idrosolubile e soluzioni acquose, contenenti quantità variabili di solventi organici, contenenti almeno un polielettrolita anionico, naturale, sintetico, semisintetico in particolari e definite condizioni operative meccaniche ed ambientali si ottengono microparticelle chimicamente omogenee, vantaggiosamente utilizzabili per il rilascio controllato di molecole biologicamente attive, in terapia, profilassi, e diagnostica in vitro e in vivo, così come in campo cosmetico e dietetico.
Sono noti numerosi metodi di preparazione di microparticelle. J.Ogawa, J.Bìomater.Sci.Polym. EDN 8: 391-409 (1997). I metodi noti sono tutti basati essenzialmente su separazione di fase evaporazione del solvente, spray-drying, emulsificazione, polimerizzazione interfacciale. Nessuno dei metodi noti prevede tuttavia l'impiego di tecniche analoghe simili od uguali a quella oggetto della presente invenzione, e non danno luogo a particelle chimicamente omogenee.
Forma pertanto oggetto della presente invenzione una microparticella chimicamente omogenea costituita da una componente proteica e da un polimero naturale, sintetico o semisintetico o da una miscela di essi.
Preferibilmente la componente proteica comprende almeno una proteina compresa tra albumina, alfa 1 -globulina, alfa 2-globulina, collagene, fibrinogeno, gelatina, più preferibilmente l’albumina è l’albumina umana naturale o ricombinante.
Preferibilmente il polimero comprende polimeri polianionici o miscele di essi, più preferibilmente contenenti gruppi carbossilici e/o fosforici e/o solforici.
Preferibilmente i polimeri comprendono emiesteri di copolimeri alternati dell'anidride maieica con vinileteri di oligoetilenglicoli aventi grado di oligomerizzazione 1 < n < 100, più preferibilmente 1 < n < 10.
Preferibilmente la microparticella è di forma sferoidale con un diametro compreso tra 50 nm e 2000 nm, più preferibilmente tra 100 nm e 300 nm.
Costituisce ulteriore oggetto dell’invenzione un procedimento per la preparazione di microparticelle secondo l’invenzione comprendente la fase di miscelazione di una prima soluzione contenente il polimero naturale ad una concentrazione compresa tra 5 g e 200 g per litro con una miscela di solventi organici idrofili, pratici ed aprotici, con una seconda soluzione contenente la componente proteica ad una concentrazione compresa tra 1 g e 40 g per litro, in cui il rapporto ponderale tra il polimero e la componente proteica è compreso tra 100 e 1, ad un pH compreso tra 2 e 9 e ad una temperatura compresa tra 0°C e 60°C, in condizioni di agitazione tali da impedire fenomeni di aggregazione e da favorire la coprecipitazione del polimero e della componente proteica.
Preferibilmente il solvente organico della prima soluzione è costituito da etanolo, alternativamente da una miscela acqua/etanoio con un contenuto di etanolo compreso tra 0% e 80%.
Preferibilmente la componente proteica nella prima soluzione è ad una concentrazione compresa tra 2 g e 6 g per litro.
Preferibilmente il polimero nella seconda soluzione è ad una concentrazione compresa tra 40 g e 60 g per litro.
Preferibilmente il rapporto ponderale tra il polimero e la componente proteica è compreso tra 10 e 1, più preferibilmente tra 5 e 1.
Preferibilmente il pH è compreso tra 4 e 7.
Preferibilmente la temperatura è compresa tra 4°C e 25°C.
Ulteriore oggetto dell’invenzione è l’uso delle microparticelle dell'invenzione a scopo terapeutico, diagnostico, profilattico, dietetico, analitico, cosmetico e preparativo di sistemi di rilascio controllato di molecole attive.
La presente invenzione verrà ora descritta in suoi esempi non limitativi.
Esempio 1 Preparazione di microsfere PAM14/HSA
Una soluzione di 60 mg di emiestere metilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 2,0 mi di acqua, è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22 G in una soluzione di 24 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 2,0 mi di acqua bidistillata, mantenuta sotto agitazione magnetica. Terminata l'aggiunta, l'agitazione magnetica è stata mantenuta per 60 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 140 nm e indice di polidispersità di 0,1-0, 3.
Esempio 2 Preparazione di microsfere PAM11/MYO/HSA
Una soluzione di 100 mg di emiestere metilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM11) in 3,0 mi di miscela 1:3 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 50 mg di una miscela 1:4 mioglobina/sieroalbumina umana (MYO/HSA) in 8 mi di acqua bidistillata, sotto agitazione magnetica. Terminata l'aggiunta, l'agitazione magnetica è stata mantenuta per ulteriori 60 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 450 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,3.
Esempio 3 Preparazione di microsfere PAM14/HSA/HSA-FITC/MAN Una soluzione di 210 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 4,0 mi di miscela 4:1 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 40 mg di sieroalbumina umana (HSA) e 600 mg di sieroalbumina umana fluorescein isotiocianato (HSA-FITC) in 10 mi di acqua bidistillata contenente il 10% in peso di mannitolo (MAN). Terminata l'aggiunta, l’agitazione magnetica è stata mantenuta per 90 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic tight scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 160 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,3.
