ITRM20120560A1 - NEW MARKERS FOR THE MONITORING OF THE KIDNEY TRANSPLANT. - Google Patents
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Description
"NUOVI MARCATORI PER IL MONITORAGGIO DEL TRAPIANTO DI RENE" "NEW MARKERS FOR KIDNEY TRANSPLANT MONITORING"
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda una selezione di marcatori utilizzabili su urine e/o sangue per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapianto in un paziente ed un kit per realizzare tale metodo. The present invention relates to a selection of markers that can be used on urine and / or blood to monitor a kidney transplant and / or to predict a rejection of a kidney transplant in a patient and a kit for carrying out this method.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE STATE OF THE PRIOR ART
Il trapianto di un organo rimane la strategia terapeutica di elezione nei casi in cui si osserva un’irreparabile danno funzionale a carico dello stesso. Tuttavia, successivamente al trapianto, possono insorgere diverse complicanze delle quali la più drammatica è il rigetto, ad esempio acuto, dell’organo trapiantato. Organ transplantation remains the therapeutic strategy of choice in cases where irreparable functional damage is observed. However, after the transplant, various complications may arise, the most dramatic of which is rejection, for example acute, of the transplanted organ.
Allo scopo di limitare la probabilità di rigetto e al contempo evitare la perdita completa dell’organo trapiantato, al paziente è generalmente somministrata una terapia immunosoppressiva. Tuttavia, seppure da un lato i farmaci immunosoppressori consentono di diminuire il rischio di sviluppo di una risposta immunitaria contro l’organo trapiantato, dall’altro presentano una serie di effetti collaterali tra i quali, ad esempio, l’aumento della suscettibilità del paziente alle infezioni ed, in alcuni casi anche, danni citotossici per lo stesso organo trapiantato. In order to limit the likelihood of rejection and at the same time avoid complete loss of the transplanted organ, the patient is generally given immunosuppressive therapy. However, although on the one hand the immunosuppressive drugs allow to decrease the risk of developing an immune response against the transplanted organ, on the other hand they have a series of side effects including, for example, the increased susceptibility of the patient to infections and, in some cases also, cytotoxic damage to the transplanted organ itself.
In particolare, nel trapianto di rene, il rigetto acuto si manifesta clinicamente con un immediato deterioramento del tessuto e della funzione renale ai quali può seguire o meno la perdita definitiva del rene trapiantato. Dati presenti nella letteratura scientifica riportano che si osserva almeno un episodio di rigetto in circa il trenta percento dei pazienti sottoposti a trapianto di rene. In particular, in kidney transplantation, acute rejection is clinically manifested by an immediate deterioration of the tissue and renal function which may or may not be followed by the definitive loss of the transplanted kidney. Data in the scientific literature report that at least one rejection episode is observed in about thirty percent of patients undergoing kidney transplantation.
Tali pazienti, oltre a rigetto dell’organo, mostrano anche una più elevata percentuale di perdita completa delle sue funzionalità rispetto a soggetti trapiantati nei quali non è osservato alcun episodio di rigetto acuto. In aggiunta, nel caso di terapia immunosoppressiva somministrata a pazienti che hanno subito un trapianto di rene, farmaci utilizzati per questo tipo di terapia, come ad esempio la ciclosporina, possono avere effetti citotossici sull’organo trapiantato. In addition to organ rejection, these patients also show a higher percentage of complete loss of its functionality than transplant recipients in whom no episode of acute rejection is observed. In addition, in the case of immunosuppressive therapy administered to patients who have undergone a kidney transplant, drugs used for this type of therapy, such as cyclosporine, can have cytotoxic effects on the transplanted organ.
Allo stato attuale, la diagnosi di rigetto e, in particolare di rigetto acuto, è effettuata mediante tecniche chirurgiche invasive, come ad esempio, l’ago-biopsia, volte ad ottenete un campione di tessuto direttamente derivato dall’organo trapiantato. At present, the diagnosis of rejection and, in particular of acute rejection, is carried out using invasive surgical techniques, such as needle biopsy, aimed at obtaining a tissue sample directly derived from the transplanted organ.
Appare evidente che un tale approccio, presenta tutti i rischi propri delle tecniche chirurgiche e deve essere realizzato ripetutamente su pazienti trapiantati che, ovviamente, non sono in condizioni di salute ideali, ma si trovano, come sopra detto, in condizione di “immunosoppressione” post trapianto. It is clear that such an approach has all the risks inherent in surgical techniques and must be carried out repeatedly on transplant patients who, obviously, are not in ideal health conditions, but are, as mentioned above, in a condition of "immunosuppression" post transplant.
Tale approccio, inoltre, non consente un monitoraggio costante nel tempo poiché sarebbe necessario sottoporre il paziente a continui prelievi di tessuto dal rene trapiantato. Furthermore, this approach does not allow constant monitoring over time since it would be necessary to subject the patient to continuous sampling of tissue from the transplanted kidney.
Dal punto di vista molecolare, è la presenza delle diverse popolazioni linfocitarie che costituiscono l’infiltrato infiammatorio che si forma intorno all’organo trapiantato, a determinare il decorso clinico del trapianto. Diversi studi hanno dimostrato che la prevalenza di linfociti T-regolatori che presentano FoxP3 influenza positivamente l’accettazione del trapianto (O. Bestard, J.M. Cruzado, M. Mestre et al., "Achieving donor-specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3+ regulatory T celi recruitment in human renai allograft infiltrates", J Immunol, voi. 179, no. 7, pp. From a molecular point of view, it is the presence of the different lymphocyte populations that make up the inflammatory infiltrate that forms around the transplanted organ, which determines the clinical course of the transplant. Several studies have shown that the prevalence of T-regulatory lymphocytes presenting FoxP3 positively influences transplant acceptance (O. Bestard, J.M. Cruzado, M. Mestre et al., "Achieving donor-specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3 + regulatory T celi recruitment in human renai allograft infiltrates ", J Immunol, vol. 179, no. 7, pp.
4901-9, 2007; C. Braudeau, M. Racape, M. Girai et al., "Variation in numbers of CD4+CD25highFOXP3+ T cells with normal immuno-regulatory properties in long-term graft outcome", Transpl Int, voi. 20, no. 10, pp. 845-55, 2007.) 4901-9, 2007; C. Braudeau, M. Racape, M. Girai et al., "Variation in numbers of CD4 + CD25highFOXP3 + T cells with normal immuno-regulatory properties in long-term graft outcome", Transpl Int, vol. 20, no. 10, pp. 845-55, 2007.)
Nel caso del trapianto di rene, allo scopo di identificare idonei geni o proteine correlate con il decorso clinico del trapianto, sono stati saggiati, su campioni bioptici di rene, singoli marcatori molecolari come Perforina, Granzima B, 0X40, OX40L, PD1 , PDL-1 e PDL-2 (B. Li, C. Hartono, R. Ding et al., "Noninvasive diagnosis of renalallograft rejection by measurement of messenger RNA for perforin and granzyme B in urine", N Engl J Med, voi. 344, no. 13, pp. 947-54, 2001 ; C. Afaneh, T. Muthukumar, M. Lubetzky et al., "Urinary celi levels of mRNA for 0X40, OX40L, PD-1 , PD-L1 , or PD-L2 and acute rejection of human renai allografts", Transplantation, voi. 90, no. 12, pp. 1381-7, 2010). Tuttavia, ad oggi non è stato identificato un marcatore che da solo possa permettere la valutazione dello stato immunitario di un soggetto così come l’esito del trapianto. In the case of kidney transplantation, in order to identify suitable genes or proteins correlated with the clinical course of the transplant, single molecular markers such as Perforin, Granzima B, 0X40, OX40L, PD1, PDL- were tested on kidney biopsy samples. 1 and PDL-2 (B. Li, C. Hartono, R. Ding et al., "Noninvasive diagnosis of renalallograft rejection by measurement of messenger RNA for perforin and granzyme B in urine", N Engl J Med, vol. 344, no. 13, pp. 947-54, 2001; C. Afaneh, T. Muthukumar, M. Lubetzky et al., "Urinary celi levels of mRNA for 0X40, OX40L, PD-1, PD-L1, or PD-L2 and acute rejection of human renai allografts ", Transplantation, vol. 90, no. 12, pp. 1381-7, 2010). However, to date, no marker has been identified that alone can allow the assessment of a person's immune status as well as the outcome of the transplant.
Per tale motivo, nel caso di diagnosi di rigetto del rene, sono stati proposti una serie di test clinici nei quali sono valutati contemporaneamente più marcatori molecolari quali Perforina, Granzima B, IP-10, CD3, FoxP3, CXCR3, CD103, come riportato nella domanda di brevetto PCT/US2001/027754. For this reason, in the case of a diagnosis of kidney rejection, a series of clinical tests have been proposed in which several molecular markers such as Perforin, Granzyme B, IP-10, CD3, FoxP3, CXCR3, CD103 are evaluated at the same time, as reported in patent application PCT / US2001 / 027754.
Tuttavia, poiché è essenziale affinare quanto più possibile la metodologia per la valutazione della probabilità di rigetto del rene trapiantato, a causa dell’alta complessità del sistema immunitario, è auspicabile fornire test clinici più sensibili di quelli fino ad oggi disponibili. However, since it is essential to refine as much as possible the methodology for assessing the probability of rejection of the transplanted kidney, due to the high complexity of the immune system, it is desirable to provide more sensitive clinical tests than those available to date.
