ITRM20140620A1

ITRM20140620A1 - Compounds and uses thereof

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Publication number: ITRM20140620A1
Application number: ITRM2014A000620A
Authority: IT
Original assignee: Lead Discovery Siena S R L
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2016-04-30
Also published as: WO2016066755A3; EP3212649A2; US20180186796A1; WO2016066755A2; CA2965734A1; JP2017533269A

Description

Campo d?applicazione

La presente invenzione si riferisce a derivati 4-ammino-sostituiti pirazolo[3,4-d]pirimidinici e pirrolo [2,3-d]pirimidinici aventi struttura I, II, III e IV, in grado di inibire la famiglia delle chinasi Src (SFKs), quali le tirosin chinasi Src, Fyn e Hck cos? come la tirosin chinasi Abl, e al loro utilizzo ed al loro metodo di preparazione. In particolare, i composti oggetto dell?invenzione sono da utilizzare per il trattamento e/o prevenzione del cancro, come il neuroblastoma (NB) o il glioblastoma multiforme (GBM) o per uso nel trattamento e/o prevenzione delle malattie neurodegenerative quali le taupatie.

Stato dell?arte

La deregolazione delle tirosin chinasi (TK) ? stata associata allo sviluppo del cancro (proliferazione, migrazione, invasione, angiogenesi, farmaco resistenza etc.), pertanto piccole molecole inibitrici delle TK rappresentano una delle pi? grandi famiglie di farmaci attualmente studiate dalle compagnie farmaceutiche e dal mondo accademico per il trattamento dei tumori. Notevolmente, gli inibitori delle TK (TKI), agendo su specifici bersagli molecolari, durante la terapia anti tumorale potrebbero essere correlate a ridotti effetti collaterali di tossicit?. Molti TKI sono stati testati per le loro attivit? antiproliferativa in vitro e antitumorale in vivo e alcuni di loro sono stati approvati per trial clinici o sono attualmente utilizzati nella terapia del cancro.<1,2>

Una sottoclasse di TK non recettoriali quale bersaglio nel trattamento dei tumori umani ? la famiglia delle Src tirosin chinasi (SFK) che include nove membri quali Src, Fyn e Hck.

D?altra parte, Abl condivide una significativa omologia di sequenza e una notevole somiglianza strutturale nella sua forma attiva con i membri della famiglia Src. Per questo motivo, diversi inibitori ATP-competitivi che bersagliano la conformazione attiva dell?enzima, originariamente sviluppati quali inibitori di Src, hanno dimostrato di essere anche potenti inibitori di Abl.<3>

NB ? una forma rara di cancro del sistema nervoso simpatico dove la iperattivazione dell c-Src gioca un ruolo chiave nella differenziazione, adesione cellulare e nella sopravvivenza delle cellule tumorali.<4,5 >Recentemente, PP2, noto inibitore di c-Src, ha dimostrato di inibire la sopravivenza/proliferazione e di ridurre l?aggregazione delle linee cellulari di NB<6 >mentre l?inibitore duale Src/Abl dasatinib ha dimostrato di essere efficace nel ridurre la crescita del NB sia in vitro che in vivo (Figura 1).<7 >

Il NB rappresenta il 9% delle neoplasie maligne in pazienti al di sotto dei 15 anni ed il 15% di tutte le morti pediatriche di natura oncologica.<8>

NB ? il pi? comune tumore solido extracraniale dell?et? infantile ed ? la principale causa di morte infantile per neoplasie.<9 >Nonostante il sostanziale miglioramento nel trattamento, osservato durante gli ultimi decenni, di alcune sottopopolazioni ben definite di pazienti, l?esito per bambini con un fenotipo clinico ad alto rischio ? migliorato solo modestamente con una sopravvivenza a lungo termine minore del 40%.<10,11 >Le opzioni terapeutiche per il trattamento clinico del NB consistono in un approccio multimodale che include la chirurgia, la chemioterapia, la radioterapia e la bioterapia. L?attuale trattamento chemioterapeutico per il NB ad alto rischio comprende cicli ad alto dosaggio di cisplatino ed etoposide alternati con l?utilizzo di vincristina, doxorubicina e ciclofosfamide. Inoltre, durante la prima remissione potrebbe essere utilizzata l?isotretinoina. Nonostante miglioramenti del tasso complessivo di guarigione di questi pazienti, le strategie terapeutiche sono ancora lontano dall?essere soddisfacenti soprattutto a causa degli effetti collaterali gravi.<12,13 >Pertanto, nuovi approcci terapeutici sono necessari per migliorare la prognosi nei pazienti NB.

GBM ? il tumore cerebrale primario pi? comune e aggressivo, con una prognosi estremamente sfavorevole e con molti pochi progressi terapeutici nell?ultima decade.<14 >Rimangono molteplici sfide, tra cui l'eterogeneit? del tumore, la localizzazione del tumore in una regione dove si ? fuori dalla portata del controllo locale, e la rapida, aggressiva recidivit? del tumore. Pertanto, il trattamento di pazienti con gliomi maligni rimane palliativo e comprende la chirurgia, radioterapia e la chemioterapia. La radioterapia in aggiunta alla chirurgia o chirurgia combinata con la chemioterapia ha dimostrato di prolungare la sopravvivenza in pazienti con GBM rispetto alla chirurgia sola. L'aggiunta della radioterapia alla chirurgia ha dimostrato di aumentare la sopravvivenza da 3-4 mesi a 7-12 mesi,<15 >qualsiasi periodo di risposta ? di breve durata perch? il tumore si ripresenta in genere entro 1?anno, con conseguente, ulteriore peggioramento clinico.<16 >Diversi bersagli terapeutici sono stati recentemente identificati (ad esempio VEGF e EGFR) indicando che la terapia mirata potrebbe rappresentare una strategia promettente. Dati preclinici, hanno dimostrano che le chinasi c-Src e la famiglia delle chinasi SRC (SFKs) mediano vie di segnalazione intracellulari che controllano processi chiave biologici/oncogenici, fornendo un forte razionale per lo studio di inibitori SRC/SFK.<17>

Fyn ? una tirosin chinasi non-recettoriale appartenente alla famiglia delle chinasi Src (SFK).<39 >I nove membri di questa famiglia sono raggruppati in sotto-classi: la sottofamiglia SrcA che comprende Src, Yes, Fyn, e Fgr, la sottofamiglia SrcB contenente Lck, Hck, Blk, e Lyn, e, infine, Frk nella propria sottofamiglia. Fyn ? una proteina di 59 kDa comprendente 537 amminoacidi codificati dal gene Fyn, localizzato sul cromosoma 6q21. Tre isoforme di Fyn sono note: fynB espressa principalmente nel cervello, fynT espresso in cellule ematopoietiche (cellule T) e fynDelta7 che ? stata identificata nelle cellule mononucleate del sangue periferico.<40 >Nei vertebrati le proteine della SFK condividono una struttura simile che comprende sei domini funzionali distinti: il dominio di omologia Src 4 (SH4), un dominio unico, dominio SH3, dominio SH2, un dominio catalitico (SH1) ed una regione regolatoria C-terminale. Il dominio SH4 ? una regione che comprende segnali per la modifica con acidi grassi.<39 >Il dominio unico ? specifico per ogni proteina della famiglia Src e si propone di essere responsabile di interazioni specifiche con particolari recettori e proteine bersaglio.<41 >I domini SH2 e SH3 interagiscono con altre proteine, e queste interazioni regolano l'attivit? tirosin-chinasica. Il dominio chinasico, che catalizza il trasferimento del gruppo fosfato terminale dell'ATP ad un residuo di tirosina della proteina substrato, presenta una struttura tipica bilobata formata da un piccolo lobo N-terminale, coinvolto nel legame con ATP, ed un lobo C-terminale pi? grande, dove ? presente un loop di attivazione (A-loop), con un residuo di tirosina conservato che ? auto-fosforilato nella forma attiva dell'enzima.<42 >Il loop A contiene 28 residui, che sono definiti nella sequenza primaria come la regione compresa tra due motivi tripeptide conservati, DFG (Asp-Phe-Gly) e APE (Ala-Pro-Glu).<43 >Oltre a condividere la stessa struttura, i membri della SFK sono caratterizzati dagli stessi meccanismi di regolazione. Infatti, l'attivazione o l'inibizione di attivit? chinasica dipende da interazioni intramolecolari tra SH2 e SH3 con il dominio chinasico e da fosforilazione/defosforilazione di due tirosine critiche, la prima situata nel loop A e la seconda in corrispondenza della regione C-terminale.<44 >La proteina Fyn ? in grado di interagire con quasi 300 proteine diverse e, attraverso queste interazioni, partecipa a molte vie cellulari, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Fyn ? coinvolta nella regolazione del sistema immunitario, e nello sviluppo ed attivazione delle cellule T.<45 >Essa svolge un ruolo cruciale nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC), dove ? coinvolta nella mielinizzazione, differenziazione morfologica associata alla formazione di neuriti in oligodendrociti, formazione e regolazione delle sinapsi, differenziazione degli oligodendrociti e sviluppo della memoria.<46 >Recenti evidenze suggeriscono che l?iperattivazione/deregolazione di Fyn potrebbe contribuire alla patogenesi della malattia di Alzheimer (AD) e di altre taupatie. Queste malattie sono caratterizzate dall?alterazione nella quantit? o nella struttura della proteina Tau, una proteina associata ai microtubuli che costituisce una componente fondamentale dei grovigli neurofibrillari di AD.<47 >Nei neuroni normali la proteina Tau ? presente nel citoplasma in forma non-fosforilata. Al contrario, la Tau risulta fosforilata in diversi siti in AD. In particolare, quando associato a grovigli neurofibrillari, la Tau ? risultata essere fosforilata sul suo residuo amino terminale Tyr18,<49 >con Fyn che ? l?unica chinasi responsabile di tale evento in AD. Un numero crescente di evidenze suggeriscono che la fosforilazione della Tyr18 ? un evento precoce nella fisiopatologia di AD che porta a cambiamenti conformazionali in Tau, iniziando la fibrillarizzazione.<48 >Inoltre, la beta-amiloide (A?) ? stata trovata attivare Fyn; ulteriormente, la sovraespressione di Fyn accelera la perdita delle sinapsi e accelera l'insorgenza di deficit cognitivo nei modelli di topi transgenici di AD, mentre l'inibizione dell?espressione di Fyn previene la perdita di sinapsi. Gli approcci terapeutici contro AD attualmente utilizzati negli studi clinici sono focalizzati sulla rimozione di A? o sull?inibizione della produzione e aggregati della stessa. Pertanto, grazie al suo ruolo centrale nella trasduzione del segnale di A?, Fyn rappresenta un bersaglio terapeutico unico in AD.

La sovraespressione di Fyn ha dimostrato di guidare una trasformazione morfologica delle cellule normali, portando allo sviluppo dei tumori. Infatti, Fyn ? sovraespresso in diversi tipi di cancro, tra cui glioblastoma multiforme, carcinoma a cellule squamose della testa e del collo, melanoma,<50 >cancro al seno,<51 >alle ovaie,<52 >cancro della prostata,<53 >e del pancreas.<54 >Recenti studi hanno dimostrato il suo coinvolgimento anche nel mesotelioma.<55 >Ultimamente, Singh ed i colleghi<56 >hanno dimostrato che l'attivit? della chinasi Fyn gioca un ruolo nella progressione della leucemia mieloide cronica (LMC), in quanto contribuisce all?instabilit? genomica BCR-ABL1 indotta, una caratteristica della crisi blastica di CML.<57 >La fase di crisi blastica terminale, della malattia rimane una sfida clinica. La crisi blastica di CML ? difficile da trattare a causa della resistenza agli inibitori della tirosina chinasi, all?aumentata l'instabilit? genomica e alle mutazioni secondarie acquisite. Il knockdown di Fyn comporta una ridotta crescita e proliferazione cellulare in vitro e in vivo. Inoltre, il gruppo ha dimostrato che la perdita completa di Fyn utilizzando modelli knockout genetici diminuisce il potenziale di proliferazione e clonogenico di cellule trasdotte con BCR-ABL1 sottolineando che Fyn ? implicata nella crescita e clonogenicit? BCR-ABL1 mediata. Inoltre, utilizzando un modello di cellule di LMC in crisi blastica, hanno scoperto che la sovraespressione di Fyn costitutivamente attiva, ha causato un aumento di aneuploidia ed alterazioni genomiche. A causa del coinvolgimento di Fyn in tale malattia, la ricerca di inibitori Fyn rappresenta un settore di studio in espansione.

Sommario dell'invenzione

Negli ultimi anni, il gruppo degli inventori ha condotto studi approfonditi su una serie di nuovi inibitori delle chinasi Src, Abl, Fyn e Hck caratterizzati da uno scaffold pirazolo[3,4-d]pirimidinico e pirrolo[2,3-d]pirimidinico.<18 >Diversi membri di questa famiglia ? stato trovato che sono in grado di indurre apoptosi e ridurre la proliferazione di numerose linee cellulari di tumori solidi (A431, 8701-BC, SaOS-2, e PC3). Un membro selezionato di questa famiglia, Si34 caratterizzato da un gruppo C6-metiltio sullo scaffold pirazolo [3,4-d] pirimidinico, ha mostrato un?attivit? antiproliferativa promettente su colture cellulari SH-SY5Y di NB umano.<19 >Al fine di ottenere ulteriori informazioni sulle potenzialit? di dette pirazolo [3,4-d] pirimidine per il trattamento dei tumori solidi, quali NB e GBM, una piccola libreria di analoghi, strettamente correlati caratterizzati dalla presenza di un gruppo metiltio in C6, ? stata sintetizzata per esplorare l?importanza dei diversi gruppi funzionali in N1 e C4 per l'attivit? biologica. Tra gli analoghi di sintesi, il composto Si214, ha dimostrato la caratteristica di avere una potente attivit? inibitoria contro c-Src (Ki = 90 nM) e un notevole effetto antiproliferativo sulle cellule SH-SY5Y NB (IC50 = 80 nM). Tuttavia, nonostante le sue notevoli attivit?, tale composto soffre di una scarsa solubilit? in acqua (0,12 mg/ml) che ne preclude la possibilit? di somministrazione per via orale.<20 >Di conseguenza, una serie di derivati pirazolo[3,4-d] pirimidinici, dotati di maggiore solubilit? grazie all'introduzione di gruppi polari nella posizione C6 esposta al solvente, ? stata progettata e sintetizzata dal gruppo degli inventori. Questo studio ha portato all'identificazione del C4-anilino derivato Si192 che ha mostrato un profilo migliore in termini sia di attivit? che di propriet? ADME, essendo caratterizzato da una elevata stabilit? metabolica (95%), una buona solubilit? in acqua (1,7 mg/ml) , un?efficace permeabilit? di membrana (10 x 10<-6 >cm/s) e una potente attivit? inibitoria contro c-Src isolato (Ki = 0,21 ?M).<21 >A partire dai dati ottenuti su Si192, gli autori hanno sviluppato inibitori di seconda generazione, dotati di una migliore affinit? verso c-Src e migliorate propriet? ADME, da testare contro NB e GBM in vivo. A questo scopo ? stato applicato un approccio multidisciplinare che ha unito cristallografia a raggi X, disegno molecolare basato sullo studio della struttura, sintesi, caratterizzazione del profilo ADME in vitro e valutazione dell?attivit? biologica in vitro e in vivo. L'ottimizzazione di derivati pirazolo [3,4-d] pirimidinici ? stata indirizzata, a partire dal complesso cristallografico di Si192 e c-Src, utilizzando calcoli di perturbazione di energia libera (FEP), al fine di guidare la sintesi degli inibitori di c-Src, mostrati nel presente documento, molti dei quali sono dotati di attivit? biologica nell?ordine del nanomolare.

Un piccolo set di composti hanno mostrato una potente attivit? antiproliferativa nei confronti di cellule di NB e GBM, nonch? caratteristiche ADME ottimali. I composti oggetto dell'invenzione inibivano la proliferazione di linee cellulari di NB e GBM e hanno mostrato attivit? in vivo, un buon profilo di propriet? ADME (in particolare in termini di permeabilit? della membrana) mostrando una maggiore solubilit? in acqua rispetto ai composti precedentemente riportati Si192 e Si181.

Di conseguenza, sono stati condotti ulteriori studi sul composto Si306, uno dei derivati pi? promettenti, per testare la sua efficacia contro NB e GBM in vivo dopo somministrazione in topi. Nel modello di topi NB, la crescita tumorale ? stata significativamente inibita dal composto Si306 alla dose di 50 mg / kg. Successive osservazioni delle masse tumorali asportate e saggi in vitro uggeriscono che l?inibitore di c-Src era attivo sia sulle cellule tumorali che su cellule endoteliali associate al tumore inibendo la loro capacit? migratoria e l'angiogenesi.

Inoltre, Si306 ? stato somministrato in vivo a topi nudi inoculati per via sottocutanea con cellule U87 di GBM. I topi hanno ricevuto 50mg/kg di Si306 al giorno e l'effetto antitumorale del composto ? stata valutato anche in combinazione con un unico trattamento radioterapico (4Gy). Al termine del trattamento, i topi che hanno ricevuto la terapia combinata hanno mostrato una riduzione dell'80% della massa tumorale. La terapia combinata di Si306 con radioterapia ? stata valutata anche in vitro (cellule U87) attraverso l?uso di un saggio a bassa densit? di crescita, ed ancora una volta la terapia combinata ha dimostrato di ridurre in maniera significativa il numero delle colonie rispetto al controllo o al trattamento singolo. Si306 ? stato testato anche in combinazione con mitomicina C un noto agente genotossico su modello cellulare U87 e U251; il trattamento combinato ha determinato un effetto antiproliferativo sinergico che ? stato pi? pronunciato nelle cellule U87. Inoltre, profarmaci dei composti descritti nella presente invenzione, sono stati sintetizzati in modo da migliorare ulteriormente la solubilit? in acqua, infatti il miglioramento di questa propriet? farmacocinetica potrebbe influenzarne positivamente la sua distribuzione sia nel plasma che in vivo. I profarmaci hanno mostrato un miglioramento generale delle attivit? su linee cellulari tumorali NB e GBM, rispetto ai rispettivi farmaci. Studi di biodistribuzione hanno mostrato l'idrolisi in vivo di proSi306 e la sua capacit? di raggiungere la massima concentrazione nel cervello e nel plasma.

Nella presente invenzione, un protocollo di disegno molecolare basato sulla struttura proteica ? stato impiegato allo scopo di identificare nuovi inibitori Fyn. Fyn ? un membro della famiglia di tirosin-chinasi non recettoriali Src (SFK). La sua attivit? anomala ha dimostrato di essere correlata allo sviluppo di vari tumori umani nonch? patologie gravi, come il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson, rendendo cos? Fyn un bersaglio attraente per l'identificazione di nuovi agenti terapeutici per taupatie e tumori.

In primo luogo, un approccio di screening virtuale ? stato applicato ad un database di composti disponibili in commercio portando a termine un protocollo di docking nel sito di legame dell?ATP della chinasi Fyn. Successivamente, una libreria di derivati pirazolo [3,4-d] pirimidinici, che hanno in precedenza dimostrato di essere inibitori duali di Src/Abl, ? stata sottoposta allo stesso protocollo di calcolo. Modifiche puntiformi volte ad ottimizzare le interazioni di van der Waals del ligando all'interno della regione idrofobica I hanno determinato un rapido aumento della affinit? di legame, con l?identificazione degli inibitori Si310 e Si308 aventi Ki di 70 nM e 95 nM, rispettivamente. Sorprendentemente, entrambi i composti hanno mostrato un profilo interessante di attivit? antiproliferativa contro la linea cellulare K562 di leucemia mieloide cronica e sono risultati in grado di inibire la fosforilazione mediata da Fyn-della proteina Tau in modelli di linee cellulari della malattia di Alzheimer.

La presente invenzione fornisce un composto di formula I, II o III

o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo,

in cui Z rappresenta CH o N;

R1 rappresenta una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1;

o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1;

o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; R8? e R9? sono indipendentemente H o CH3; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1;

o:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1;

R2 rappresenta NR10?R11? ;

R10? e R11? sono indipendentemente H, alchile, cicloalchile, 1-pirrolidinile, 4-morfolinile, 1-esaidroazepinile;

o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N;

R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostitutito, o gruppo arilachilico non sostituito o sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove M ? NH o S o O;

R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; R3 rapresenta H

o un arilalchile con la formula:

dove R22?, R23?, R24?, R25?, R26? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alkyl, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4;

R4 rappresenta:

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH; OMe, O-alchile, alchile;

dove R28?, R29?, R30?, R31?, R32? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2.

R5 rappresenta H, alchiltio, alchilammino, cicloalchile, cicloalchiltio, cicloalchilammino, alchile, S(CH2)nOH, S(CH2)nNH2, NH(CH2)nOH, NH(CH2)nNH2;

R6 rappresenta H,

o un arilalchile con la formula:

dove R22?, R23?, R24?, R25?, R26?sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2-C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove L ? CH o N; n ? un numero intero da 0 a 4;

R7 rappresenta:

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH, OMe, O-alchile, alchile;

dove R33? rappresenta SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; R8 rappresenta H, alchiltio, alchilammino, cicloalchile, cicloalchiltio, cicloalchilammino, alchile, S(CH2)pOH, S(CH2)pNH2, S(CH2)pNHCH3, S(CH2)pN(CH3)2, NH(CH2)pOH, NH(CH2)pNH2; NH(CH2)pNHCH3, NH(CH2)pNH(CH3)2; p ? un numero intero da 0 a 6; o una catena alchilica con la formula:

o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; R8? e R9? sono indipendentemente H o CH3; m ? un numero intero da 0 a 2;

o:

R9 rappresenta:

dove R34? ? H o alchile o cicloalchile o 1-pirrolidinile o 4-morfolinile o 1-esaidroazepinile; o una catena alchilica con la formula:

o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N;

R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2-C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostitutio o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove M ? NH o S o O;

R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; dove R35? ? una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; R36? ? H o alchile o arile o arilalchile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1;

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

R10 rappresenta:

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH; O-achile, achile;

dove R28?, R29?, R30?, R31?, R32? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2-C1-6 alchile, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4;

con l?esclusione dei seguenti composti:

1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-N-propil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si109);

N-benzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si110);

1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(4-fluorobenzil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si180);

1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-N-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si182);

1-(2-cloro-2-feniletill)-N-(3-clorofenil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si181);

1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-N-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si192);

N-cicloesile-6-(2-morfolinoetossi)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Sv12); N<4>-(3-clorofenil)-N<6>-(2-morfolinoetil)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diammina (Sv24);

2-(4-metilpiperazin-1-il)etil butil(1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(etiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi20);

2-(4-metilpiperazin-1-il)etil (3-bromofenil)(6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi278);

sono esclusi.

Preferibilmente l?invenzione fornisce un composto di formula I precedentemente definito, in cui Z ? N, e/o R1 ? SCH2CH24-morfolinile e/o R2 ? NHC6H5 o NHC6H4mCl o NHC6H4mF o NHC6H4mBr o NHC6H4mOH e/o R3 ? H e/o R4 ? CH2CH2C6H5 o CH2CHClC6H5 o CH2CHMeC6H5 o CH2CH2C6H4pF o

Ancora preferibilmente l?invenzione fornisce un composto di formula II come precedentemente definito, in cui Z ? N e/o R2 ? NHC6H5 o NHC6H4mCl o NHC6H4mF o NHC6H4mBr o NHC6H4mOH e/o R5 ? H e/o R6 = H o C6H5 o C6H4pF o C6H4pCl o C6H4pMe o 5-indolile; e/o R7 ? o CH2CH2C6H4pSO2Me o CH2CH2C6H4pPO(Me)2 o CH2CHClC6H4pSO2Me o CH2CHClC6H4pPO(Me)2.

Ancora preferibilmente l?invenzione si riferisce ad un composto di formula III come precedentemente definito, in cui Z ? N e/o R8 ? H o SMe o SEt o SCH2CH2-4-morfolino; e/o

R34? ? CH2C6H5 o CH2C6H4oCl o C6H4mCl o

C6H4mBr o CH2CH2C6H5 o C6H5 o nBu; e in cui R35? ?

Come esempio preferito il composto della presente invenzione ?:

N-(3-Clorofenil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine (Si303);

6-[(2-Morfolin-4-iletil)tio]-N-fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si313);

N-(3-Fluorofenil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-fenipropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si314);

N-(3-Clorofenil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-fenipropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si307);

N-(3-Clorofenil)-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si327);

N-(3-Bromofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si306);

3-{[6-[(2-Morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]ammino}fenol cloridrato (Si332);

3-{[6-[(2-Morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]ammino}fenol cloridrato (Si329);

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si310); 3-(4-Clorofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si308);

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-metilfenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si309);

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-metossifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si311); 1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina cloridrato (Si244); 3-Fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si312);

1-{4-[4-Ammino-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]fenil}etanone (Si336); 3-(4-Clorofenil)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si337);

3-(4-Metilfenil)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si338);

3-(1H-indol-5-il)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si339); N-benzil-6-(sec-butiltio)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si146);

6-(Sec-butiltio)-1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si147);

1-(2-Cloro-2-feniletil)-6-(ciclopentiletio)-N-(3-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si170);

6-(Sec-butiltio)-N-(3-clorofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si148);

Sintesi di 2-(4-benzilammino-1-stiril-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-ilammino)-etanolo (Si74);

N-[2-(3-clorofenil)etil]-6-(metiltio)-1-[2-fenilvinil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si215);

N,6-dibenzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si164);

o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo.

Preferibilmente il composto della presente invenzione ? per uso medico, preferibilmente per uso come SFK inibitore, preferibilmente come c-Src inibitore, ancora preferibilmente per uso nel trattamento e/o prevenzione di cancro, preferibilmente cancro solido o ematopoietico, preferibilmente il cancro ? selezionato dal gruppo costituito da neuroblastoma, glioblastoma, osteosarcoma, cancro della prostata, leucemia, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma epatocellulare. Il cancro potrebbe anche essere glioblastoma multiforme, carcinoma a cellula squamosa della testa e del collo, melanoma, cancro del seno, ovarico e pancreatico, mesotelioma e leucemia mieloide cronica.