Esempio 4 Preparazione di microsfere PAM14/HSA/GDA-bCD
Una soluzione di 200 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 4,0 mi di miscela 3:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 40 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 10,0 mi di acqua bidistillata contenente il 5% in peso di glicidiidiiso-propilidenarabitolo-betaciclodestrina (GDA-bCD). Terminata l'aggiunta, la dispersione è stata mantenuta in agitazione magnetica per 60 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 190 nm e indice di polidispersità di 0,1 -0,2.
Esempio 5 Preparazione di microsfere PAM14/HSA/ASFET
Una soluzione di 100 mg di emiestere butilico del copolimero alternato anidride maleica/metossietil vinil etere (PAM14) in 2,0 mi di miscela 3:2 etanolo/acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 31 mg di sieroalbumina umana (HSA) ed 11 mg di asialofetuina (ASFET) in 5,0 mi di acqua bidistillata. La dispersione di microsfere è stata lasciata in agitazione magnetica per 60 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 1450 nm e indice di polidispersità di 0,6.
Esempio 6 Preparazione di microsfere AA/HSA/GDX-bCD
Una soluzione di 100 mg di acido poliacrilico (AA) in 4 mi di acqua è stata aggiunta mediante una siringa munita di ago 22G in una soluzione di 60 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 10 mi di acqua bidistillata contenente il 5% in peso di glicidildiisopropilidenxilitolobetaciclodestrina (GDA-bCD), sotto agitazione magnetica. Terminata l'aggiunta, l’agitatore magnetica è stata mantenuta per ulteriori 60 minuti. L’analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 350 nm e indice di polidispersità di 0,3-0,5.
Esempio 7 Preparazione di microsfere AAL7HSA/GLU
Una soluzione di 200 mg di acido olginico (AAL) in 4 mi di acqua è stata gocciolata mediante una siringa munita di ago 22 G in una soluzione di 60 mg di sieroalbumina umana (HSA) in 12 mi di acqua bidistillata contenente il 7 % in peso di glucosio, sotto agitazione magnetica. L’agitazione magnetica è stata continuata per 60 minuti. L'analisi dimensionale mediante dynamic light scattering ha evidenziato che le microsfere sono caratterizzate da un diametro medio di 210 nm ed indice di polidispersità di 0,2-0, 4.
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI 1. Microparticelfa chimicamente omogenea costituita da una componente proteica e da un polimero naturale, sintetico o semisintetico o da una miscela di essi.
- 2. Microparticella secondo la rivendicazione 1 in cui la componente proteica comprende almeno una proteina compresa tra albumina, alla 1 -globulina, alfa 2-globulina, collagene, fibrinogeno, gelatina.
- 3. Microparticella secondo la rivendicazione 2 in cui detta proteina ò albumina umana naturale o ricombinante.
- 4. Microparticella secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto polimero comprende polimeri polianionici o miscele di essi.
- 5. Microparticella secondo la rivendicazione 4 in cui detti polimeri polianionici contengono gruppi carbossilici e/o fosforici e/o solforici.
- 6. Microparticella secondo la rivendicazione 5 in cui detti polimeri comprendono emiesteri di copolimeri alternati dell'anidride maleica con vinileteri di oligoetilenglicoli aventi grado di oligomerizzazione 1 < n < 100.
- 7. Microparticella secondo la rivendicazione 6 in cui il grado di oligomerizzazione di detti polimeri è 1 < n < 10.
- 8. Microparticella secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti di forma sferoidale con un diametro compreso tra 50 nm e 2000 nm.
- 9. Microparticella secondo la rivendicazione 8 in cui il diametro è compreso tra 100 nm e 300 nm.
- 10. Procedimento per la preparazione di microparticelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti comprendente la fase di miscelazione di una prima soluzione contenente il polimero naturale ad una concentrazione compresa tra 5 g e 200 g per litro con una miscela di solventi organici idrofili, protici ed aprotici, con una seconda soluzione contenente la componente proteica ad una concentrazione compresa tra 1 g e 40 g per litro, in cui il rapporto ponderale tra il polimero e la componente proteica è compreso tra 100 e 1, ad un pH compreso tra 2 e 9 e ad una temperatura compresa tra 0°C e 60°C, in condizioni di agitazione tali da impedire fenomeni di aggregazione e da favorire la coprecipitazione del polimero e della componente proteica.
- 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui il solvente organico della prima soluzione è costituito da etanolo.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui il solvente organico della prima soluzione è costituito da una miscela acqua/etanolo con un contenuto di etanolo compreso tra 0% e 80%.
- 13. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui la componente proteica nella prima soluzione è ad una concentrazione compresa tra 2 g e 6 g per litro.
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui il polimero nella seconda soluzione è ad una concentrazione compresa tra 40 g e 60 g per litro.
- 15. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui il rapporto ponderale tra il polimero e la componente proteica è compreso tra 10 e 1.
- 16. Procedimento secondo la rivendicazione 15 in cui il rapporto ponderale tra il polimero e la componente proteica è compreso tra 5 e 1.
- 17. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui il pH è compreso tra 4 e 7.
- 18. Procedimento secondo la rivendicazione 10 in cui la temperatura è compresa tra 4°C e 25°C.
- 19. Uso di microparticelle secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 a scopo terapeutico, diagnostico, profilattico, dietetico, analitico, cosmetico e preparativo di sistemi di rilascio controllato di molecole attive.
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