Scopo della presente invenzione è identificare una strategia alternativa per monitorare e/o prognosticare l’esisto del trapianto di rene che abbia una specificità e sensibilità elevata e, quindi in altri termini che mostri un’affidabilità maggiore rispetto a quella mostrata dai metodi/test noti. The purpose of the present invention is to identify an alternative strategy for monitoring and / or prognosticating the existence of kidney transplantation which has a high specificity and sensitivity and, therefore in other words, which shows greater reliability than that shown by known methods / tests. .
SOMMARIO DELL'INVENZIONE SUMMARY OF THE INVENTION
Gli inventori della presente invenzione hanno realizzato un metodo per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapianto in un paziente in cui grazie alla specifica selezione dei marcatori e dei campioni utilizzati è possibile ottenere informazioni più affidabili e specifiche sul decorso del trapianto. The inventors of the present invention have developed a method for monitoring a kidney transplant and / or prognosticating a rejection of a kidney transplant in a patient in which, thanks to the specific selection of the markers and samples used, it is possible to obtain more reliable and specific information on the course. of the transplant.
In particolare, gli inventori hanno osservato che la contemporanea determinazione dei livelli di mRNA di ciascuno dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima B, 0X40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 e l’analisi complessiva dei suddetti livelli di espressione mediante un modello statistico, di seguito definito nel dettaglio, consentono di fornire un metodo per monitorare il trapianto di rene e/o predire il rigetto del rene che si caratterizza per un’elevata affidabilità clinica. In particular, the inventors observed that the simultaneous determination of the mRNA levels of each of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima B, 0X40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 and the overall analysis of the above expression levels by means of a statistical model, defined in detail below, allow to provide a method for monitoring the transplantation of kidney and / or predict kidney rejection which is characterized by high clinical reliability.
Inoltre, il metodo oggetto della presente invenzione ovvero la determinazione dei livelli di mRNA di ciascuno dei geni di cui sopra è effettuato su un campione biologico di sangue e/o urine senza necessità quindi di ricorrere al prelievo di un campione di tessuto dell’organo trapiantato usando tecniche invasive come, ad esempio, una biopsia al fini di valutare l’esito del trapianto. Di conseguenza, il metodo qui descritto può essere vantaggiosamente utilizzato non solo per prognosticare il rigetto del rene trapiantato in un paziente ma anche per il monitoraggio nel tempo del decorso del trapianto stesso mediante determinazione dei livelli di mRNA di ciascuno dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, 0X40, 0X40 L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 e analisi degli stessi da effettuarsi su campioni di sangue e/o urine ottenuti in tempi diversi e con frequenza anche bassa, ad esempio ogni 7/15 giorni. Furthermore, the method object of the present invention or the determination of the mRNA levels of each of the above genes is carried out on a biological sample of blood and / or urine without the need therefore to resort to taking a tissue sample of the transplanted organ. using invasive techniques such as, for example, a biopsy to evaluate the outcome of the transplant. Consequently, the method described here can be advantageously used not only to predict the rejection of the transplanted kidney in a patient but also to monitor the course of the transplant over time by determining the mRNA levels of each of the FoxP3, IL-17 genes. , IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, 0X40, 0X40 L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 and analysis of same to be carried out on blood and / or urine samples obtained at different times and with a low frequency, for example every 7/15 days.
In aggiunta, essendo i livelli di mRNA di ciascuno dei marcatori sopra indicati determinabili sia su un campione di sangue che di urine, l'affidabilità del risultato ovvero l’accuratezza dell'informazione relativa alla probabilità di rigetto ottenibile con il metodo qui descritto, può essere confermata, verificata o anche migliorata applicando il metodo in oggetto in parallelo su un campione di sangue e su uno di urine del paziente che ha ricevuto il rene trapiantato. In addition, since the mRNA levels of each of the above markers can be determined both on a blood and urine sample, the reliability of the result or the accuracy of the information relating to the probability of rejection obtainable with the method described here can be confirmed, verified or even improved by applying the method in question in parallel on a blood and urine sample of the patient who received the transplanted kidney.
Per quanto sopra detto, oggetto della presente descrizione è: For the above, the subject of this description is:
un metodo per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapianto in un paziente comprendente i seguenti passaggi: a method of monitoring a kidney transplant and / or prognosticating a rejection of a kidney transplant in a patient comprising the following steps:
- determinare i livelli di mRNA per ciascuno dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 in un campione di sangue e/o d’urina di detto paziente - determine the mRNA levels for each of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 in a blood and / or urine sample from that patient
normalizzare ciascuno di detti livelli con il livello basale dell’mRNA del gene corrispondente; normalize each of these levels with the basal level of the mRNA of the corresponding gene;
- calcolare un valore predittivo sulla base di detti livelli di mRNA normalizzati; - confrontare detto valore con un valore di cutoff. - calculating a predictive value on the basis of said normalized mRNA levels; - compare said value with a cutoff value.
Ulteriore oggetto della presente invenzione è un kit per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapiantato in un campione di sangue e/o d’urina di un paziente comprendente: A further object of the present invention is a kit for monitoring a kidney transplant and / or prognostic rejection of a kidney transplanted into a patient's blood and / or urine sample comprising:
- una o più aliquote di coppie di primer per l'amplificazione di ciascuno dei cDNA dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3; e/o - one or more aliquots of primer pairs for the amplification of each of the cDNAs of the FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L genes , PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3; and / or
- una o più sonde per riconoscere ciascuno cDNA ottenuti dagli mRNA dii FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 - one or more probes to recognize each cDNA obtained from the mRNAs of FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL -1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invenzione riguarda un metodo per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapianto in un paziente comprendente i seguenti passaggi: The present invention relates to a method for monitoring a kidney transplant and / or prognosticating a rejection of a kidney transplant in a patient comprising the following steps:
- determinare i livelli di mRNA per ciascuno dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 in un campione di sangue e/o d’urina di detto paziente - determine the mRNA levels for each of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 in a blood and / or urine sample from that patient
normalizzare ciascuno di detti livelli con il livello basale dell’mRNA del gene corrispondente; normalize each of these levels with the basal level of the mRNA of the corresponding gene;
- calcolare un valore predittivo sulla base di detti livelli di mRNA normalizzati; - confrontare detto valore con un valore di cutoff. - calculating a predictive value on the basis of said normalized mRNA levels; - compare said value with a cutoff value.
Nella presente descrizione con l’espressione “monitoraggio di un trapianto di rene” s’intende il controllo dell’andamento dello stato fisiologico del rene trapiantato nel tempo. In altre parole, il monitoraggio comprende quindi la determinazione nel tempo dei livelli di mRNA di ciascun dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 utilizzando campioni di sangue e/o di urine ottenuti in tempi diversi a partire ad esempio dalla data del trapianto. In una forma di realizzazione dell'invenzione il monitoraggio può essere anche effettuato a partire dall’inizio di una specifica terapia anti-rigetto in seguito al verificarsi di un episodio di rigetto acuto del rene trapiantato. Lo scopo di questo caso è, quindi, quello di valutare prima, durante e/o dopo un generico intervallo di tempo, l’eventuale miglioramento o peggioramento, dello stato patologico del rene in un paziente sottoposto a detta terapia. In altri termini, quindi il monitoraggio è relativo all’efficacia della terapia anti-rigetto che corrisponde, in ultima analisi, anche alla probabilità di rigetto del rene in un paziente nel quale è stato osservato l’episodio immunitario contro l’organo trapiantato. In this description, the expression "monitoring of a kidney transplant" means the control of the physiological state of the transplanted kidney over time. In other words, monitoring therefore includes the determination over time of the mRNA levels of each of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 using blood and / or urine samples obtained at different times starting for example from the date of transplantation. In an embodiment of the invention, monitoring can also be carried out starting from the beginning of a specific anti-rejection therapy following the occurrence of an acute rejection episode of the transplanted kidney. The purpose of this case is, therefore, to evaluate before, during and / or after a generic time interval, any improvement or worsening of the pathological state of the kidney in a patient undergoing this therapy. In other words, therefore, the monitoring relates to the effectiveness of the anti-rejection therapy which ultimately also corresponds to the probability of kidney rejection in a patient in which the immune episode against the transplanted organ was observed.
Nella presente descrizione con l’espressione “prognosticare un rigetto di un rene trapianto” s’intende prevedere il probabile andamento del trapianto ovvero determinare con quale probabilità si verificherà il rigetto acuto e/o la perdita totale dell’organo trapiantato. In this description, the expression "prognosticate rejection of a kidney transplant" is intended to predict the likely course of the transplant or to determine with what probability acute rejection and / or total loss of the transplanted organ will occur.
Il metodo oggetto della presente invenzione si caratterizza per la selezione specifica di alcuni marcatori alcuni dei quali singolarmente già noti essere associati negativamente o positivamente all’esito del trapianto al rene. The method object of the present invention is characterized by the specific selection of some markers, some of which individually already known to be associated negatively or positively with the outcome of the kidney transplant.