La presente invenzione fornisce ulterioremente un composto avente la formula IV o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo per uso nel trattamento e/o prevenzione di neuroblastoma e/o glioblastoma e/o una malattia neurodegenerativa:

IV

In cui:

Z rappresenta CH o N;

R6 rapresenta H

o un arilalchile con la formula:

dove R22?, R23?, R24?, R25?, R26?sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 achenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CO(C1-6 alchile), CONH2, CONH-C1-6 achil, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2-C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove L ? CH o N; n ? un numero intero da 0 a 4;

R8 rapresenta H, benzile, alchiltio, alchilammino, cicloalchile, cicloalchiltio, cicloalchilammino, alchile, S(CH2)pOH, S(CH2)pNH2, S(CH2)pNHCH3, S(CH2)pN(CH3)2, NH(CH2)pOH, NH(CH2)pNH2; NH(CH2)pNHCH3, NH(CH2)pNH(CH3)2; p ? un numero intero da 0 a 6;

o una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O;

n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1;

o:

dove Y ? NH o O o S; V ? un ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1;

o:

R10 rappresenta

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH; O-achile, alchile;

o R10 rappresenta

dove R27? rapresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH, OMe, O-alchile, alchile;

dove R33? rappresenta SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero da 0 a 4;

R11 rappresenta NR37?R38? ;

R37? e R38? sono indipendentemente H, alchile, cicloalchile, 1-pirrolidinile, 4-morfolinile, 1-esaidroazepinile;

o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N;

R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilachilico sostituito o non sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove M ? NH o S o O;

R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilachilico sostituito o non sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4;

o una catena alchilica con la formula:

o una catena carbonilica con la formula:

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

o R11 rapresenta

dove R34? ? H o alchile o cicloalchile o 1-pirrolidinile o 4-morfolinile o 1-esadroazepinile; o una catena alchilica con la formula:

o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N;

o:

dove M ? NH o S o O;

dove R35? ? una catena alchilica con la formula:

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

con la condizione che i composti:

N-(3-clorofenil)-6-(metiltio)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si214);

6-(metiltio)-N-fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si276);

N-(3-clorofenil)-6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si277); N-(3-bromofenil)-6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si278)

N-benzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si34); 1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-N-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si35); e 1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(3-clorofenil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si83);

siano esclusi.

La presente invenzione fornisce ulteriormente il composto di formula IV come precedentemente definito in cui Z ? N, e/o R8 ? SCH2CH24-morfolinil o SMe o SEt o S(iPr) o Sciclopentile e/o R11 ? NHC6H5 o NHC6H4mCl o NHC6H4mF o NHC6H4mBr o NHC6H4mOH e/o R6 ? H e/o R10 ? CH2CH2C6H5 o CH2CHClC6H5 o CH2CHMeC6H5 o CH2CH2C6H4pF o La presente invenzione fornisce ulteriormente il composto di formula IV come definito qui sopra in cui Z ? N e/o R11 ? NHC6H5 o NHC6H4mCl o NHC6H4mF o NHC6H4mBr o NHC6H4mOH e/o R8 ? H e/o R6 = H o C6H5 o C6H4pF o C6H4pCl o C6H4pMe o 5-indolile; e/o R10 ? CH2CH2C6H5 o CH2CHClC6H5 o CH2CHMeC6H5 o CH2CH2C6H4pSO2Me o CH2CH2C6H4pPO(Me)2 o CH2CHClC6H4pSO2Me o CH2CHClC6H4pPO(Me)2

Oppure la presente invenzione fornisce ulteriormente il composto di formula IV come precedentemente definito

in cui Z ? N e/o R8 ? H o SMe o SEt o SCH2CH2-4-morfolino; e/o R6 ? H e/o

R11 ? in cui R34? ? CH2C6H5 o CH2C6H4oCl o C6H4mCl o C6H4mBr o CH2CH2C6H5 o C6H5 o nBu; e in cui R35? ?

e/o R10 ? , in cui R27? ? H o Cl o Me; R30? ? H o Br; e R28?, R29?, R31?, R32? sono H.

In un esempio preferito il composto dell?invenzione per uso nel trattamento e/o prevenzione di neuroblastoma e/o glioblastoma e/o una malattia neurodegenerative, ?:

o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo.

Preferibilmente il composto della presente invenzione ? per uso con una ulteriore terapia antitumorale, preferibilmente la ulteriore terapia anti-tumorale ? radioterapia, preferiblmente la ulteriore terapia anti-tumorale ? una chemioterapia selezionata dal gruppo costituito da: mitomicina C, cisplatino, etoposide, vincristina, doxorubicina, isotretinoina e ciclofosfammide.

L?invenzione fornisce ulteriormente una composizione farmaceutica comprendente il composto dell?invenzione definito come qui sopra e un vettore farmaceuticamente accettabile, preferibilmente il vettore farmaceuticamente accettabile ? una nanoparticella come: liposoma, albumina e ciclodestrina.

L?invenzione ulteriormente fornisce un processo per la preparazione di un composto di formula III come definito qui sopra, o sali di questo, in cui

comprendente il seguente passaggio:

In cui R8, R27?, R28?, R29?, R30?, R31?, R32?, R34? sono come definiti precedentemente, e in cui R35? ?:

una catena alchilica con la formula:

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

o:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

L?invenzionefornisceinoltreunprocessoperlapreparazionedicompostidiformulaIcome quisopradefiniti,osalidiquesto,comprendenteiseguentipassaggi:

a

Reattiviecondizioni:(i)4-(2-cloroetil)morfolina,NaOH,EtOH,anidraDMF,riflusso,6ore;(ii)POCl3/DMF,CH2Cl2, riflusso,6-8ore;(iii)R2NH2,EtOH,riflusso,3-5ore.

L?invenzionefornisceinoltreunprocessoperlapreparazionedicompostidiformulaIV come quisopradefiniti,osalidiquesto,comprendenteiseguentipassaggi:

o un processo per la preparazione di composti di formula IV come qui sopra definiti, o sali di questi, comprendente i seguenti passaggi:

o un processo per la preparazione di composti di formula IV come qui sopra definiti, o sali di questi, comprendenti i seguenti passaggi:

L?invenzione fornisce inoltre un processo per la preparazione del composto Si74 di formula IV come qui sopra definito, o sali di questo, comprendente i seguenti passaggi:

a Reattivi e condizioni: i. mCPBA, CHCl3, t.a., 6 ore; ii.2-aminoetanolo, DMSO, butan-1-olo, 90 ?C, 12 ore.

L?invenzione fornisce inoltre un processo per la preparazione del composto Si164 di formula IV come qui sopra definito, o sali di questo, comprendente i seguenti passaggi:

Nella presente invenzione:

Il termine ?alogeno? o ?alo? si riferisce a fluoro, cloro, bromo, o iodio.

Il termine ?alchile? si riferisce a una catena idrocarburica radicalica lineare o ramificata, costituita solamente da atomi di carbonio e idrogeno. Appropriati esempi di detto alchile includono ma non sono limitati a metile, etile, n-propile, isopropile, butile, sec-butile, tertbutile, pentile, isopentile, tert-pentile, esile, eptile, ottile, nonile, decanile, esadecanile, eicosanile, ecc. ?gruppi alchilici sostituiti? significa che ogni atomo di idrogeno su ciascun atomo di carbonio indipendentemente potrebbe essere indipendentemente rimpiazzato da un sostituente, appropriati esempi di sostituente includono ma non sono limitati a F, Cl, Br, I, CF3, CN, O-C1-6 alchile, C1-6 alchile, OH, S-C1-6 alchile, COC1-6 alchile, OCOC1-6 alchile, CO2C1-6 alchile.

Il termine ?C1-6 alchile? si riferisce a una catena idrocarburica radicalica lineare o ramificata, costituita solamente da atomi di carbonio e idrogeno, avente da uno a sei atomi di carbonio.

Appropriati esempi di C1-6 alchile includono ma non sono limitati a etile, n-propile, isopropile, butile, sec-butile, tert-butile, pentile, isopentile, tert-pentile, esile.

Il termine ?C2-6 alchile? si riferisce a una catena idrocarburica radicalica lineare o ramificata, constituita solamente di atomi di carbonio e idrogeno,avente da due a sei atomi di carbonio. Appropriati esempi di C2-6 alchile includono ma non sono limitati a etile, n-propile, isopropile, butile, sec-butile, tert-butile, pentile, isopentile, tert-pentile, esile.

Il termine ?C2-6 alchenile? si riferisce a una catena idrocarburica radicalica lineare o ramificata, contenente almeno un doppio legame carbonio-carbonio, costituita solamente di atomi di carbonio e idrogeno, aventi da due a sei atomi di carbonio. Appropriati esempi di C2-

6 alchenile ma non sono limitati a etenile, propenile, allile, isobutenile, pentenile, prenile, esenile, ecc.

Il termine ?C2-6 alchinile? si riferisce a una catena idrocarburica radicalica lineare o ramificata, contenente almeno un triplo legame carbonio-carbonio, costituita solamente da atomi di carbonio e idrogeno, avente da due a sei atomi di carbonio. Appropriati esempi di C2-

6 alchinile ma non sono limitati a acetilenile, etinile, propinile, ecc.

Il termine gruppo ?aloalchile? ? preferibilmente un gruppo aloalchile C1-C10 lineare o ramificato, pi? preferibilmente un gruppo aloalchile C1-C8, pi? preferibilmente un gruppo aloalchile C1-C6 lineare o ramificato, ancora pi? preferibilmente un gruppo aloalchile C1-C4 lineare o ramificato, pi? preferibilmente un gruppo aloalchile C1-C2, essendo in particolare CF3, CHF2, CH2F.

Il termine ?aril? rappresenta un sistema mono e biciclico anello aromatico di, rispettivamente, 6, 9 o 10 atomi, appropriati esempi di tale arile sono fenie, indenile, indanile e naftile e tetraidronaftalenile.

?Arile sostituito? o ?gruppi arile sostituiti? significa che l?atomo di idrogeno su indipendentemente ogni atomi di carbonio potrebbe essere indipendentemente rimpiazzato da un sostituente, appropriati esempi di sostituenti includono ma non sono limitati a F, Cl, Br, I, CF3, CN, O-C1-6 alchile, C1-6 alchile, OH, S-C1-6 alchile, COC1-6 alchile, OCOC1-6 alchile, CO2C1-6 alchile.

Il termine ?arilalchile? rapresenta ogni radicale univalente derivato da un radicale alchilico per sostituzione di uno o pi? atomi di idrogeno con gruppi arilici, in cui l?arile ? definito come qui sotto. ?Gruppo arilalchile sostituito? significa che ogni atomo di idrogeno su indipendentemente ogni atomo di carbonio potrebbe essere indipendentemente rimpiazzato da un sostituente, appropriati esempi di sostituenti includono ma non sono limitati a F, Cl, Br, I, CF3, CN, O-C1-6 alchile, C1-6 alchile, OH, S-C1-6 alchile, COC1-6 alchile, OCOC1-6 alchile, CO2C1-6 alchile.

Il termine ?cicloalchile? si riferisce a un sistema di anello idrocarburico monociclico saturo avente almeno tre atomi di carbonio, preferibilmente da tre a sette atomi di carbonio. Appropriati esempi di gruppi cicloalchilici includono ciclopropile, ciclobutile, ciclopentile, e cicloesile ecc.

Il termine ?cicloalchilammino? si riferisce a un gruppo cicloalchil-NH in cui il gruppo cicloalchile ? definito come qui sopra.

Il termine ?cicloalchiltio? si riferisce a un gruppo cicloalchil-S in cui il gruppo cicloalchile ? definito come qui sopra.

Il termine ?alchiltio? si riferisce a un gruppo alchil-S in cui il gruppo alchilico ? definito come qui sopra.

Il termine ?alchilammino? si riferisce a un grupo alchil-NH in cui il gruppo alchilico ? definito come qui sopra.

Taupatie sono una classe di malattie neurodegenerative associate con l?aggregazione patologica di proteine tau nel cervello umano.

La meglio conosciuta di queste malattie ? il morbo di Alzheimer (AD), in cui la proteina tau ? depositata nei neuroni nella forma di grovigli neurofibrillari (NFTs). Essi furono i primi descritti dall?eponimo Alois Alzheimer per uno dei suoi pazienti che soffriva del disturbo. I grovigli sono formati per iperfosforilazione di una proteina microtubulo-associata, conosciuta come tau, che si aggrega in una forma insolubile. (Queste aggregazioni di proteina tau iperfosforilata sono denominate anche come PHF, o "filamenti elicodali appaiati). Il preciso meccanismo della formazione del groviglio non ? completamente conosciuto, ed ? ancora controverso se i grovigli sono un fattore causale primario nella malattia o giocano un ruolo pi? periferico. AD ? anche classificato come un amiloidosi a causa della presenza di placche senili.

Altre condizioni in cui i grovigli neurofibrillari sono comunemente osservati comprendono: Paralisi sopranucleare progressiva anche se con filamento rettilineo piuttosto che con PHF tau, demenza pugilistica (encefalopatia traumatica cronica), la demenza frontotemporale e parkinsonismo legato al cromosoma 17, ma senza placche ?-amiloide rilevabili, la malattia Lytico-Bodig (complesso Parkinson-demenza di Guam), demenza Groviglio predominante, con NFTs simili a AD, ma senza placche, che finisce per apparire nell?anziano, ganglioglioma e gangliocitoma, Meningioangiomatosi, panencefalite sclerosante subacuta, cos? come l?encefalopatia da piombo, sclerosi tuberosa, malattia di Hallervorden-Spatz, e lipofuscinosi.

Nella malattia di Pick e nella degenerazione cortico-basale le proteine tau sono depositate sotto forma di corpi di inclusione all'interno di neuroni ?gonfi?.

La malattia dei granuli argirofili (AGD), un altro tipo di demenza, ? caratterizzata all?esame microscopico del tessuto cerebrale dalla presenza di abbondanti grani argirofili e corpi avvolti. Alcuni la considerano un tipo di malattia di Alzheimer. La malattia pu? coesistere con altre taupatie quali paralisi sopranucleare progressiva e la degenerazione cortico-basale, e anche con la malattia di Pick. Alcune altre taupatie includono: la demenza frontotemporale o degenerazione lobare frontotemporale. Le taupatie non-Alzheimer a volte vengono raggruppate insieme come "complesso di Pick".

Nell'ambito dell'invenzione sono anche compresi i sali dei composti della presente invenzione. A causa del loro potenziale impiego in medicina, i sali dei composti di formula I, II, III e IV sono preferibilmente farmaceuticamente accettabile. Sali farmaceuticamente accettabili comprendono i sali non tossici convenzionali ottenuti per salificazione di un composto di formula I, II, III e IV con acidi inorganici (per esempio acido cloridrico, bromidrico, solforico o fosforico), o con acidi organici (ad esempio acido acetico, propionico , succinico, benzoico, solfanilico, 2-acetossi-benzoico, cinnamico, mandelico, salicilico, glicolico, lattico, ossalico, malico, maleico, malonico, fumarico, tartarico, citrico, ptoluensolfonico, metansolfonico, etansolfonico, o naftalensulfonico). Per una review su sali farmaceutici adatti vedere (37). Altri sali, che non sono farmaceuticamente accettabili, per esempio il sale trifluoroacetato, possono essere utili nella preparazione di composti della presente invenzione e questi formano un ulteriore aspetto dell'invenzione. L'invenzione comprende nel suo ambito tutte le possibili forme stechiometriche e non stechiometriche dei sali dei composti di formula I, II, III e IV.

Inoltre, i composti di formula I, II, III e IV possono esistere in forme non solvatate cos? come in forme solvatate con solventi farmaceuticamente accettabili quali acqua, EtOH e simili. Alcuni composti di formula I, II, III e IV possono esistere in forme stereoisomeriche (ad esempio, essi possono contenere uno o pi? atomi di carbonio asimmetrici). I singoli stereoisomeri (enantiomeri e diastereoisomeri) e miscele di questi sono inclusi nell'ambito della presente invenzione. La presente invenzione copre anche i singoli isomeri dei composti rappresentati dalla formula I, II, III e IV come miscele con isomeri in cui uno o pi? centri chirali sono invertiti. Analogamente si intende che i composti di formula I, II, III e IV possono esistere in forme tautomeriche diverse da quelle mostrate nella formula e questi sono inclusi nell'ambito della presente invenzione.

L'invenzione include anche tutte le variazioni isotopiche adatte di un composto dell'invenzione. Una variazione isotopica di un composto dell'invenzione ? definita come quella in cui almeno un atomo ? sostituito da un atomo avente lo stesso numero atomico ma una massa atomica differente dalla massa atomica che di solito si trova in natura. Esempi di isotopi che possono essere incorporati nei composti dell'invenzione includono isotopi quali <2>H, <3>H, <13>C, <14>C, <15>N, <17>O, <18>O, 31P, <32>P, <35>S, <18>F e <36>Cl rispettivamente. Alcune variazioni isotopiche dell?invenzione, ad esempio, quelle in cui un isotopo radioattivo come <3>H o <14>C ? incorporato, sono utili negli studi di distribuzione tissutale del farmaco e/o substrato. Inoltre, la sostituzione con isotopi come il deuterio <2>H, pu? fornire certi vantaggi terapeutici derivanti da una maggiore stabilit? metabolica. Le variazioni isotopiche dei composti dell'invenzione possono generalmente essere preparate mediante procedure convenzionali cos? come con i metodi illustrativi o con le preparazioni descritte negli esempi qui di seguito utilizzando opportune variazioni isotopiche dei reagenti adatti. L'invenzione inoltre comprende anche composizioni farmaceutiche contenenti almeno un composto della presente invenzione o un suo sale farmaceuticamente accettabile o un solvato dello stesso e uno o pi? vettori, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.

Le composizioni farmaceutiche possono essere scelte in base alle esigenze di trattamento. Tali composizioni sono preparate tramite miscelazione e sono opportunamente adattate alla somministrazione orale o parenterale, e come tali possono essere somministrate sotto forma di compresse, capsule, preparazioni orali, polveri, granuli, pillole, o soluzioni liquidi iniettabili o infusibili, sospensioni, supposte, preparazione per inalazione.

Compresse e capsule per la somministrazione orale sono generalmente presentate in forma di dosaggio unitario e contengono eccipienti convenzionali quali leganti, riempitivi (compresi cellulosa, mannitolo, lattosio), diluenti, agenti di compresse, lubrificanti (compresi stearato di magnesio), detergenti, disintegranti (ad esempio polivinilpirrolidone e derivati dell'amido come amido glicolato di sodio), coloranti, aromatizzanti e agenti bagnanti (per esempio sodio lauril solfato).

Le composizioni solide orali possono essere preparate con metodi convenzionali di miscelazione, riempimento o pastigliatura. L'operazione di miscelazione pu? essere ripetuta per distribuire il principio attivo in tutte le composizioni contenenti grandi quantit? di riempitivi. Tali operazioni sono convenzionali.

Le preparazioni liquide orali possono essere nella forma di, ad esempio, sospensioni acquose o oleose, soluzioni, emulsioni, sciroppi o elisir, o possono essere presentate come prodotto secco da ricostituire con acqua o con un veicolo adatto prima dell'uso. Tali preparazioni liquide possono contenere additivi convenzionali quali agenti sospendenti, per esempio sorbitolo, sciroppo, metilcellulosa, gelatina, idrossietilcellulosa, carbossimetilcellulosa, gel di stearato di alluminio oppure grassi commestibili idrogenati; agenti emulsionanti, ad esempio lecitina, sorbitan monooleato, o acacia; veicoli non acquosi (che possono includere oli commestibili) quali olio di mandorle, olio di cocco frazionato, esteri oleosi quali esteri di glicerina, glicole propilenico, o alcool etilico; conservanti, come metile o propile pidrossibenzoato o acido sorbico, e se desiderato, aromatizzanti o coloranti convenzionali. Le formulazioni orali includono anche formulazioni convenzionali a lento rilascio come compresse o granuli gastro-resistenti rivestiti.

La preparazione farmaceutica per la somministrazione via inalazione pu? essere fornita da un insufflatore o da un nebulizzatore a pressione.

Per la somministrazione parenterale il dosaggio unitario di fluido pu? essere preparato, comprendendo il composto e un veicolo sterile. Il composto pu? essere sospeso o disciolto, a seconda del veicolo e della concentrazione. Le soluzioni parenterali sono normalmente preparate sciogliendo il composto in un veicolo, la sterilizzazione per filtrazione di quest?ultimo, riempimento dei flaconi idonei e sigillatura. Vantaggiosamente, adiuvanti quali anestetici locali, conservanti e agenti tampone possono essere sciolti nel veicolo. Per aumentare la stabilit?, la composizione pu? essere congelata dopo aver riempito le fiale e rimosso l'acqua sotto vuoto. Le sospensioni parenterali sono preparate sostanzialmente nello stesso modo, eccetto che il composto pu? essere sospeso nel veicolo invece di essere sciolto, e sterilizzato mediante esposizione a ossido di etilene prima della sospensione nel veicolo sterile. Convenientemente, un tensioattivo o un agente bagnante possono essere inclusi nella composizione per facilitare la distribuzione uniforme del composto dell'invenzione.

Per somministrazione orale o sublinguale le composizioni possono essere tavolette, pastiglie, pastiglie o gel.

I composti possono essere farmaceuticamente formulati come supposte o clisteri di ritenzione, ad esempio supposte contenenti basi convenzionali come burro di cacao, polietilenglicole, o altri gliceridi, per una somministrazione rettale.

Un?altra via di somministrazione dei composti della presente invenzione riguarda il trattamento topico. Le formulazioni topiche possono contenere ad esempio pomate, creme, lozioni, gel, soluzioni, paste e/o possono contenere liposomi, micelle e/o microsfere. Esempi di unguenti comprendono unguenti oleosi quali oli vegetali, grassi animali, idrocarburi semisolidi, unguenti emulsionabili come solfato idrossistearina, lanolina anidra, petrolato idrofilo, alcool cetilico, glicerolo monostearato, acido stearico, unguenti idrosolubili contenenti glicoli di polietilene di vario peso molecolare. Le creme, come noto agli esperti di formulazione, sono liquidi viscosi o emulsioni semisolide, e contengono una fase oleosa, un emulsionante e una fase acquosa. La fase oleosa contiene generalmente petrolato e un alcol come l?alcool cetilico o stearico. Le formulazioni adatte per la somministrazione topica oculare includono anche il collirio, in cui il principio attivo viene disciolto o sospeso in un adatto veicolo, in particolare in un solvente acquoso per l'ingrediente attivo.

Un ulteriore modo di somministrazione dei composti dell'invenzione riguarda la veicolazione transdermica. Formulazioni transdermiche tipiche comprendono vettori acquosi e non acquosi convenzionali, come creme, oli, lozioni o paste o possono essere sotto forma di membrane o cerotti medicati.

Un riferimento per le formulazioni ? il libro di Remington.<38>

I composti della presente invenzione possono essere impiegati per l'uso nel trattamento e/o la prevenzione delle condizioni di cui sopra come unica terapia o in combinazione con altri agenti terapeutici o da somministrazioni separate oppure, comprendendo i due o pi? principi attivi nella stessa formulazione farmaceutica. I composti possono essere somministrati simultaneamente o sequenzialmente.

Gli altri agenti terapeutici possono essere farmaci antitumorali o composti attualmente sul mercato. Esempi non esaustivi degli agenti aggiuntivi adatti includono in particolare i farmaci appartenenti al gruppo di: mitomicina C, cisplatino, etoposide, vincristina, doxorubicina, isotretinoina e ciclofosfamide.

La combinazione pu? essere somministrata come composizione separata (simultanea, sequenziale) dei singoli componenti del trattamento o come un?unica forma di dosaggio contenente entrambi gli agenti. Quando i composti della presente invenzione sono in combinazione con altri principi attivi, i principi attivi possono essere formulati separatamente in preparazioni ad un unico ingrediente di una delle forme sopra descritte e quindi dati come preparazioni combinate, che sono somministrate contemporaneamente o diverse volte, o possono essere formulati insieme in preparazione a due o pi? ingredienti.

I composti di formula generale I, II, III e IV possono essere somministrati ad un paziente in una dose giornaliera totale di, per esempio, da 0,001 a 1000 mg/kg di peso corporeo al giorno. Le composizioni delle unit? di dosaggio possono contenere quantit? di sottomultipli della stessa per compensare la dose giornaliera. Il composto pu? anche essere somministrato settimanalmente o qualsiasi altro giorno. La determinazione dei dosaggi ottimali per un particolare paziente ? ben noto agli esperti del ramo. Come ? prassi comune, le composizioni sono normalmente accompagnate da istruzioni per l'uso scritte o stampate nel trattamento in questione. L'invenzione verr? ora illustrata per mezzo di esempi non limitanti con riferimento alle seguenti figure:

Figura 1. Struttura molecolare di PP2, Dasatinib e dei composti Si34, Si214, Si192 e Si34. Figura 2. Inibitore Si192 in complesso con cSrc wild-type (codice PDB: 4O2P). Viene visualizzata la densit? elettronica sperimentale di Si192 a 2.1 ? di risoluzione (mappa 2fo-Fc sagomata a 1?). Il dominio chinasico ? nella conformazione attiva DFG-in e le interazioni a legame idrogeno attive dell'inibitore con Thr338 (gatekeeper) e di conseguenza lo scheletro dell'ammide Met341 sono illustrate come linee tratteggiate rosse. Regione cerniera (arancione), elica C (turchese), DFG-motif (rosa) e inibitore Si192 (bastoncini gialli).

Figura 3. A) Catena A (magenta) e B (acquamarina) del cristallo allineate tra loro. Le differenze tra le due conformazioni sono state osservate a livello del loop di attivazione, elica ?C ed il loop P. B) Catena A (magenta) e B (acquamarina) utilizzato per i calcoli MC/FEP. I residui mancanti nella struttura cristallina sono stati modellati.

Figura 4. Pannello A: risoluzione analitica HPLC del composto racemico Si192 su Chiralcel OD ad un flusso di 0,8 ml/min con una fase mobile n-esano/2-propanolo con 5% di acetonitrile 90:10 (v/v) (Rt1=31.33 min, Rt2=36.22 min); Pannello B e C: repliche analitiche HPLC su singolo enantiomero separato su Chiralcel OD con flusso di 0,8 ml/min ed una fase mobile n-esano/2-propanolo con 5% di acetonitrile (90:10 v/v).

Figura 5. spettri CD (metanolo, temperatura ambiente) degli enantiomeri di Si192 ottenuti dalla separazione della miscela racemica. Il primo eluato ? blu e il secondo ? rosso.

Figura 6. Valutazione della crescita delle cellule SH-SY5Y coltivate come sferoide in presenza di 1 ?M di Si306. L'area media di sferoide ? stata calcolata a 24, 48 e 72 ore come descritto nella sezione sperimentale. Immagini rappresentative delle colture cellulari al punto finale prese dal microscopio a contrasto sono visualizzate sulla destra. *p <0,01 secondo test t-Student. CTR = controllo trattato con il veicolo.

Figura 7. L'analisi della distribuzione del ciclo cellulare delle cellule SH-SY5Y dopo il trattamento con 0,1 ?M di Dasatinib e concentrazioni crescenti di Si306. Lo stato delle cellule SH-SY5Y ? stata studiato tramite la citofluorimetria dopo colorazione con propidio ioduro ed i risultati sono stati espressi come percentuale di cellule in ogni fase del ciclo cellulare rispetto a cellule vitali totali. L'apoptosi ? stata valutata calcolando il numero di cellule ipodiploidi ed ? stata espressa come percentuale di cellule apoptotiche rispetto alle cellule totali (vitali e cellule morte). I risultati sono la media di tre esperimenti differenti. *p<0,01 rispetta il valore delle cellule non trattate.

Figura 8. Valutazione dell'effetto antitumorale di Si306. A) L'inibizione della crescita tumorale da trattamento con Si306 (50 mg / kg) o Dasatinib (50 mg / kg) in un modello di roditore di NB. Gli xenotrapianti tumorali sono stati monitorati misurando i diametri della massa tumorale. B) Effetto anti-angiogenico di Si306 valutato mediante test di germinazione con le cellule endoteliali. L?istogramma mostra il numero medio di germogli per sferoide per ogni condizione sperimentale (CTR = cellule non trattate). Immagini rappresentative vengono visualizzate sulla destra. *p<0,01 secondo test t-Student. CTR = controllo trattati con il veicolo.

Figura 9. Numero di cellule U251, espresso in percentuale rispetto a cellule non trattate. Cellule U251 sono state trattate per 72 ore con 5 ?M e 30?M di Si306. Per ogni punto sperimentale ? indicata la percentuale di cellule vitali e morte.

Figura 10. Numero di cellule U87, espresse in percentuale rispetto a cellule non trattate. Le cellule U87 sono state trattate per 72 ore con 5 ?M e 30?M di Si306. Per ogni punto sperimentale ? indicata la percentuale di cellule vitali e morte.

Figura 11. (A) istogrammi del peso dei tumori. I tumori sono stati asportati da modelli in vivo di GBM ottenuti inoculando cellule U87 sottocute in topi immunodeficienti. I topi sono stati trattati una volta con radiazioni (RX, 4Gy) e a giorni alterni con 50 mg/kg di Si306 (306) per 30 giorni. (B) Sono mostrate immagini rappresentative di tumori asportati. CTR = controllo trattato con il veicolo. Trattamento con RX ha indotto una riduzione di circa il 40% (contro circa il 5% in Ctr). Si306 induce una riduzione di circa il 50% (contro circa il 5% in Ctr). Il trattamento combinato (radiazione Si306) ha indotto una riduzione di circa dell'80% (vs Ctr circa 5%).

Figura 12. Numero di colonie formate da cellule U87 dopo il trattamento con radiazioni (RX, 4Gy) e 1 ?M e 10 ?M Si306. CTR = controllo trattato con il veicolo.

Figura 13. Numero di cellule U87 espresso in percentuale rispetto a cellule non trattate. Cellule U87 sono state trattate per 72 ore con 10?M Si306 e concentrazioni crescenti di mitomicina C (0,02-20 ?M). CTR = controllo trattato con veicolo.

Figura 14. Numero di cellule U251, espresso in percentuale rispetto alle cellule non trattate. Cellule U251 sono state trattate per 72 ore 10?M Si306 e concentrazioni crescenti di mitomicina C (0,02-20 ?M). CTR = controllo trattato con il veicolo.

Figura 15. Biodistribuzione ottenuta mediante iniezione intraperitoneale di composto (Si306 e proSi306) 50 mg/kg in topi Balb/c. L'area inquadrata mostra la quantit? di proSi306 e Si306 (derivato dall'idrolisi del proSi306) trovata in cervello e plasma dei topi trattati solo con Si306. Le barre (*) rappresentano la quantit? di farmaco Si306 trovato nel cervello e plasma dei topi trattati con il farmaco libero Si306. Gli esperimenti sono stati eseguiti in quadruplicato. Le misurazioni sono state effettuate dopo 24 ore di trattamento. I campioni sono stati analizzati mediante HPLC-UV-MS.

Figura 16. Si308 e Si309 inibiscono la fosforilazione mediata da A?42- della Tyr17-Tau nelle cellule differenziate SH-SY5Y. L?analisi Western blot della fosforilazione mediata da A?42-della Tyr17-Tau ? stata eseguita dopo 1.5 (A) o (C) 6 ore dalla somministrazione di differenti quantit? di composti Si308 e Si309. (B) e (D), i dati sono stati quantificati mediante chemiluminescenza. Gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia, le barre di errore rappresentano ? SEM.

ESEMPIO 1

Sintesi dei composti e loro caratterizzazione

1.1 Struttura cristallografica e studi computazionali

L?inibitore Si192 ? stato co-cristallizzato con c-Src in condizioni simili a quelle precedentemente riportate da Michalczyk et al.<58 >In breve, le concentrazioni finali di 540 micro-molare di inibitore (soluzione madre 100 mM in DMSO) e 180 micromolare dell?enzima c-Src wild type (conservato in 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolo (v / v)) sono state pre-incubate per 1 h in ghiaccio per indurre la formazione del complesso enzima-inibitore prima della cristallizzazione. I cristalli sono stati accresciuti con il metodo goccia sospesa a 20 ?C dopo miscelazione di 1 ?L di soluzione proteina-inibitore con soluzione standard (0-30 mM NaCl, pH 7,0, 9-20% di glicole etilenico). Tutti i cristalli sono stati congelati con ulteriore aggiunta di 30% (v/v) di glicerolo. I dati di diffrazione dei cristalli dei complessi c-Src-Si192 sono stati raccolti al PX10SA dello Swiss Light Source (PSI, Villingen, Svizzera) a una risoluzione di 2.1 ?, usando lunghezze d'onda vicina a 1?. Il set di dati ? stato elaborato con XDS60 e scalato utilizzando XSCALE.<59-60>

Determinazione e Affinamento della struttura del complesso c-Src-Si192. La struttura del complesso c-Src-inibitore ? stata risolta con il metodo della sostituzione molecolare con il software PHASER<61 >utilizzando la struttura di c-Src 2OIQ<62 >come modello. Le due molecole di c-Src nell'unit? asimmetrica sono state modificate manualmente utilizzando il programma COOT.<63 >Il modello ? stato affinato con CNS<64 >usando il metodo ?simulated annealing? per rimuovere eventuali distorsioni del modello. L'affinamento finale ? stato effettuato con REFMAC5.65 I files di topologia dell?inibitore sono stati generati utilizzando il server Dundee PRODRG2.<66 >Le strutture rifinite sono state validate con PROCHECK.<67 >Dati dettagliati, sull?affinamento, e le statistiche Ramachandran sono forniti in Tabella 1.

Tabella 1: Raccolta dei dati e statistiche di rifinitura per c-Src wild type in complesso con Si192

<a >

I dati di diffrazione sono stati usati da un singolo cristallo per determinare la struttura del complesso. I valori tra parentesi si riferiscono alla struttura di massima risoluzione.

Computer Modeling

Protocollo di loop modeling.

Come query ? stata utilizzata la sequenza FASTA di c-Src, le coordinate delle due catene della struttura cristallina degli inventori (c-Src complessata con Si192) erano a loro volta impiegate come modelli ed i residui mancanti sono stati costruiti utilizzando il programma Prime.<68>

Per ogni catena, il metodo di campionamento seriale del loop ? stato applicato scegliendo "Extended" come livello di accuratezza (consigliato per per un loop lungo tra 6 e 11 residui) e per l'analisi successiva ? stata salvata la conformazione ad energia pi? bassa.

Analogamente, per riempire il loop-A della catena B ? stato utilizzato Prime costruendo il residuo mancante Cys277 e gli amminoacidi 300 e 301 assenti nella catena A.<69 >Il numero massimo di strutture da restituire ? stato fissato a 10. ? stato applicato un cut-off di energia pari a 10 kcal/mol. Le conformazioni del loop sono state raggruppate e sono stati selezionati dei rappresentanti per ogni cluster. Infine ? stato selezionata la struttura migliore del loop secondo lo score.

Monte Carlo/perturbazione dell?energia libera

I calcoli MC/FEP sono stati effettuati con il programma MCPRO seguendo i protocolli standard.<70,71 >Le Z-Matrix per i complessi di c-Src-ligando sono state ottenute con il programma di crescita molecolare BOMB<70 >a partire dalla posa di Si192 all'interno della struttura cristallina degli inventori (codice PDB: 4O2P). I modelli includevano 160 residui amminoacidici pi? vicini al ligando. Sono state effettuate brevi minimizzazioni gradienteconiugate sulle strutture iniziali per tutti i complessi per ridurre eventuali contatti sfavorevoli. Le coordinate per i ligandi liberi sono state ottenute mediante estrazione dai complessi. Successivamente, sui ligandi ? stata effettuata l?analisi di ricerca conformazionale a 1500 step utilizzando il programma BOSS72 con il campo di forza OPLS/CM1Ax e idratazione GB/SA. Per il calcolo FEP, ? stato utilizzato il conformero risultante con l?energia pi? bassa. I ligandi ed i complessi dissociati sono stati solvatati con sfere di acqua TIP4P ("cap") con un raggio di 25 ?. Le molecole di acqua a stretto contatto con gli atomi del soluto sono state rimosse. Alcune catene laterali remote sono state neutralizzate per mantenere la neutralit? complessiva richiesta per ogni sistema. Durante le simulazioni MC sono stati campionatI le catene laterali della proteina ed il ligando entro 10 ? da qualsiasi altro ligando. Gli unici vincoli sono stati le lunghezze dei legami nelle catene laterali, e tutti gli atomi dello scheletro sono stati congelati dopo una breve minimizzazione gradiente-coniugata. Le energie dei sistemi sono state valutate con i campi di forza OPLS-AAX per la proteina, e OPLS/CM1Ax per i ligandi. Le cariche atomiche CM1A per le molecole neutre sono state regolate a 1,14. Le differenze nelle energie libere di legame sono state determinate dal normale ciclo termodinamico che richiede la conversione di un ligando in un altro sia in forma libera in acqua che legato alla proteina. I calcoli FEP hanno utilizzato 11 finestre di campionamento di sovrapposizione semplice.Per il ligando libero, ogni finestra era costituita da 40 M di configurazioni di equilibrio e 60 M di configurazioni per il calcolo della media. Per i calcoli della forma legata ciascuna finestra copriva 20 M configurazioni per la equilibrazione del solvente, 40 M configurazioni per la equilibrazione totale e 50 M configurazioni per il calcolo della media. Nel caso della scansione del legame alogeno il numero di configurazioni ? stato aumentato a 60 M di equilibrazione e 80 M di media. Tutte le simulazioni MC sono state eseguite a 298 K.

Struttura raggi X e Studi Computazionali

Per ottenere una maggiore comprensione strutturale riguardo il legame dei derivati C6 sostituiti, gli inventori hanno determinato la struttura cristallina del complesso del dominio chinasico di c-Src (aa 256-533) ed il composto Si192. I dati di diffrazione sono stati raccolti con una risoluzione di 2,1 ? e la successiva elaborazione e raffinazione dei dati ha mostrato all'interno dell'unit? cella cristallografica due molecole proteiche, che in questo lavoro verranno indicate come la catena A e catena B. L?analisi comparativa della struttura proteinaligando empiricamente determinata e quella degli studi di docking precedentemente eseguiti hanno illustrato modalit? di legame coincidenti di Si192 nei confronti di c-Src (Figura 2).<20 >Il sostituente C4 anilinico e la catena laterale in N1 sono localizzate all?interno delle zone idrofobiche rispettivamente I e II. Inoltre, la struttura a raggi X ha confermato la presenza di due legami idrogeno predetti, uno che coinvolge il gruppo amminico in C4 che interagisce con la catena laterale di Thr338 e l?altro, N2 dello scaffold pirazolopirimidinico che instaura dei contatti con lo scheletro della Met341. Sorprendentemente, lo stesso tipo di legame ? stato osservato per il composto Si192 all'interno della tasca di legame dell'ATP di ogni catena. Tuttavia, nonostante molti dei residui del loop di attivazione fossero poco definiti (da 413 a 424 per la catena A e da 411 a 424 per la catena B) sono state osservate differenze significative tra le due catene nel loro riarrangiamento 3D di tale loop flessibile (aa 402-423 ) come anche nella posizione dell?elica-?C (aa 303-318) e nella conformazione del loop ricco di glicina (aa 273-281) (Figura 3A).<75 >In particolare, nella catena A, la catena laterale della Glu310 si proietta lontano dal sito di legame per l?ATP adottando una conformazione simile a quella della cSrc chiusa ed inibita fosforilata su Tyr527. (codice PDB: 2SRC)<75 >Contrariamente, nella catena B, Glu310 mostra la sua catena laterale rivolta verso il sito attivo formando un ponte salino con Lys295, tipico delle chinasi attive. Inoltre, nella catena A, gli amminoacidi risolti del loop di attivazione (Phe405-Asp413) sono disposti in una alfa elica three-turn in modo simile ma non identico come nella c-Src fosforilata (codice PDB: 2SRC).<75 >Viceversa, il loop di attivazione determinato della catena B richiama quello risolto per la conformazione attiva di c-Src (codice PDB: 1Y57).<76 >Un'altra differenza significativa tra le catene A e B risiede nell'orientamento del motivo DFG: nella catena A Glu404 proietta la sua catena laterale profondamente nel sito di legame dell?ATP, riducendo cos? le dimensioni della tasca idrofobica I che ospita il sostituente C4. La plasticit? strutturale di c-Src in presenza di piccole molecole inibitrici ? stata recentemente descritta.<77 >Per tener conto delle differenze conformazionali, entrambe le catene sono state utilizzate in tutti i successivi studi computazionali. Un protocollo di modellistica molecolare ? stato applicato per la prima volta per riempire i residui mancanti (per dettagli vedere la sezione sperimentale sopra) e le due catene raffinate sono state allineate tra loro (Figura 3). Partendo da queste strutture completate, l'ottimizzazione di Si192 ? stata eseguita con un approccio computazionale , guidato principalmente dai risultati dei calcoli Monte Carlo Free-Energy Perturbation (MC/FEP).<78 >In particolare, anche se per la preparazione della struttura cristallina a raggi X ? stata utilizzata la miscela racemica di Si192, solo l?enantiomero R ? stato trovato in grado di impegnare il sito attivo chinasico in entrambe le catene, questo ha spinto gli studi degli inventori verso ulteriori indagini sul centro chirale. Non sono state osservate differenze nelle attivit? dei due enantiomeri contro c-Src (vedi l'attivit? biologica in vitro nel paragrafo di seguito, Tabella 6).

Successivamente gli inventori si sono concentrati sull'anello anilino C4 al fine di ottimizzare l'attivit? di Si192 aumentando l'affinit? per la chinasi c-Src.

Sono state effettuate scansioni MC/FEP alogeno (cloro, bromo e fluoro) e ossidrile per identificare i siti e gruppi pi? promettenti per sostituire gli idrogeni anilinici di C4. Nei calcoli presenti le posizioni orto 2,6 e le posizioni meta 3,5 non sono equivalenti in quanto non interconvertono durante le simulazioni MC richiedendo simulazioni separate per ogni conformero. Secondo la numerazione sull'anello nella Tabella 2, la sostituzione dell?idrogeno con OH ? stato predetto di essere favorevole (energia libera di legame positiva, ??Gb) da 5,11, 4,89, 1,49 kcal/mol per C2, C3 e C4, rispettivamente, e sfavorevole per C5 e C6 (??Gb di -6,68 e -5,08 kcal/mol, rispettivamente) in caso in cui i complessi iniziali sono stati costruiti utilizzando la catena B.

Tabella 2. Risultati MC/FEP per la variazione di energia libera di legame con l'introduzione dei sostituenti cloro, bromo, fluoro e idrossile sull'anello C4 anilinico all'interno della Catena B.

<a>??Gb ? la variazione dell?energia libera di legame calcolata (kcal/mol) per introdurre i sostituenti; ? ? ? l?incertezza calcolata.

Valori di ??Gb positivi sono stati trovati anche con l'introduzione di cloro, bromo o fluoro sul C2 (4,8, 1,28 e 1,96 kcal/mol, rispettivamente). Al contrario, nella catena A l'entit? di tali sostituzioni ? risultata ad essere sfavorevole con ??Gb negativo (Tabella 3).

Tabella 3. risultati MC / FEP per la variazione di energia libera di legame con l'introduzione del cloro, bromo, fluoro e idrossile sull'anello C4 anilinico all'interno della catena A

Tenendo conto dei risultati MC/FEP, ? stata sintetizzata una libreria mirata di derivati pirazolo[3,4-d]pirimidinici recanti un sostituente m-OH sull'anello anilinico C4 per aumentare sia la solubilit? in acqua che l?affinit? di legame per c-Src dei composti studiati. Inoltre, sono stati sintetizzati e testati in saggi enzimatici analoghi sostituiti con bromo, cloro e fluoro in posizione meta per allargare le relazioni struttura-attivit? (Tabella 4), nonostante le previsione di possibili risultati sfavorevoli. Per quanto riguarda queste ultime sostituzioni, ? stata studiata anche la possibilit? di legame ad alogeno tra gli inibitori degli inventori ed il sito di legame ATP tramite la scansione del legame alogeno sia sulla catena A e B considerando i sostituenti m-Br e m-Cl (Tabella 4).

Tabella 4. Scansione del legame alogeno per gli atomi di cloro e bromo, sulle catene A e B

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Durante le simulazioni sulla catena B ? stato trovato un effetto marginale di interazione alogeno per i sostituenti cloro e bromo in posizione C5 (1,14 e 0,35 kcal/mol, rispettivamente), mentre i risultati negativi sono stati ottenuti nel caso di utilizzo della catena A. Il contributo del legame alogeno positivo calcolato ? dovuto all'interazione di Cl o Br, con lo scheletro carbonilico di Ile336, agendo come base di Lewis. Tuttavia, questo contributo ha soltanto un effetto limitato sull?energia totale libera di legame calcolata per l'introduzione di bromo o cloro in posizione meta sul gruppo anilinico C4, che rimane ancora generalmente negativo. In sintesi, l'analisi dei risultati MC/FEP hanno chiaramente evidenziato che l?affinit? di legame per c-Src pu? essere aumentata sostituendo l'idrogeno con un gruppo ossidrile in posizione 3 dell'anello anilinico in C4. Questa sostituzione consente la stabilizzazione del complesso tra la conformazione attiva di c-Src e le pirazolo[3,4-d]pirimidine qui studiate. L'interazione a legame idrogeno tra il gruppo 3-OH del ligando e la catena laterale Glu310, generalmente coinvolto nella formazione di un ponte salino con Lys295, d? indubbiamente un contributo importante all'affinit? di legame. D'altra parte, introduzioni di un gruppo ossidrile o alogeni in posizione 2 sono state previste come sostituzioni favorevoli e saranno quindi sottoposti a studi futuri da parte degli inventori.

1.2-Chimica: Materiali e Metodi

I materiali di partenza sono stati acquistati da Aldrich-Italia (Milano, Italia). I punti di fusione sono stati determinati con un apparecchio B?chi 530 e non sono corretti. Gli spettri IR sono stati misurati con spettrofotometro Perkin-Elmer 398 in KBr o CHCl3. Gli spettri <1>H NMR sono stati registrati sullo spettrometro Bruker Avance DPX400 a 400 MHz in CDCl3 o (CH3)2SO.

Gli spostamenti chimici sono riportati come ? (ppm) rispetto al TMS come standard interno, le J in Hz. I segnali <1>H sono descritti utilizzando le seguenti abbreviazioni: s = singoletto, d = doppietto, t = tripletto, q = quartetto, quint = quintetto, sx = sestetto, sept = settetto, m = multipletto, br = segnale largo, br s = singoletto ampio. Le TLC sono state effettuate su gel di silice Merck 60 F254. Le purificazioni cromatografiche sono state eseguite su colonne impaccate con gel di silice Merck 60 230-400 mesh con il metodo flash. Le analisi elementari sono state determinate con un analizzatore elementare EA 1110 (Fison -Instruments, Milano, Italia) e la purezza di tutti i composti sintetizzati analizzati era >95%.

Gli spettri di massa sono stati ottenuti con il sistema Agilent 1100 LC/MSD VL (G1946C) con un flusso di 0.4 mL/min utilizzando un sistema binario di solventi 95:5 metanolo/acqua. Il rilevamento UV ? stato monitorato a 254 nm. Gli spettri di massa sono stati acquisiti in modalit? positive ES (+) e negative ES (-) con modalit? di scansione nel range 50-1500 m/z. Sono stati utilizzati i seguenti parametri di sorgente di ioni: flusso del gas essiccamento, 9 ml/min; pressione del nebulizzatore, 40 psig; temperatura del gas essiccazione, 350 ? C.

Nella presente invenzione sono utilizzate le seguenti abbreviazioni:

Eccetto dove diversamente indicato, tutte le temperature sono espresse in ?C (gradi centigradi) o K (Kelvin).

Le rese sono state calcolate ipotizzando che i prodotti fossero puri al 100%, se non diversamente indicato.

I composti (SI o Si sono equivalenti) Si192, Si181, Si319, Si320, Si321, Si328, Si315, Si316, Si317, Si318, Si322, Si331, Si188, Si189, Si190, Si323, Si171, Si170, Si330, Si176, Si174, Si138, Si135, Si109, Si180, Si182, Si34, Si39, Si1001, Si1003 sono stati sintetizzati utilizzando procedure precedentemente riportate da noi, e gli intermedi 6, 7, 8, 12, 16, 24a-b, 24a-b, Si58 e 26 sono stati gi? riportati da noi.<18,20,21,22,23>

Separazione degli enantiomeri (Fig. 4 e 5)

Separazione chirale del racemo Si192

Strumentazione

Gli studi di separazione chirale sono stati effettuati su un sistema Varian Prostar HPLC (Varian Analytical Instruments, USA) equipaggiato con una pompa binaria con una valvola di iniezione manuale e un modello Prostar 325 Detector UV-VIS. La rilevazione CD ? stata effettuata utilizzando uno spettropolarimetro Jasco CD-815 (Jasco Corporation, Tokyo, Giappone). Le rotazioni ottiche sono state determinate con un polarimetro Perkin Elmer-Mod 343 a 589 nm, utilizzando una microcella 10<-1 >dm. Le concentrazioni sono espresse come g mL<-1>.

Colonne enantioselettive e sostanze chimiche

La colonna polisaccaridica era costituita da cellulosa tris-3,5-dimetilfenilcarbammato (250 mm x 4,6 millimetri, Chiralcel OD) ricoperta con 10 micron di gel di silice. La colonna chirale ? stata ottenuta da Daicel (Tokyo, Giappone). Tutti i solventi e i reagenti sono stati acquistati da Sigma Aldrich Srl (Milano, IT).

LC (Cromatografia Liquida) condizioni enantioselettive

La separazione cromatografica ? stata effettuata a temperatura ambiente con fase mobile nesano/2-propanolo- con acetonitrile al 5%, 90:10 (v/v). Il rilevamento ? stato effettuato a 280 nm. Il volume di iniezione era di 20 ?l. A partire da 10 mg di racemo sono stati ottenuti: 4 mg di Si192 (R) (tR: 31'33 '') e 4 mg di Si192 (S) (tR: 36'20 '') (Figura 4).

Condizioni CD (dicroismo circolare)

Gli spettri CD sono stati acquisiti con uno spettrometro Jasco J-815 con array di dati lineari, due accumuli e con velocit? di scansione di 100 nm min<-1>. Una cella di quarzo con cammino ottico di 1,0 millimetro ? stato utilizzata e gli spettri CD sono stati registrati a temperatura ambiente. Gli spettri CD ottenuti dai composti eluiti dalla separazione della miscela racemica sono stati acquisiti nell'intervallo 190-400 nm. Gli enantiomeri puri sono stati sciolti in metanolo per ottenere soluzioni 0,001 mol L<-1>. ? stata fatta la media di tre scansioni e il bianco sottratto per ottenere lo spettro CD (Figura 5).

Tutti i composti possedevano una purezza ?95% come verificato mediante analisi elementare per confronto con i valori teorici.

[2-(4-Fluorofenil)etil]idrazina (2).

Una soluzione di 1-(2-bromoetil)-4-fluorobenzene 1 (5 g, 24,6 mmol) in

isopropanolo (10 mL) ? stata aggiunta goccia a goccia ad una soluzione di idrazina monoidrato (10 mL, 206,2 mmol) in isopropanolo (200 mL) e la reazione ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 10 h. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, l?eccesso di idrazina e di solvente sono stati rimossi a pressione ridotta. Poi ? stata aggiunta una soluzione di KOH al 40% (10 mL) e la fase acquosa ? stata estratta con dietil etere (3 x 15 mL). Le fasi organiche sono state a loro volta lavate con H2O (2 x 15 mL), anidrificate (MgSO4), ed evaporate a pressione ridotta per ottenere un olio che ? stato purificato per distillazione, ottenendo 2 come olio giallo pallido (3,1 g, 81%),che ? stato usato come grezzo nel passaggio successivo.

Etil 5-ammino-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-1H-pirazolo-4-carbossilato (3).

Una soluzione di [2-(4-fluorofenil)etil]idrazina 2 (1,54 g, 10 mmol) e

etil(etossimetilene)cianoacetato (1,69 g, 10 mmol) in toluene anidro (30 mL) ? stata riscaldata a 80 ?C per 8 h. La soluzione ? stata concentrate a pressione ridotta alla met? del volume e lasciata raffreddare a temperature ambiente. Il solido giallo pallido ottenuto ? stato filtrato e ricristallizzato in toluene per ottenere il composto desiderato 3 come solido bianco (2,16 g, 78 %); pf: 129-131 ?C . <1>H NMR (CDCl3): ? 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 3.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2Ar), 4.05 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2N), 4.16 (q, J = 7.2 Hz, 2H, CH2O), 4.36 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 6.94-7.35 (m, 4H Ar), 7.65 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3426, 3293 (NH2), 1678 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >278. Anal. (C14H16N3O2F) C, H, N.

Etil 5-{[(benzoilammino)carbotio-il]ammino}-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-1H-pirazolo-4-carbossilato (4).

Una soluzione di etil 5-ammino-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-1H-pirazolo-4-

carbossilato 3 (500 mg, 1,8 mmol) e benzoilisotiocianato (0,97 mL, 7,2 mmol) in THF anidro (10 mL) ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 12 h. Dopo raffreddamento a temperauta ambiente, il solvente ? stato rimosso a pressione ridotta e il grezzo cristallizzato come solido bianco per aggiunta di dietil etere (20 mL) (713 mg, 90%); pf: 185-187 ?C. <1>H NMR (CDCl3): ? 1.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 3.20 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2Ar), 4.12-4.34 (m, 4H, CH2O CH2N), 7.00-7.98 (m, 9H Ar), 7.98 (s, 1H, H-3), 9.32 (s, 1H, NH scompare con D2O), 11.80 (s, 1H, NH, scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3367, 3127 (NH), 1706 (COOEt), 1662 (CONH) MS: m/z [M+1]<+ >441. Anal. (C22H21N4O3FS) C, H, N, S.

1-[2-(4-Fluorofenil)etil]-6-tioxo-1,5,6,7-tetraidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one (5).