In particolare, i geni la cui espressione ovvero i cui livelli di mRNA sono determinati in accordo al metodo qui descritto sono FoxP3, IL-17 (interleuchina 17), IL-23 (interleuchina 23), IL-21 (interleuchina 21), ROR-gamma (retinoic-acid-related orphan receptor ROR-gamma), IL-27 (interleuchina 27), perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3. Conseguentemente il metodo comprende un passaggio di determinazione i livelli di mRNA per ciascuno dei singoli geni FoxP3, IL-17 (interleuchina 17), IL-23 (interleuchina 23), IL-21 (interleuchina 21), ROR-gamma (retinoic-acid-related orphan receptor ROR-gamma), IL-27 (interleuchina 27), perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 in un campione di sangue e/o d’urina di un paziente a cui è stato trapiantato un rene. In particular, the genes whose expression or mRNA levels are determined according to the method described here are FoxP3, IL-17 (interleukin 17), IL-23 (interleukin 23), IL-21 (interleukin 21), ROR -gamma (retinoic-acid-related orphan receptor ROR-gamma), IL-27 (interleukin 27), perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3. Consequently, the method comprises a step to determine the mRNA levels for each of the individual genes FoxP3, IL-17 (interleukin 17), IL-23 (interleukin 23), IL-21 (interleukin 21), ROR-gamma (retinoic-acid -related orphan receptor ROR-gamma), IL-27 (interleukin 27), perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 in a sample of blood and / or urine from a patient who has had a kidney transplant.
In particolare, FoxP3 è un marcatore della popolazione anti-infiammatoria di cellule T regolatrici la cui presenza nel sito trapiantato correla con un esito positivo del trapianto stesso (O. Bestard, J.M. Cruzado, M. Mestre et al., "Achieving donor-specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3+ regulatory T celi recruitment in human renai allograft infiltrates", J Immunol, voi. 179, no. 7, pp. 4901-9, 2007; C. Braudeau, M. Racape, M. Girai et al., "Variation in numbers of CD4+CD25highFOXP3+ T cells with normal immuno-regulatory properties in long-term graft outcome", Transpl Int, voi. In particular, FoxP3 is a marker of the anti-inflammatory population of regulatory T cells whose presence in the transplant site correlates with a positive outcome of the transplant itself (O. Bestard, J.M. Cruzado, M. Mestre et al., "Achieving donor-specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3 + regulatory T celi recruitment in human renai allograft infiltrates ", J Immunol, vol. 179, no. 7, pp. 4901-9, 2007; C. Braudeau, M. Racape, M. Girai et al., "Variation in numbers of CD4 + CD25highFOXP3 + T cells with normal immuno-regulatory properties in long-term graft outcome", Transpl Int, vol.
20, no. 10, pp. 845-55, 2007). Più recentemente, una nuova popolazione di cellule CD4 con attività pro-infiammatoria che presenta il recettore nucleare retinoic-acidrelated orphan receptor ROR-gamma e secerne: IL-17 (interleuchina 17), IL-23 (interleuchina 23) e’ stata descritta ed e’ stato dimostrato influenzare negativamente il decorso del trapianto [3, 4], Per maggiori dettagli circa i geni della Perforina, Granzima B si veda B. Li et al. (B. Li, C. Hartono, R. Ding et al., "Noninvasive diagnosis of renalallograft rejection by measurement of messenger RNA for perforin and granzyme B in urine", N Engl J Med, voi. 344, no. 13, pp. 947-54, 2001); per il gene CD103 si veda R. Ding et al. (R. Ding, B. Li, T. Muthukumar et al., "CD103 mRNA levels in urinary cells predici acute rejection of renai allografts", Transplantation, voi. 75, no. 8, pp. 1307-12, 2003.); per I geni IP-10, CXCR3 si veda R.R. Tatapudi et al. (R.R. Tatapudi, T. Muthukumar, D. Dadhania et al., "Noninvasive detection of renai allograft inflammation by measurements of mRNA for IP-10 and CXCR3 in urine", Kidney Int, voi. 65, no. 6, pp. 2390-7, 2004); per I geni OX40, OX40L, PD1 , PDL-1 e PDL-2 si veda C. Afaneh (C. Afaneh, T. Muthukumar, M. Lubetzky et al., "Urinary celi levels of mRNA for 0X40, OX40L, PD-1 , PD-L1 , or PD-L2 and acute rejection of human renai allografts", Transplantation, voi. 90, no. 12, pp. 1381-7, 2010). 20, no. 10, pp. 845-55, 2007). More recently, a new population of CD4 cells with pro-inflammatory activity presenting the nuclear retinoic-acidrelated orphan receptor ROR-gamma and secreting: IL-17 (interleukin 17), IL-23 (interleukin 23) has been described and it has been shown to negatively influence the course of transplantation [3, 4]. For more details about Perforin genes, Granzima B see B. Li et al. (B. Li, C. Hartono, R. Ding et al., "Noninvasive diagnosis of renalallograft rejection by measurement of messenger RNA for perforin and granzyme B in urine", N Engl J Med, vol. 344, no. 13, pp . 947-54, 2001); for the CD103 gene see R. Ding et al. (R. Ding, B. Li, T. Muthukumar et al., "CD103 mRNA levels in urinary cells predict acute rejection of renai allografts", Transplantation, vol. 75, no. 8, pp. 1307-12, 2003.) ; for IP-10, CXCR3 genes see R.R. Tatapudi et al. (R.R. Tatapudi, T. Muthukumar, D. Dadhania et al., "Noninvasive detection of renai allograft inflammation by measurements of mRNA for IP-10 and CXCR3 in urine", Kidney Int, vol. 65, no. 6, pp. 2390 -7, 2004); for OX40, OX40L, PD1, PDL-1 and PDL-2 genes see C. Afaneh (C. Afaneh, T. Muthukumar, M. Lubetzky et al., "Urinary celi levels of mRNA for 0X40, OX40L, PD- 1, PD-L1, or PD-L2 and acute rejection of human renai allografts ", Transplantation, vol. 90, no. 12, pp. 1381-7, 2010).
La determinazione dei livelli di espressione di ciascuno dei geni della selezione di cui sopra può essere effettuata su qualsiasi campione biologico ottenuto dal paziente a cui è stato trapiantato un rene, quindi ad esempio, anche su campione bioptico dell’organo trapiantato. In una forma di realizzazione preferita dell'invenzione il campione su cui determinare i livelli di mRNA di ciascuno dei geni FoxP3, IL-17 (interleuchina 17), IL-23 (interleuchina 23), IL-21 (interleuchina 21), ROR-gamma (retinoic-acid-related orphan receptor ROR-gamma), IL-27 (interleuchina 27), perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 è un campione di sangue e/o urina. In particolare, il metodo qui descritto può essere effettuato o su un campione di sangue o su un campione di urine o su entrambi i campioni preferibilmente ottenuti ragionevolmente allo stesso tempo t=X così che entrambi siano rappresentativi di una stessa condizione relativa all’organo trapiantato e al paziente sotto esame. In una forma di realizzazione dell'invenzione la determinazione dei livelli di mRNA è effettuata su cellule mononucleate del sangue periferico comprese nel campione di sangue e/o su cellule renali comprese nel campione di urina. The determination of the expression levels of each of the genes of the above selection can be carried out on any biological sample obtained from the patient to whom a kidney has been transplanted, therefore, for example, also on a biopsy sample of the transplanted organ. In a preferred embodiment of the invention, the sample on which to determine the mRNA levels of each of the genes FoxP3, IL-17 (interleukin 17), IL-23 (interleukin 23), IL-21 (interleukin 21), ROR- gamma (retinoic-acid-related orphan receptor ROR-gamma), IL-27 (interleukin 27), perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 is a blood and / or urine sample. In particular, the method described here can be carried out either on a blood sample or on a urine sample or on both samples, preferably obtained reasonably at the same time t = X so that both are representative of the same condition relating to the transplanted organ. and to the patient under examination. In an embodiment of the invention the determination of the mRNA levels is carried out on peripheral blood mononuclear cells included in the blood sample and / or on renal cells included in the urine sample.
I livelli di mRNA di ciascun gene possono essere determinati mediante una qualsiasi tecnica ritenuta idonea dall’esperto del settore a tal fine. In generale tali tecniche possono comprendere sia tecniche in cui sono amplificati i cDNA ottenuti per retrotrascrizione degli mRNA di interesse sia rilevazione degli stessi mediante specifiche sonde in grado di riconoscerli. In una forma di realizzazione dell’invenzione la determinazione dei livelli di ciascun mRNA dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 è effettuata mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando coppie di primer ciascuna in grado di amplificare maniera specifica ciascuno degli mRNA di cui sopra. A titolo meramente esemplificativo, le coppie di primer o le sonde che possono essere utilizzate per la determinazione dei livelli di espressione dei geni sopra indicati sono riportate nelle tabelle 2 e 3 di cui sotto. The mRNA levels of each gene can be determined by any technique deemed suitable by the expert in the field for this purpose. In general, these techniques can include both techniques in which the cDNAs obtained by reverse transcription of the mRNAs of interest are amplified and their detection by specific probes capable of recognizing them. In an embodiment of the invention, the determination of the levels of each mRNA of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD -1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 is performed by polymerase chain reaction (PCR) using pairs of primers each capable of specifically amplifying each of the above mRNAs. By way of example only, the pairs of primers or probes that can be used to determine the expression levels of the genes indicated above are shown in tables 2 and 3 below.
Tabella 2 Table 2
Num. Num.