Una soluzione di etil 5-{[(benzoilammino)carbotio-il]ammino}-1-[2-(4-

fluorofenil)etil]-1H-pirazolo-4-carbossilato 4 (600 mg, 1,36 mmol) in NaOH 2N(10 mL) ? stata mantenuta alla temperatura di riflusso per 10 min, poi diluita con H2O (10 mL) e acidificata con acido acetico glaciale. Dopo12 h a 4 ?C, il solido cristallizzato ? stato filtrato e ricristallizzato in etanolo assoluto per dare 1-[2-(4-fluorofenil)etil]-6-tioxo-1,5,6,7-tetraidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one 5 come solido bianco (249 mg, 63%);pf: 257-259 ?C. <1>H NMR (CDCl3): ? 3.22 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2Ar), 4.25 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2N), 7.06-7.51 (m, 4H Ar), 7.96 (s, 1H, H-3), 9.28 (s, 1H, NH scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3400-3300 (NH), 1694 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >291. Anal. (C13H11N4OFS) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi dei composti 9, 10, 11.

Una miscela di1-sostituito 6-tioxo-1,5,6,7-tetraidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one e 5 o 6 o 7 (1 mmol) con 4-(2-cloroetil)morfolina (224 mg, 1,5 mmol), NaOH (40 mg, 1 mmol) in DMF anidra (1 mL) ed etanolo assoluto (3 mL) ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a riflusso per 6 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente, il solvente ? stato evaporato a pressione ridotta e la miscela ? stata purificata in acqua fredda (20 mL).Il solido ottenuto ? stato filtrato, lavato con acqua e ricristallizzato in etanolo assoluto.

1-[2-(4-Fluorofenil)etil]-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1,5-diidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one (9).

Solido bianco (347 mg, 86%); pf: 213-215 ?C . <1>H NMR

(CDCl3): ? 2.42-2.68 (m, 4H, 2CH2N morf.), 2.77-2.83 (m, 2H, CH2N), 3.15-3.22 (m, 4H, CH2S CH2Ar), 3.75-3.83 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.45 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2N piraz.), 7.08-7.23 (m, 4H Ar), 8.02 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3400-2800 (NH), 1667 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >404. Anal. (C19H22N5O2FS) C, H, N, S.

6-[(2-Morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-feniletil)-1,5-diidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one (10).

Solido bianco (197 mg, 51%); pf: 197-198 ?C. <1>H NMR

(CDCl3): ? 2.55-2.70 (m, 4H, 2CH2N morf.), 2.80-2.84 (m, 2H, CH2N), 3.17-3.24 (m, 4H, CH2S CH2Ar), 3.80-3.85 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2N piraz.), 7.10-7.26 (m, 5H Ar), 8.02 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3500-2800 (NH), 1667 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >386. Anal. (C19H23N5O2S) C, H, N, S.

6-[(2-Morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-fenilpropil)-1,5-diidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one (11).

Solido bianco (200 mg, 50%); pf: 128-130 ?C.<1>H NMR (CDCl3):

? 1.24 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CH3), 2.60-2.70 (m, 4H, 2CH2N morf.), 2.80-2.90 e 3.15-3.25 (2m, 4H, SCH2CH2), 3.45-3.52 (m, 1H, CHCH3), 3.80-4.00 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.38-4.40 (m, 2H, CH2N piraz.), 7.18-7.28 (m, 5H Ar), 7.99 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3450-2900 (NH), 1678 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >400. Anal. (C20H25N5O2S) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi dei composti 13, 14, 15.

Il complesso di Vilsmeier , precedentemente preparato da POCl3 (0.74 mL, 8 mmol) e DMF anidra (590 mg, 8 mmol) ? stato aggiunto alla sospensione di 9, 10, 11 o 12 (1 mmol) in CH2Cl2 (10 mL). La miscela ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 6-12 h. Per i composti 14 e 15, la soluzione ? stata lavata con una soluzione di NaOH 4N (2 x 10 mL), acqua (2 x 10 mL), anidrificata (MgSO4), filtrata,e concentrata a pressione ridotta. L?olio ottenuto ? stato purificato mediante cromatografia (Florisil<?>, 100-200 mesh) usando dietil etere come eluente, ottenendo il prodotto puro.

4-Cloro-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-6-[(2-mofolin-4-il-etil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (13).

Solido bianco (363 mg, 86%); pf: 101-102 ?C. <1>H NMR

(CDCl3): ? 2.50-2.85 (m, 6H, 2CH2N morf. CH2N), 3.24 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2Ar), 3.33-3.45 (m, 2H, SCH2), 3.67-3.84 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2N piraz.), 7.00-7.33 (m, 4H Ar), 8.04 (s, 1H, H-3). MS: m/z [M+1]<+ >423. Anal. (C19H21N5OClFS) C, H, N, S.

4-Cloro-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (14).

Olio giallo (323 mg, 80%).<1>H NMR (CDCl3): ? 2.51-2.90 (m,

6H, 2CH2N morf. CH2N), 3.22 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2Ar), 3.30-3.40 (m, 2H, SCH2), 3.68-3.88 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.62 (t, J = 7.2 Hz, 2H, CH2N piraz.), 7.09-7.26 (m, 5H Ar), 8.01 (s, 1H, H-3). MS: m/z [M+1]<+ >405. Anal. (C19H22N5OClS) C, H, N, S.

4-Cloro-6-[(2-morfolin-4-il-etil)thio]-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (15).

Olio giallo (288 mg, 69%). <1>H NMR (CDCl3): ? 1.22 (d, J = 6.8

Hz, 3H, CH3), 2.50-2.66, 2.73-2.82, 3.26-3.41 e 3.45-3.58 (4m, 8H, 2CH2N morf. SCH2CH2), 3.68-3.85 (m, 5H, 2CH2O morf. CHCH3), 4.40-4.56 (m, 2H, CH2N piraz.), 7.07-7.30 (m, 5H Ar), 7.96 (s, 1H, H-3). MS: m/z [M+1]<+ >419. Anal. (C20H24N5OClS) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi dei composti Si303, Si313, Si314, Si307, Si327, Si306. L?anilina adeguata (2 mmol) ? stata aggiunta alla soluzione del 4-cloro derivato 13, 14, 15 o 16 (1 mmol) in etanolo assoluto (5 mL), la miscela ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 3-5 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente, il solido ottenuto ? stato filtrato, lavato con acqua, e ricristallizzato in etanolo assoluto.

N-(3-Clorofenil)-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si303).

Solido bianco (233 mg, 47%); pf: 235-237 ?C.<1>H NMR (CDCl3):

? 2.88-2.95 (m, 4H, 2CH2N morf.), 3.15 (t, J = 7.0, 2H, CH2Ar), 3.22-3.30 (m, 2H, CH2N), 3.69-3.74 (m, 2H, SCH2), 4.00-4.49 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.64 (t, J = 7.0, 2H, CH2N piraz.), 7.16-7.38 (m, 9H Ar), 7.51 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3300-3100 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >496. Anal. (C25H27N6OClS) C, H, N, S.

6-[(2-Morfolin-4-il-etil)tio]-N-fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si313).

Solido bianco (332 mg, 70%); pf: 212-213 ?C.<1>H NMR (CDCl3):

? 1.14 (d, J = 6.8 Hz, 3H, CH3), 2.80-3.00 (m, 2H, SCH2), 3.20-3.45, 3.46-3.60, 3.72-3.85 e 4.02-4.15 (4m, 11H, 4CH2 morf. CH2N CHCH3), 4.30-4.44 (m, 2H, CH2N piraz.), 6.70-6.81 e 7.07-7.35 (2m, 10H Ar), 7.49 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3500-2800 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >476. Anal. (C26H30N6OS) C, H, N, S.

N-(3-Fluorofenil)-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ammina (Si314).

Solido bianco (182 mg, 37%); pf: 236-237 ?C. <1>H NMR

(CDCl3): ? 1.24 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 2.08-2.60, 2.78-3.17, 3.27-3.74 e 3.97-4.38 (4m, 13H, SCH2 + 4CH2 morf. CH2N CHCH3), 4.40-4.50 (m, 2H, CH2N piraz.), 5.90-6.40 e 7.03-7.50 (2m, 10H, 9 Ar H-3), 9.33 (br s, 1H, NH, scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3450-3100 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >494. Anal. (C26H29N6OFS) C, H, N, S.

N-(3-Clorofenil)-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si307).

Solido giallo pallido (265 mg, 52%); pf: 247-249 ?C. <1>H NMR

([D6]DMSO): ? 1.23 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3), 2.52-2.67, 2.74-2.81, 3.24-3.40 e 3.43-3.59 (4m, 8H, 2CH2N morf. SCH2CH2), 3.65-3.80 (m, 4H, 2CH2O morf.), 3.85-3.90 (m, 1H, CHCH3), 4.40-4.50 (m, 2H, CH2N piraz.), 7.20-7.40 (m, 9H Ar), 7.97 (s, 1H, H-3), 10.40 (br s, 1H, NH scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3450-3100 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >510. Anal. (C26H29N6OClS) C, H, N, S.

N-(3-Clorofenil)-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pyrimidin-4-ammina (Si327).

Solido bianco (159 mg, 31%); pf: 127-128 ?C . <1>H NMR

(CDCl3): ? 2.44-2.69 e 2.80-2.91 (2m, 6H, 2CH2N morf CH2N), 3.14 (t, J = 6.8 Hz, 2H, SCH2), 3.37-3.54 e 3.70-3.82 (2m, 6H, CH2Ar 2CH2O morf.), 4.49 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2N piraz.), 6.87-6.92, 7.05-7.08 e 7.28-7.36 (3m, 9H, 8 Ar H-3). IR (cm<-1>): 1558 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >514. Anal. (C25H26N6OClFS) C, H, N, S.

N-(3-Bromofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-[(2-morfolin-4-il-etil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si306).

Solido bianco (350 mg, 61%); pf: 232-233 ?C.<1>H NMR (CDCl3):

? 2.90-3.99 (m, 12H, 4CH2 morf. CH2N CH2S), 4.63-4.85 e 5.04-5.21 (2m, 2H, CH2N piraz.), 5.55-5.70 (m, 1H, CHCl), 7.03-8.52 (m, 10H, 9 Ar H-3), 11.33 (br s, 1H, NH scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3450 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >575. Anal. (C25H26N6OBrClS) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi dei composti Si332, Si329.

Il 3-amminofenolo (545 mg, 5 mmol) ? stato aggiunto alla soluzione del 4-cloro derivato desiderato 14 o 15 (1 mmol) in etanolo assoluto (10 mL), e la miscela ? stata mantenuta alla temperatura di riflusso per 3-5 h.Dopo raffreddameneto a temperature ambiente , il solvente ? stato evaporato a pressione ridotta ed il grezzo ? stato solubilizzato in etil acetato (10 mL), lavato con una soluzione HCl 0.1N(2 x 10 mL), una soluzione NaOH 1N(10 mL), brine (2 x 10 mL), anidrificata (MgSO4), filtrata, e concetrata a pressione ridotta per ottenere un olio marrone che ? stato cristallizzato a 4 ?C per aggiunta di una miscela 1:1 di dietil etere/etere di petrolio (pe 40-60 ?C). Se necessario, il solido ottenuto ? stato purificato mediante cromatografia usando come eluente CH2Cl2. I composti Si332 e Si329 sono stati ottenuti come sali cloroidrato.

3-{[6-[(2-Morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]ammino}fenol cloroidrato (Si332).

Solido giallo pallido (261 mg, 51%); pf: 261-262 ?C. <1>H NMR

(CDCl3): ? 3.05-3.58 (m, 10H, CH2Ar 2CH2N morf. SCH2 + CH2N), 3.77-3.95 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.57 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2N piraz.), 6.52-6.63 e 7.08-7.32 (2m, 10H, 9 Ar H-3), 8.22 (br s, 1H, NH scompare con D2O), 9.61 (br s, 1H scompare con D2O), 10.18 (br s, 1H scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3500-3100 (NH OH). MS: m/z [M+1]<+ >478. Anal. (C25H29N6O2ClS) C, H, N, S.

3-{[6-[(2-Morfolin-4-il-etil)tio]-1-(2-fenilpropol)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]ammino}fenol cloroidrato (Si329).

Solido giallo pallido (248 mg, 47%); pf: 177-178 ?C. <1>H NMR

(CDCl3): ? 1.16-1.33 (m, 3H, CH3), 2.60-2.80, 2.88-3.03 e 3.30-3.64 (3m, 9H, 2CH2N morf. CHCH3 + CH2CH2S), 3.78-3.97 (m, 4H, 2CH2O morf.), 4.38-4.55 (m, 2H, CH2N pyraz.), 6.54-6.74 e 7.09-7.33 (2m, 9H Ar), 7.58 (br s, 1H, scompare con D2O), 7.92 (s, 1H, H-3), 8.18 (br s, 1H, scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3500-3100 (NH OH). MS: m/z [M+1]<+ >492. Anal.(C26H31N6O2ClS) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi di 18a, 18b, 18c, 18d, 18e.

Una dispersione al 60% di idruro di sodio in olio minerale (1,21 g, 30,3 mmol) ? stata aggiunta a piccole porzioni ad una soluzione di malonitrile (1,00 g, 15,1 mmol) in THF anidro (25 mL) preraffreddato a 0/5?C. Dopo 30 minuti a 0/5 ?C, il cloruro acilico adatto (15,1 mmol)? stato aggiunto goccia a goccia. La soluzione di colore arancio ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a temperature ambiente per 2-12 h, poi ? stato aggiunto lentamente dimetilsolfato (1,75 mL, 18,2 mmol) e la soluzione ? mantenuta alla temperatura di riflusso per 3-6 h. Infine ? stato aggiunto 2-idrazino-1-feniletanolo 17 (4,62 g, 30,2 mmol) disciolto in THF anidro (2 mL) e la reazione ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 4 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente, sono stati aggiunti in agitazione magnetica acqua(25 mL) e NH3 conc. (5 mL). Dopo 15 minuti il THF ? stato rimosso a pressione ridotta and e la fase acquosa ? stata estratta con CH2Cl2 (3 x 30 mL). La fase organic ? stata lavata con acqua (15 mL), brine (15 mL), anidrificata(Na2SO4)ed evaporate a pressione ridotta. Il grezzo ? stato purificato mediante cromatografia. (gel di silice 0.060-0.200 mm, 40 ?) usando Et2O/PE (pe 40-60 ?C)come eluente, con un gradiente di eluizione (3:1?9:1) ottenendo i composti 18a, 18b, 18c 18d o 18e.

5-Ammino-3-(4-fluorofenil)-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1H-pirazolo-4-carbonitrile (18a).

Solido bianco (1,54 g, 32%); pf: 175-176 ?C. <1>H NMR: ? 4.01-4.10 e 4.15-

4.19 (2m, 2H, CH2), 5.12-5.18 (m, 1H, CH), 7.19-7.52 e 8.25-8.30 (2m, 9H Ar). IR (cm<-1>): 3450-2900 (OH), 3388, 3323 (NH2), 2223 (CN). MS: m/z 323 [M+1]<+>. Anal. (C18H15N4FO) C, H, N.

5-Ammino-3-(4-clorofenil)-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1H-pirazolo-4-carbonitrile (18b).

Solido bianco (2,50 g, 49%); pf: 173-174 ?C. <1>H NMR: ? 3.99-4.15 (m, 2H,

CH2), 5.12-5.18 (m, 1H, CH), 7.50-7.54 e 7.96-7.99 (2m, 9H Ar). IR (cm<-1>): 3450-3100 (OH), 3388, 3322 (NH2), 2223 (CN). MS: m/z 340 [M+1]<+>. Anal. (C18H15N4ClO) C, H, N.

5-Ammino-1-(2-idrossi-2-feniletil)-3-(4-metilfenil)-1H-pirazolo-4-carbonitrile (18c).

Solido bianco (2,02 g, 42%); pf: 172-174 ?C. <1>H NMR: ? 2.36 (s, 3H, CH3),

4.00-4.05 e 4.12-4.15 (2m, 2H, CH2), 5.10-5.15 (m, 1H, CH), 7.20-7.34 e 7.57-7.91 (2m, 9H Ar). IR (cm<-1>): 3400-3200 (OH), 3400, 3322 (NH2), 2221 (CN). MS: m/z 319 [M+1]<+>. Anal. (C19H18N4O) C, H, N.

5-Ammino-1-(2-idrossi-2-feniletil)-3-(4-metossifenil)-1H-pirazolo-4-carbonitrile (18d).

Solido bianco (2.50 g, 50%); pf: 144-145 ?C. <1>H NMR: ? 3.79 (s, 3H, CH3),

4.03-4.06 e 4.10-4.15 (2m, 2H, CH2), 5.11-5.15 (m, 1H, CH), 7.18-7.30 e 7.60-7.85 (2m, 9H Ar). IR (cm<-1>): 3450-2900 (OH), 3409, 3351 (NH2), 2220 (CN). MS: m/z 335 [M+1]<+>. Anal. (C19H18N4O2) C, H, N.

5-Ammino-1-(2-idrossi-2-feniletil)-3-fenil-1H-pirazolo-4-carbonitrile (18e).

Solido bianco (1,84 g, 40%); pf: 165-166 ?C. <1>H NMR: ? 3.95-4.23 (m, 2H,

CH2), 5.10-5.18 (m, 1H, CH), 7.20-7.37 e 7.79-7.81 (2m, 10H Ar). IR (cm<-1>): 3560-3240 (OH), 3358, 3350 (NH2), 2204 (CN). MS: m/z 305 [M+1]<+>. Anal. (C18H16N4O) C, H, N.

Procedura generale per la sintesi di 19a, 19b, 19c, 19d, 19e.

La sospensione dell?intermedio adatto 18a, 18b, 18c, 18d o 18e (3 mmol) in formammide (18 mL, 450 mmol) ? stata riscaldata a 190 ?C per 3-4 h e poi versata in acqua (40 mL). Il grezzo solido ? stato filtrato, lavato con acqua, sospeso in etanolo e portato alla temperature di ebollizione in presenza di carbonio attivo per 10 minuti. Il solido ? stato solubilizzato al punto di ebollizione dell?etanolo. Dopo filtrazione per l?allontanamento del carbonio attivo, i composti 19b, 19c o 19e sono precipitati come solidi puri. I composti 19a e 19d precipitati sono stati ulteriormente purificati mediante cromatografia flash (gel di silice 0.060-0.200 mm, 40 ?) usando CH2Cl2/CH3OH (98:2) come eluente per ottere un olio puro che lentamente cristallizza con l'aggiunta di una miscela di Et2O/PE (pe 40-60 ?C) (1:1).

2-[4-Ammino-3-(4-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-feniletanolo (19a).

Solido bianco (497 mg, 48%); pf: 190-192 ?C. <1>H NMR: ? 4.12-4.34 e 4.42-

4.45 (2m, 2H, CH2), 5.05-5.10 (m, 1H, CH), 7.19-7.30 and 7.51-7.60 (2m, 9H Ar), 8.12 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3500-3060 (OH), 3484, 3307 (NH2). MS: m/z 350 [M+1]<+>. Anal. (C19H16N5FO) C, H, N.

2-[4-Ammino-3-(4-clorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-feniletanolo (19b).

Solido bianco (509 mg, 46%); pf: 200-201 ?C. <1>H NMR: ? 4.21-4.28 e 4.35-

4.42 (2m, 2H, CH2), 5.15-5.18 (m, 1H, CH), 7.21-7.34 and 7.70-7.82 (2m, 9H Ar), 8.10 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3450-2990 (OH), 3407, 3290 (NH2). MS: m/z 367 [M+1]<+>. Anal. (C19H16N5ClO) C, H, N.

2-[4-Ammino-3-(4-metilfenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-feniletanolo (19c).

Solido bianco (496 mg, 48%); pf: 93-95 ?C. <1>H NMR: ? 2.37 (s, 3H, CH3),

4.20-4.25 and 4.30-4.37 (2m, 2H, CH2), 5.10-5.15 (m, 1H, CH), 7.19-7.32 e 7.50-7.78 (2m, 9H Ar), 8.12 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3500-3000 (OH), 3469, 3296 (NH2). MS: m/z 346 [M+1]<+>. Anal. (C20H19N5O) C, H, N.

2-[4-Ammino-3-(4-metossifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il]-1-feniletanolo (19d).

Solido bianco (427 mg, 39%); pf: 161-163 ?C.<1>H NMR: ? 3.82 (s, 3H, CH3),

4.22-4.27 e 4.33-4.41 (2m, 2H, CH2), 5.13-5.21 (m, 1H, CH), 7.15-7.38 e 7.45-7.90 (2m, 9H Ar), 8.10 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3500-2900 (OH), 3461, 3360 (NH2). MS: m/z 362 [M+1]<+>. Anal. (C20H19N5O2) C, H, N.

2-(4-Ammino-3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)-1-feniletanolo (19e).

Solido bianco (549 mg, 55%); pf: 160-161 ?C. <1>H NMR: ? 4.10-4.32 e 4.40-

4.38 (2m, 2H, CH2), 5.02-5.08 (m, 1H, CH), 7.16-7.22 and 7.42-7.50 (2m, 10H Ar), 8.09 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3500-2900 (OH), 3474, 3315 (NH2). MS: m/z 332 [M+1]<+>. Anal. (C19H17N5O) C, H, N.

Procedura generale per la sintesi di Si244, Si308, Si309, Si310, Si311.

SOCl2 (80 ?L, 1.1 mmol) ? stato aggiunto goccia a goccia alla soluzione dell?intermedio adatto 19a, 19b, 19c, 19d o 19e (0.5 mmol) in CH2Cl2 anidro (5 mL), e la rezione ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a temperature ambiente per 12 h in atmosfera di azoto. Sono stati aggiunti acqua (5 mL) e NaOH 1N (1 mL) con cautela e la fase acquosa ? stata estratta con CH2Cl2 (2 x 5 mL). Successivamente la fase organica ? stata lavata con acqua(5 mL), brine (5 mL), anidrificata (Na2SO4) e concentrata a pressione ridotta. I composti finali Si308, Si309, Si310 o Si311 sono stati ottenuti come solidi bianchi aggiungendo una miscela di Et2O/PE (pe 40-60 ?C) (1:1). Il composto Si244,che ha portato ad un olio giallo, ? stato precipitato come sale cloroidrato, per aggiunta di una soluzione satura di HCl in Et2O anidro.

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si310).

Solido bianco (125 mg, 68%); pf: 203-206 ?C. <1>H NMR: ? 4.77-4.82 e 4.95-

5.00 (2m, 2H, CH2N), 5.68-5.70 (m, 1H, CHCl), 7.38-7.42 e 7.51-7.64 (m, 9H Ar), 8.22 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3477, 3314 (NH2). MS: m/z 369 [M+1]<+>. Anal. (C19H15N5ClF) C, H, N.

3-(4-Clorofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si308).

Solido bianco (65 mg, 34%); pf: 150-151 ?C. <1>H NMR: ? 4.76-4.80 e 4.97-

5.02 (2m, 2H, CH2N), 5.67-5.68 (m, 1H, CHCl), 7.34-7.36 e 7.51-7.61 (m, 9H Ar), 8.24 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3470, 3301 (NH2). MS: m/z 385 [M+1]<+>. Anal. (C19H15N5Cl2) C, H, N.

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-metilfenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si309).

Solido bianco (90 mg, 49%); pf: 159-160 ?C. <1>H NMR: ? 2.36 (s, 3H, CH3),

4.75-4.80 e4.95-5.01 (2m, 2H, CH2N), 5.66-5.70 (m, 1H, CHCl), 7.24-7.39 e7.50-7.63 (m, 9H Ar), 8.23 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3468, 3306 (NH2). MS: m/z 365 [M+1]<+>. Anal. (C20H18N5Cl) C, H, N.

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-metossifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si311).

Solido bianco (146 mg, 77%); pf: 152-153 ?C. <1>H NMR: ? 3.89 (s, 3H,

OCH3), 4.75-4.80 e 5.01-5.07 (2m, 2H, CH2N), 5.58-5.62 (m, 1H, CHCl), 7.01-7.10 e 7.26-7.68 (m, 9H Ar), 8.36 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3470, 3305 (NH2). MS: m/z 381 [M+1]<+>. Anal. (C20H18N5ClO) C, H, N.

1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina cloroidrato (Si244).

Solido bianco (135 mg, 70%); pf: 129-132 ?C. <1>H NMR: ? 4.76-4.81 e 5.00-

5.06 (2m, 2H, CH2N), 5.50-5.54 (m, 1H, CHCl), 7.23-7.73 (m, 10H Ar), 9.49 (s, 1H, H-6). MS: m/z 387 [M+1]<+>. Anal. (C19H17N5Cl2) C, H, N.

Sintesi del 5-ammino-1H-pirazolo-4-carbonitrile (20).

L?idrazina monoidrato (800 ?L, 16,4 mmol) ? stata aggiunta ad una soluzione di

(etossimetilene)malononitrile (2 g, 16,4 mmol) in etanolo assoluto (10 mL) e la miscela ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 4 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente, il solvente ? stato evaporato a pressione ridotta. Dopo ? stata aggiunta acqua fredda (50 mL) ed il grezzo ? stato filtrato e lavato con acqua (3 x 40 mL) per avere il compost 20 come solido rosso (1,40 g, 81%); pf: 172-174 ?C. (Lit.74%; mp: 169-170 ?C).

Sintesi dell? 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (21).

Una soluzione di 5-ammino-1H-pirazolo-4-carbonitrile 20 (400 mg, 3,7 mmol) e

formammide (5 mL, 125,8 mmol) ? stata mantenuta in agitazione magnetic a 200 ?C per 1 h.Dopo raffreddamento a temperature ambiente, ? stata aggiunta acqua (20 mL) ed il solido ottenuto ? stato filtrato. Il grezzo ? stato sospeso in acqua calda e (40 mL) HCl conc.(5 mL), dopo ? stato aggiunto carbonio attivo (600 mg) e la miscela ? stata mantenuta alla temperatura di ebollizione per 15 min. Dopo la filtrazione per eliminare il carbonio attivo, ? stato aggiunto NH3 conc., il solido precipitato ? stato filtrato, ottenendo il compost 21 come solido bianco (405 mg, 81%); pf 353-356 ?C. (Lit.58%, pf >300 ?C).

Sintesi della 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (22).

L? N-iodosuccinimmide (2 g, 8,9 mmol) ? stata aggiunta ad una soluzione di 1H-

pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 21 (800 mg, 5,9 mmol) in DMF anidra (5 mL) e la miscela ? stata riscaldata a 80 ?C per 14 h in atmosfera di azoto. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, ? stata aggiunta acqua (20 mL) ed il solido precipitatao ? stato filtrato e lavato con acqua (50 mL). Il prodotto grezzo ? stato ricristallizzato in etanolo assoluto, per dare il composto 22 come solido giallo chiaro (1,31 g, 85 %); pf 272-275 ?C. (Lit.97%).