Accesso Primer Primer Referenza Access Primer Primer Reference
Gene GenBank forward revers Gene GenBank forward revers
Afaneh C et 5’TCCGCT Afaneh C and 5'TCCGCT
5’ al 2012 5 'to 2012
NM_003327 CACTCCC NM_003327 CACTCCC
OX40 ACGACGT Trasplantatio OX40 ACGACGT Trasplantatio
.2 ACTTCTG .2 ACTTCTG
GGTCAGC n 90: 1381-TCCAA 3’ 3’ 87 GGTCAGC n 90: 1381-TCCAA 3 '3' 87
5’ 5’TTCGGT Afaneh C et CACCTAC AAATTGT al 2012 5'5'TTCGGT Afaneh C et CACCTAC AAATTGT to 2012
OX40L NM_003326 OX40L NM_003326
ATCTGCCT ACTTTGAT Trasplantatio ATCTGCCT ACTTTGAT Trasplantatio
.3 .3
GCACTTC ACTTTGA n 90: 1381-3’ A 3’ 87 GCACTTC ACTTTGA n 90: 1381-3 'A 3' 87
Afaneh C et Afaneh C et
5’ 5’ al 2012 5'5 'to 2012
PD-1 NM_005018 CTACAAC TGTGTTG Trasplantatio PD-1 NM_005018 CTACAAC TGTGTTG Trasplantatio
.1 TGGGCTG GAGAAGC .1 TGGGCTG GAGAAGC
n 90: 1381-GCGG 3’ TGCAGG 3’ 87 n 90: 1381-GCGG 3 'TGCAGG 3' 87
5’ Afaneh C et GGAGATT 5’GAGTCC al 2012 5 'Afaneh C et GGAGATT 5'GAGTCC to 2012
TTTCATTT PD-L1 NM_014143 TTTCATTT PD-L1 NM_014143
AGATCCT Trasplantatio AGATCCT Trasplantatio
.2 GGAGGAT .2 GGAGGAT
GAGGAAA n 90: 1381-ACCA 3’ GTG 3’ 87 GAGGAAA n 90: 1381-ACCA 3 'GTG 3' 87
Afaneh C et Afaneh C et
5’ 5’ al 2012 5'5 'to 2012
PD-L2 AGGGAAC AGCAGCC PD-L2 AGGGAAC AGCAGCC
NM_025239 Trasplantatio NM_025239 Trasplantatio
TTACTTTG AAGTTGG TTACTTTG AAGTTGG
n 90: 1381-GCCAGC 3’ ATGGG 3’ 87 n 90: 1381-GCCAGC 3 'ATGGG 3' 87
Granzy J04071 5'- 5 'C A AG AG Afaneh C et Granzy J04071 5'- 5 'C A AG AG Afaneh C et
me B GCGAATC GGCCTCC al 2012 TGACTTA AGAGTCC- Trasplantatio CGCCATT 3' n 90: 1381-ATT-3' 87 me B GCGAATC GGCCTCC al 2012 TGACTTA AGAGTCC- Trasplantatio CGCCATT 3 'n 90: 1381-ATT-3' 87
5'- Afaneh C et al 2012 Perfori GGACCAG 5'-Trasplantatio n M28393 TACAGCT GCCCTCTT 5'- Afaneh C et al 2012 Perfori GGACCAG 5'-Trasplantatio n M28393 TACAGCT GCCCTCTT
GAAGTCA TCAGCAC n 90: 1381-TG-3' GGGTG-3' 87 GAAGTCA TCAGCAC n 90: 1381-TG-3 'GGGTG-3' 87
Afaneh C et 5’- 5GGAGCC al 2012 Foxp3 NM_014009 GAGAAGC CTTGTCG Trasplantatio TGAGTGC GATGAT-3’ n 90: 1381-CATGCA-3’ 87 Afaneh C et 5'- 5GGAGCC to 2012 Foxp3 NM_014009 GAGAAGC CTTGTCG Trasplantation TGAGTGC GATGAT-3 'n 90: 1381-CATGCA-3' 87
Tatapudi RR 5_- 5 TGGCCT et al 2004 ATTTTGTC TCGATTCT Kidney IP-10 NM_001565 CACGTGT GGATTC- International Tatapudi RR 5_- 5 TGGCCT et al 2004 ATTTTGTC TCGATTCT Kidney IP-10 NM_001565 CACGTGT GGATTC- International
TGAGATC TGAGATC
A-3_ 3_ , 65:.2390-97 Tatapudi RR 5_- 5 CAACCT et al 2004 CXCR NM 00154 ACCCAGC CGGCGTC Kidney 3 AGCCAGA ATTTAGC- International GCAC-3 3_ , 65:.2390-97 Ding et al 5_- 5_CCTGGT 2003 CD103 XM_008508 CGTGCTC GTCCTCTT Trasplantatio AGCTCCC GGTTCTG- n 75: 1307-TTCTG-3_ 3_ 12 A-3_ 3_, 65: .2390-97 Tatapudi RR 5_- 5 CAACCT et al 2004 CXCR NM 00154 ACCCAGC CGGCGTC Kidney 3 AGCCAGA ATTTAGC- International GCAC-3 3_, 65: .2390-97 Ding et al 5_- 5_CCTGGT 2003 CD103 XM_008508 CGTGCTC GTCCTCTT Trasplantatio AGCTCCC GGTTCTG- n 75: 1307-TTCTG-3_ 3_ 12
5' AGG Mansour H CAG GAA 3' TCA et al. 2008 IL-17 NM_002190 TCA CAA GCG TTG JASN TCC CAC ATG CAG 19:2277-81 GA CCC AAG T 5 'AGG Mansour H CAG GAA 3' TCA et al. 2008 IL-17 NM_002190 TCA CAA GCG TTG JASN TCC CAC ATG CAG 19: 2277-81 GA CCC AAG T
5'- Parrish-TGTGAAT 5'AACAGG Novak j et al IL-21 NM_ AAAA 5'- Parrish-TGTGAAT 5'AACAGG Novak j et al IL-21 NM_ AAAA
GAC 2000 021803 TTGGTCCC AGCTGAC NATURE TG AA-3' CAC TCA-3' VOL 408 5' TTC TCT 3' CGG Mansour H GCT CCC AGA AGG et al. 2008 IL-23 NM_016584 TGA TAG AGA CGC JASN CCC TGT G TGC CA 19:2277-81 GAC 2000 021803 TTGGTCCC AGCTGAC NATURE TG AA-3 'CAC TCA-3' VOL 408 5 'TTC TCT 3' CGG Mansour H GCT CCC AGA AGG et al. 2008 IL-23 NM_016584 TGA TAG AGA CGC JASN CCC TGT G TGC CA 19: 2277-81
Molle C et 5' al. Springs C et 5 'al.
IL-27 GGAGCGT 3'AGCTGC 2007 IL-27 GGAGCGT 3'AGCTGC 2007
NM_145659 CTCTGCTT ATCCTCTC J Immunol CATCT CATGTT 178:7607-15; NM_145659 CTCTGCTT ATCCTCTC J Immunol CATCT CATGTT 178: 7607-15;
5' CTC CAT Mansour H ROR- NM_005060 et al. 2008 gamma and CTT TGA 3' CAC ATG 5 'CTC CAT Mansour H ROR- NM_005060 et al. 2008 gamma and CTT TGA 3 'CAC ATG
CTT CTC CTG GCT JASN CTT CTC CTG GCT JASN
t NM_001001 CCA CTC ACA CAG t NM_001001 CCA CTC ACA CAG
19:2277-81 19: 2277-81
523.1 CCT A GCT C 523.1 CCT A GCT C
Houses K03432 5' GCCCGA 5TCCATTA Afaneh C et kiping AGCGTTT TTCCT al 2012 18S ACTTTGA AGCTGCG Trasplantatio rRNA 3' GTATC 3' n 90: 1381-87 Houses K03432 5 'GCCCGA 5TCCATTA Afaneh C et kiping AGCGTTT TTCCT al 2012 18S ACTTTGA AGCTGCG Trasplantatio rRNA 3' GTATC 3 'n 90: 1381-87
Tabella 3 Table 3
Num. Num.
Accesso Primer Primer Referenza Gene GenBank forward revers Access Primer Primer Reference Gene GenBank forward revers
Liu B et al 2009 5'- 5'- J NM_003327 TCAGAAG GCAGAGA International 0X40 .2 TGGGAGT GCCGGAG Medicai GAGCGGA GCAGCCA Research AG-3' TCGGC-3' 37: 601 -610 Liu B et al 2009 5'- 5'- J CTTCAC CTAGTAG International OX40L NM_003326 TG Liu B et al 2009 5'- 5'- J NM_003327 TCAGAAG GCAGAGA International 0X40 .2 TGGGAGT GCCGGAG Medicai GAGCGGA GCAGCCA Research AG-3 'TCGGC-3' 37: 601 -610 Liu B et al 2009 5'- 5'- J CTTCAC CTAGTAG International OX40L NM_003326 TG
.3 CTACATCT GCTCAAG Medicai GCCTGCA- GCAATCT Research 3' TG-3' 37: 601 -610 .3 CTACATCT GCTCAAG Medicai GCCTGCA- GCAATCT Research 3 'TG-3' 37: 601 -610
primer/probe (Applied primer / probe (Applied
OX40L NM_003326 Biosystems) OX40L NM_003326 Biosystems)
.3 .3
Hs00182411_ml Hs00182411_ml
Wang Y et al Wang Y et al
5'- 5'- 5'- 5'-
PD-1 GACAACG GCTTGTCC 2011 PD-1 GACAACG GCTTGTCC 2011
NM_005018 Chin Med J NM_005018 Chin Med J
CCACCTTC GTCTGGT CCACCTTC GTCTGGT
ACCT-3' TGCT-3' 124:674-678 ACCT-3 'TGCT-3' 124: 674-678
primer/probe (Applied primer / probe (Applied
PD-L1 NM_014143 PD-L1 NM_014143
.2 Biosystems) Mm01208505_ml .2 Biosystems) Mm01208505_ml
primer/probe (Applied primer / probe (Applied
PD-L2 NM_025239 Biosystems) PD-L2 NM_025239 Biosystems)
Hs00228839_ml Hs00228839_ml
Granzy primer/probe (Applied Granzy primer / probe (Applied
J04071 J04071
me B biosystems) me B biosystems)
Hs01554355_ml Hs01554355_ml
Perfori primer/probe (Applied Pierce primer / probe (Applied
n M28393 Biosystems) n M28393 Biosystems)
Hs00169473_ml Hs00169473_ml
5’- 5- Hamzaoui A Foxp3 NM_014009 GTGGCCC GCTGCTC et al GGATGTG CAGAGAC 2011 AGAA-3’ TGTACCA Journal of TCT-3’ Inflammatio n Research 4: 139-146 5'- 5- Hamzaoui A Foxp3 NM_014009 GTGGCCC GCTGCTC et al GGATGTG CAGAGAC 2011 AGAA-3 'TGTACCA Journal of TCT-3' Inflammatio n Research 4: 139-146
primer/probe (Applied primer / probe (Applied
IP- 10 NM_001565 Biosystems) IP- 10 NM_001565 Biosystems)
HsOl 124251 _ gl HsOl 124251 _ gl
primer/probe (Applied primer / probe (Applied
CXCR NM 00154 Biosystems) CXCR NM 00154 Biosystems)
3 Hs00188109_ml 3 Hs00188109_ml
5’- Gu Y et al CTCCAGA 50AGCTTT 2008 5'- Gu Y et al CTCCAGA 50AGCTTT 2008
CCCTC- Eur. J. IL- 17 AGGCCCT CCCTC- Eur. J. IL- 17 AGGCCCT
NM_002190 CAGACTA CGCATTG Immunol. NM_002190 CAGACTA CGCATTG Immunol.
C- ACACAG- 38: 1807-13 C- ACACAG- 38: 1807-13
3’ 3’ 3 '3'
Kh antri W et al primer/probe (Applied Kh antri W et al primer / probe (Applied
IL- 17 2010 IL- 17 2010
NM_002190 Biosystems) Infection and Hs00174383_ml immunity 78: 845-853 5’- Borie S GGAGAAG 5’- 2009 IL-21 NM_ ACAGAAA GTCCAAC Blood 021803 CACAGAC- TGCAAGT 114: 4089-3’ TAGATCC- 98 NM_002190 Biosystems) Infection and Hs00174383_ml immunity 78: 845-853 5'- Borie S GGAGAAG 5'- 2009 IL-21 NM_ ACAGAAA GTCCAAC Blood 021803 CACAGAC- TGCAAGT 114: 4089-3 'TAGATCC- 98
3’ 3 '
Dien Bard j 5_- 5_- et al IL-21 NM_ GGCAACA AAGCAGG 2009 Dien Bard j 5_- 5_- et al IL-21 NM_ GGCAACA AAGCAGG 2009
021803 TGGAGAG AAAAAGC Am J Pathol TGACCA-GATTG-3_ 175:825-34 021803 TGGAGAG AAAAAGC Am J Pathol TGACCA-GATTG-3_ 175: 825-34
3_ 3_
IL-21 NM_ primer/probe (Applied IL-21 NM_ primer / probe (Applied
Biosystems) Biosystems)
021803 021803
Hs00222327_ml Hs00222327_ml
Kh antri W Kh antri W
primer/probe (Applied et al IL-23 NM_016584 Biosystems) 2010 primer / probe (Applied et al IL-23 NM_016584 Biosystems) 2010
Infection and Hs00372324_ml immunity 78: 845-853 Infection and Hs00372324_ml immunity 78: 845-853
primer/probe (Applied primer / probe (Applied
Biosystems) Biosystems)
IL-27 NM_145659 IL-27 NM_145659
Hs00377366_ml Hs00377366_ml
TGCAGGA Gu Y et al NM_005060 5’-ROR- and CCGCTGA GTAGGCC 2008 gamma NM_001001 GAGGGCT ACATTAC Eur. J. TGCAGGA Gu Y et al NM_005060 5'-ROR- and CCGCTGA GTAGGCC 2008 range NM_001001 GAGGGCT ACATTAC Eur. J.
A- Immunol A- Immunol
523.1 TCA-3 523.1 TCA-3
3’C 38: 1807-13 GAPD Wang Y et al 3’C 38: 1807-13 GAPD Wang Y et al
H 5'- 5'- 2011 H 5'- 5'- 2011
GAAGGTG GAAGATG GAAGGTG GAAGATG
Houses NM_002046 Chin Med J kiping AAGGTCG GTGATGG Houses NM_002046 Chin Med J kiping AAGGTCG GTGATGG
124:674-678 124: 674-678
GAGTC-3' GATTTC-3' GAGTC-3 'GATTTC-3'
In una forma di realizzazione della presente invenzione l’amplificazione può essere effettuata, anche utilizzando di una o più coppie di primer riportate nelle tabelle precedenti, mediante Real-Time PCR. In an embodiment of the present invention, the amplification can be carried out, even using one or more pairs of primers shown in the previous tables, by means of Real-Time PCR.
Vantaggiosamente, il passaggio di amplificazione del metodo in oggetto può essere preceduto da pre-amplificazione dell’mRNA ottenuto dal campione di urine e/o di sangue d’interesse. Tale ulteriore passaggio ha lo scopo di aumentare la quantità di messaggero di partenza ottenuto dal campione, così che anche la presenza di esigue quantità di mRNA ottenute, possono essere analizzate al fine di ottenere informazioni circa l’espressione dei geni di interesse. Advantageously, the amplification step of the method in question can be preceded by pre-amplification of the mRNA obtained from the urine and / or blood sample of interest. This further step has the purpose of increasing the amount of starting messenger obtained from the sample, so that even the presence of small amounts of mRNA obtained can be analyzed in order to obtain information about the expression of the genes of interest.
Oggetto della presente descrizione è dunque un metodo per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapiantato in un paziente comprendente i seguenti passaggi: The object of the present description is therefore a method for monitoring a kidney transplant and / or prognosticating a rejection of a transplanted kidney in a patient comprising the following steps:
- determinare i livelli di mRNA per ciascuno dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 in un campione di sangue e/o d’urina di detto paziente - determine the mRNA levels for each of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 in a blood and / or urine sample from that patient
-normalizzare detti livelli con i livelli basali degli mRNA dei geni corrispondenti; - calcolare un valore predittivo sulla base di detti livelli di mRNA normalizzati; - confrontare detto valore predittivo con un valore di cutoff. - normalize said levels with the basal levels of the mRNAs of the corresponding genes; - calculating a predictive value on the basis of said normalized mRNA levels; - compare said predictive value with a cutoff value.
Con l’espressione “normalizzare detti livelli con i livelli basali degli mRNA dei geni corrispondenti” si intende esprime il livello di mRNA di ciascun gene sopra indicato in funzione del livello che il medesimo gene ha in condizioni “basali” ovvero in condizioni fisiopatologiche normali ovvero rispetto ad un controllo sano che eventualmente può essere anche lo stesso paziente prima dell’insorgenza della causa associata con la perdita di funzionalità di un rene. Il livello basale potrà essere determinato anche, ad esempio, come media tra i livelli di mRNA del gene di interesse in soggetti senza rigetto acuto. Alternativamente, il livello basale dell’mRNA di un dato gene può essere anche il livello determinato per tale gene in un dato soggetto al tempo t=0 ovvero al tempo a partire dal quale si vuole monitorare l’andamento del trapianto di rene. A titolo meramente esemplificativo e non limitativo, tale tempo t=0 può essere il tempo in cui per la prima volta è quantizzato l’mRNA del gene di interesse successivamente al trapianto. The expression "normalize said levels with the basal levels of the mRNAs of the corresponding genes" means expressing the mRNA level of each gene indicated above as a function of the level that the same gene has in "basal" conditions or in normal pathophysiological conditions or compared to a healthy control that possibly can also be the same patient before the onset of the cause associated with the loss of function of a kidney. The basal level can also be determined, for example, as the average between the mRNA levels of the gene of interest in subjects without acute rejection. Alternatively, the basal level of the mRNA of a given gene can also be the level determined for that gene in a given subject at time t = 0 or the time from which you want to monitor the progress of the kidney transplant. By way of non-limiting example, this time t = 0 may be the time in which the mRNA of the gene of interest is quantized for the first time after transplantation.
A partire dall'insieme dei livelli di mRNA normalizzati dei geni di cui sopra, è successivamente calcolato un valore predittivo che, ad esempio, può essere calcolato mediante regressione lineare dei livelli di mRNA di FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3. Starting from the set of normalized mRNA levels of the above genes, a predictive value is then calculated which, for example, can be calculated by linear regression of the mRNA levels of FoxP3, IL-17, IL-23, IL- 21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3.
In una forma di realizzazione del metodo, il valore di cutoff può essere calcolato a partire da una o più curve ROC (Receiver Operating Characteristic). In one embodiment of the method, the cutoff value can be calculated from one or more Receiver Operating Characteristic (ROC) curves.