Sintesi della 3-iodo-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (23).

K2CO3 (600 mg, 4.34 mmol) ? stato aggiunto ad una soluzione di 3-iodo-1H-

pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 22 (400 mg, 1,53 mmol) in DMF anidra (5 mL), e la miscela ? stata riscaldata a 50 ?C per 1 h. 1-Bromo-2-fenilpropano (350 ?L, 2.30 mmol) ? stato aggiunto e la reazione ? stata mantenuta in agitazione magnetica a 130 ?C per 18 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente ? stata aggiunta acqua (30 mL) ed il solido precipitato ? stato filtrato e purificato mediante cromatografia (gel di silice 0.060-0.200 mm, 40 ?) usando una miscela di CH2Cl2/MeOH (95:5) come eluente per ottenere 23 come solido bianco (390 mg, 67%); pf 265-268 ?C. <1>H NMR: ? 1.22 (m, 3H, CH3), 3.52-3.57 (m, 1H, CH), 4.48-4.50 (m, 2H, CH2), 5.83 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 7.18-7.28 (m, 5H Ar), 8.28 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3480, 3360 (NH2). MS: m/z 380 [M+H]<+>. Anal. (C14H14N5I) C, H, N.

Procedura generale per la sintesi di Si312, Si336, Si337, Si338, Si339. L?acido boronico adeguato (1,08 mmol) ? stato aggiunto ad una sospensione di 3-iodo-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 23 (100 mg, 0,27 mmol) in toluene anidro(5 mL), e la miscela ? stata mantenuta sotto agitazione a temperatura ambiente in atmosfera d? azoto per 10 minuti. Poi sono stati aggiunti Cs2CO3 (350 mg, 1,07 mmol) e PdCl2(dppf) (20 mg, 10% mol). La reazione ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a 90 ?C per 14 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente, ? stata aggiunta acqua (70 mL) e la sospensione acquosa ? stata estratta con EtOAc (2 x 40 mL). La fase organica ? stata lavata con acqua (40 mL) e brine (40 mL), anidrificata (Na2SO4)e concentrata a pressione ridotta per ottenere il grezzo, che ? stato purificato mediante cromatografia (gel di silice 0.060-0.200 mm, 40 ?) usando una miscela di CH2Cl2/MeOH (95:5) come eluente per ottenere il composto Si312, Si336, Si337, Si338 o Si339.

3-fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si312).

Solido bianco (24 mg, 27%); pf: 105-109 ?C. <1>H NMR: ? 1.28 (d, J = 6.8 Hz,

3H, CH3), 3.60-3.65 (m, 1H, CH), 4.56-4.62 (m, 2H, CH2N), 5.58 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 7.17-7.27 e 7.46-7.67 (2m, 10H Ar), 8.40 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3476, 3298 (NH2). MS: m/z 330 [M+1]<+>. Anal. (C20H19N5) C, H, N.

1-{4-[4-Ammino-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]fenil}etanone (Si336).

Solido giallo (50 mg, 50%); pf 232-235 ?C. <1>H NMR CDCl3: ? 1.29 (d, J =

6.8 Hz, 3H, CHCH3), 2.67 (s, 3H, CH3CO), 3.58-3.65 (m, 1H, CH), 4.58-4.60 (m, 2H, CH2), 5.47 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 7.19-7-27, 7.77-7.79 e 8.11-8.13 (3m, 9H Ar), 8.37 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3478, 3315 (NH2). MS: m/z 372 [M+H]<+>. Anal. (C22H21N5O) C, H, N.

3-(4-Clorofenil)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si337).

Solido giallo (42 mg, 43%); pf 153-154 ?C. <1>H NMR: ? 1.27 (d, J = 6.8 Hz,

3H, CH3), 3.46-3.62 (m, 1H, CH), 4.50-4.60 (m, 2H, CH2), 5.74 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 7.18-7.25, 7.41-7.49 e 7.51-7.61 (3m, 9H Ar), 8.33 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3470, 3421 (NH2). MS: m/z 365 [M+H]<+>. Anal. (C20H18N5Cl) C, H, N.

3-(4-Metilfenil)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si338)

Solido marrone chiaro (30 mg, 32%); pf 152-155 ?C.<1>H NMR: ? 1.27 (d, J =

4.4 Hz, 3H, CHCH3), 2.43 (s, 3H, CH3Ar), 3.47-3.66 (m, 1H, CH), 4.55-4.57 (m, 2H, CH2), 5.31 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 7.18-7.20, 7.32-7.44 e 7.53-7.55 (3m, 9H Ar), 8.34 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3480, 3325 (NH2). MS: m/z 344 [M+H]<+>. Anal. (C21H21N5) C, H, N.

3-(1H-indol-5-il)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si339).

Solido marrone chiaro (30 mg, 30%); pf 240-241 ?C.<1>H NMR: ? 1.26 (d, J =

7.2 Hz, 3H, CH3), 3.49-3.74 (m, 1H, CH), 4.56-4.59 (m, 2H, CH2), 5.46 (br s, 2H, NH2 scompare con D2O), 6.65 (m, 1H, indolo H-3), 7.19-7.26, 7.27-7.32 and 7.49-7.56 (3m, 9H, 8H Ar and 1H, H-2 indolo), 7.92 (s, 1H, NH), 8.35 (s, 1H, H-6). IR (cm<-1>): 3465, 3309 (NH2). MS: m/z 369 [M+H]<+>. Anal. (C22H20N6) C, H, N.

Sintesi del 6-(sec-butiltio)-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1,5-diidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one (24c).

Una miscela di 1-(2-idrossi-2-feniletil)-6-tioxo-1,5,6,7-tetraidro-4H-

pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one 8 (2,.88 g, 10 mmol), 2-bromobutano (1,11 mL, 10,14 mmol) e K2CO3 anidro (1,38 g, 10 mmol) in DMF anidra(10 mL) ? stata mantenuta in agitazione magnetica a temperature ambiente per 24 h. La miscela ? stata versata in acqua fredda; il solido bianco ottenuto ? stato filtrato, lavato con acqua e ricristallizzato il etil acetato. Solido bianco (1,58 g, 46%); pf: 171-172 ?C. <1>H NMR: ? 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH2CH3), 1.38-1.45 (m, 3H, CHCH3), 1.62-1.78 (m, 2H, CH2CH3), 3.68-3.79 (m, 1H, SCH), 4.25-4.40 (m, 2H, CH2N), 5.10-5.19 (m, 1H, CHOH), 7.18-7.41 (m, 5H Ar), 7.90 (s, 1H, H-3), 12.00 (br s, 1H, NH scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3300-3030 (NH OH), 1704 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >345. Anal. (C17H20N4O2S) C, H, N, S.

Sintesi della 6-(sec-butiltio)-4-cloro-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (25c).

Il complesso di Vilsmeier, precedentemente preparato da POCl3 (9,32

mL, 100 mmol) e DMF anidra (7.7 mL, 100 mmol) ? stato aggiunto a una soluzione di 6-(secbutiltio)-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1,5-diidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one 24c (3,44 g, 10 mmol) in CHCl3 (50 mL). La miscela ? stata mantenuta a temperatura di riflusso per 8 h. La soluzione ? stata lavata con acqua (2 x 20 mL), anidrificata (MgSO4), filtrata, concentrate a pressione ridotta. L?olio grezzo ? stato purificaro mediante cromatografia (Florisil<?>, 100-200 mesh) usando dietil etere come eluente, ottenendo il prodotto puro. Olio giallo (1,91 g, 50%).

<1>H NMR: ? 1.03 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH2CH3), 1.33-1.51 (m, 3H, CHCH3), 1.62-1.86 (m, 2H, CH2CH3), 3.67-3.91 (m, 1H, SCH), 4.63-5.00 (m, 2H, CH2N), 5.36-5.53 (m, 1H, CHCl), 7.11-7.43 (m, 5H Ar), 7.94 (s, 1H, H-3). MS: m/z [M+1]<+ >382. Anal. (C17H18N4Cl2S) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi dei composti Si146 e Si147. L?ammina adatta (4 mmol) ? stata aggiunta ad una soluzione del 4-cloro derivato 25c (381 mg, 1 mmol) in toluene anidro(5 mL) e la miscela ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a temperature ambiente per 48 h. La fase organica ? stata lavata con acqua (2 x 10 mL), anidrificata (MgSO4), filtrate, e concetrata a pressione ridotta. L?olio grezzo ? stato purificato mediante cromatografia (Florisil<?>, 100-200 mesh) usando dietil etere come eluente. Il composto ? stato cristallizzato per aggiunta di una miscela 1:1 di Et2O/etere di petrolio (PE) (pe 40-60 ?C).

N-benzil-6-(sec-butiltio)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si146).

Solido bianco (271 mg, 60%); pf: 112-113 ?C. <1>H NMR: ? 1.05 (t, J =

7.2 Hz, 3H, CH2CH3), 1.42-1.45 (m, 3H, CHCH3), 1.68-1.74 e 1.80-1.85 (2m, 2H, CH2CH3), 3.81-3.84 (m, 1H, SCH), 4.68-4.88 (m, 4H, CH2N CH2Ar), 5.49-5.53 (m, 1H, CHCl), 7.24-7.41 (m, 10H Ar), 7.69 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3250 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >453. Anal. (C24H26N5ClS) C, H, N, S.

6-(Sec-butiltio)-1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si147).

Solido bianco (368 mg, 79%); pf: 97-98 ?C. <1>H NMR: ? 1.03 (t, J = 7.0

Hz, 3H, CH2CH3), 1.34-1.50 (m, 3H, CHCH3), 1.59-1.83 (m, 2H, CH2CH3), 2.91 (t, J = 6.2 Hz, 2H, CH2Ar), 3.70-3.88 (m, 3H, SCH CH2NH), 4.60-4.90 (m, 2H, CH2N), 5.30 (br s, 1H, NH scompare con D2O), 5.41-5.54 (m, 1H, CHCl), 7.04-7.41 (m, 10H Ar), 7.63 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3255 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >467. Anal. (C25H28N5ClS) C, H, N, S.

Procedura generale per la sintesi dei composti Si170 e Si148. L?anilina opportuna (2 mmol) ? stata aggiunta ad una soluzione del 4-cloro derivato 25b o 25c (1 mmol) in etanolo assoluto (5 mL), e la miscela ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 3-5 h. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, il solido ottenuto ? stato filtrato, lavato con acqua, e ricristallizzato in etanolo assoluto.

1-(2-Cloro-2-feniletil)-6-(ciclopentiletio)-N-(3-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si170).

Solido bianco (206 mg, 44%); pf: 226-227 ?C. <1>H NMR: ? 1.78-1.84 e

2.12-2.43 (2m, 8H, 4CH2 ciclopentile), 3.98-4.17 (m, 1H, SCH), 4.54-4.68 e 4.73-4.89 (2m, 2H, CH2N), 5.26-5.44 (m, 1H, CHCl), 5.54 (br s, 1H, NH scompare con D2O), 6.93-7.53 (m, 10H, 9Ar H-3). IR (cm<-1>): 2835 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >469. Anal. (C24H23N5ClFS) C, H, N, S.

6-(Sec-butiltio)-N-(3-clorofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si148).

Solido bianco (236 mg, 50%); pf: 213-214 ?C. <1>H NMR: ? 1.02 (t, J =

7.0 Hz, 3H, CH2CH3), 1.40-1.44 (m, 3H, CHCH3), 1.65-1.80 (m, 2H, CH2CH3), 3.80-3.85 (m, 1H, SCH), 4.75-4.80 e 4.87-4.93 (2m, 2H, CH2N), 5.63-5.67 (m, 1H, CHCl), 7.14-7.66 (m, 9H Ar), 8.30 (s, 1H, H-3), 10.34 (br s, 1H, NH scompare con D2O). IR (cm<-1>): 2933 (NH). MS: m/z [M+1]<+ >473. Anal. (C23H23N5Cl2S) C, H, N, S.

Sintesi della N-[2-(3-clorofenil)etil]-6-(metiltio)-1-[2-fenilvinil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si215).

Una soluzione di NaOH 4N (2 mL) ? stata aggiunta ad una

sospensione di N-[2-(3-clorofenil)etil]-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina Si58 (458 mg, 1 mmol) in etanolo al 95% (12 mL), e la miscela ? stata mantenuta alla temperatura di riflusso per 5 h. Dopo raffreddamento, il solido ? stato filtrato, lavato con acqua, e ricristallizzato in etanolo assoluto. Solido bianco (273 mg, 65%); pf: 104-106 ?C. <1>H NMR: ? 2.64 (s, 3H, SCH3), 2.98 (t, J = 5.0 Hz, 2H, CH2Ar), 3.87 (q, J = 5.0 Hz, 2H, CH2NH), 5.52 (br s, 1H, NH scompare con D2O), 7.09-7.50 (m, 10H, 9Ar CH=), 7.92 (s, 1H, H-3), 7.96 (d, Jtrans = 16.0 Hz, 1H, CH=). IR (cm<-1>): 3269 (NH), 1663 (C=C). MS: m/z [M+1]<+ >423. Anal. (C22H20N5ClS), C, H, N, S.

Sintesi del 2-(4-benzilammino-1-stiril-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-il-ammino)-etanolo (Si74).

L?etanolammina (180 ?L, 3 mmol) ? stata aggiunta ad una

sospensione di 26 (405 mg, 1 mmol) in butan-1-olo (16 mL) e DMSO (4 mL), e la miscela ? stata riscaldatat a 90 ?C per 12 h. Dopo raffreddamento a temperature ambiente, butan-1-olo ? stato rimosso a temperature ridotta; dopo ? stata aggiunta acqua (20 mL) e la soluzione ? stata sottoposta ad estrazione con etil acetato (2 x 20 mL); la fase organica ? stata lavata con acqua (20 mL), anidrificata (MgSO4) ed evaporata a pressione ridotta. Il solido ottenuto ? stato filtrate e ricristallizzato in etanolo assoluto. Solido bianco. (255 mg, 66%); pf: 148-149 ?C.<1>H NMR: ? 3.68 (q, J = 4.8 Hz, 2H, CH2), 3.88 (q, J = 4.8 Hz, 2H, CH2), 4.77 (d, J = 4.6 Hz, 2H, CH2Ar), 5.63 (br s, 1H, NH, scompare con D2O), 7.22-7.54 (m, 11H, 10Ar CH=), 7.78 (s, 1H, H-3), 7.82 (d, Jtrans = 17.2 Hz, 1H, CH=). IR (cm<-1>): 3281-3025 (OH NH), 1657 (C=C). MS: m/z [M+1]<+ >387. Anal. (C22H22N6O) C, H, N.

Sintesi del 6-benzil-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1,5-diidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one (28).

Ad una soluzione di sodio etossido, preparata da sodio (138 mg, 6 mmol)

ed etanolo assoluto (5 mL), e metilfenilacetato (900 mg, 6 mmol) ? stata aggiunta una soluzione di 5-ammino-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1H-pirazolo-4-carbossammide 27 (246 mg, 1 mmol) in etanolo assoluto (5 mL). La miscela ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 6 h; dopo raffreddamento a temperature ambiente, ? stata aggiunta acqua fredda (30 mL) e la soluzione ? stata acidificata con acido acetic al 3%. Il precipitato solido ? stato filtrato, lavato con acqua e ricristallizzato in etanolo assoluto ottenendo il composto 28 Solido bianco (200 mg, 58%); pf: 205-207 ?C. <1>H NMR: ? 3.98 (s, 2H, CH2Ar), 4.06 (br s, 1H, OH scompare con D2O), 4.44-4.51 e 4.55-4.61 (2m, 2H, CH2N), 5.13-5.18 (m, 1H, CHOH), 7.16-7.35 (m, 10H Ar), 8.00 (s, 1H, H-3), 10.94 (br s, 1H, NH scompare con D2O). IR (cm<-1>): 3440-2893 (OH NH), 1694 (CO). MS: m/z [M+1]<+ >347. Anal. (C20H18N4O2) C, H, N.

Sintesi della 6-benzil-4-cloro-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina (29).

Il complesso di Vilsmeier, precedentemente preparato da POCl3 (2.80 mL,

30 mmol) e DMF anidra (2.3 mL, 30 mmol) ? stato aggiunto ad una sospensione di 6-benzil-1-(2-idrossi-2-feniletil)-1,5-diiydro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one 28 (346 mg, 1 mmol) in CHCl3 (10 mL). La miscela ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 12 h. La soluzione ? stata lavata con acqua (2 x 20 ml), anidrificata (MgSO4),filtrata e concentrate a prssione ridotta. L?olio grezzo ? stato purificato mediante cromatografia (Florisil<?>, 100-200 mesh), usando dietil etere come eluente, per ottenere il composto come olio giallo che ? stato cristallizzato in frigorifero aggiungendo una miscela di Et2O/PE (pe 40-60 ?C) (1:1). Solido bianco (320 mg, 84%); pf: 172-173 ?C.<1>H NMR: ? 3.99 (s, 2H, CH2Ar), 4.64-4.77 and 4.81-4.96 (2m, 2H, CH2N), 5.36-5.51 (m, 1H, CHCl), 7.03-7.66 (m, 10H Ar), 8.03 (s, 1H, H-3). MS: m/z [M+1]<+ >384. Anal. (C20H16N4Cl2) C, H, N.

N,6-dibenzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si164).

La benzilammina (440 ?L, 4 mmol) ? stata aggiunta ad una soluzione del 4-

cloro derivato 29 (383 mg, 1 mmol) in toluene anidro (5 mL) e la miscela ? stata mantenuta in agitazione magnetica a temperature ambiente per 48 h. La fase organica ? stata lavata con acqua (2 x 10 mL), anidrificata (MgSO4), filtrata, e concentrata a pressione ridotta. L?olio grezzo ? stato cristallizzato per aggiunta di una miscela 1:1 di Et2O/PE (pf: 40?60 ?C) to give Si164. Solido bianco (250 mg, 55%); pf: 125 ?C. <1>H NMR: ? 4.00 (s, 2H, CH2Ar), 4.53-4.96 (m, 4H, CH2N NHCH2Ar), 5.40-5.54 (m, 1H, CHCl), 7.00-7.73 (m, 15 H Ar), 8.04 (s, 1H, H-3). IR (cm<-1>): 3255 (NH) MS: m/z [M+1]<+ >455. Anal.(C27H24N5Cl) C, H, N.

Schema 1. Preparazione dell?intermedio 5<a>

a Reagenti e condizioni: (i) NH2NH2<.>H2O, iPrOH, riflusso, 10 h; (ii) etil(etossimetilen)cianoacetato, toluene, 80 ?C, 8 h; (iii) benzoil isotiocianato, THFanidro, riflusso, 12 h; (iv) 2 N NaOH, 100 ?C, 10 min, poi AcOH.

Schema 2. Preparazione dei derivati Si303, Si332, Si313, Si314, Si307, Si329, Si327, Si306a

R1

a Reagenti e condizioni: (i) 4-(2-cloroetil)morfolina, NaOH, EtOH, DMFanidra, riflusso, 6 h; (ii) POCl3/DMF, CH2Cl2, riflusso, 6-8 h; (iii) R2NH2, EtOH, riflusso, 3-5 h.

Schema 3. Preparazione dei derivati Si308, Si309, Si310, Si311, Si244<a>

<a>Reagenti e condizioni: i. a) malonitrile, NaH, THFanidro, 0/5 ?C, 30 min; b) RC6H4COCl, rt, 2-12 h; c) Me2SO4, riflusso, 3-6 h; d) 17, riflusso, 4 h; ii. formammide, 190 ?C, 3-4 h; iii. SOCl2, CH2Cl2anidro, ta, 12 h, in atmosfera di N2.

Schema 4. Preparazione dei derivati Si312, Si336, Si337, Si338, Si339a

<a>Reagenti e condizioni: i. formammide, 200 ?C, 1 h; ii. NIS, DMFanidra, 80 ?C, 14 h; iii.1-bromo-2-fenilpropano, K2CO3, DMFanidra, 130 ?C, 18 h; iv. acidi boronici, Cs2CO3, PdCl2(dppf), Tol anidro, 90 ?C, 14 h.

Schema 5. Preparazione dei derivati Si170, Si146, Si147, Si148, Si215<a>

Schema 6. Preparazione del derivato Si74<a >

a Reagenti e condizioni: i. mCPBA, CHCl3, ta, 6 h; ii.2-amminoetanolo, DMSO, butan-1-olo, 90 ?C, 12 h.

Schema 7. Preparazione del derivato Si164a

a Reagenti e condizioni: i. metil fenilacetato, EtONa, EtOH assoluto, riflusso, 6 h; ii. POCl3/DMF, CHCl3 riflusso,12 h; iii. benzilammina, toluene an., ta, 48 h.

1.3-Chimica: Discussione

Il composto Si327 ? stato sintetizzato a partire dalla [2-(4-fluorofenil)etil]idrazina 2, ottenuta dalla reazione del 1-(2-bromoetil)-4-fluorobenzene 1 con idrazina monoidrato in isopropanolo; alla temperatura di riflusso per 10 h (Schema 1). L?idrazina derivata 2 ? stata fatta reagire con etil(etossimetilene)cianoacetato in toluene anidro a 80 ?C per 8 h, ottenendo l? etil 5-ammino-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-1H-pirazolo-4-carbossilato 3 che ? stato trattato con benzoil isotiocianato in THF anidro alla temperatura di riflusso per 12 h per avere l?intermedio 4. Questo composto ? stato a sua volta ciclizzato a pirazolo[3,4-d]pirimidinone 5 per trattamento con NaOH 2N a 100 ?C per 10 min, seguito da acidificazione con acido acetico. L?alchilazione del gruppo tiocarbonilico in posizione C6 con 4-(2-cloroetil)morfolina in DMF anidra in presenza di una soluzione alcolica di NaOH ha portato al composto 9, che ? stato trattato con il complesso di Vilsmeier (POCl3/DMF, 1:1) in CH2Cl2 a temperatura di riflusso per 12 h ottenendo il composto alogenato 13 (Schema 2). Infine, quest?ultimo ? stato fatto reagire con un eccesso di 3-cloro anilina in etanolo assoluto a riflusso per 5 h, portando al composto desiderato Si327. La sintesi degli altri composti N-morfolino-etan-tio sostituiti in C6 ? riportata nello Schema 2. Il composto Si181, mostrato in Tabella 2, ? stato precedentemente riportato da noi.<21 >L?alchilazione del gruppo tiocarbonilico dei derivati 5-8<20 >con 4-(2-cloroetil)morfolina ha permesso di ottenere i 6-alchiltio derivati 9-12, che poi sono stati trattati con il complesso di Vilsmeier (POCl3/DMF, 1:1) in CH2Cl2 a riflusso per 6-8 h per ottenere i composti 13-16 presentanti un atomo di cloro in C4. Infine, la reazione di 13-16 con l?anilina adatta in etanolo assoluto a riflusso per 3?5 h ha portato al composto Si desiderato con buona resa.

La sintesi delle pirazolo[3,4-d]pirimidine 3-sostistuite, Si244, Si308, Si309, Si310 e Si311 ? stata condotta facendo reagire tre componenti in un unico passaggio.<24 >Il sodio idrossido ? stato aggiunto a piccole porzioni ad una soluzione di malononitrile in THF anidro preraffreddato a 0/5 ?C; dopo 30 minuti ? stato aggiunto il cloruro acilico adatto e la soluzione ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente per 2-12 h. Poi ? stato aggiunto dimetilsofato e la soluzione ? stata mantenuta alla temperatura di riflusso per 3-6 h. Infine,? stato aggiunto il 2-idrazino-1-feniletanolo 17 solubilizzato in THF anidro (2 mL) e la reazione ? stata mantenuta alla temperature di riflusso per 4 h ottenendo gli intermedi 18a-c, purificati mediante cromatografia flash. I composti 18a-c sono stati sospesi in formammide e la miscela ? stata riscaldata a 190 ?C per 3-4 h per fornire le pirazolo-pirimidine 19a-c, che sono state fatte reagire a loro volta con tionil cloruro in CH2Cl2 anidro a temperatura ambiente per 12 h in atmosfera di azoto per avere i composti finali Si308, Si309 e Si310 (Schema 3). La sintesi dei composti Si312, Si337, Si336, Si338 e Si339 ? stata condotta via Suzuki crosscoupling, poich? la reazione ad unico passaggio descritta precedentemente ha portato a rese molto basse. Il 5-ammino-1H-pirazolo-4-carbonitrile 20,<20 >ottenuto dalla reazione di (etossimetilene)malononitrile con idrazina monoidrato, ? stato ciclizzato per reazione con formammide a 200 ?C per 1 h, offrendo l?1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 21.<20 >La reazione di 21 con N-iodosuccinimmide (NIS) in DMF anidro a 80 ?C per 14 h in atmosfera di azoto ha dato la 3-iodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 22.<26 >Quest?ultima ? stata trattata a sua volta con K2CO3 e 1-bromo-2-fenilpropano a 130 ?C per 18 h per produrre la 3-iodo-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina 23 con buona resa. Infine, il composto 23 ? stato fatto reagire con un eccesso dell?acido boronico adatto in presenza di Cs2CO3 e PdCl2(dppf) in toluene anidro a 90 ?C per 14 h ottenendo i composti Si336 and Si339 (Scheme 4). La sintesi dei composti Si170, Si146, Si147, Si148 e Si74 ? stata condotta a partire dall?1-(2-idrossi-2-feniletil)-6-thioxo-1,5,6,7-tetraidro-4H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-one 8, riportata da noi precedentemente.<20 >L?alchilazione del gruppo tiocarbonilico in C6 con l?alchil bromuro ideale in N,N-dimetilformammide (DMF) anidra a temperatura ambiente ha offerto i 6-alchiltio derivati 24a-c, a loro volta trattati con il complesso di Vilsmeier (POCl3/DMF, 1:1) in CHCl3 per ottenenere i dicloro-derivati 25a-c. Infine, la reazione con eccesso dell?ammina adeguata in toluene a temperature ambiente ha portato ai composti Si146, Si147, Si58 e Si34 con buona resa. Differentemente, i composti Si170 e Si148 sono stati ottenuti facendo reagire 25b,c con l?anilina adeguata in etanolo assoluto a riflusso per 3-5 h. Il composto Si215 ? stato ottenuto per trattamento di Si34 con una soluzione di NaOH 4N a riflusso per 5 h (Schema 5). L?ossidazione del composto Si39 con l?acido metacloroperossibenzoico (mCPBA) in CHCl3 ha dato il 6-metilsolfonil derivato 26. Infine, Si74 ? stato ottenuto per sostituzione nucleofila del gruppo metilsolfonil con 2-aminoetanolo in dimetilsolfossido (DMSO) e butan-1-olo a 90 ?C per 12 h con buona resa (Schema 6). Il composto Si164 ? stato ottenuto a partire da 27,<18 >questo ? stato clorurato per trattamento con il complesso di Vilsmeier in CHCl3 a riflusso per 12 h e si ? ottenuto il composto diclorurato 29, che per reazione con la benzilammina, ha portato al composto Si164 (Schema 7).