In particolare, le curve ROC possono essere determinate, ai fini della presente invenzione, come segue: In particular, the ROC curves can be determined, for the purposes of the present invention, as follows:
- calcolare la media ± errore standard (±SE) dei livelli di mRNA per ciascun dei suddetti geni sia nei soggetti senza rigetto (livello basale) sia nei soggetti con rigetto, dove preferibilmente tale rigetto è un rigetto acuto del rene trapiantato; - calculate the mean ± standard error (± SE) of the mRNA levels for each of the above genes both in subjects without rejection (baseline level) and in subjects with rejection, where preferably this rejection is an acute rejection of the transplanted kidney;
- effettuare un test di significatività per ciascuno dei detti geni sulla base della media dei livelli di mRNA calcolata in soggetti con rigetto e la media dei livelli di mRNA calcolata in soggetti senza rigetto per detto gene; - carrying out a significance test for each of said genes on the basis of the average of the mRNA levels calculated in subjects with rejection and the average of the mRNA levels calculated in subjects without rejection for said gene;
- costruire una curva ROC (Receiver Operating Characteristic) per ogni singolo gene o per ogni combinazione lineare di geni la cui espressione risulta essere significativamente modulata rispetto al livello basale corrispondente, in modo da poter determinare il punto di cutoff (valore soglia) ottimale, ovvero quello che fornirà la massima sensibilità e specificità possibile per predire l’outcome di un episodio di rigetto. Inoltre, si potrà eventualmente determinare l’area sottesa alla curva ROC (AUC) e la sua varianza per valutare la performance del test e la sua significatività e confrontare la performance di due o più curve ROC fra loro (Hanley e McNeil 1983) per stabilire qual è la migliore combinazione lineare predittiva e quindi il miglior valore di cutoff da utilizzare nel metodo oggetto della presente invenzione. - construct a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve for each single gene or for each linear combination of genes whose expression is significantly modulated with respect to the corresponding basal level, so as to be able to determine the optimal cutoff point (threshold value), i.e. one that will provide the highest possible sensitivity and specificity to predict the outcome of a rejection episode. Furthermore, it will be possible to determine the area under the ROC curve (AUC) and its variance to evaluate the performance of the test and its significance and to compare the performance of two or more ROC curves with each other (Hanley and McNeil 1983) to establish what is the best predictive linear combination and therefore the best cutoff value to be used in the method object of the present invention.
Riassumendo, quindi il valore di cutoff può essere determinato effettuando i seguenti passaggi operativi: In summary, then the cutoff value can be determined by performing the following operating steps:
Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui detto valore di cutoff è determinato come segue: Method according to any one of the preceding claims wherein said cutoff value is determined as follows:
- calcolare la media dei livelli di mRNA per ciascun di detti geni sia in soggetti senza rigetto sia in soggetti con rigetto; - calculate the average of the mRNA levels for each of said genes both in subjects without rejection and in subjects with rejection;
- effettuare un test di significatività per ciascuno dei detti geni sulla base della media dei livelli di mRNA calcolata in soggetti con rigetto e la media dei livelli di mRNA calcolata in soggetti senza rigetto per detto gene; - carrying out a significance test for each of said genes on the basis of the average of the mRNA levels calculated in subjects with rejection and the average of the mRNA levels calculated in subjects without rejection for said gene;
- costruire una curva ROC (Receiver Operating Characteristic) per ogni combinazione lineare di geni la cui espressione è modulata nei soggetti con rigetto rispetto ai soggetti senza rigetto; - construct a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve for each linear combination of genes whose expression is modulated in subjects with rejection compared to subjects without rejection;
-individuare detto valore di cutoff sulla base di detta curva ROC. - identify said cutoff value on the basis of said ROC curve.
Secondo un’ulteriore forma di realizzazione del metodo qui descritto monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapianto in un paziente può essere effettuato come segue. Per ciascun livello di mRNA determinato per ciascuno dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, 0X40, 0X40 L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3 è effettuato un test di significatività rispetto al corrispondente livello basale al fine di ottenere un valore di significatività P,. Quindi, ad esempio, il valore di espressione ottenuto mediante Reai Time PCR e relativo al gene FoxP3 è analizzato statisticamente rispetto al valore di espressione del medesimo gene FoxP3 determinato per un campione controllo/sano di siero e/o urine. Effettuando detto test di significatività per ciascuno dei livelli di mRNA determinati per ciascuno dei geni di cui sopra, si ottiene un insieme costituito da singole significatività P, ognuna delle quali si riferisce alla deviazione dell’espressione di ciascun gene di interesse rispetto al proprio livello di espressione basale. According to a further embodiment of the method described herein, monitoring a kidney transplant and / or prognosticating a rejection of a kidney transplant in a patient can be carried out as follows. For each mRNA level determined for each of the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, 0X40, 0X40 L, PD-1, PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3 a significance test is performed with respect to the corresponding baseline level in order to obtain a significance value P ,. Therefore, for example, the expression value obtained by Reai Time PCR and related to the FoxP3 gene is statistically analyzed with respect to the expression value of the same FoxP3 gene determined for a control / healthy sample of serum and / or urine. By carrying out this significance test for each of the mRNA levels determined for each of the above genes, a set consisting of individual P significances is obtained, each of which refers to the deviation of the expression of each gene of interest with respect to its own level of basal expression.
Per ciascuna delle singole significatività P, è successivamente calcolato un logaritmo naturale della probabilità χ,<2>mediante la formula: For each of the individual significances P, a natural logarithm of the probability χ, <2> is subsequently calculated using the formula:
dove n sono i gradi di libertà; log è il logaritmo naturale e P, le singole significatività. where n are the degrees of freedom; log is the natural logarithm and P, the individual significances.
Nel metodo in oggetto dovendo essere definita la probabilità di rigetto o di non rigetto (prognosi), o variazione o non variazione dello stato fisiologico dell’organo trapiantato (monitoraggio), i gradi di libertà possono essere uguali a 2. In the method in question, since the probability of rejection or non-rejection (prognosis), or variation or non-variation of the physiological state of the transplanted organ (monitoring), must be defined, the degrees of freedom can be equal to 2.
Conseguentemente quello che si ottiene è un nuovo insieme formato da diversi valori di Xi<2>ognuno dei quali è relativo a ciascuno degli mRNA trascritti dai geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3. Detti valori degli χ<2>calcolati sono poi sommanti ottenendo un valore complessivo V. Successivamente, la probabilità R relativa al rigetto del rene trapiantato da parte di detto paziente è estratta dalla tabella 1 dei valori critici del χ<2>(nota anche come tabella dei valori critici del χ<2>) sulla base di detto valore complessivo V e dei gradi di libertà n. Consequently, what is obtained is a new set formed by different values of Xi <2> each of which is related to each of the mRNAs transcribed by the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL- 27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3. Said values of the calculated χ <2> are then added together obtaining an overall value V. Subsequently, the probability R relating to the rejection of the transplanted kidney by said patient is extracted from table 1 of the critical values of χ <2> (also known as table of critical values of χ <2>) on the basis of said total value V and the degrees of freedom n.
Tabella 1 : tabella dei valori critici del χ<2>Table 1: table of critical values of χ <2>
Quindi a titolo esemplificativo e non limitante, se il valore di V è 5.070, per n=2 ovvero per 2 gradi di libertà, il valore della probabilità R è compreso tra 0.9 a 0.95 ovvero la probabilità è compresa tra il 10% e il 5%. . So by way of example and not limiting, if the value of V is 5.070, for n = 2 or for 2 degrees of freedom, the value of the probability R is between 0.9 to 0.95 or the probability is between 10% and 5 %. .
Ulteriore oggetto della presente invenzione è un kit per monitorare un trapianto di rene e/o prognosticare un rigetto di un rene trapiantato in un campione di sangue e/o d’urina di un paziente comprendente mezzi per la determinazione dei livelli di espressione degli mRNA dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, 0X40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3. A further object of the present invention is a kit for monitoring a kidney transplant and / or prognosticating a rejection of a kidney transplanted into a patient's blood and / or urine sample comprising means for determining the mRNA expression levels of FoxP3 genes, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, 0X40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3.