ESEMPIO 2

2-Saggi ADME:

2.1-Saggi ADME: Materiali e Metodi

Reagenti. Tutti i solventi, reagenti, sono stati forniti da Sigma-Aldrich Srl (Milano, Italia), l?Estratto di Lipidi Polari di Cervello (Suino) ? stato fornito da Avant Polar Lipids, INC. (Alabama, USA). Il Dodecano ? stato acquistato presso Fluka (Milano, Italia). I microsomi umani epatici derivanti da un gruppo di donatori maschi alla concentrazione di 20 mg mL<-1 >sono stati acquistati presso BD Gentest-Biosciences (San Jose, California). L?acqua utlizzata ? stata prodotta con lo strumento Milli-Q (Millipore, Milford, MA, USA). Le micropiastre munite di filtro da 96 pozzetti (MultiScreen-IP, Clear Plates, diametro dei pori 0.45 ?m), e le micropiastre da 96-pozzetti UV-trasparenti sono state fornite da Millipore (Bedford, MA, USA).

Saggio di Permeabilit? su Membrane Artificiali Parallele (PAMPA). La soluzione donatrice (0.5 mM) ? stata preparata per diluizione con tampone fosfato (pH 7.4, 0.025 M) di una soluzione madre del composto 1 mM in dimetilsolfossido (DMSO). I filtri sono stati rivestiti con 5 ?L di una soluzione 1% (p/v) di fosfatidilcolina in dodecano o con 4 ?L di un soluzione (20 mg mL<-1>16% CHCl3, 84% dodecano) di lipidi polari di cervello preparata da una soluzione in CHCl3 10% p/v, per i saggi di permeabilit? intestinale e i saggi di permeabilit? BBB, rispettivamente. La soluzione donatrice (150 ?L) ? stata aggiunta in ciascun pozzetto del compartimento donatore. A ciascun pozzetto del compartimento accettore sono stati aggiunti 300 ?L della soluzione accettrice (50% DMSO in tampone fosfato). Tutti i composti sono stati testati in tre piastre diverse in giorni diversi. Le due piastre sono state messe a contatto (sandwich) sono state incubate per 5

ore a temperatura ambiente mantenendo blanda agitazione. Alla fine del periodo di incubazione, le piastre sono state separate, e sulle soluzioni donatrice ed accettrice sono state effettuate le determinazioni quantitative mediante LC-UV a 280 nm.

Le analisi LC sono state eseguite con un sistema Varian Prostar HPLC (Varian Analytical Instruments, USA) fornito di una pompa binaria, una valvola di iniezione manuale ed un rivelatore UV-VIS Prostar 325. Le separazioni cromatografiche sono state condotte usando una colonna Polaris C18-A (150-4.6 mm, diametro particelle 5 ?m) ad una velocit? di flusso di 0,8 mL min<-1 >con una fase mobile costituita da 60% ACN /40% H2O-acido formico 0,1%. La permeabilit? apparente (Papp) per i saggi PAMPA ? stata calcolta ricorrendo alla seguente equazione ricavata dall?equazione di Wohnsland and Faller<27 >and Sugano et al.<28 >che con alcune modifiche permette di ottenere il valore di permeabilit? in termini di cm s<-1>,

dove VA ? il volume del pozzetto accettore, VD ? il volume del pozzetto donatore (cm<3>), A ? l?area effettiva del filtro dove ? depositata la membrana (cm<2>), t il tempo di incubazione (s), r ? invece il rapporto tra la concentrazione del farmaco nell?accettore e la concetrazione di farmaco nell?equilibrio. La concentrazione del farmaco ? stimata integrando l?area del picco cromatografico.

La ritenzione di membrana espressa in % ? calcolata con la seguente equazione:

:

dove r ? il rapporto fra la concentrazione del farmaco nell?accettore e la concetrazione di farmaco nell?equilibrio, D, A, e Eq rappresentano la concetrazione di farmaco nel donatore, nell?accettore e nella soluzione equilibrio, rispettivamente.

Saggio di Solubilit? in Acqua. Ogni composto solido (1 mg) ? stato aggiunto ad 1mL di acqua. I campioni sono stati mantenuti in agitazione a temperatura ambiente per 24-36 h. Le sospensioni sono state filtrate attraverso un filtro di nylon da 0,45 ?m (Acrodisc), ed il composto solubilizzato ? stato determinato con un sistema LC-MS-MS. Per ogni composto la determinazione ? stata condotta in triplicato.

Per ogni quantificazione ? stato usato un sistema LC-MS Varian (Varian Inc) costituito da un?unit? di degassaggio del solvente, due pompe (212-LC), uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo MSD (Mod.320-LC) munito di sistema di ionizzazione ES ed interfacciato con il software Varian MS Workstation System Control Vers. 6.9. Le separazioni cromatografiche sono state effettuate con una colonna Pursuit C18 (50 x 2.0 mm) (Varian) con diametro delle particelle di 3 ?m mediante il seguente gradiente di eluizione: eluente A ACN ed eluente B costituito da una soluzione acquosa di acido formico (0,1%). L?analisi ? iniziata con 0% di eluente A, che ? stato aumentato linearmente al 70% in 10 min, per poi aumentare lentamente al 98% in 15 min. La velocit? di flusso ? stata mantenuta a 0,2 mL min<-1 >ed il volume di iniezione ? stato di 5 ?L. Lo strumento ha operato in modalit? positiva utilizzando i seguenti parametri: rivelatore 1850 V, pressione del gas di essiccamento 25.0 psi, temperatura di desolvatazione 300.0 ?C, gas di nebulizzazione 40.0 psi, ago 5000 V e scudo 600 V. L?Azoto ? stato usato come gas di nebulizzazione e di essiccamento. L? Argon ? stato usato come gas di collisione per indurre dissociazione alla pressione di 1,8 mTorr nella cella di collisione. Le transizioni cos? come la tensione capillare e l'energia di collisione utilizzati per ciascun composto sono riassunti nella Tabella 5.

Tabella 5. Parametri cromatografici e MS (transizione monitorata, energia di collisione, tensione capillare e tempo di ritenzione tR) dei composti selezionati.

Saggi di Stabilit? Microsomiale. Una soluzione in DMSO di ciascun composto ? stata incubata a 37 ?C per 60 min in tampone fosfato 125 mM (pH 7,4), 5 ?L di proteine microsomiali di fegato umano (0,2 mg mL<-1>), in presenza di sistema rigenerante NADPH in un volume finale di 0,5 mL (concentrazione finale del composto, 50 ?M); il DMSO non ha superato il 2% (soluzione finale). La reazione ? stata interrotta per raffreddamento in ghiaccio e aggiungendo 1,0 mL di acetonitrile. La miscela di reazione ? stata centrifugata, ed il composto parente ed i metaboliti sono stati successivamente determinati mediante analisi LC-UV-MS.

Le analisi cromatografiche sono state condotte con un sistema Agilent 1100 LC/MSD VL (G1946C) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) costituito da un?unit? di degassaggio del solvente, due pompe, un rivelatore UV 1100, ed uno spettrometro di massa MSD 1100 modello VL La separazione cromatografica ? stata effettuata usando una colonna Varian Polaris C18-A (150-4,6 mm, dimensione delle particelle 5 ?m) ed utilizzando il seguente gradiente di eluizione: eluente A ACN ed eluente B costituito da una soluzione acquosa di acido formico (0,1%). L?analisi ? iniziata con 2% di eluente A, che ? stato aumentato rapidamente al 70% in 12 min, per poi aumentare lentamente al 98% in 20 min. La velocit? di flusso ? stata mantenuta a 0,8 mL min<-1 >ed il volume di iniezione ? stato di 5 ?L. Lo spettrometro di massa Agilent 1100 (MSD) a singolo quadrupolo ? stato utilizzato con spray ortogonale API-ES (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). L?Azoto ? stato usato come gas si essiccamento La pressione del gas di nebulizzazione, il flusso del gas di essiccazione, la tensione capillare, la tensione di frammentazione, e la temperatura di vaporizzazione sono state mantenute a 40 psi, 9 L/min, 3000 V, 70 V, e 350 ?C, rispettivamente. La rivelazione UV ? stata monitorata a 280 nm. Le determinazioni LC-ESI-MS sono state condotte utilizzando MSD in modalit? positiva. Lo spettro ? stato acquisito con un intervallo di scansione m/z 100-1500 utilizzando un intervallo di acquisizione di 0,1 u. La percentuale di composto non metabolizzato ? stato calcolato per confronto con soluzioni di riferimento. 1.2-Saggi ADME: Discussione

E? ben noto che gli inibitori chinasici sono generalmente caratterizzati da problemi di solubilit? a causa della loro natura lipofila. Pertanto, la valutazione precoce di propriet? ADME in questo campo rappresenta, pi? che mai, un passo fondamentale per selezionare i candidati farmaci. Pertanto, gli studi ADME in vitro sono stati condotti su i composti c-Src inibitori pi? attivi riportati in questo documento al fine di valutare al pi? presto il loro assorbimento/stabilit?. In particolare ? stato determinato, la stabilit? in acqua, la permeabilit? su membrane artificiali parallele (PAMPA) e la stabilit? in microsomi di fegato umano (HLM) per gli inibitori c-Src pi? attivi. (Tabella 6). Generalmente, sono state identificate ottime propriet? per i composti studiati. Infatti, la stabilit? metabolica ? risultata essere superiore al 90%, i valori di permeabilit? di membrana variavano da 1,72 a 9,33x10<?6 >cm/s evidenziando una sufficiente capacit? di attraversare le membrane cellulari. Inoltre, la solubilit? in acqua di alcuni composti era aumentata da circa 2 fino a valori maggiori di 57 volte, rispetto a quella del composto di riferimento Si192, con il composto pi? solubile Si332 che mostra un valore di solubilit? di 97 ?g/mL.

ESEMPIO 3

Saggi Enzimatici ed Attivit? Biologica contro Neuroblastoma, Glioblastoma e Leucemia

3.1-Saggi Enzimatici:

3.1.1-Saggi Enzimatici: Materiali e Metodi

Saggio enzimatico su chinasi Fyn isolata. La chinasi attiva ricombinante Fyn e gli specifici substrati peptidici (Peptide Sunstrato Src, cat 12-140) sono stati comprati da Merk-Millipore. Il saggio della chinasi ? stato eseguito in presenza di ATP (200 ?M) e di substrato peptidico (100 ?M). Tutti i saggi di inibizione sono stati condotti con 0,01 ?g di chinasi attiva, 0,33 pmol [?<32>P]ATP, 60 mM HEPES-NaOH pH 7,5, 3 ?M Na-ortovanadato, 1,2 mM DTT, 50 ?g/ml PEG20.000, 10 mM magnesio acetato, 0,004%NP40 e 10% DMSO in un volume finale di 10 ?L. Fyn e gli inibitori sono stati preincubati in ghiaccio per 5 min; dopo l?addizione del substrato la reazione ? stata condotta a 30 ?C per 10 min. La reazione ? stata fermata mediante l?aggiunta di 5 ?L di acido fosforico al 3%. Le aliquote (10 ?L) sono state successivamente trasferite all?interno di una Filtermat P30 (PerkinElmer), lavate per 5 volte con acido fosforico 75mM ed una volta con acetone per 5 minuti. Il filtro ? stato asciugato e trasferito in una busta di plastica sigillabile, ed 4 mL di scintillation cocktail sono stati aggiunti. Le reazioni sono state lette su uno scintillation counter MicroBeta Liquid (Perkinelmer). I valori di ID50 sono stati ottenuti secondo la seguente equazione:

?=V/(1+(I/ID50)

dove v ? la velocit? relativa misurata, V ? la massima velocit? apparente in assenza di inibitore, I ? la concentrazione di inibitore, ed ID50 ? la dose di inibizione al 50%.

I valori di Ki nei confronti di Fyn ricombinante sono stati calcolati secondo la seguente equazione:

secondo un meccanismo di inibizione competitiva verso il substrato ATP, dove [SATP] ? la concentrazione di ATP. Le curve di fitting sono state eseguite con il programma GraphPad Prism versione 5.00.

Saggio enzimatico su chinasi Src isolata. Src ricombinante umana ? stata comprata da Upstate (Lake Placid, NY). L?attivit? ? stata misurata in un filter-binding assay utilizzando un kit commerciale (Src Assay Kit, Upstate), secondo il protocollo del produttore, utilizzando 150 ?M dello specifico peptide substrato di Src (KVEKIGEGTYGVVYK) ed in presenza di 0.125 pMol di Src e 10 ?M di [?-32P]-ATP. I valori di affinit? apparente (Km) della preparazione di Src per il suo peptide e per l?ATP sono state determinate separatamente e sono risultate essere rispettivamente 30 ?M e 5 ?M.

Saggio enzimatico su chinasi Abl isolata. Abl ricombinante umana ? stata comprata da Upstate. L?attivit? ? stata misurata in un filter-binding assay utilizzando uno specifico peptide substrato di Abl (Abtide, Upstate). Le condizioni di reazione sono state: 10 ?M [?-32P]-ATP, 50 ?M peptide, 0.022 ?M c-Abl. I valori di affinit? apparente (Km) della preparazione di Abl per il suo peptide e l?ATP sono state determinate separatamente e sono risultate essere rispettivamente 1,5 ?M e 10 ?M.

3.1.2- Saggi Enzimatici: Discussione

Tutti i composti sintetizzati, incluso il composto di riferimento Si192, sono stati inizialmente testati in un saggio enzimatico per valutare la loro affinit? verso c-Src isolata (Tabella 6).

Tabella 6. Attivit? enzimatica, attivit? cellulare e propriet? ADME dei composti testati

I composti Si181 e Si135 gi? pubblicati dagli inventori sono stati inseriti in Tabella 6 per fini comparativi. Come si evince dalla Tabella 6, i derivati disegnati razionalmente Si332, Si329, Si322, Si323 e Si330 hanno mostrato una potente attivit? inibitoria in vitro contro c-Src con valori di Ki nell?ordine del nanomolare (rispettivamente 40 nM, 70nM, 30 nM, 10 nM e 7 nM). Questi valori sono probabilmente dovuti al contributo del gruppo idrossile in posizione meta dell?anello anilinico, come ipotizzato dai calcoli di modellistica molecolare degli inventori ed ulteriormente confermato dalle osservazioni delle relazioni struttura-attivit?. Con la semplice addizione di un sostituente m-OH sul C4 dell?anello anilinico, sono stati identificati potenti agenti con un incremento di attivit? da 2 a 30 volte (comparare Si329 con Si319, Si329 con Si313, Si323 con Si188 e Si330 con Si171 in Tabella 6). Al contrario, non sono stati osservati andamenti chiari con l?introduzione di fluoro, cloro o bromo nella medesima posizione. Comunque composti con notevole attivit? sono stati identificati anche in queste serie come Si317, Si327, Si170 e Si306, con valori di Ki intorno a 100 nM. Gli inibitori c-Src pi? attivi Si332, Si329, Si322 e Si330 sono stati anche testati contro Abl. Questi composti mantengono il profilo di attivit? inibitoria duale Src/Abl delle strutture lead Si192 e Si181, ma hanno mostrato valori di Ki di un ordine di magnitudine superiore per Src, possedendo una selettivit? significativa per c-Src rispetto ad Abl. Il derivato Si192 ha esibito moderata attivit? con Ki di 7,5 ?M. Come pu? essere osservato dalla Tabella 6, i derivati Si308 e Si309 hanno mostrato un potente effetto inibitorio in vitro contro Fyn, con valori di Ki nel?ordine del nanomolare (rispettivamente 70 nM e 95 nM). Queste potenze di attivit? sono probabilmente dovute al contributo di un cloro o di un sostituente metile in posizione para dell?anello fenilico in C3 (comparare Si308 con Si244 e Si309 con Si244). Attivit? interessanti sono state inoltre trovate per composti Si310, Si337e Si338 che mostrano affinit? submicromolare (rispettivamente 0,36 ?M, 0,78 ?M e 0,995 ?M).

Inoltre, Si174, Si74, S13 e Si244 sono risultate essere dotate, rispettivamente, di valori di Ki di 1,4 ?M, 1,15 ?M, 3,5 ?M e 0,9 ?M. I derivati Si109, Si180, Si192, Si215, Si148, Si164 hanno esibito moderata attivit? con valori di Ki che vanno da 7,5 ?M fino a 16 ?M. Nessuna attivit? ? stata rilevata per i composti rimanenti.

Come andamento generale, la sostituzione di un atomo di cloro con un metile in posizione N1 della catena laterale conduce ad una considerevole riduzione dell?affinit? con decremento dell?attivit? di circa 10 volte (comparare Si312 contro Si244, Si337 contro Si308 e Si338 con Si309).

3.2- Neuroblastoma:

3.2.1- Neuroblastoma: Materiali e Metodi

Analisi del Ciclo Cellulare. Cellule (SH-SY5Y) sono state seminate in piastre di Petri da 60 mm con una densit? di 3 x 10<5>. Dopo trattamento e conseguente incubazione per 24 ore a 37 ?C e 5% CO2 in atmosfera umidificata, le cellule raccolte sono state lavate e fissate overnight con etanolo al 70%. Dopo, l?etanolo ? stato rimosso per centrifugazione e le cellule risospese in PBS, sono state colorate con 50 ?g/mL di ioduro di propidio (PI) a 4 ?C per 30 minuti al buio. Le cellule colorate sono state analizzate con Tali image based cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) contando 20 campi di esempio ed i dati grezzi sono stati elaborati mediante il software Flowing (v. 2.5.0, by Perttu Terho, University of Turku, Finland).

Saggio di Crescita dello Sferoide. L?azione antitumorale in vitro ? stata valutata mediante il saggio dello sferoide di neuroblastoma. La linea cellulare SH-SY5Y ? stata utilizzata come modello di neuroblastoma umano. Le cellule sono state comprate dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) e sono state coltivate in terreno DMEM addizionato con 10% di Siero Fetale Bovino. IBIDI angiogenesis micro-slide (IBIDI GmbH) rivestite con fattore di crescita ridotto Matrigel (BD, Bioscience) e la polimerizzazione ? stata permessa per 30 minuti. Cellule SH-SY5Y sono state seminate in piastre con 96 pozzetti in presenza o meno (CTR) di inibitore. Iniziando da 24 ore dopo la semina, in condizioni basali, aggregati cellulari con fattezze sferoidali (diametro > 100 ?m) sono risultati visibili. Le dimensioni degli sferoidi cellulari, in termini di area e di diametro, sono state determinate utilizzando un sistema di analisi Image Pro-plus v 4.5 considerando 5 trattamenti/campi casuali (ingrandimento 400x). IC50 (concentrazione del farmaco che determina il 50% di inibizione della crescita) ? stata calcolata mediante il software Grafit v4.0 (Erithacus Software Limited) utilizzando la curva sigmoide con miglior fitting.

Animali e Modello Sperimentale in vivo. Topi maschi nudi CD1 (Charles River, Milan, Italy) sono stati tenuti secondo le linee guida stabilite dall?Istituto di appartenenza degli inventori (Universit? dell?Aquila, regolamento del Dipartimento di Scienze Cliniche Applicate e Biotecnologiche, conforme al regolamento del governo Italiano n.116 del 27 Gennaio 1992 sull?uso di animali da laboratorio). Prima di qualunque manipolazione invasiva, i topi sono stati anestetizzati con un mix di ketamina (25 mg/mL) e xylazina (5 mg/mL). L?innesto del tumore ? stato ottenuto mediante iniezione s.c. di 1 x 10<6 >cellule SH-SY5Y in 100 ?L di 10 mg/mL di Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). La crescita del tumore ? stata monitorata giornalmente misurando la media del diametro tumorale. Il volume del tumore ? stato espresso in mm<3 >secondo la formula 4/3?r<3>. Per la somministrazione in vivo di Si306 ? stata preparata una sospensione in 0,5% di soluzione di metilcellulosa. Ogni topo ha ricevuto una somministrazione giornaliera orale del veicolo metilcellulosa, oppure 50 mg/kg di Si306.

Analisi Citofluorimetrica. L?analisi del contenuto di DNA ? stata eseguita come valutazione del ciclo cellulare. 0.5 x 10<6 >cellule SH-SY5Y sono state piastrate in piastre di 100 mm di diametro e trattate il giorno successivo con Si306 per 72 h. Successivamente le cellule sono state staccate con tripsina, fissate con etanolo 70% freddo a 4 ?C per 2 ore, risospese in 500 ?L di soluzione colorante (40 ?g/mL di ioduro di propidio e 500 ?g/mL di Rnase A in PBS; tutti dalla Sigma) per 30 min a 37 ?C ed analizzate tramite citometria a flusso. ? stato utilizzato un citometro a flusso FACSCalibur (BD Biosciences) e l?analisi ? stata eseguita con software FlowJo (BD Biosciences).

Saggio di germinazione. La linea cellulare di endotelio microvascolare cerebrale HBMEC ? stata comprata da ScienCell Research Laboratory (Carlsbad, CA, USA). Le cellule HBMEC sono state sospese in mezzo di coltura contenente 20% di metilcellulosa, seminate con densit? pari a 1000 cellule/pozzetto, all?interno di piastre non adesive a 96 pozzetti e coltivate a 37 ?C (5% CO2, umidit? 100%). In queste condizioni, le cellule endoteliali sospese (EC) formano spontaneamente entro 4 h un singolo aggregato cellulare conosciuto come sferoide. Gli sferoidi sono stati raccolti entro 24 ore ed utilizzati negli esperimenti di germinazione angiogenetica. Brevemente, gli sferoidi sono stati seminati in micro-slides rivestite con Matrigel e le immagini sono state osservate sopo 24 h, catturate con un microscopio inverso ed analizzate con un sistema di analisi NIH Image J. Per le analisi statistiche ? stato considerato il numero di gemme per sferoide, con un minimo di 10 sferoidi per ogni trattamento.

3.2.2- Neuroblastoma: Discussione

Attivit? biologica in vitro. Inibitori c-Src selezionati sono stati valutati per la loro abilit? di inibire la proliferazione di cellule SH-SY5Y di neuroblastoma nel saggio di formazione dello sferoide. Le cellule sono state trattate per 72 h con concentrazioni crescenti di inibitore (0,01-50 ?M) ed i valori di IC50 sono stati calcolati considerando la media dell?area dello sferoide rispetto al controllo (Tabella 6). L?effetto maggiore su SH-SY5Y ? stato ottenuto con Si322 e Si306 che hanno mostrato valori di IC50 rispettivamente di 0.12 e 0.34 ?M. Il tasso di crescita dello sferoide in presenza di Si306 ed immagini rappresentative sono mostrate in Fig. 6. Gli effetti biologici di Si306 sono stati anche valutati attraverso una analisi del ciclo cellulare (Fig. 7). Le cellule SH-SY5Y sono state trattate con concentrazioni crescenti di Si306 (0,1-10 ?M) e la percentuale di cellule in ogni fase del ciclo cellulare ? stata valutata tramite una analisi citofluorimetrica del contenuto di DNA. Si306 ha determinato un significativo e dosedipendente accumulo di cellule in fase G1 del ciclo cellulare partendo da 0,1 ?M. In parallelo, gli inventori hanno osservato un progressivo accumulo di cellule ipodiploidi indicando la presenza di cellule apoptotiche. Il trattamento con 10 ?M di Si306 ha indotto apoptosi in circa il 50% delle cellule trattate.

Studi in vivo. Tra gli inibitori c-Src pi? promettenti, il composto Si306 ? stato selezionato per gli studi in vivo in quanto ha mostrato un bilancio appropriato tra le differenti propriet? ADME, notevole attivit? nel saggio enzimatico, e promettente potenza submicromolare contro cellule SH-SY5Y di neuroblastoma. L?attivit? anticancro di Si306 ? stata testata in vivo utilizzando un modello di innesto xenogeno nel topo. I topi ai quali sono state inoculate cellule SH-SY5Y di neuroblastoma sono stati trattati giornalmente con 50 mg/kg di Si306 partendo dall?inizio dell?apparizione di una massa tumorale visibile, ed il volume del tumore valutato ad intervalli regolari. Si306 ha causato una significativa riduzione del volume tumorale dopo 60 giorni di trattamento per via orale con una riduzione di pi? del 50% in media del volume tumorale comparato con i topi trattati con il placebo. Il trattamento in vivo con Dasatinib (50 mg/kg) ha determinato un andamento di inibizione molto simile ma l?apparizione di una massa tumorale tangibile ? stata riscontrata prima nel gruppo trattato con Dasatinib rispetto ad i topi trattati con Si306 (Fig. 8). Sorprendentemente, i topi non hanno mostrato segni di angoscia o perdita di peso. ? degno di nota che la angiogenesi associata alla massa tumorale alla fine ? stata significativamente compromessa nei topi trattati con Si306 (dati non riportati). Cos? ? stato eseguito un saggio di germinazione tridimensionale in vivo per analizzare gli effetti di Si306 sulla risposta angiogenetica delle cellule epiteliali. Gli sferoidi di cellule endoteliali HBMEC sono stati seminati su Matrigel. 24 h dopo l?inizio dell?esperimento, gli inventori hanno osservato una riduzione significativa dell?angiogenesi come dimostrato della riduzione del numero di gemme derivate dallo sferoide trattato con il composto, a concentrazioni di 0,5 ?M e 1 ?M, comparato con le cellule di controllo non trattate (Fig.8B).

3.3-Glioblastoma:

3.3.1-Glioblastoma: Materiali e Metodi

Test di proliferazione su cellule U87 e U251. Le cellule U87 e U251 sono state comprate da European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK) e sono state coltivate in terreno DMEM addizionato con 10% di Siero Fetale Bovino. Ai fini di determinare l?effetto antiproliferativo dei farmaci le cellule tumorali sono state seminate con densit? di 2 x 10<5 >cellule/mL e trattate con composti alle concentrazioni indicate. Le colture sono state mantenute a 37 ?C al 5% v/v CO2 per 72 h. Il numero di cellule e la vitalit? ? stata valutata con il test di esclusione del Trypan blu. Le cellule vitali sono state espresse in percentuale rispetto alle cellule non trattate (100%). Sono mostrati i valori di media e SD di minimo tre esperimenti differenti.