In una forma di realizzazione dell’invenzione il kit può comprendere una o più aliquote di coppie di primer per amplificare ciascuno dei cDNA dei geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3; e/o una o più sonde per riconoscere ciascuno dei cDNA ottenuti da ciascuno degli mRNA trascritti dai geni FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21 , ROR-gamma, IL-27, perforina, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1 , PDL-1 , PDL-2, CD103, IP-10 e CXCR3. I primer per la retrotrascrizione potranno essere anch’essi inclusi nel kit dell’Invenzione. Il kit secondo l’invenzione, quindi, comprenderà almeno una coppia di primer per l’amplificazione di ciascuno dei 16 cDNA sopra indicati e/o almeno una sonda per la sua rilevazione nel campione. Il kit comprenderà quindi almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di FoxP3, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di IL-17, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di IL-23, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di IL-21 , almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di ROR-gamma, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di IL-27, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di perforina, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di granzima-B, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di 0X40, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di OX40L, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di PD-1 , almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di PDL-1 , almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di PDL-2, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di CD103, almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di IP-10 e almeno una coppia di primer per l’amplificazione del cDNA di CXCR3 e/o almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di FoxP3, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di IL-17, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di IL-23, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di IL-21 , almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di ROR-gamma, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di IL-27, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di perforina, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di granzima-B, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di 0X40, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di OX40L, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di PD-1 , almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di PDL-1 , almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di PDL-2, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di CD103, almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di IP-10 e almeno una sonda per la rilevazione del cDNA di CXCR3. Inoltre, il kit può comprendere mezzi che definiscono o per definire il valore di cutoff e quindi, in altri termini che consento di comprendere se in detto paziente c’è o meno un rischio di rigetto del rene trapiantato sulla base del metodo secondo sopra descritto. Inoltre, detti mezzi possono anche comprendere un programma per elaboratore per implementare il metodo qui descritto. In an embodiment of the invention, the kit can comprise one or more aliquots of primer pairs to amplify each of the cDNAs of the FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin genes , granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3; and / or one or more probes to recognize each of the cDNAs obtained from each of the mRNAs transcribed by the genes FoxP3, IL-17, IL-23, IL-21, ROR-gamma, IL-27, perforin, granzima-B, OX40, OX40L, PD-1, PDL-1, PDL-2, CD103, IP-10 and CXCR3. The primers for reverse transcription may also be included in the Invention kit. The kit according to the invention, therefore, will include at least a pair of primers for the amplification of each of the 16 cDNAs indicated above and / or at least one probe for its detection in the sample. The kit will therefore comprise at least one primer pair for FoxP3 cDNA amplification, at least one primer pair for IL-17 cDNA amplification, at least one primer pair for IL-23 cDNA amplification, at least one primer pair for IL-21 cDNA amplification, at least one primer pair for ROR-gamma cDNA amplification, at least one primer pair for IL-27 cDNA amplification, at least one primer pair for perforin cDNA amplification, at least one primer pair for granzima-B cDNA amplification, at least one primer pair for 0X40 cDNA amplification, at least one primer pair for OX40L cDNA amplification, at least one primer pair for PD-1 cDNA amplification, at least one primer pair for PDL-1 cDNA amplification, at least one primer pair for PDL-1 cDNA amplification, PDL-2, at least one primer pair for CD103 cDNA amplification, at least u a primer pair for IP-10 cDNA amplification and at least one primer pair for CXCR3 cDNA amplification and / or at least one FoxP3 cDNA detection probe, at least one cDNA detection probe of IL-17, at least one probe for detecting IL-23 cDNA, at least one probe for detecting IL-21 cDNA, at least one probe for detecting ROR-gamma cDNA, at least one probe for detecting of IL-27 cDNA, at least one probe for detecting perforin cDNA, at least one probe for detecting granzima-B cDNA, at least one probe for detecting 0X40 cDNA, at least one probe for detecting cDNA of OX40L, at least one probe for PD-1 cDNA detection, at least one probe for PDL-1 cDNA detection, at least one probe for PDL-2 cDNA detection, at least one probe for cDNA detection of CD103, at least one probe for the detection of the IP-10 cDNA and at least one probe for the detection vation of CXCR3 cDNA. Furthermore, the kit may comprise means that define or to define the cutoff value and therefore, in other words, which allow to understand whether or not there is a risk of rejection of the transplanted kidney in said patient on the basis of the method described above. Furthermore, said means may also comprise a computer program for implementing the method described herein.
Il kit, può ulteriormente comprendere una o più aliquote di reagenti per Real-Time PCR come, ad esempio, dNTP, polimerasi, tamponi, cloruro di magnesio ecc. e/o uno o più supporti solidi su cui dette sonde, specifiche per la determinazione diretta o indiretta dei messaggeri dei geni di cui sopra, sono immobilizzate, preferibilmente. In una forma di realizzazione dell’invenzione i primer e/o le sonde sono marcate. In aggiunta, il kit può anche comprendere una o più aliquote di un controllo negativo e/o una o più aliquote di un controllo positivo, in cui detti controlli comprendono un campione di cellule mononucleate del sangue periferico e/o un campione di cellule renali. The kit may further comprise one or more aliquots of Real-Time PCR reagents such as, for example, dNTP, polymerase, buffers, magnesium chloride, etc. and / or one or more solid supports on which said probes, specific for the direct or indirect determination of the messengers of the above genes, are preferably immobilized. In one embodiment of the invention the primers and / or probes are marked. In addition, the kit may also comprise one or more aliquots of a negative control and / or one or more aliquots of a positive control, wherein said controls comprise a peripheral blood mononuclear cell sample and / or a kidney cell sample.
PARTE SPERIMENTALE EXPERIMENTAL PART
Isolamento dell’RNA totale da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) I PBMC sono isolati da sangue periferico, tramite gradiente di densità Ficoll-Paque Plus (densità 1.077 g/ml; Amersham, Uppsala, Sweden). Isolation of total RNA from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) PBMCs are isolated from peripheral blood, using the Ficoll-Paque Plus density gradient (density 1,077 g / ml; Amersham, Uppsala, Sweden).
L’RNA totale è estratto dai PBMC usando RNeasy mini kit (QIAGEN Ine., Valencia, CA, USA) secondo il protocollo del produttore. Total RNA is extracted from PBMCs using RNeasy mini kit (QIAGEN Ine., Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's protocol.
Isolamento dell’RNA totale dalle urine Total RNA isolation from urine
L’Urina è centrifugata a 2000 g per 30 minuti a 4 gradi. L’RNA è estratto dal sedimento tramite RNeasy (QIAGEN Ine., Valencia, CA, USA) secondo il protocollo del produttore. La resa e la purezza dell’RNA totale isolato dai campioni biologici è misurata tramite spettrofotometro (NanoDrop Products , Wilmington, DE, USA). The urine is centrifuged at 2000 g for 30 minutes at 4 degrees. The RNA is extracted from the sediment by RNeasy (QIAGEN Ine., Valencia, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. The yield and purity of total RNA isolated from biological samples is measured by a spectrophotometer (NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA).
Quantificazione di mRNA. Quantification of mRNA.
II cDNA derivante dall’mRNA isolato è preparato usando il kit TaqMan® Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems, Foster City, CA). The cDNA derived from the isolated mRNA is prepared using the TaqMan® Reverse Transcription Reagents kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Per la quantizzazione dell’mRNA relativo ai geni di interesse ovvero FOXP3, IL17, 11-21 , IL-23, IL-27, ROR-gamma, Perforina, Granzima B, CD103, IP-10, CXCR3, 0X40, OX40L, PD1 , PDL-2, è usata in modo sequenziale una TaqMan® PreAmp Master Mix and thè TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). In questo modo si ottengono migliori risultati, in quanto la preamplificazione permette una quantizzazione assoluta di un vasto pannello di mRNA da quantità minime di cDNA (20 differenti mRNA da 3μΙ cDNA a 1pg di RNA totale in 10ΟμΙ) . For the quantization of the mRNA related to the genes of interest i.e. FOXP3, IL17, 11-21, IL-23, IL-27, ROR-gamma, Perforin, Granzima B, CD103, IP-10, CXCR3, 0X40, OX40L, PD1 , PDL-2, a TaqMan® PreAmp Master Mix and the TaqMan® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) is sequentially used. In this way, better results are obtained, as the preamplification allows an absolute quantization of a large panel of mRNA from minimal amounts of cDNA (20 different mRNAs from 3μΙ cDNA to 1pg of total RNA in 10ΟμΙ).
La reazione di amplificazione è fatta per ogni campione in provette da PCR da 0.2ml con un volume di reazione finale di 10μΙ contenente 3μΙ cDNA (proveniente dalla trascrizione inversa di 1 pg di RNA totale in 10ΟμΙ), 1μΙ 10x di tampone, 0.6μΙ MgCI2 (25mM), 0.4μΙ 4x dNTP (10mM ciascuno), 0.4μΙ Ampli-Taq gold (51Ι/μΙ), 0.15μΙ primer mix per gene (50μΜ di primer senso and 50μΜ antisenso) e acqua fino ad un volume finale di 10μΙ. Dopo vortex, la PCR è impostata utilizzando un termociclatore Verity e un profilo di reazione di PCR a 10 cicli, costituito da una temperatura iniziale mantenuta a 95 ° C per 10 minuti, di denaturazione a 95 ° C per 10 secondi e una temperatura di annealing dei primer e di estensione di 60° C per 1 min. Alla fine dei 10 cicli, 90μΙ di tampone TE è aggiunto alla reazione di PCR e 2.5μΙ di amplicone di PCR diluito è usato per quantizzare l’mRNA usando il sistema di rilevazione Fast detection System (Applied Biosystems). The amplification reaction is done for each sample in 0.2ml PCR tubes with a final reaction volume of 10μΙ containing 3μΙ cDNA (from the reverse transcription of 1 pg of total RNA in 10μΙ), 1μΙ 10x of buffer, 0.6μΙ MgCI2 (25mM), 0.4μΙ 4x dNTP (10mM each), 0.4μΙ Ampli-Taq gold (51Ι / μΙ), 0.15μΙ primer mix per gene (50μΜ of sense primer and 50μΜ antisense) and water to a final volume of 10μΙ. After vortexing, PCR is set up using a Verity thermal cycler and a 10-cycle PCR reaction profile, consisting of an initial temperature maintained at 95 ° C for 10 minutes, denaturation at 95 ° C for 10 seconds, and an annealing temperature of the primers and extension of 60 ° C for 1 min. At the end of the 10 cycles, 90μΙ of TE buffer is added to the PCR reaction and 2.5μΙ of diluted PCR amplicon is used to quantize the mRNA using the Fast detection System (Applied Biosystems).
I livelli di mRNA sono misurati usando un ABI Prism 7700 Fast detection System (Applied Biosystems). La reazione di PCR per ogni campione è fatta in duplicato con un volume di reazione di 20μΙ usando 10μΙ 2X di TaqMan® Gene Expression Master Mix 2.5μΙ di cDNA stampo pre-amplified, 0.15μΙ di primer (50μΜ di primer senso e 50μΜ di primer anti-senso), 0.05μΙ di probe (100μΜ) and 7.35 μΙ di acqua. Il protocollo di amplificazione della PCR consiste di una temperatura iniziale a 95Ό per 20 secondi e 40 cicli di denaturazione a 95Ό per 3 secondi, d i un annealing dei primer ed estensione a 60Ό per 30 secondi. I livelli di mRNA saranno calcolati tramite il metodo della curva standard (Ding at al 2003; Mansour er al 2008), e il numero di copie di mRNA è normalizzato usando il numero di copie di 18S rRNA (copie di mRNA in 1pg RNA/copie di 18S rRNA in 1 fg RNA). I primer oligonucleotidici e i probe fluorigenici TaqMan che sono usati, sono stati scelti dalla letteratura scientifica o disegnati tramite il software Applied Biosystems® Primer Express®. Le sequenze dei primer e delle sonde utilizzate sono riportate in Tabella 1e o Tabella 2. The mRNA levels are measured using an ABI Prism 7700 Fast detection System (Applied Biosystems). The PCR reaction for each sample is done in duplicate with a reaction volume of 20μΙ using 10μΙ 2X of TaqMan® Gene Expression Master Mix 2.5μΙ of pre-amplified template cDNA, 0.15μΙ of primer (50μΜ of Sense primer and 50μΜ of primer anti-sense), 0.05μΙ of probe (100μΜ) and 7.35μΙ of water. The PCR amplification protocol consists of an initial temperature at 95Ό for 20 seconds and 40 denaturation cycles at 95Ό for 3 seconds, annealing the primers and extending at 60Ό for 30 seconds. The mRNA levels will be calculated by the standard curve method (Ding at 2003; Mansour er at 2008), and the mRNA copy number is normalized using the copy number of 18S rRNA (mRNA copies in 1pg RNA / copies of 18S rRNA in 1 fg RNA). The oligonucleotide primers and TaqMan fluorigenic probes that are used were selected from the scientific literature or designed using Applied Biosystems® Primer Express® software. The sequences of the primers and probes used are shown in Table 1e or Table 2.
Le sonde sono marcate con la 6-carbossi-fluoresceina all’estremità 5’ e 6-carbossitetrametilrodamina o MGB all’estremità 3’. La FAM funziona come reporter e TAMRA come quencer. Il 18S rRNA è stato usato come gene housekeeping di riferimento per normalizzare i livelli di mRNA. The probes are marked with 6-carboxy-fluorescein at the 5 'end and 6-carboxytetramethylrodamine or MGB at the 3' end. FAM works as a reporter and TAMRA as a quencer. 18S rRNA was used as a reference housekeeping gene to normalize mRNA levels.
I profili di mRNA sia in urine che in PBMC per FOXP3, IL-17, 11-21 , IL-23, IL-27, ROR-gamma (variante 1 e 2), Perforina, Granzima B, CD103, IP-10, CXCR3, 0X40, OX40L, PD1 , PDL-2 e il gene di riferimento 18S rRNA sono misurati usando una preamplificazione e una PCR real-time quantitativa in modo sequenziale. The mRNA profiles in both urine and PBMC for FOXP3, IL-17, 11-21, IL-23, IL-27, ROR-gamma (variant 1 and 2), Perforin, Granzima B, CD103, IP-10, CXCR3, 0X40, OX40L, PD1, PDL-2 and the reference gene 18S rRNA are measured using a pre-amplification and quantitative real-time PCR sequentially.
Analisi Statistica Statistic analysis
L’analisi statistica è eseguita usando un software come GraphPad Prism -, La Jolla, CA, USA. Statistical analysis is performed using software such as GraphPad Prism -, La Jolla, CA, USA.
Sarà valutata la media ± intervallo di confidenza a 95% per i livelli basali o livelli di controllo, in modo poi da poter valutare tutte quelle espressioni geniche che sono up o down-regolate rispetto a tale intervallo. L’insieme dei geni candidati saranno quindi inclusi in un modello di regressione logistica che prevede la presenza / assenza di rigetto cronico acuto dagli mRNA predittori. The mean ± 95% confidence interval for baseline or control levels will be evaluated, in order to evaluate all those gene expressions that are up or down-regulated with respect to this interval. The set of candidate genes will then be included in a logistic regression model that predicts the presence / absence of acute chronic rejection from predictor mRNAs.
I livelli dell’mRNA normalizzato per il 18S rRNA saranno esaminati per la distribuzione della normalità con il test di Kolmogorov-Smirnov. Normalized mRNA levels for 18S rRNA will be examined for the distribution of normality with the Kolmogorov-Smirnov test.
Dai dati in letteratura, ci aspettiamo che la distribuzione non sia normale quindi i livelli di mRNA normalizzato per il 18S rRNA potrebbero essere trasformati in logaritmo normale in modo da diminuire tale deviazione dalla normalità, e in questa forma potrebbero essere utilizzati per tutte le analisi. From the data in the literature, we expect that the distribution is not normal, therefore the levels of mRNA normalized for 18S rRNA could be transformed in the normal logarithm in order to decrease this deviation from normal, and in this form could be used for all analyzes.
Successivamente, per testare le differenze fra il gruppo con il rigetto acuto e il gruppo dei donatori sani, a seconda che il test della normalità sia superato o meno si utilizzerà rispettivamente il test t di Student o il test di Mann-Whitney U. Le variabili categoriche si potrebbero comparare invece usando il Fisher’s Exact Test o il Chi-Square Analysis. Subsequently, to test the differences between the group with acute rejection and the group of healthy donors, depending on whether the test of normality is passed or not, the Student's t test or the Mann-Whitney U test will be used, respectively. categorical could be compared using Fisher's Exact Test or Chi-Square Analysis instead.
La correlazione di rango di Spearman verrà usata per analizzare le associazioni monotoniche dei livelli di trascrizione di mRNA normalizzato per il 18S rRNA e le biopsie, e il tempo trascorso dal trapianto. Spearman's rank correlation will be used to analyze the monotonic associations of transcription levels of normalized mRNA for 18S rRNA and biopsies, and the time elapsed since transplantation.
Le curve ROC per i livelli di mRNA individuali così come per le combinazioni lineari dei livelli di mRNA saranno utilizzate per determinare i punti di cutoff che hanno prodotto la massima combinazione di sensibilità e specificità per predire il rigetto acuto o anticipare il rigetto acuto. ROC curves for individual mRNA levels as well as linear combinations of mRNA levels will be used to determine the cutoff points that produced the maximum combination of sensitivity and specificity to predict acute rejection or anticipate acute rejection.
Claims (11)
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|---|---|---|---|
| IT000560A ITRM20120560A1 (en) | 2012-11-14 | 2012-11-14 | NEW MARKERS FOR THE MONITORING OF THE KIDNEY TRANSPLANT. |
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| ITRM20120560A1 true ITRM20120560A1 (en) | 2014-05-15 |
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Citations (1)
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| WO2011112719A1 (en) * | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Cornell University | Methods and compositions to predict and detect acute rejection |
-
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- 2012-11-14 IT IT000560A patent/ITRM20120560A1/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011112719A1 (en) * | 2010-03-09 | 2011-09-15 | Cornell University | Methods and compositions to predict and detect acute rejection |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| AFANEH CHEGUEVARA ET AL: "Urinary Cell Levels of mRNA for OX40, OX40L, PD-1, PD-L1, or PD-L2 and Acute Rejection of Human Renal Allografts", TRANSPLANTATION, WILLIAMS AND WILKINS, BALTIMORE US, vol. 90, no. 12, 1 December 2010 (2010-12-01), pages 1381 - 1387, XP009159818, ISSN: 0041-1337 * |
| AFFYMETRIX: "GeneChip TM Human Genome U133 Arraysge/pjp", DATASHEET AFFYMETRIX,, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 1 - 8, XP007921348 * |
| H. MANSOUR ET AL: "Intragraft Levels of Foxp3 mRNA Predict Progression in Renal Transplants with Borderline Change", JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, vol. 19, no. 12, 19 November 2008 (2008-11-19), pages 2277 - 2281, XP055064085, ISSN: 1046-6673, DOI: 10.1681/ASN.2008030254 * |
| HAYATO IWASE ET AL: "Clinical Significance of Regulatory T-Cell-Related Gene Expression in Peripheral Blood After Renal Transplantation", TRANSPLANTATION, vol. 91, no. 2, 1 January 2011 (2011-01-01), pages 191 - 198, XP055064076, ISSN: 0041-1337, DOI: 10.1097/TP.0b013e3181ffbab4 * |
| HECKER A ET AL: "Expression of interleukin-21, interleukin-21 receptor alpha and related type I cytokines by intravascular graft leukocytes during acute renal allograft rejection", IMMUNOBIOLOGY, URBAN UND FISCHER VERLAG, DE, vol. 214, no. 1, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 41 - 49, XP025874682, ISSN: 0171-2985, [retrieved on 20080617], DOI: 10.1016/J.IMBIO.2008.04.004 * |
| WANG S ET AL: "Reduction of Foxp3-expressing regulatory T cell infiltrates during the progression of renal allograft rejection in a mouse model", TRANSPLANT IMMUNOLOGY, ELSEVIER, NL, vol. 19, no. 2, 1 May 2008 (2008-05-01), pages 93 - 102, XP022713446, ISSN: 0966-3274, [retrieved on 20080428], DOI: 10.1016/J.TRIM.2008.03.004 * |
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