Innesto xenogeno di U87. Topi maschi nudi CD1 (Charles River, Milan, Italy) sono stati tenuti secondo le linee guida stabilite dall?Universit? dell?Aquila, regolamento del Dipartimento di Scienze Cliniche Applicate e Biotecnologiche, conforme al regolamento del governo Italiano n.116 del 27 Gennaio 1992 sull?uso di animali da laboratorio. Prima di qualunque manipolazione invasiva, i topi sono stati anestetizzati con un mix di ketamina (25 mg/mL) e xylazina (5 mg/mL). L?innesto del tumore ? stato ottenuto mediante iniezione s.c. di 1 x 10<6 >cellule U87 in 100 ?L di 12 mg/mL di Matrigel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Per la somministrazione di Si306 in vivo ? stata preparata una sospensione in 0,5% di soluzione di metilcellulosa. Ogni topo ha ricevuto una somministrazione orale del veicolo di metilcellulosa oppure 40 mg/kg di Si306. Alla fine i tumori sono stati recuperati e pesati. Saggio di crescita a bassa densit?. La capacit? di crescita alla densit? clonale delle cellule U87 ? stata valutata piastrandole a densit? di 10 cellule/cm<2 >in siero fetale bovino 10% addizionato di DMEM. Dopo due settimane di coltura, le cellule aderenti sono state fissate con metanolo freddo, lavate con PBS/BSA e asciugate all?aria. Le cellule aderenti sono state colorate con 0,5% di crystal violet per 15 minuti a temperatura ambiente. Le colonie colorate sono state fotomicrografate ed analizzate in numero e dimensione con il software di dominio pubblico ImageJ (by Wayne Rasband, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Sono mostrati i valori di media e SD di minimo tre esperimenti differenti.

3.3.2-Glioblastoma: Discussione

L?effetto antiproliferativo di Si306 ? stato testaro in vitro su linee cellulari U87 e U251 (Fig. 9 e 10).

Attivit? biologica in vitro. La linea cellulare U251 di glioma maligno ? stata definita da un uomo di 75 anni con GBM da Ponten e collaboratori.<29,30 >Ponten e colleghi, da una donna con GBM, hanno definito il modello di GBM U87.<30 >Queste linee cellulari di GBM sono conosciute per mimare le caratteristiche salienti del GBM umano e come tali hanno ricevuto significativa attenzione nelle ultime quattro decadi per modelli xenogenetici di cancro nei topi. <29,31>

Le linee cellulari U251 e U87 differiscono sotto importanti aspetti molecolari. U87 ? intrinsecamente pi? radioresistente rispetto a U251, il che ? parzialmente attribuibile a un maggior numero di cellule U251 in fase G2/M, lo stadio cellulare maggiormente radiosensibile, mentre le cellule U87 si trovano maggiormente in fase S e G1, lo stadio cellulare maggiormente radioresistente.<32 >U251 contiene p53 mutante e U87 contiene p53 WT.<33>

Una concentrazione di 5 ?M di Si306 ha indotto una riduzione di circa il 50% del numero totale di cellule quando comparato al controllo dopo 72h di trattamento (Fig. 9 e 10). Nelle cellule U87 (Fig. 10), l?effetto di Si306? stato pi? pronunciato che nelle cellule U251 (Fig. 9), in pi? fino all?80% di cellule morte sono state osservate in presenza di 30 ?M del composto. Studi in vivo. Si306 ? stata somministrata in vivo a topi nudi con cellule U87 inoculate sottocute. I topi hanno ricevuto 50 mg/kg di Si306 a giorni alterni e l?effetto antitumorale del composto ? stato valutato anche in combinazione con un singolo trattamento radioterapico (4Gy). Alla fine i topi che hanno ricevuto la terapia combinata hanno mostrato i tumori pi? piccoli di tutto il resto del gruppo dell?esperimento (<80% rispetto al gruppo non trattato) (Fig. 11).

La terapia combinata di Si306 pi? la radioterapia ? stata valutata anche in vitro grazie al saggio di crescita a bassa densit?. Le cellule U87 sono state seminate a bassa densit? (< 100 cellule/cm<2>) ed hanno ricevuto una irradiazione (4Gy) pi? 1 ?M o 10 ?M di Si306 a giorni alterni. Dopo 15 giorni, il numero delle colonie con pi? di 10 cellule ? stato contato. La terapia combinata ha ridotto significativamente il numero di colonie rispetto al controllo ed al singolo trattamento (Fig.12).

Si306 ? stata testata anche in combinazione con mitomicina C (Fig.13 e 14). La mitomicina ? un noto agente genotossico, le cellule U87 (Fig. 13) e U251 (Fig. 14) sono state trattate con concentrazioni crescenti di mitomicina C in presenza di 1 ?M di Si306 per 72 ore. Il trattamento combinato ha determinato un effetto antiproliferativo sinergico che ? stato pi? pronunciato nelle cellule U87.

3.4-Leucemia:

3.4.1-Leucemia: Materiali e Metodi

Attivit? antiproliferativa su linea cellulare umana K562.

Gli esperimenti in vitro sono stati effettuati utilizzando la linea cellulare umana K562 di Leucemia Mieloide Cronica (CLM). Le cellule sono state comprate dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) e sono state coltivate in terreno RPMI addizionato di 10% di Siero Bovino Fetale. Ai fini di determinare l?effetto antiproliferativo degli inibitori Fyn, le cellule K562 sono state seminate a densit? di 2 x 10<5 >cellule/mL e trattate con composti a concentrazioni crescenti da 0,01 ?M fino a 50 ?M. La coltura ? stata mantenuta a 37 ?C in 5% v/v CO2 per 72 h. Il numero delle cellule e la vitalit? ? stata valutata utilizzando un contatore di cellule automatico NucleoCounter? (Chemometec, Denmark). I risultati del NucleoCounter sono stati rappresentati sia come totale che come concentrazione cellulare non vitale, dipendentemente dall?esempio di preparazione indicato dal costruttore. IC50 (concentrazione del farmaco che determina il 50% di inibizione della crescita) ? stata calcolata con il software Grafit v4.0 (Erithacus Software Limited) utilizzando la curva sigmoide con miglior fitting.

3.4.2-Leucemia: Discussione

Alcuni membri della famiglia delle Src chinasi sono sovraespresse e/o iperattivate in CML, e la loro attivit? regola la proliferazione e la differenziazione delle cellule cancerose. Nelle cellule K562 l?espressione della chinasi Fyn ? sotto diretto controllo dell?oncogene BCR-ABL1 e la sua sovraespressione ? fondamentale per sostenere la proliferazione di K562. I composti testati hanno mostrato un?effettiva attivit? antiproliferativa che si correla bene con i valori di Ki determinati da saggi di inibizione in vitro. I composti pi? efficaci, Si308 e Si309, hanno mostrato valori promettenti di IC50 per la vitalit? cellulare in un range submicromolare. ? importante notare che questi composti, quando testati in normali fibroblasti umani, non mostrano nessun segno di tossicit? cellulare.

ESEMPIO 4

Effetto dei composti sulla neurodegenerazione

4.1-Neurodegenerazione: Materiali e Metodi

Coltura cellulare, differenziazione e trattamento su cellule SH-SY5Y. La linea cellulare SH-SY5Y di neuroblastoma ? stata coltivata in terreno ottenuto mescolando volumi equivalenti di MEM e HAM F12 addizionati con 15% di siero vitellino fetale (FCS, Australian origin, Lonza), 100U/mL di penicillina, 100 ?g/mL streptomicina e 2 mM di L-glutammina (tutti da Euroclone) e 37 ?C in aria umidificata con 5% di CO2. Il terreno ? stato cambiato ogni 48 ore. Le cellule sono state divise a raggiungimento di circa l?80% di confluenza e mai coltivate oltre il passaggio 20. La differenziazione cellulare ? stata raggiunta grazie a pretrattamento per 5 giorni delle cellule SH-SY5Y con terreni contenenti 1% FCS e 10 ?M di acido retinoico (RA, Sigma Aldrich). Successivamente le cellule sono state trattate per altri 7 giorni in terreni senza siero ed addizionati con 50 ng/mL di fattore neurotrofico cerebrale ricombinante umano (BDNF, Peprotech), 10 ng/mL di fattore beta di crescita nervoso ricombinante umano (NGF, Peprotech), 10 ng/mL di proteina neurogulina 1 beta 2 (NRG, Abcam) e 9,35 ?g/mL di vitamina D3 (Sigma Aldrich). Per confermare la completa differenziazione neuronale, ? stata controllata l?espressione di isoforme mature di Tau. Le cellule differenziate sono state trattate per 1.5, 3 e 6 ore con un terreno contenente 10 ?M di oligomeri/protofibrille A?42 e supplemento N2 (Life Technologies), in presenza o in assenza di inibitori Fyn disciolti in DMSO. Come controllo le cellule sono state trattate con terreno contenente una quantit? equivalente di DMSO.

Preparazione di A?42. I campioni di oligomeri/protofibrille A?42 sono stati preparati utilizzando i protocolli precedentemente descritti (Wong J et al., Neuroscience 210, 2012, 363-374). Brevemente, i peptidi A?42 (Sigma) sono stati disciolti in 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo e liofilizzati per rimuovere completamente il solvente. I peptidi A?42 liofilizzati sono stati ricostituiti in DMSO ad una concentrazione di 10 nM, diluita 1:100 utilizzando HAM F12 (senza rosso fenolo e glutammina), tenuto in agitazione per 15 secondi ed incubato 24 ore a 4 ?C. Gli oligomeri/protofibrille A?42 sono stati visualizzati grazie all?SDS-PAGE ed alla colorazione di argento.

ESEMPIO 5

Profarmaci dei composti dell?invenzione

A meno che non sia diversamente specificato, i materiali e metodi sono gli stessi di quelli riportati precedentemente per gli esempi 1, 2 e 3.

5.1- Chimica: Materiali e Metodi

Composti S13, Si35, Si83, Si214, Si221, Si223, Si278 e Si306 sono stati gi? riportati da noi.<18,20,21,22,23>

Procedura generale per la sintesi di profarmaci a struttura pirazolo[3,4-d]pirimidinica (proS13, proS13(A), proSi221, proSi214, proSi306, proSi35, proSi223, proSi83, proSi20, proSi278(A), proSi278(B), proSi278(C), proSi278(D))

NaHCO3 (2,25 mmol, 5,00 eq.) ? stato aggiunto ad una soluzione del composto a struttura pirazolo[3,4-d]pirimidinica appropriata (0,45 mmol, 1,00 eq.) in DCM anidro (8 mL). Dopo 5 minuti di agitazione a temperatura ambiente, la sospensione ? stata raffreddata in bagno di ghiaccio, successivamente ? stata aggiunta una soluzione di trifosgene (0,45 mmol, 1,00 eq.) in DCM anidro (8 mL). Dopo 30 minuti il bagno di ghiaccio ? stato rimosso ed ? stato permesso alla miscela di reazione di riscaldarsi fino a temperatura ambiente, la reazione ? stata mantenuta in agitazione fino alla sparizione dello spot del composto a struttura pirazolo[3,4-d]pirimidinica di partenza nella TLC (approssimativamente 2h). Una soluzione di 2-(4-Metilpiperazin-1-il)etanolo (o alcol appropriato) (0,90 mmol, 2,00 eq.) in DCM anidro ? stata aggiunta e la miscela di reazione risultante agitata a temperatura ambiente per 16 ore. Il solvente ? stato evaporato a pressione ridotta e il residuo risultante purificato grazie alla cromatografia flash utilizzando una miscela di DCM e MeOH come eluente.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil benzil(1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4il)carbammato (proS13)

Solido bianco e schiumoso. Resa: 79%. <1>H-NMR (CDCl3) ?

(ppm): 8.65 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 7.39 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.24 (m, 8H), 5.52 (dd, J = 6, 8.4 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 5.02 (dd, J = 8.8, 14.4 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 6, 14 Hz, 1H), 4.33 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.40 (m, 8H), 2.24 (s, 3H).<13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 154.7, 154.1, 154.0, 137.7, 135.7, 128.7, 128.5, 128.2, 128.1, 127.1, 127.0, 106.3, 63.9, 60.1, 56.3, 54.8, 53.7, 52.9, 49.9, 45.8. MS (ES) m/z: 535 [M+1]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (1-(2-(4-bromofenil)-2-cloroetil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)(2-clorobenzil)carbammato (proSi221)

Solido bianco e schiumoso. Resa: 76%. <1>H-NMR (CDCl3) ?

(ppm): 8.62 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.18 (m, 6H), 5.50 (m, 1H), 5.44 (s, 2H), 4.99 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.34 (m, 2H), 2.54 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.41 (m, 8H), 2.26 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 154.7, 154.6, 154.2, 136.7, 135.8, 135.1, 132.3, 131.7, 129.2, 128.9, 128.0, 127.0, 126.6, 122.8, 106.1, 64.3, 59.0, 56.2, 54.7, 53.4, 52.7, 48.1, 45.6, 29.5. MS (ES) m/z: 648 [M+1]+, 670 [M+23]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (3-clorofenil)(6-(metiltio)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi214)

Olio trasparente. Resa: 75%. <1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.93

(s, 1H), 7.35 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 7.22 (m, 7H), 4.62 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 4.39 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.22 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.47 (m, 8H), 2.32 (S, 3H), 2.28 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.2, 155.2, 153.7, 153.1, 140.8, 137.8, 134.3, 134.1, 129.6, 129.4, 129.1, 128.7, 128.4, 127.9, 127.0, 126.7, 126.6, 103.2, 64.5, 63.8, 56.2, 54.8, 52.7, 48.3, 48.1, 45.6, 45.5, 35.1. MS (ES) m/z: 567 [M+1]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (3-bromofenil)(1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi306)

Solido bianco e schiumoso. Resa: 51%. <1>H-NMR

(CDCl3) ? (ppm): 7.95 (s, 1H), 7.48 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.42 (m, 3H), 7.29 (m, 4H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.51 (t, J = 6 Hz, 1H), 4.94 (dd, J = 8.8, 14 Hz, 1H), 4.71 (dd, J = 6, 14 Hz, 1H), 4.35 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 3.01 (m, 2H), 2.49 (m, 19H), 2.27 (s, 3H).

<13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.1, 155.8, 153.9, 153.0, 140.8, 137.7, 135.2, 131.8, 130.9, 130.0, 128.8, 128.5, 127.4, 127.1, 121.9, 103.2, 77.1, 76.8, 76.5, 66.7, 64.5, 59.9, 57.4, 56.2, 54.8, 53.3, 53.2, 52.8, 45.6, 31.7, 30.7, 29.5, 29.1, 27.9. MS (ES) m/z:745 [M+1]+, 767 [M+23]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (3-bromofenil)(6-metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi278 (A))

Olio trasparente. Resa: 30%.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.88 (s,

1H), 7.49 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.12 (m, 7H), 4.49 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 4.35 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.53 (m, 1H), 2.55 (m, 10H), 2.35 (s, 3H), 2.8 (s, 3H)1.41 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 175.5, 168.4, 155.8, 153.9, 153.3, 141.0, 134.5, 132.0, 131.1, 130.2, 128.5, 127.6, 127.2, 126.8, 122.1, 103.2, 64.6, 56.1, 54.0, 53.8, 51.8, 44.5, 39.9, 21.8, 18.8, 14.1. MS (ES) m/z: 626 [M+1]+, 648[M+23]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil butyl(1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(etiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi20)

Olio trasparente. Resa: 39%.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 8.08 (s,

1H), 7.39 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.27 (m, 3H), 5.50 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 8.4, 14.4 Hz, 1H), 4.76 (dd, J = 6.4, 14 Hz, 1H), 4.37 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.03 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.17 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.67 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.54 (m, 8H), 2.31 (s, 3H), 1.66 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.43 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.31 (m, 3H), 0.93 (t, J = 7.1 Hz, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.2, 155.7, 154.4, 154.4, 138.1, 136.1, 128.9, 128.7, 127.4, 104.0, 63.9, 60.1, 56.6, 55.1, 53.8, 53.2, 47.3, 46.0, 30.9, 29.7, 25.4, 20.1, 14.7, 13.9. MS (ES) m/z: 561 [M+1]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)(fenetil)carbammato (proSi35)

Olio trasparente. Resa: 71%. <1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 8.06

(s, 1H), 7.41 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.24 (m, 8H), 5.51 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.93 (dd, J = 8, 14 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 6.8, 14.4 Hz, 1H), 4.30 (m, 4H), 3.02 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.65 (m, 11H), 2.38 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.7, 155.7, 154.1, 138.7, 138.0, 136.1, 129.0, 128.7, 128.5, 127.4, 126.5, 103.7, 63.6, 60.1, 56.4, 54.7, 53.8, 52.3, 48.8, 45.4, 35.1, 29.7, 14.3. MS (ES) m/z: 595 [M+1]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (1-(2-(4-bromofenil)-2-cloroetil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)(fenil)carbammato (proSi223)

Solido bianco. Resa: 25%.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 8.61 (s, 1H),

7.77 (s, 1H), 7.42 (m, 4H), 3.76 (m, 5H), 5.48 (t, J = 8 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 8.4, 14 Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 6.4, 14 Hz, 1H), 4.36 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.43 (m, 8H), 2.31 (S, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 155.6, 155.0, 154.7, 153.6, 139.9, 136.8, 135.0, 131.9, 129.1, 128.7, 128.3, 123.1, 106.1, 65.2, 64.8, 59.2, 56.3, 56.2, 54.8, 54.7, 53.6, 53.4, 52.4, 45.5, 30.3, 29.7. MS (ES) m/z: 598 [M+1]+, 620 [M+23]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etil (1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)(3-clorofenil)carbammato (proSi83)

Olio trasparente. Resa: 85%. <1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.95

(s, 1H), 7.40 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.29 (m, 6H), 7.11 (m, 1H), 5.50 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 4.93 (dd, J = 8.4, 14 Hz, 1H), 4.76 (dd, J = 6.4, 14 Hz, 1H), 4.35 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.55 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.41 (m, 8H), 2.27 (s, 3H), 2.26 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.6, 155.8, 153.7, 153.1, 140.6, 137.7, 135.2, 134.1, 129.6, 129.0, 128.8, 128.5, 127.9, 127.2, 126.9, 103.0, 64.6, 59.8, 56.2, 54.8, 53.6, 52.8, 45.7, 29.5. MS (ES) m/z: 601 [M+1]<+>.

1-(4-Metilpiperazin-1-il)propan-2-il (3-bromofenil)(6-metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi278 (B))

Olio trasparente. Resa: 30%.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.88 (s,

1H), 7.46 (m, 2H), 7.24 (m, 5H), 7.16 (m, 2H); 5.20 (m, 1H), 4.50 (m, 2H), 3.52 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 2.45 (m, 10H), 2.33 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 1.22 (m, 6H).<13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.1, 155.5, 153.9, 152.9, 143.1, 141.1, 134.29, 131.8, 130.6, 129.8, 128.2, 127.3, 127.0, 126.5, 121.7, 103.15, 71.0, 62.6, 54.8, 53.5, 52.7, 45.4, 39.7, 29.5, 18.5, 17.9. MS (ES) m/z: 639 [M+1]<+>.

1-(4-Metilpiperazin-1-il)butan-2-il (3-bromofenil)(6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi278 (C))

Olio trasparente. Resa: 40%.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.90

(s, 1H), 7.46 (m, 2H), 7.24 (m, 5H), 7.16 (m, 2H); 5.08 (m, 1H), 4.50 (m, 2H), 3.52 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 2.50 (m, 12H), 2.29 (s, 3H), 2.27 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 0.88 (m, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 170.2, 155.4, 154.0, 153.2, 143.1, 141.1, 134.4, 131.8, 130.5, 129.7, 128.2, 127.3, 127.0, 126.5, 121.7, 103.4, 75.4, 61.0, 54.9, 53.5, 45.6, 39.7, 29.5, 25.1, 18.5, 13.9, 9.34. MS (ES) m/z: 652 [M+1]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)-1-feniletil (3-bromofenil)(6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi278 (D))

Olio trasparente. Resa: 32%.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.74

(s, 1H), 7.54 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.21 (m, 12H), 6.00 (d, J = 8.8 Hz, 1H); 4.48 (m, 2H), 3.53 (q, J = 6.8 Hz, 1H), 2.88 (bs, 6H), 2.72 (m, 7H), 2.31 (s, 3H), 1.25 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 168.4, 155.7, 153.9, 152.8, 143.3, 141.2, 137.6, 134.4, 132.1, 131.1, 130.3, 128.7, 127.4, 127.2, 126.8, 126.3, 122.0, 103.2, 75.4, 63.2, 54.4, 53.8, 51.2, 44.4, 39.9, 29.7, 25.1, 18.7. MS (ES) m/z: 652 [M+1]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)etanolo (30)

La metilpiperazina (3,54 mL, 31,9 mmol, 1.33 eq.) ? stata disciolta in

toluene (11 mL), il bromoetanolo (1,70 mL, 23,9 mmol, 1.00 eq.) ? stato lentamente aggiunto e la miscela di reazione ? stata messa in agitata o.n. a r.t. Poi ? stata filtrata e la fase organica recuperata, il solvente rimosso a pressione ridotta per dare il prodotto desiderato. Resa: 80%.

Solido bianco.<1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 4.51 (s, 1H); 3.14 (m, 2H); 2.01 (m, 10H); 1.78 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 59.8, 58.0, 54.4, 52.6, 45.5. MS (ES) m/z: 145 [M+H]<+>.

1-(4-Metilpiperazin-1-il)propan-2-olo (31)

La metilpiperazina (55,0 ?L, 0,50 mmol, 2.00 eq.) ? stata disciolta in

toluene (7 mL), l?1-bromo-2-propanolo (23,0 ?L, 0,25 mmol, 1.00 eq.) ? stato lentamente aggiunto e la miscela di reazione lasciata in agitazione o.n. a r.t.. Poi ? stata filtrata e la fase organica recuperata, il solvente rimosso a pressione ridotta per dare il prodotto desiderato. Resa: 38%. Olio trasparente.<1>H-NMR (MeOD) ? (ppm): 4.51 (s, 1H); 3.14 (m, 2H); 2.01 (m, 10H); 1.78 (s, 3H). <13>C-NMR (MeOD) ? (ppm): 63.8, 63.0, 52.8, 50.6, 42.7, 19.8. MS (ES) m/z: 160 [M+H]<+>.

1-(4-Metilpiperazin-1-il)butan-2-olo (32)

ZnCl2 (12,4 mg, 0,09 mmol, 0,10 eq.) ? stato aggiunto alla soluzione di

metilpiperazina (110 ?L, 1,00 mmol, 1,10 eq.) e 1,2-epossibutano (79,0 ?L, 0,91 mmol, 1.00 eq.) in ACN (8 mL); la miscela di reazione in agitazione ? stata messa a riflusso per 16 ore. Successivamente purificata con cromatografia flash usando PE:EtOAc:MeOH:Et3N = 10:8:1:1 come eluente. Resa: 31%. Olio trasparante. <1>H-NMR (MeOD) ? (ppm): 3.62 (m, 1H); 2.47 (bs, 8H); 2.32 (m, 2H); 2.26 (s, 3H); 1.43 (m, 2H); 0.92 (t, J = 7.6 Hz, 3H). <13>C-NMR (MeOD) ? (ppm): 71.5, 61.5, 58.2, 57.6, 46.6, 28.3, 9.5. MS (ES) m/z: 173 [M+H]<+>.

2-(4-Metilpiperazin-1-il)-1-feniletanolo (33)

La metilpiperazina (55,0 ?L, 0,50 mmol, 2.00 eq.) ? stata disciolta in

toluene (7 mL) e la miscela di reazione scaldata a 100 ?C, successivamente ? stato lentamente aggiunto ossido di stirene (23,0 ?L, 0,25 mmol, 1.00 eq.) e la miscela di reazione lasciata in agitazione o.n. a 130 ?C. ? stata aggiunta H2O ed ? stata eseguita estrazione con DCM (x3); la fase organica ? stata raccolta, lavata con brine ed anidrificata con Na2SO4. L?olio residuo ottenuto dopo evaporazione del solvente ? stato purificato con cromatografia flash utilizzando EtOAc:MeOH = 8:2 come eluente. Resa: 60%. Olio trasparente. <1>H-NMR (CDCl3) ? (ppm): 7.29 (m, 5H); 4.71 (m, 1H); 3.93 (bs, 1H); 2.75 (bs, 2H); 2.49 (m, 8H); 2.27 (s, 3H). <13>C-NMR (CDCl3) ? (ppm): 142.2, 128.3, 127.5, 125.8, 68.8, 66.15, 55.2, 53.0, 46.0. MS (ES) m/z: 221 [M+H]+.

Metodo Cromatografico

Le analisi di LC sono state eseguite con un sistema Agilent 1100 LC/MSD VL (G1946C) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) costituito da un?unit? di degassamento del solvente sotto vuoto, una pompa binaria a gradiente ad alta pressione, un detector UV di serie 1100, e uno spettrometro di massa di modello VL benchtop 1100 MSD.

I profili cromatografici sono stati ottenuti usando una colonna Varian Polaris C18-A (150 -4.6 mm, 5 ?m di dimensione delle particelle) e come gradiente di eluizione: l?eluente A era ACN e l?eluente B acqua. Le analisi sono cominciate con il 2% di eluente A, che ? stato rapidamente aumentato fino al 70% in 12 min, successivamente aumentato lentamente fino al 98% in 20 min. La velocit? di flusso ? stata 0,8 mL min<-1 >e il volume iniettato 20 ?L.

Lo strumento a singolo quadrupolo Agilent di serie 1100 mass spectra detection (MSD) ? stato equipaggiato con lo spray ortogonale API-ES (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). L?azoto ? stato usato come gas nebulizzante ed essiccante. La pressione del gas nebulizzante, il flusso del gas essiccante, il voltaggio del capillare, il voltaggio del fragmentor, e la temperatura di vaporizzazione sono stati settati a 40 psi, 9 L/min, 3000 V, 70 V, e 350?C, rispettivamente. La rilevazione UV ? stata monitorata a 254 nm. La determinazione LC-ESI-MS ? stata eseguita usando MSD in modalit? ione positivo. Gli spettri sono stati acquisiti in un intervallo di scansione m/z 100-1500, usando una misura di scalino di 0,1 u.

Saggio di Solubilit? in Acqua.

Il composto solido (1 mg) ? stato aggiunto a 1 mL di acqua. I campioni sono stati agitati in un bagno agitatore a 20?C per 24 h. Le sospensioni sono state filtrate attraverso un filtro di nylon (Acrodisc) di 0,45-?m, e il composto solubilizzato ? stato determinato con un saggio LC-UV-MS. La determinazione ? stata eseguita in triplicato.

Le analisi cromatografiche sono state eseguite con il metodo sopra riportato e la quantificazione dei composti ? stata fatta mediante il confronto con apposite curve di calibrazione realizzate con soluzioni standard in metanolo.

Saggio di Permeabilit? su Membrane Artificiali Parallele (PAMPA).

La soluzione donatrice dei composti testate (0,5 mM) ? stata preparata diluendo una soluzione stock 1 mM del composto in dimetilsolfossido (DMSO) usando tampone fosfato (pH 7,4, 25 mM). I filtri sono stati rivestiti con 5 ?L di una soluzione di fosfatidilcolina in dodecano all? 1% (p/v) o con 4 ?L di una soluzione lipidica polare di cervello (20 mg/mL 16% CHCl3, 84% dodecano) preparata a partire da una soluzione al 10% p/v di CHCl3, per la permeabilit? intestinale e la permeabilit? della BEE, rispettivamente. La soluzione donatrice (150 ?L) ? stata aggiunta ad ogni pozzetto della piastra filtrante. Ad ogni pozzetto della piastra accettrice sono stati aggiunti 300 ?L di soluzione (50% DMSO in tampone fosfato). I composti sono stati testati in tre piastre diverse in giorni diversi. Il sandwich ? stato incubato per 5 h a temperatura ambiente sotto leggera agitazione. Dopo il tempo di incubazione, le piastre sono state separate, e sono stati presi campioni da entrambi i lati, ricevente e donatore, e sono stati analizzati usando LC con rilevazione UV a 254 nm.

Le analisi cromatografiche sono state eseguite con il metodo sopra riportato.

La permeabilit? (Papp) per il PAMPA ? stata calcolata secondo la seguente equazione, ottenuta da Wohnsland and Faller and Sugano et al.<27, 28>.

L?equazione ? con alcune modifiche al fine di ottenere i valori di permeabilit? in cm/s:

dove VA ? il volume nel pozzetto accettore, VD ? il volume nel pozzetto donatore (cm<3>), A ? l? ?area effettiva? della membrana (cm<2>), t ? il tempo di incubazione (s) e r il rapporto tra la concentrazione di farmaco nell?accettore e la concentrazione del farmaco all?equilibrio nel volume totale (VD+VA). La concentrazione di farmaco ? stata stimata usando l?integrazione dell?area dei picchi.

La ritenzione di membrana (%) ? stata calcolata secondo la seguente equazione:

dove r ? il rapporto tra la concentrazione di farmaco nell?accettore e la concentrazione all?equilibrio, D, A, e Eq rappresentano la concentrazione di farmaco nel donatore, nell?accettore e nella soluzione all?equilibrio, rispettivamente.

5.2-Attivit? Biologica:Materiali e Metodi

Saggio di Stabilit? Microsomiale.

Ciascun composto, solubilizzato in DMSO, ? stato incubato a 37 ?C per 60 min in tampone fosfato 25 mM (pH 7,4), 5 ?L di proteine microsomiali di fegato umano (0,2 mg/mL), in presenza di un sistema generante-NADPH al volume finale di 0.5 mL (concentrazione finale dei composti, 50 ?M); il DMSO non ha superato il 2% (soluzione finale). La reazione ? stata interrotta mediante raffreddamento in ghiaccio e aggiungendo 1.0 mL di acetonitrile. Le miscele di reazione sono state poi centrifugate per 15 min a 10000 rpm, e il farmaco di partenza e i metaboliti sono stati successivamente determinati con LC-UV-MS.

Le analisi cromatografiche sono state eseguite con il metodo sopra riportato.

La percentuale di composto non metabolizzato ? stata calcolata mediante il confronto con le soluzioni di riferimento. La determinazione ? stata eseguita in triplicato.

Test di stabilit?

Le soluzioni di profarmaco (500 ?M) mantenute a 20?C, sono state preparate dissolvendo i composti in tampone fosfato 0,0125 M pH 7,4, acqua e metanolo, rispettivamente. Aliquote (20 ?L) prelevate durante il periodo di incubazione di 48 h sono state analizzate tramite HPLC.

Per determinare la stabilit? enzimatica, sono stati miscelati plasma umano (750 ?L), tampone fosfato (700 ?L) e 50 ?L di una soluzione 3,0 mM di profarmaco in MeOH (concentrazione finale 100 ?M).

La fiala ? stata incubata a 37 ?C e, a intervalli di tempo predeterminato, un?aliquota di 150 ?L ? stata prelevata, miscelata con 600 ?L di acetonitrile freddo e centrifugata a 5000 rpm per 15 minuti. Il supernatante ? stato rimosso e analizzato tramite HPLC.

L?idrolisi dei composti ? stata seguita con HPLC con metodi di rilevamento UV-MS sopra riportati.

L?emivita della quantit? degradata (t1/2) ? stata calcolata secondo la seguente equazione, ottenuta da Sobol et al<79>.

Dove ln(2) ? il logaritmo naturale di 2 (0.693) e k ? la costante di eliminazione.

I valori sono espressi in minuti.

Saggio di proliferazione

Cellule U87 and U251 sono state acquistate dall? European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK) e sono state coltivate in mezzo DMEM integrato con il 10% di Siero Fetale Bovino. Al fine di determinare l?effetto antiproliferativo dei farmaci, le cellule tumorali sono state seminate a una densit? di 2?10<5 >cellule/ml e trattate con i composti alle concentrazioni indicate. Le colture sono state mantenute a 37?C in CO2 al 5% v/v per72 h. Il numero di cellule e la vitalit? sono stati valutati con il test ad esclusione Trypan blue. Le cellule vitali sono state espresse in percentuale rispetto alle cellule non trattate (=100%). Sono mostrate le medie dei valori e SD di almeno tre diversi esperimenti.

Attivit? antiproliferativa su linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Gli esperimenti in vitro sono stati eseguiti usando la linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Le cellule sono state acquistate dall?American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) e sono state coltivate in mezzo DMEM integrato con il 10% di Siero Fetale Bovino. Al fine di determinare l?effetto antiproliferativo dei farmaci le cellule SH-SY5Y sono state seminate a una densit? di 2?10<5 >cellule/ml e sono state trattate con i composti a concentrazioni crescenti 0,01 a 50 ?M. Le colture sono state mantenute a 37?C in CO2 al 5% v/v per72 h. Il numero di cellule e la vitalit? sono stati valutati usando il contatore automatico di cellule NucleoCounter? (Chemometec, Denmark). I risultati del NucleoCounter hanno rappresentato la concentrazione cellulare sia totale che non-vitale, a seconda della preparazione del campione indicata dal costruttore. L?IC50 (concentrazione di farmaco che ha determinato il 50% di inibizione della crescita) ? stata calcolata con il software Grafit v4.0 (Erithacus Software Limited) usando la miglior curva sigmoide usando la curva sigmoide pi? adatta.

Distribuzione tissutale in vivo. Topi maschi BALB/c (Charles River, Milano, Italia) sono stati mantenuti sotto le linee guida stabilite dall? Universit? dell?Aquila, regolamento del Dipartimento di Scienze Cliniche Applicate e Biotecnologiche, conforme al regolamento del governo Italiano n.116 del 27 Gennaio 1992 sull?uso di animali da laboratorio. Ogni animale ? stato trattato con 50 mg/Kg del composto, solubilizzato in DMSO (p.i.). Due gruppi di animali sono stati trattati con 30 e Pro30, rispettivamente. Ciascun esperimento ? stato eseguito in quadruplicato.

Dopo 24 ore, i topi sono stati sacrificati e sono stati raccolti il sangue e il cervello e sono stati trattati per le analisi quantitative.

Il sangue, precedentemente eparinizzato, ? stato centrifugato a 4000 rpm per 20 minuti per separare la frazione plasmatica e dopo sono stati raccolti 500 ?l in una fiala da test. Per ogni campione ? stato aggiunto 1 ml di ACN (in presenza del composto S345?M, come standard interno, vedi Fig.1) per denaturare le proteine e per estrarre il farmaco e il pro farmaco.

I campioni sono stati centrifugati a 4000 rpm per 20 minuti, il surnatante ? stato recuperato, evaporato e analizzato con il metodo LC-UV-MS sopra riportato.

Il cervello ? stato omogeneizzato in presenza di tampone Tris-HCl (50mM) e dopo trattato come precedentemente descritto per il sangue.

Preparazione dei campioni

Figura 1.

5.3-Profarmaco: Discussione

L?uso di profarmaci ? versioni chimicamente modificate del farmaco farmaceuticamente attivo, che dopo essere stati sottoposti a trasformazioni in vivo rilasciano il farmaco attivo ? rappresenta una strategia consolidata per migliorare le propriet? fisico-chimiche, biofarmaceutiche o farmacocinetiche di potenziali candidati farmaci.<34,35>

L?attivit? biologica delle pirazolo[3,4-d]pirimidine ? a volte associate ad una bassa solubilit? in acqua che potrebbe influenzare il futuro sviluppo di questi candidati farmaci. Per superare questo problema, migliorare le propriet? farmacocinetiche e facilitare la distribuzione in vivo, sono stati sintetizzati profarmaci di composti pirazolo[3,4-d]pirimidinici.<36 >

Questi composti sono caratterizzati da una porzione solubilizzante, ossia un gruppo N-metilpiperazino, legato alla posizione C4 del nucleo pirazolo[3,4-d]pirimidinico, tramite una catena O-alchil carbammica.

Lo sviluppo di una sintesi rapida e versatile, applicabile ad una vasta gamma di composti finali precedentemente sintetizzati, ? stato un primo obiettivo. Dopo la sintesi degli alcoli appropriati 30, 31, 32 e 33 (Schema 5), ? stata eseguita una procedura one pot-two step, usando bicarbonato di sodio come base per: la formazione di cloro carbonato e il successivo spiazzamento del cloro con l?alcol. (Schema 6). Tutti i profarmaci (proS13, proS13(A), proSi221, proSi214, proSi306, proSi35, proSi223, proSi83, proSi20, proSi278(A), proSi278(B), proSi278(C), proSi278(D)) sono stati sintetizzati a partire dal corrispondente composto S-Si (S13, Si221, Si214, Si306, Si35, Si223, Si83, Si20, Si278) elencati in Tabella 7.

Schema 5. Sintesi degli alcoli 30, 31, 32 e 33<a>

Schema 6. Procedura generica per la sintesi dei derivati profarmaci di formula IIIaa

Dove

R35?OH ? un composto alcolico,

R8, R27?, R28?, R29?, R30?, R31?, R32?, R34? sono come sopra definiti, e

R35? ?:

una catena alchilica con formula:

dove Y ? NH o O o S; R36? ? H o alchile o arile o arilalchilee; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1;

oppure:

dove Y ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

oppure:

doveY ? NH o O o S;

n ? un numero intero da 0 a 4;

Tabella 7: Composti Pirazolo[3,4-d]pirimidinici e loro rispettivi Profarmaci recentemente sintetizzati.

Sono state valutate la solubilit? in acqua, la permeabilit? apparente nel tratto GI (gastro intestinale) e nella BEE (barriera emato-encefalica). Sono anche riportate le stabilit? in PBS, MeOH e plasma (Tabella 8).

Tabella 8: Caratterizzazione di composti esempio: solubilit?, stabilit? e permeabilit? di membrane

I profarmaci hanno dimostrato una solubilit? in acqua migliore rispetto ai rispettivi farmaci. Inoltre aumentando l?ingombro della porzione di profarmaco ne risulta un miglioramento della stabilit? in plasma, permettendo cos? agli inventori di scegliere il sostituente giusto a seconda della necessit? (t1/2 in plasma umano: proSi278 (A) (3,21 h) < proSi278 (B) (10,4 h) < proSi278 (C) (11,31 h)).

La Tabella 9 mostra i dati cellulari in line cellulari di glioma (U251, U87) e neuroblastoma (SH-SY5Y), i profarmaci hanno mostrato un generale aumento di attivit? verso queste linee cellulari di cancro.

Tabella 9: Valutazione biologica di composti esempio

La Fig. 15 mostra la biodistribuzione in vivo: proSi306 (e il prodotto derivato dalla sua idrolisi, ossia Si306) hanno mostrato una pi? alta concentrazione nel cervello (sede del glioma) in confronto al farmaco. Lo stesso saggio ha dimostrato l?idrolisi in vivo di proSi306, con il conseguente rilascio del farmaco Si306. Inoltre, l?analisi del plasma ha indicato un miglior profilo di distribuzione per il profarmaco. Questi risultati hanno dimostrato la validit? dell?aproccio dei profarmaci, infatti la quantit? del composto totale ? data dalla somma di proSi306 e Si306 (prodotto dall?idrolisi) ? in grado di raggiungere rispettivamente il cervello e il tessuto sanguigno risulta pi? alta di quella ottenuta dalla somministrazione del solo farmaco Si306.

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(2) Pytel, D.; Sliwinski, T.; Poplawski, T.; Ferriola, D.; Majsterek, I. Tyrosine kinase blockers: new hope for successful cancer therapy. Anticancer Agents Med. Chem.2009, 9, 66-76.

(3) Schenone S, Brullo C, Musumeci F, Botta M. Novel dual Src/Abl inhibitors for hematologic and solid malignancies. Expert Opin Investig Drugs. 2010 19, 931-45.

(4) (a) Bolen, J. B.; Rosen, N.; Israel, M. A. Increased pp60c-src tyrosyl kinase activity in human neuroblastoma is associated with amino-terminal tyrosine phosphorylation of the src gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82, 7275-7279. (b) O?Shaughnessy, J.; Deseau, V.; Amini, S.; Rosen, N.; Bolen, J. B. Analysis of the c-src gene product structure, abundance, and protein kinase activity in human neuroblastoma and glioblastoma cells. Oncogene Res. 1987, 2, 1-18. (c) Bjelfman, C.; Hedborg, F.; Johansson, I.; Nordenskjold, M.; Pahlman. S. Expression of the neuronal form of pp60c-src in neuroblastoma in relation to clinical stage and prognosis. Cancer Res.1990, 50, 6908-6914. (d) Matsunaga, T.; Takahashi, H.; Ohnuma, N.; Tanabe, M.; Yoshida, H.; Iwai, J.; Shirasawa, H.; Simizu, B. Expression of N-myc and c-src proto-oncogenes correlating to the undifferentiated phenotype and prognosis of primary neuroblastomas. Cancer Res.1991, 51, 3148-3152. (e) Finlay, D.; Vuori, K. Novel noncatalytic role for caspase-8 in promoting SRC-mediated adhesion and Erk signaling in neuroblastoma cells. Cancer Res.2007, 67, 11704-11711.

(5) a) Matsunaga, T.; Shirasawa, H.; Tanabe, M.; Ohnuma, N.; Takahashi, H.; Simizu, B. Expression of alternatively spliced src messenger RNAs related to neuronal differentiation in human neuroblastomas. Cancer Res. 1993, 53, 3179-3185. b) Matsunaga, T.; Shirasawa, H.; Tanabe, M.; Ohnuma, N.; Kawamura, K.; Etoh, T.; Takahashi, H.; Simizu B. Expression of neuronal Src mRNA as a favorable marker and inverse correlation to N-myc gene amplification in human neuroblastomas. Int. J. Cancer, 1994, 58, 793-798.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composto di formula I, II o III

o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo, in cui Z rappresenta CH o N; R1 rappresenta una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; R8? e R9? sono indipendentemente H o CH3; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; R2 rappresenta NR10?R11? ; R10? e R11? sono indipendentemente H, alchile, cicloalchile, 1-pirrolidinile, 4-morfolinile, 1-esaidroazepinile; o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N; R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostitutito, o gruppo arilachilico non sostituito o sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove M ? NH o S o O; R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico non sostituito o sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; R3 rapresenta H o un arilalchile con la formula:

dove R22?, R23?, R24?, R25?, R26? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; R4 rappresenta:

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH; OMe, O-alchile, alchile; dove R28?, R29?, R30?, R31?, R32? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2. R5 rappresenta H, alchiltio, alchilammino, cicloalchile, cicloalchiltio, cicloalchilammino, alchile, S(CH2)nOH, S(CH2)nNH2, NH(CH2)nOH, NH(CH2)nNH2; R6 rappresenta H, o un arilalchile con la formula:

dove R22?, R23?, R24?, R25?, R26?sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2-C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove L ? CH o N; n ? un numero intero da 0 a 4; R7 rappresenta:

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH, OMe, O-alchile, alchile; dove R33? rappresenta SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; R8 rappresenta H, alchiltio, alchilammino, cicloalchile, cicloalchiltio, cicloalchilammino, alchile, S(CH2)pOH, S(CH2)pNH2, S(CH2)pNHCH3, S(CH2)pN(CH3)2, NH(CH2)pOH, NH(CH2)pNH2; NH(CH2)pNHCH3, NH(CH2)pNH(CH3)2; p ? un numero intero da 0 a 6; o una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; R8? e R9? sono indipendentemente H o CH3; m ? un numero intero da 0 a 2; o:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; R9 rappresenta:

dove R34? ? H o alchile o cicloalchile o 1-pirrolidinile o 4-morfolinile o 1-esaidroazepinile; o una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1; o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N; R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2-C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostitutio o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove M ? NH o S o O; R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; dove R35? ? una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; R36? ? H o alchile o arile o arilalchile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; R10 rappresenta:

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH; O-achile, achile; dove R28?, R29?, R30?, R31?, R32? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2-C1-6 alchile, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; con l?esclusione dei seguenti composti: 1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-N-propil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si109); N-benzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si110); 1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(4-fluorobenzil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si180); 1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-N-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si182); 1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(3-clorofenil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si181); 1-(2-cloro-2-feniletil)-6-((2-morfolinoetil)tio)-N-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si192); N-cicloesile-6-(2-morfolinoetossi)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Sv12); N4-(3-clorofenil)-N6-(2-morfolinoetil)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4,6-diammina (Sv24); 2-(4-metilpiperazin-1-il)etil butil(1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(etiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi20); 2-(4-metilpiperazin-1-il)etil (3-bromofenil)(6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)carbammato (proSi278); sono esclusi.
2. Composti di formula I secondo la rivendicazione 1 in cui Z ? N, e/o R1 ? SCH2CH24morfolinile e/o R2 ? NHC6H5 o NHC6H4mCl o NHC6H4mF o NHC6H4mBr o NHC6H4mOH e/o R3 ? H e/o R4 ? CH2CH2C6H5 o CH2CHClC6H5 o CH2CHMeC6H5 o CH2CH2C6H4pF o o i composti di formula II secondo la rivendicazione 1 in cui Z ? N e/o R2 ? NHC6H5 o NHC6H4mCl o NHC6H4mF o NHC6H4mBr o NHC6H4mOH e/o R5 is H e/o R6 = H o C6H5 o C6H4pF o C6H4pCl o C6H4pMe o 5-indolile; e/o R7 ? o CH2CH2C6H4pSO2Me o CH2CH2C6H4pPO(Me)2 o CH2CHClC6H4pSO2Me o CH2CHClC6H4pPO(Me)2. o il composto di formula III secondo la rivendicazione 1 in cui Z ? N e/o R8 ? H o SMe o SEt o SCH2CH2-4-morfolino; e/o R9 ? in cui R34? ? CH2C6H5 o CH2C6H4oCl o C6H4mCl o C6H4mBr o CH2CH2C6H5 o C6H5 o nBu; e in cui R35? ?

e/o R10 in cui R27? ? H o Cl o Me; R30? ? H o Br; e R28?, R29?, R31?, R32? sono H.
3. Composto secondo la rivendicazione 1 che ?: N-(3-Clorofenil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine (Si303); 6-[(2-Morfolin-4-iletil)tio]-N-fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si313); N-(3-Fluorofenil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-fenipropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si314); N-(3-Clorofenil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-fenipropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si307); N-(3-Clorofenil)-1-[2-(4-fluorofenil)etil]-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si327); N-(3-Bromofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-[(2-morfolin-4-iletil)tio]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si306); 3-{[6-[(2-Morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]ammino}fenol cloridrato (Si332); 3-{[6-[(2-Morfolin-4-iletil)tio]-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]ammino}fenol cloridrato (Si329); 1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si310); 3-(4-Clorofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si308); 1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-metilfenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si309); 1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-(4-metossifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si311); 1-(2-Cloro-2-feniletil)-3-fenil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina cloridrato (Si244); 3-Fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si312); 1-{4-[4-Ammino-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il]fenil}etanone (Si336); 3-(4-Clorofenil)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si337); 3-(4-Metilfenil)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si338); 3-(1H-indol-5-il)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si339); N-benzil-6-(sec-butiltio)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si146); 6-(Sec-butiltio)-1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si147); 1-(2-Cloro-2-feniletil)-6-(ciclopentiletio)-N-(3-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si170); 6-(Sec-butiltio)-N-(3-clorofenil)-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si148); Sintesi di 2-(4-benzilammino-1-stiril-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-ilammino)-etanolo (Si74); N-[2-(3-clorofenil)etil]-6-(metiltio)-1-[2-fenilvinil]-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si215); N,6-dibenzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si164); o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo.
4. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 per uso medico, preferibilmente per uso come SFKs inibitore, preferibilmente come c-Src inibitore, ancora preferibilmente per uso nel trattamento e/o prevenzione di cancro, preferibilmente il cancro ? selezionato all?interno del gruppo costituito da neuroblastoma, glioblastoma, osteosarcoma, cancro della prostata, leucemia, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma epatocellulare.
5. Composto avente formula IV o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo per uso nel trattamento e/o prevenzione di neuroblastoma e/o glioblastoma e/o una malattia neurodegenerativa:

IV In cui: Z rappresenta CH o N; R6 rapresenta H o un arilalchile con la formula:

dove R22?, R23?, R24?, R25?, R26?sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 achenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CO(C1-6 alchile), CONH2, CONH-C1-6 achile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2-C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove L ? CH o N; n ? un numero intero da 0 a 4; R8 rapresenta H, benzile, alchiltio, alchilammino, cicloalchile, cicloalchiltio, cicloalchilammino, alchile, S(CH2)pOH, S(CH2)pNH2, S(CH2)pNHCH3, S(CH2)pN(CH3)2, NH(CH2)pOH, NH(CH2)pNH2; NH(CH2)pNHCH3, NH(CH2)pNH(CH3)2; p ? un numero intero da 0 a 6; o una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; V ? un ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; V ? ciclopropile o ciclopentile o cicloesile; R8? e R9? sono indipendentemente H o CH3; m ? un numero intero da 0 a 2; o:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; R10 rappresenta

dove R27? rappresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH; O-achile, alchile; dove R28?, R29?, R30?, R31?, R32? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2-C1-6 alchile, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilalchilico sostituito o non sostituito; SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; o R10 rappresenta

dove R27? rapresenta H, CH3, CF3, F, Cl, Br, OH, OMe, O-alchile, alchile; dove R33? rappresenta SO2H, SO2CH3, PO2, PO(CH3)2, POHCH3, POH2, SO2J dove J ?:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero da 0 a 4; R11 rappresenta NR37?R38? ; R37? e R38? sono indipendentemente H, alchile, cicloalchile, 1-pirrolidinile, 4-morfolinile, 1-esaidroazepinile; o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N; R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilachilico sostituito o non sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove M ? NH o S o O; R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilachilico sostituito o non sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4; o una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1; o una catena carbonilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; R36? ? H o alchile o arile o arilalchile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; o R11 rapresenta

dove R34? ? H o alchile o cicloalchile o 1-pirrolidinile o 4-morfolinile o 1-esadroazepinile; o una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; n ? un numero intero da 0 a 4; i ? un numero intero da 0 a 1; o un arilalchile con la formula:

dove T e U sono indipendentemente C o N; R12?, R13?, R14?, R15?, R16? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHCONH-C1-6 alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilachilico sostituito o non sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove M ? NH o S o O; R17?, R18?, R19?, R20?, R21? sono indipendentemente H, C1-6 alchile, C2-6 alchenile, C2-6 alchinile, gruppo arilico sostituito o non sostituito, alogeno, aloalchile, OCH3, NO2, CN, CONH2, CONH-C1-6 alchile, CON(C1-6 alchile)2, NH2, NH-C1-6 alchile, N(C1-6 alchile)2, NHC(O)alchile, NHSO2C1-6 alchile, SO2NH2, SO2NHC1-6 alchile, SO2N(C1-6 alchile)2, OQ? o SQ? dove Q? ? H, o gruppo alchilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilico sostituito o non sostituito, o gruppo arilachilico sostituito o non sostituito, n ? un numero intero da 0 a 4; dove R35? ? una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; R36? ? H o alchile o arile o arilalchile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; con la condizione che composti: N-(3-clorofenil)-6-(metiltio)-1-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si214); 6-(metiltio)-N-fenil-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si276); N-(3-clorofenil)-6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si277); N-(3-bromofenil)-6-(metiltio)-1-(2-fenilpropil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si278) N-benzil-1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si34); 1-(2-cloro-2-feniletil)-6-(metiltio)-N-fenetil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si35); e 1-(2-cloro-2-feniletil)-N-(3-clorofenil)-6-(metiltio)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ammina (Si83); siano esclusi.
6. Composto per uso secondo la rivendicazione 5 che ?:

o uno stereoisomero o un sale farmaceuticamente accettabile di questo.
7. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 per un uso con una ulteriore terapia anti-tumorale, preferibilmente l?altra terapia anti-tumorale ? radioterapia, preferibilmente l?altra terapia anti-tumorale ? una chemioterapia selezionata dal gruppo costituito da: mitomicina C, cisplatino, etoposide, vincristina, doxorubicina, isotretinoina e ciclofosfammide.
8. Composizione farmaceutica comprendente il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 6 e un vettore farmaceuticamente accettabile, preferibilmente il vettore farmaceuticamente accettabile ? una nanoparticella come: liposoma, albumina e ciclodestrina.
9. Processo per la preparazione di un composto di formula III come definito nella rivendicazione 1, in cui

comprendente il seguente passaggio:

In cui R8, R27?, R28?, R29?, R30?, R31?, R32?, R34? sono come definiti nella rivendicazione 1, e in cui R35? ?: una catena alchilica con la formula:

dove Y ? NH o O o S; R36? ? H o alchile o arile o arilalchile; X ? CH o N; W ? NH o NCH3 o O; m ? un numero intero da 0 a 2; i ? un numero intero da 0 a 1; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; o:

dove Y ? NH o O o S; n ? un numero intero da 0 a 4; o un processo per la preparazione di composti di formula I come definiti nella rivendicazione 1, o sali di questo, comprendente i seguenti passaggi:

aReattivi e condizioni: (i) 4-(2-cloroetil)morfolina, NaOH, EtOH, anidra DMF, riflusso, 6 ore; (ii) POCl3/DMF, CH2Cl2, riflusso, 6-8 ore; (iii) R2NH2, EtOH, riflusso, 3-5 ore. o un processo per la preparazione di composti di formula IV come definiti nella rivendicazione 5, o sali di questo, comprendente i seguenti passaggi:

o un processo per la preparazione di composti di formula IV come definiti nella rivendicazione 5, o sali di questi, comprendente i seguenti passaggi:

o un processo per la preparazione di composti di formula IV come definiti nella rivendicazione 5, o sali di questi, comprendente i seguenti passaggi:

o un processo per la preparazione del composto Si74 di formula IV come definito nella rivendicazione 5, o sali di questo, comprendente i seguenti passaggi:

a Reattivi e condizioni: i. mCPBA, CHCl3, t.a., 6 ore; ii.2-aminoetanolo, DMSO, butan-1-olo, 90 ?C, 12 ore. o un processo per la preparazione del composto Si164 di formula IV come definito nella rivendicazione 5, o sali di questo, comprendente i seguenti passaggi: