RU2651038C1 - Method for detecting disorders in children of immunological reactivity in conditions of excessive exposure to strontium - Google Patents
Method for detecting disorders in children of immunological reactivity in conditions of excessive exposure to strontium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2651038C1 RU2651038C1 RU2017126444A RU2017126444A RU2651038C1 RU 2651038 C1 RU2651038 C1 RU 2651038C1 RU 2017126444 A RU2017126444 A RU 2017126444A RU 2017126444 A RU2017126444 A RU 2017126444A RU 2651038 C1 RU2651038 C1 RU 2651038C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strontium
- gene
- hla
- tlr4
- immunological reactivity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности, к исследованиям ксенобиотиков, а именно стронция, вызывающего нарушение иммунологической реактивности у детей, проживающих в районах экологического неблагополучия, и может быть использовано для диагностики и прогнозирования токсического действия стронция на нарушение иммунологической реактивности пациента.The invention relates to medicine and biology, in particular, to studies of xenobiotics, namely strontium, which causes a violation of immunological reactivity in children living in areas of ecological distress, and can be used to diagnose and predict the toxic effect of strontium on a violation of the immunological reactivity of a patient.
Изобретение может быть использовано для постановки предварительного диагноза как в специализированных клиниках при обследовании пациентов, так и в обычных учреждениях здравоохранения. Результаты указанных обследования необходимы для разработки индивидуальных программ наблюдения и лечения в зависимости от тяжести изменения иммунной системы ребенка, а, кроме того, могут быть использованы при формировании санитарно-гигиенических мероприятий по предупреждению и устранению воздействия вредных химических веществ, обуславливающих формирование избыточной, агрессивной реакции иммунитета у детей.The invention can be used to make a preliminary diagnosis both in specialized clinics for the examination of patients, and in conventional healthcare institutions. The results of these examinations are necessary for the development of individual monitoring and treatment programs depending on the severity of changes in the child’s immune system, and, in addition, can be used in the formation of sanitary and hygienic measures to prevent and eliminate the effects of harmful chemicals that cause the formation of an excessive, aggressive immune response in children.
Следует пояснить, что вследствие воздействия каких-либо внешних факторов, в частности, в результате появления вредных химических веществ в среде обитания, увеличивается вероятность изменения иммунитета в виде модификации иммунной защиты, следствием чего может быть повышение заболеваемости, особенно у детей, в связи с незрелостью адаптивных механизмов организма и иммунной системы.It should be clarified that due to the influence of any external factors, in particular, as a result of the appearance of harmful chemicals in the environment, the probability of a change in immunity in the form of a modification of the immune defense increases, which may result in an increase in the incidence, especially in children, due to immaturity adaptive mechanisms of the body and the immune system.
Для задач ранней диагностики нарушений здоровья, а также для оценки эффективности профилактики и лечения, актуальным является выделение маркерных показателей иммунологического и генетического статуса, которые можно использовать в качестве дополнительных диагностических показателей, характеризующих ответ организма на специфическое средовое окружение.For the tasks of early diagnosis of health disorders, as well as to evaluate the effectiveness of prevention and treatment, it is relevant to highlight marker indicators of immunological and genetic status, which can be used as additional diagnostic indicators characterizing the body's response to a specific environmental environment.
Для понимания существа вопроса, следует пояснить следующее.To understand the essence of the issue, the following should be clarified.
Постоянное многокомпонентное воздействие техногенных химических факторов в промышленно развитых регионах оказывает негативное влияние на здоровье населения, в частности, детское. В последнее десятилетие возникла проблема воздействия стабильного стронция на здоровье в связи с вовлечением в питьевое водоснабжение больших объемов артезианской воды водоносных горизонтов, где содержание стабильного стронция в 2-5 раз превышает предельно-допустимое - 7 мг/л. Стронций, будучи изоформен кальцию и обладая высокой подвижностью, способен блокировать ионные каналы для последнего, воздействовать на кальций-зависимые рецепторы и конкурировать за активные участки белков, не выполняя физиологической функции, что может определить модифицирующее влияние стронция на иммунную регуляцию, в том числе, на изменение иммунной реактивности организма.The constant multicomponent effect of technogenic chemical factors in industrially developed regions has a negative effect on the health of the population, in particular, for children. In the last decade, the problem of the effect of stable strontium on health has arisen in connection with the involvement of large volumes of artesian water in aquifers in drinking water supply, where the content of stable strontium is 2-5 times higher than the maximum allowable - 7 mg / l. Strontium, being calcium isoform and possessing high mobility, is capable of blocking ion channels for the latter, acting on calcium-dependent receptors and competing for active sites of proteins without performing a physiological function, which can determine the modifying effect of strontium on immune regulation, including a change in the body's immune reactivity.
Иммунологическая реактивность - способность организма проявлять защитно-иммунологические функции в отношении возбудителей инфекционных болезней и обеспечивать специфический ответ на антигенное воздействие.Immunological reactivity - the ability of an organism to exhibit protective and immunological functions against pathogens of infectious diseases and provide a specific response to antigenic effects.
При этом экотоксиканты, в частности, стронций, способны нарушать регуляторные функции иммунной системы, что может способствовать нарушению адаптационных возможностей организма, возникновению аутоиммунных состояний. Этим и обусловлена потребность в установлении нарушения иммунологической реактивности, модифицированной стронцием.In this case, ecotoxicants, in particular strontium, can disrupt the regulatory functions of the immune system, which can contribute to the violation of the adaptive capabilities of the body, the emergence of autoimmune conditions. This is the reason for the need to establish a violation of the immunological reactivity modified by strontium.
Из уровня техники известно, что в настоящее время большинство способов диагностики иммунного состояния основано на использовании в качестве маркеров показателей крови. Причем известно, что при этом в качестве маркерных показателей используют толл-рецепторы, в частности TLR4.It is known from the prior art that at present, most methods of diagnosing an immune condition are based on the use of blood indicators as markers. Moreover, it is known that toll receptors, in particular TLR4, are used as marker indicators.
Из уровня техники (Патент РФ №2605381) известен способ измерения клеточно-опосредованной иммунологической реактивности, согласно которому проводят контактирование образца цельной крови, представляющего собой источник лимфоцитов, с одним или более агентами (в частности, с TLR4), которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитета. Измерение присутствия или повышения уровня иммунной эффекторной молекулы из иммунных клеток показывает уровень клеточно-опосредованной реактивности у субъекта. Использование указанного изобретения позволяет выявлять иммунные дисфункции путем использования системы цельной крови и объединения стимуляторов, которые усиливают системы приобретенного и врожденного иммунитете, обеспечивая синергетический эффект.The prior art (RF Patent No. 2605381) discloses a method for measuring cell-mediated immunological reactivity, according to which a whole blood sample, which is a source of lymphocytes, is contacted with one or more agents (in particular, TLR4), which enhance the acquired and congenital systems immunity. Measurement of the presence or increase in the level of an immune effector molecule from immune cells shows the level of cell-mediated reactivity in a subject. The use of this invention allows the detection of immune dysfunctions by using the whole blood system and combining stimulants that enhance the acquired and innate immunity systems, providing a synergistic effect.
Недостатком указанного способа является то, что он не позволяет установить причину иммунной дисфункции, и не отвечает на вопрос о факторе, который мог бы ее вызвать (инфекционный, химический агент), а также не учитывает наличие генетической предрасположенности, реализация которой и может привести к иммунным нарушениям.The disadvantage of this method is that it does not allow to establish the cause of immune dysfunction, and does not answer the question about the factor that could cause it (infectious, chemical agent), and also does not take into account the presence of a genetic predisposition, the implementation of which can lead to immune violations.
Также известно использование в качестве критериев генов TLR4 и HLA-DR при диагностике заболеваний.It is also known to use TLR4 and HLA-DR genes as criteria in the diagnosis of diseases.
Из патента РФ №2587325 известен способ диагностики и прогнозирования развития хронического эндометрита (ХЭ) у женщин репродуктивного возраста по экспрессии toll-like рецепторов в эндометрии, согласно которому с помощью иммуногистохимического окрашивания срезов эндометриальной ткани, по проценту позитивно окрашенных клеток эндометрия в баллах, определяют показатели локального врожденного иммунитета - TLR2, TLR4, TLR9: при одновременном выявлении в эпителиальных клетках эндометрия экспрессии TLR2, TLR4 - 3 и более баллов, TLR9 - 4 и более баллов и при отсутствии морфологических критериев ХЭ диагностируют наличие факторов риска и предрасположенности к развитию ХЭ; при одновременном выявлении в эпителиальных клетках эндометрия экспрессии TLR2, TLR4 - менее 3 баллов, TLR9 - менее 4 баллов и при отсутствии морфологических критериев ХЭ диагностируют отсутствие ХЭ; при одновременном выявлении в эпителиальных клетках эндометрия экспрессии TLR2, TLR4 - 3 и более баллов, TLR9 - 6 баллов и при наличии морфологических критериев ХЭ диагностируют наличие и прогрессирование ХЭ (активация воспалительного процесса в эндометрии); при одновременном выявлении в эпителиальных клетках эндометрия экспрессии TLR2, TLR4 - менее 3 баллов, TLR9 - менее 6 баллов и при наличии морфологических критериев ХЭ диагностируют наличие ХЭ в стадии ремиссии (без активации воспалительного процесса в эндометрии); при одновременном выявлении в эпителиальных клетках эндометрия экспрессии TLR2 - 3 и более баллов, TLR4 - 5 и более баллов, TLR9 - 6 баллов и при наличии морфологических критериев ХЭ диагностируют наличие длительно существующего ХЭ, течение которого характеризуется развитием склеротических изменений сосудов и фиброзом стромы эндометрия различной степени выраженности.From the patent of the Russian Federation No. 2587325, a method is known for diagnosing and predicting the development of chronic endometritis (CE) in women of reproductive age by expression of toll-like receptors in the endometrium, according to which, using immunohistochemical staining of sections of the endometrial tissue, the parameters are determined by the percentage of positively stained endometrial cells in points local innate immunity - TLR2, TLR4, TLR9: with simultaneous detection in the endometrial epithelial cells of the expression of TLR2, TLR4 - 3 or more points, TLR9 - 4 or more points and in the absence viii of morphological criteria for CE diagnose the presence of risk factors and a predisposition to the development of CE; with simultaneous detection in the endometrial epithelial cells of the expression of TLR2, TLR4 - less than 3 points, TLR9 - less than 4 points and in the absence of morphological criteria for CE, the absence of CE is diagnosed; with simultaneous detection in the endometrial epithelial cells of expression of TLR2, TLR4 - 3 or more points, TLR9 - 6 points and in the presence of morphological criteria for CE, the presence and progression of CE are diagnosed (activation of the inflammatory process in the endometrium); with the simultaneous detection in the endometrial epithelial cells of expression of TLR2, TLR4 - less than 3 points, TLR9 - less than 6 points and if morphological criteria for CE are diagnosed, the presence of CE in the remission stage (without activating the inflammatory process in the endometrium); with simultaneous detection in the endometrial epithelial cells of expression of TLR2 - 3 or more points, TLR4 - 5 or more points, TLR9 - 6 points and in the presence of morphological criteria, CE diagnoses the presence of a long-existing CE, the course of which is characterized by the development of sclerotic changes in blood vessels and endometrial stromal fibrosis of various severity.
Также из патента РФ №2236013 известен способ диагностики ХЭ и характера воспаления, в котором с помощью иммуногистохимического окрашивания срезов эндометриальной ткани определяют показатели местного иммунитета: количество лимфоцитов экспрессирующих маркеры естественных киллерных клеток CD56+, CD16+ и маркеры активации HLA-DR(II)+, и тем самым диагностируют различные варианты течения ХЭ.Also, from the RF patent No. 2236013, a method for diagnosing CE and the nature of inflammation is known, in which, using immunohistochemical staining of endometrial tissue sections, local immunity indicators are determined: the number of lymphocytes expressing CD56 +, CD16 + natural killer cell markers and HLA-DR (II) + activation markers, and thereby diagnose various options for the course of CE.
Однако недостатком данных методов является то, что исследуются данные показатели (TLR4 и HLA-DR). как факторы местной воспалительной реакции (иммуногистохимия) - хронического эндометрита, тогда как иммунный ответ ассоциирован прежде всего с клетками крови лейкоцитами (нейтрофилы - TLR4, лимфоциты - HLA-DR). Также не оценивается полиморфность генов, отвечающих за экспрессию белков TLR4 и HLA-DR. Поэтому указанный способ является недостаточно точным.However, the disadvantage of these methods is that these indicators are studied (TLR4 and HLA-DR). as factors of the local inflammatory reaction (immunohistochemistry) - chronic endometritis, while the immune response is associated primarily with blood cells with white blood cells (neutrophils - TLR4, lymphocytes - HLA-DR). Also, the polymorphism of the genes responsible for the expression of TLR4 and HLA-DR proteins is not evaluated. Therefore, this method is not accurate enough.
Из патента РФ №2621155 известен способ оценки у детей влияния стронция на апоптоз, ассоциированный с аллельными вариантами гена FAS. При его реализации производят отбор пробы крови у ребенка, и определяют в пробе содержание стронция, также из указанной пробы крови производят выделение мононуклеарных клеток, далее на полученных мононуклеарных клетках определяют уровень лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты ДНК, затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР проводят генотипирование полиморфизма, используя в качестве праймера участок ДНК гена FAS 14405С/Т (rs1159120) путем исследования его аллельного состояния, устанавливая при этом для гена FAS одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или патологическое гомозиготное, и при одновременном выполнении следующих условий: наличие патологического гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена FAS 14405С/Т, снижение в крови уровня лимфоцитов, содержащих на мембране рецептор CD95+, в 1,5 и более раз по отношению к нижней границе физиологической нормы указанных лимфоцитов с CD95+ для детей, и при превышении концентрации стронция в крови более, чем в 1,5 раза, по отношению к референтному уровню, оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как замедленный, а при отсутствии хотя бы одного из вышеуказанных условий оценивают процесс апоптоза у ребенка под влиянием стронция как нормальный.From the patent of the Russian Federation No. 2621155, a method is known for assessing in children the effect of strontium on apoptosis associated with allelic variants of the FAS gene. During its implementation, a blood sample is taken from the child, and the strontium content is determined in the sample, mononuclear cells are isolated from the specified blood sample, then the level of lymphocytes containing the CD95 + receptor on the membrane is determined on the obtained mononuclear cells, and a sample of buccal epithelium is taken from the specified child DNA is extracted from the indicated sample of deoxyribonucleic acid, then genotyping is carried out on a detecting amplifier using the PCR polymerase chain reaction polymorphism, using the DNA fragment of the FAS 14405С / Т gene (rs1159120) as a primer by examining its allelic state, while setting the FAS gene to one of its following states: heterozygous, or normal homozygous, or pathological homozygous, and while performing the following conditions: the presence of pathological homozygous or heterozygous genotypes of the FAS 14405C / T gene, a decrease in blood level of lymphocytes containing CD95 + receptor on the membrane, by 1.5 or more times in relation to the lower boundary of the physiological norm These lymphocytes with CD95 + for children, and when the strontium concentration in the blood is more than 1.5 times higher than the reference level, assess the process of apoptosis in a child under the influence of strontium as slow, and in the absence of at least one of the above conditions assess the process of apoptosis in a child under the influence of strontium as normal.
Однако указанный известный способ позволяет установить только узкий аспект функционирования иммунной системы организма (гибель клеток), в то время как при установлении нарушения иммунологической реактивности по маркерам полиморфизма генов TLR4 и HLA-DR обеспечивается оценка особенностей генетической предрасположенности состояния факторов активации как врожденного (ген TLR4), так и приобретенного (ген HLA-DR) иммунитета.However, this known method allows to establish only a narrow aspect of the functioning of the body’s immune system (cell death), while when immunological reactivity is detected by markers of polymorphism of the TLR4 and HLA-DR genes, it is possible to assess the characteristics of the genetic predisposition of the state of activation factors as innate (TLR4 gene) and acquired (HLA-DR gene) immunity.
При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики нарушения иммунологической реактивности под влиянием стронция, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.Moreover, from the prior art, no known methods for diagnosing a violation of immunological reactivity under the influence of strontium have been identified, therefore, it is not possible to choose the closest analogue to the claimed object.
Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении точности оценки влияния стронция на наличие нарушения иммунологической реактивности, с обеспечением возможности в последующем судить о развитии аутоиммунных и атопических состояний у детей уже на ранних стадиях их формирования.The technical result achieved by the present invention is to provide an accurate assessment of the effect of strontium on the presence of impaired immunological reactivity, with the possibility of subsequently judging the development of autoimmune and atopic conditions in children already in the early stages of their formation.
Указанный технический результат достигается предлагаемым Способом выявления нарушений у детей иммунологической реактивности в условиях избыточной экспозиции стронцием, характеризующимся тем, что производят отбор пробы крови у ребенка, и определяют в пробе содержание стронция, также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), затем на детектирующем амплификаторе с использованием полимеразной цепной реакции ПЦР в режиме реального времени проводят генотипирование полиморфизма генов TLR4 и HLA-DR, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена HLA-DR С/Т (rs3135388), устанавливая при этом для каждого из указанных генов одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное, и при одновременном выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и/или гена HLA-DR С/Т (rs3135388), при одновременном превышении концентрации стронция в крови выше референтного уровня на 20%, диагностируют у ребенка наличие нарушений иммунологической реактивности в условиях избыточной экспозиции стронцием.The specified technical result is achieved by the proposed Method for detecting violations of immunological reactivity in children under conditions of excessive exposure to strontium, characterized in that a blood sample is taken from the child and the strontium content is determined in the sample, a sample of buccal epithelium is also taken from the specified child, and isolation from the specified sample is carried out deoxyribonucleic acid (DNA), then on a detecting amplifier using a real-time PCR polymerase chain reaction genotyping of polymorphism of TLR4 and HLA-DR genes is carried out using a DNA site as a primer by studying the genotypes of the TLR4 gene A8595G (rs1927911) and the HLA-DR C / T gene (rs3135388), setting one of the following conditions for each of these genes : heterozygous, or normal homozygous, or variant homozygous, and subject to the following conditions: the presence of the variant homozygous or heterozygous genotypes of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and / or the HLA-DR C / T gene (rs3135388), while at the same time exceeding st shelter above the reference level at 20%, child diagnosed in the presence of disorders of immunological reactivity in the conditions of excessive exposure strontium.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.The technical result is achieved due to the following.
В качестве критерия нарушений иммунологической реактивности в условиях контаминации стронцием рекомендуется использовать гетерозиготные или вариантные (патологические) гомозиготные генотипы гена Toll-подобного рецептора 4 - TLR4 A8595G (rs1927911), фенотипирующего клетки врожденного иммунитета, и гетерозиготные или вариантные гомозиготные генотипы гена HLA-DR С/Т (rs3135388), главного комплекса гистосовместимости, ответственные за нарушение иммунологической реактивности и ассоциированные с атопическими и аутоиммунными нарушениями (астма, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, псориаз).It is recommended to use heterozygous or variant (pathological) homozygous genotypes of the Toll-like receptor 4 gene, TLR4 A8595G (rs1927911), phenotypic cells of innate immunity, and heterozygous / variant homozygous H homozygous R genotypes T (rs3135388), the main histocompatibility complex, responsible for impaired immunological reactivity and associated with atopic and autoimmune disorders (asthma, disseminated kleroz, rheumatoid arthritis, psoriasis).
Реализующим или запускающим процесс нарушения иммунологической реактивности служит пероральная (водная) экспозиция стронцием, превышающая его референтный диапазон (0,01-0,077 мг/л).The oral (water) exposure to strontium, which exceeds its reference range (0.01-0.077 mg / l), is the one that implements or starts the process of violation of immunological reactivity.
Ген TLR4 A8595G (rs1927911) относится к классу клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, которые распознают консервативные структуры микроорганизмов и активируют клеточный иммунный ответ.TLR4 отвечает за развитие реакций врожденного иммунитета, характеризующихся атопической (аллергической, аутоиммунной) направленностью.The TLR4 A8595G gene (rs1927911) belongs to the class of cell receptors with one transmembrane fragment that recognize the conserved structures of microorganisms and activate the cellular immune response. TLR4 is responsible for the development of innate immunity reactions characterized by atopic (allergic, autoimmune) orientation.
Исследование ассоциации SNP (Single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм) гена TLR4 с хроническими воспалительными заболеваниями органов дыхания показали его роль в распознавании «паттернов» основных групп вирусов и бактерий, активацией специфического иммунитета, каскада неспецифических базовых воспалительных реакций, вовлеченных в патогенез бронхиальной астмы («Полиморфизмы генов Toll-подобных рецепторов, ассоциированные с наследственной отягощенностью и возрастом манифестации бронхиальной астмы». Вестник Адыгейского государственного университета. Серия 4: Естественно-математические и технические науки Выпуск 1 (133) 2014 Руденко К.А., Тугуз А.Р., Анохина Е.Н., Муженя Д.В.).The study of the association of SNP (Single nucleotide polymorphism, single nucleotide polymorphism) of the TLR4 gene with chronic inflammatory diseases of the respiratory system showed its role in the recognition of “patterns” of the main groups of viruses and bacteria, activation of specific immunity, a cascade of non-specific underlying inflammatory reactions involved in the pathogenesis of bronchial asthma (" Polymorphisms of Toll-like receptor genes associated with hereditary burden and age of manifestation of bronchial asthma. ”Bulletin of the Adygea State University, Series 4: Natural and Mathematical and Technical Sciences Issue 1 (133) 2014 Rudenko K.A., Tuguz A.R., Anokhina E.N., Muzhenya D.V.)
Также исследования показали (http://bjo.bmj.com/content/99/9/1301), что полиморфизм rs1927911 toll-like рецептора 4 (TLR4) был связан с сахарным диабетом 2-го типа.Studies have also shown (http://bjo.bmj.com/content/99/9/1301) that rs1927911 toll-like receptor 4 polymorphism (TLR4) was associated with type 2 diabetes mellitus.
В последнее время широко изучались роли полиморфизмов генов, сходных с рецептором (TLR), при атеросклеротических заболеваниях. Анализ подгрупп показал, что полиморфизм TLR4 (rs1927911) был значительно связан с риском церебрального инфаркта в рецессивной модели (95% ДИ 0.46-0.96) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28474755).Recently, the role of receptor-related gene polymorphisms (TLRs) in atherosclerotic diseases has been extensively studied. Subgroup analysis showed that TLR4 polymorphism (rs1927911) was significantly associated with a risk of cerebral infarction in a recessive model (95% CI 0.46-0.96) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28474755).
Система HLA - главный комплекс гистосовместимости, является большим регионом генома, ответственный за сохранение биологической индивидуальности, играет жизненно важную роль, определяя возможность и выраженность иммунного ответа на каждое конкретное антигенное воздействие, т.е. отвечает за развитие реакций приобретенного иммунитета, характеризующихся агрессивным активационным ответом на экзо- или аутоантигены. Ген HLA (С/Т гена HLA-DR (major histocompatibility complex, class II, DR) (rs3135388)) (генетический маркер носительства аллеля HLA-DRB1*15). Известна роль кодируемых им белков в патогенезе рассеянного склероза (PC) и сахарного диабета 1-го типа (СД1). PC и СД1 характеризуются связью риска развития данных состояний с человеческим лейкоцитарным антигеном (HLA)-ДРВ1*15 с однонуклеотидной заменой (SNP) rs3135388: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=gene+polymorphism+hla+dra+rs3135388; http://cyberleninka.ru/article/n/polimorfizm-genov-hla-klassa-ii-i-ctla4-zdorovyh-buryat-i-bolnyh-sahamym-diabetom-1-tipa-v-buryatskoy-respublike.The HLA system, the main histocompatibility complex, is a large region of the genome responsible for maintaining biological identity, and plays a vital role in determining the feasibility and severity of the immune response to each specific antigenic effect, i.e. responsible for the development of acquired immunity reactions, characterized by an aggressive activation response to exo or autoantigens. HLA gene (C / T of the HLA-DR gene (major histocompatibility complex, class II, DR) (rs3135388)) (genetic marker of the carrier of the HLA-DRB1 * 15 allele). The known role of the proteins encoded by him in the pathogenesis of multiple sclerosis (PC) and type 1 diabetes mellitus (T1DM). PC and T1DM are characterized by a link between the risk of developing these conditions and the human leukocyte antigen (HLA) -DRV1 * 15 with a single nucleotide replacement (SNP) rs3135388: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=gene+polymorphism + hla + dra + rs3135388; http://cyberleninka.ru/article/n/polimorfizm-genov-hla-klassa-ii-i-ctla4-zdorovyh-buryat-i-bolnyh-sahamym-diabetom-1-tipa-v-buryatskoy-respublike.
Главный комплекс гистосовместимости - единственная генетическая область, последовательно связанная с ревматоидным артритом. Например, для больных с быстрым появлением костных эрозий и внесуставными проявлениями характерен HLA-DRB1*0401 подтип. Минеральная плотность костной ткани уменьшалась с возрастом от 96,7% в группе моложе 30 лет до 15,2% в группе старше 80 лет, что было ассоциировано с аллельным полиморфизмом гена DRB1 комплекса HLA.The main histocompatibility complex is the only genetic region sequentially associated with rheumatoid arthritis. For example, for patients with rapid onset of bone erosion and extra-articular manifestations, the HLA-DRB1 * 0401 subtype is characteristic. Bone mineral density decreased with age from 96.7% in the group under the age of 30 to 15.2% in the group over the age of 80, which was associated with the allelic polymorphism of the DRL1 gene of the HLA complex.
Гены HLA-комплекса расположены на коротком плече 6-й хромосомы (6р21). Этот регион занимает область размером до 20 сантиморганид. HLA-комплекс состоит из генов, которые кодируют различные белки, вовлеченные в иммунный ответ. В зависимости от структуры и функций белковых продуктов, HLA-гены подразделяются на 3 большие класса. Наиболее близко расположенный к теломере класс I представлен генами HLA-A, В, С, Е, F, G. Эти гены кодируют поверхностные клеточные гликопротеины, представленные на наружной цитоплазматической мембране большинства клеток человека. Лежащие ближе к центромере гены класса II (HLA-DR, DQ и DP) кодируют а- и b-цепи, которые формируют гетеродимеры, экспрессирующиеся на поверхности антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, макрофаги и В-лимфоциты. Гены класса III кодируют компоненты комплемента (С2, С4, Bf), а- и р-факторы некроза опухолей, белки теплового шока, 21-ОН-гидроксилазу. Для всего HLA характерен выраженный генетический полиморфизм. Генетическая предрасположенность к разному типу иммунного ответа, обусловленная генами HLA класса II, должна реализовываться или в результате непосредственного участия самих продуктов генов HLA, или через сцепленные (то есть находящиеся близко на хромосоме и передающиеся единым блоком) с ними гены, или опосредованно, через более сложные цепочки взаимодействий.The genes of the HLA complex are located on the short arm of the 6th chromosome (6p21). This region occupies an area of up to 20 centimorganide. The HLA complex consists of genes that encode various proteins involved in the immune response. Depending on the structure and functions of protein products, HLA genes are divided into 3 large classes. The class I closest to the telomere is represented by the HLA-A, B, C, E, F, G genes. These genes encode surface cell glycoproteins present on the outer cytoplasmic membrane of most human cells. Class II genes lying closer to the centromere (HLA-DR, DQ, and DP) encode a and b chains that form heterodimers expressed on the surface of antigen presenting cells, such as dendritic cells, macrophages, and B lymphocytes. Class III genes encode complement components (C2, C4, Bf), a- and p-factors of tumor necrosis, heat shock proteins, 21-OH hydroxylase. Total HLA is characterized by pronounced genetic polymorphism. A genetic predisposition to a different type of immune response, caused by HLA class II genes, must be realized either as a result of direct participation of the HLA gene products themselves, or through genes linked (i.e., located close to the chromosome and transmitted in a single block) with them, or indirectly, through more complex chains of interactions.
На сегодняшний день есть только единичные исследования, связанные с прояснением этих вопросов. Есть предположения, что сила иммунного ответа может зависеть от плотности пептидов, представленных молекулами МНС (major histocompatibility complex, главный комплекс гистосовместимости) на поверхности АГ (антиген) презентирующей клетки, а плотность может зависеть от силы связывания пептидов с представляющей молекулой. По предположению J. Robinson et al., в пределах комплекса генов МНС могут находиться кандидатные гены, которые могут влиять на иммунный или воспалительный ответ АГ независимым образом, что следует из исследования продукции цитокинов в клеточных культурах от здоровых носителей разных HLA-гаплотипов.To date, there are only a few studies related to clarifying these issues. There are suggestions that the strength of the immune response may depend on the density of the peptides represented by MHC molecules (major histocompatibility complex, the main histocompatibility complex) on the surface of the antigen (antigen) of the presenting cell, and the density may depend on the strength of the binding of the peptides to the representing molecule. According to the assumption of J. Robinson et al., Candidate genes can be located within the complex of MHC genes, which can independently affect the immune or inflammatory response of AH, which follows from the study of cytokine production in cell cultures from healthy carriers of different HLA haplotypes.
Таким образом, основная физиологическая функция молекул HLA II класса, в отличие от I, в представлении антигенов экзогенного происхождения клетками иммунной системы для запуска иммунного ответа на них. Формирование в процессе эволюции системы генов II класса, выделение их из общих с I классом предковых генов и специализация функции возникли, вероятно, в результате действия факторов окружающей среды.Thus, the main physiological function of class II HLA molecules, in contrast to class I, is the presentation of exogenous antigens by cells of the immune system to trigger an immune response to them. The formation of the system of class II genes in the process of evolution, their isolation from the ancestral genes common with class I, and the specialization of functions have probably arisen as a result of the action of environmental factors.
Нарушение физиологических функций системы HLA лежит в основе большинства патологий человека: от патологии репродукции до таких социально значимых заболеваний, как онкозаболевания, аутоиммунные, инфекционные и другие.Violation of the physiological functions of the HLA system is the basis of most human pathologies: from reproductive pathology to socially significant diseases such as cancer, autoimmune, infectious and others.
Благодаря тому, что в заявляемом способе в качестве диагностических критериев предлагается использовать именно ген TLR4 A8595G (rs1927911) и ген HLA-DR С/Т (rs3135388), обеспечивается точность исследования, т.к. у ребенка учитывается детерминация нарушений врожденной иммунологической реактивности и/или приобретенной. Генетическая детерминация нарушений врожденного и приобретенного иммунитета формируются условиями проживания родителей ребенка на эндемичной территории (экспозиция стронцием), а сама избыточная экспозиция стронцием в процессе жизни ребенка на этой территории реализует негативную генетическую предрасположенность. Поэтому по этим показателям можно судить о генетически детерминированном характере нарушений иммунологической реактивности и разрабатывать индивидуальные программы диагностики и коррекции.Due to the fact that in the claimed method, it is proposed to use precisely the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and the HLA-DR C / T gene (rs3135388) as diagnostic criteria, the accuracy of the study is ensured, because in a child, the determination of violations of innate immunological reactivity and / or acquired is taken into account. The genetic determination of impaired innate and acquired immunity is formed by the living conditions of the child’s parents in the endemic territory (exposure to strontium), and the excess exposure to strontium during the life of the child in this territory implements a negative genetic predisposition. Therefore, these indicators can be used to judge the genetically determined nature of immunological reactivity disorders and develop individual diagnostic and correction programs.
Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы крови, а также стандартных методик изучения иммунологических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.Thanks to the use of blood samples as the test material, as well as standard methods for studying immunological parameters, simplicity, reliability and accessibility of studies are ensured, as well as obtaining the results of the necessary information content.
Установление содержания химического контаминанта - стронция, именно в крови обусловлено тем, что кровь является самой гомеостатичной средой (управляемость и регулируемость концентраций составляющих ее компонентов) и единственной, имеющей реферируемые константы в отношении техногенных химических веществ.The determination of the content of a chemical contaminant, strontium, in blood is due to the fact that blood is the most homeostatic medium (controllability and controllability of the concentrations of its constituent components) and the only one with referenced constants with respect to technogenic chemicals.
Воздействие химических факторов оказывает негативное влияние на регуляторные системы и адаптационные возможности организма, что, в свою очередь, ведет к снижению резистентности, сопротивляемости организма к инфекционным заболеваниям и повышению чувствительности к неинфекционной патологии.The influence of chemical factors has a negative effect on the regulatory systems and adaptive capabilities of the body, which, in turn, leads to a decrease in resistance, the body's resistance to infectious diseases and an increase in sensitivity to non-infectious pathology.
Благодаря использованию в качестве исследуемого материала буккального эпителия (пробы биологического материала со слизистой щеки), обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности, в плане выделения из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и посредством полимеразной цепной реакции (ПНР) проведения генотипирования полиморфизма указанных генов TLR4 и HLA-DR. При этом предлагается использовать в качестве праймера участок ДНК гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена HLA-DR С/Т (rs3135388), устанавливая при этом для каждого гена одно из следующих его состояний: гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное.Thanks to the use of buccal epithelium as a test material (a sample of biological material from the mucous membrane of the cheek), the simplicity and reliability of studies are ensured, as well as the necessary information content in terms of the isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) from this sample and through polymerase chain reaction (PNR) genotyping polymorphism of these TLR4 and HLA-DR genes. It is proposed to use as a primer a portion of the DNA of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and the HLA-DR C / T gene (rs3135388), setting for each gene one of the following states: heterozygous, or normal homozygous, or variant homozygous.
У гена TLR4 2 аллеля (1 пара аллелей), А и G (А - дикий или нормальный, G - мутантный или вариантный), причем полиморфные генотипы - AG (гетерозиготный) или GG (вариантный гомозиготный). У гена HLA-DR 2 аллеля (1 пара аллелей) С и Т (С - дикий или нормальный, Т - мутантный или вариантный), причем полиморфные генотипы - СТ (гетерозиготный) или ТТ (вариантный гомозиготный).The TLR4 gene has 2 alleles (1 pair of alleles), A and G (A is wild or normal, G is mutant or variant), and the polymorphic genotypes are AG (heterozygous) or GG (variant homozygous). The HLA-DR gene has 2 alleles (1 pair of alleles) C and T (C is wild or normal, T is mutant or variant), with polymorphic genotypes being CT (heterozygous) or TT (variant homozygous).
Стронций оказывает воздействие на нарушение иммунологической реактивности путем реализации имеющей генетической предрасположенности к развитию атопии (полиморфизм гена TLR4 A8595G rs1927911) и образованием избыточного уровня специфического иммуноглобулина G к стронцию (IgG к стронцию), а также реализации генетической предрасположенности к аутоиммунной агрессии (полиморфизм гена HLA-DR С/Т rs3135388) в виде остеопоретических изменений костной ткани с повышением уровня агрессивных цитокинов - RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand).Strontium affects the violation of immunological reactivity by implementing a genetic predisposition to the development of atopy (TLR4 A8595G rs1927911 gene polymorphism) and the formation of an excess level of specific immunoglobulin G to strontium (IgG to strontium), as well as the realization of a genetic predisposition to autoimmune aggression (H polymorphism DR C / T rs3135388) in the form of osteoporetic changes in bone tissue with an increase in the level of aggressive cytokines - RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand).
Таким образом, при оценке влияния стронция на нарушение иммунологической реактивности в предлагаемом способе рекомендуется использовать следующие критерии: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и/или наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов гена HLA-DR С/Т (rs3135388), и превышение концентрации стронция в крови по отношению к референтному уровню не менее, чем на 20%.Thus, when assessing the effect of strontium on the violation of immunological reactivity in the proposed method, it is recommended to use the following criteria: the presence of a variant homozygous or heterozygous genotype of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and / or the presence of a variant homozygous or heterozygous genotype of the HLA-DR C / T gene (rs313 , and the excess concentration of strontium in the blood relative to the reference level is not less than 20%.
Именно благодаря расширению информационных показателей, связанных с нарушением иммунологической реактивности и одновременно с количеством химического токсиканта - стронция, в крови, и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния стронция на иммунологическую реактивность.It is thanks to the expansion of information indicators associated with impaired immunological reactivity and simultaneously with the amount of a chemical toxicant - strontium in the blood, that the accuracy of the assessment of the modifying effect of strontium on immunological reactivity will be ensured.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.Based on the foregoing, we can conclude that the technical result is achieved due to the totality of the operations of the proposed method, their sequence and modes of its implementation.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.The proposed method is implemented as follows.
1. Выбирают территорию экологического риска, характеризующуюся наличием химических токсикантов, обусловленных экологической средой обитания. Исследования были проведены на территории г. Кунгур, характеризующейся наличием биогеохимической провинции с высоким содержанием стронция в подземных водах, использующихся населением, в частности детским, в качестве питьевой воды.1. Choose the territory of environmental risk, characterized by the presence of chemical toxicants due to the ecological environment. The studies were conducted in the territory of Kungur, characterized by the presence of a biogeochemical province with a high content of strontium in groundwater, used by the population, in particular for children, as drinking water.
2. На указанной территории производят отбор группы детей одной этнической популяции. Затем производят отбор пробы крови у обследуемого ребенка в специальные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,05М раствор ЭДТА в соотношении 500 мкл крови на 50 мкл антикоагулянта) - для определения содержания стронция, для выделения клеток крови и изучения маркеров клеточной дифференцировки. При этом определение стронция в крови проводят методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в соответствии с требованиями СТО М. 12-2013 и устанавливают, имеется ли превышение концентрации этого контаминанта в пробе крови над его референтным уровнем (в примере конкретного осуществления на территории г. Кунгур Пермского края референтным значением по стронцию был показатель равный 0,077 мг/дм3 (P. Heitland, 2006 г.)).2. On the specified territory, a group of children of one ethnic population is selected. Then, a blood sample is taken from the examined child in special tubes with the EDTA anticoagulant (ethylenediaminetetraacetic acid) (0.05 M EDTA solution in a ratio of 500 μl of blood per 50 μl of anticoagulant) - to determine the strontium content, to isolate blood cells and to study markers of cell differentiation. In this case, the determination of strontium in the blood is carried out by the method of mass spectrometry with inductively coupled plasma in accordance with the requirements of STO M. 12-2013 and it is established whether there is an excess of the concentration of this contaminant in the blood sample over its reference level (in the example of a specific implementation in the city of Kungur, Perm Territory, the reference value for strontium was an indicator equal to 0.077 mg / dm 3 (P. Heitland, 2006)).
3. Также у указанного ребенка отбирают пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки), причем забор осуществляют сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями без травматизации после предварительного полоскания полости рта водой. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Конец зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.3. Also, a sample of buccal epithelium is taken from the indicated child (in the form of a smear from the mucous membrane of the cheek), and the sampling is carried out with dry sterile probes with cotton swabs in rotational movements without injury after preliminary rinsing of the oral cavity with water. After taking the material, the tampon (the working part of the probe with a cotton swab) is placed in a sterile Eppendorf tube with 500 μl of transport medium (sterile 0.9% NaCl solution). The end of the probe is broken off or cut off, with the expectation that it will allow the tube lid to be tightly closed. The tube with the solution and the working part of the probe is closed.
Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт: ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.Next, DNA is extracted from the sample. For this, samples in an amount of 100 μl are lysed with 300 μl of a lysing solution, which is a 0.5% solution of sarcosyl and proteinase K (20 mg / ml) in acetate buffer (pH 7.5). Then a sorbent (kaolin) is added and the washing samples are washed with phosphate-buffered saline (pH 7.2) from proteins and a mixture of isopropyl alcohol: acetone from lipids. Nucleic acids remain on the sorbent. Next, the DNA adsorbed on the sorbent from the sample is extracted with TE buffer, which is a mixture of 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA (pH 8.0). The extract is centrifuged. After centrifugation of the tube, the supernatant contains purified DNA.
Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразную цепную реакцию проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов TLR4 (A8595G rs1927911) и HLA-DR С/Т (rs3135388).The resulting material is ready for the production of polymerase chain reaction (PCR). The polymerase chain reaction is carried out on a real-time detection amplifier with hybridization-fluorescence detection using ready-made sets of primers and probes manufactured by Syntol CJSC, Russia, in which TLR4 DNA fragments (A8595G rs1927911) and HLA- were used as primers DR C / T (rs3135388).
Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного человека готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов TLR4 A8595G rs1927911 и HLA-DR С/Т rs3135388 (использованы Наборы реагентов для определения полиморфизма A8595G гена TLR4 rs1927911 и полиморфизма С/Т гена HLA-DR rs3135388 ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl2) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.An amplification reaction is carried out, this is achieved by the fact that in order to study the allelic state of each gene in an individual, their reaction mixture is prepared. 0.1 μl of the prepared primer mixture (the term accepted in genetics for the labeled final nucleotides that limit (cut off) the amplified gene nucleotide strand) and probes for the selected TLR4 A8595G rs1927911 and HLA-DR C / T rs3135388 genes (used Reagent kits for determining A8595G polymorphism of the TLR4 rs1927911 gene and C / T polymorphism of the HLA-DR rs3135388 gene of CJSC Synthol, Russia). The remaining components necessary for PCR are added to each tube: nucleotides (deoxynucleoside triphosphates: 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP), buffers (100 mM Tris-HCl buffer, 500 mM KCl, 40 mM MgCl 2 ) and Tag F- polymerase. Make a sample in an amount of 10 μl. Thus, the total volume of the reaction mixture is 25 μl. Each tube is tightly closed by a stopper and installed in the amplifier.
При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.During PCR, amplification and detection are carried out on a Bio-Rad detection amplifier CFX96.
Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап - активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95°С; 2 этап - установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап - рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).A universal amplification program selected by the reagent manufacturer is used. It includes several stages: Stage 1 - activation of TaqF polymerase (“hot start” mode) lasts 15 minutes at 95 ° C; Stage 2 - installation cycles of amplification without measuring fluorescence (5 cycles); Stage 3 - amplification duty cycles with fluorescence measurement (40 cycles).
Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95°С), отжиг праймеров (20 с при 60°С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72°С).Each amplification cycle includes DNA denaturation (5 s at 95 ° C), primer annealing (20 s at 60 ° C) and the DNA polymerization reaction itself (15 s at 72 ° C).
Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC - для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM - для альтернативного варианта.The fluorescence signal arising from the accumulation of amplification products of DNA regions is recorded in the “real time” mode after the annealing of the primers for the selected genes via the VIC channel to detect one of the allelic variants of the genes, and the FAM channel for an alternative.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.The results are interpreted based on the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at a predetermined level, which corresponds to the presence (or absence) of the threshold cycle value (N) in the corresponding column in the result table displayed in the CFX96 amplifier software.
По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние гена TLR4 в исследуемом участке ДНК A8595G (rs1927911), а также гена HLA-DR в исследуемом участке ДНК С/Т (rs3135388) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное - в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное - в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливается гетерозиготное, или нормальное гомозиготное, или вариантное гомозиготное состояние генов TLR4 A8595G (rs1927911) и HLA-DR С/Т (rs3135388).The ratio of the threshold cycles obtained through the two detection channels determines the state of the TLR4 gene in the studied DNA region A8595G (rs1927911), as well as the HLA-DR gene in the studied DNA region C / T (rs3135388) (allelic discrimination method). There were two possible variants of the state of the gene: homozygous - in the case when one of the values of the threshold cycle is not determined (below the threshold line) and heterozygous - in the case when two values of the threshold cycles were obtained and parabolic fluorescence curves were obtained from these channels. Depending on the accumulation of which amplification product occurs in the reaction, a heterozygous or normal homozygous or variant homozygous state of the TLR4 A8595G (rs1927911) and HLA-DR C / T (rs3135388) genes is established.
4. И при выполнении следующих условий: наличие вариантного гомозиготного или гетерозиготного генотипов генов TLR4 A8595G (rs1927911) и/или HLA-DR С/Т (rs3135388) и при превышении концентрации стронция в крови не менее, чем на 20% выше максимального референтного уровня, диагностируют наличие у ребенка нарушения иммунологической реактивности под влиянием стронция.4. And under the following conditions: the presence of a variant homozygous or heterozygous genotype of the TLR4 A8595G (rs1927911) and / or HLA-DR C / T (rs3135388) genotypes and when the strontium concentration in the blood is exceeded by at least 20% above the maximum reference level , diagnose the presence of a child with a violation of immunological reactivity under the influence of strontium.
В последующем по этому показателю судят о возникновении аутоиммунных и атопических состояний, как результат нарушения иммунологической реактивности, модифицированной стронцием.Subsequently, this indicator judges the occurrence of autoimmune and atopic conditions as a result of a violation of the immunological reactivity modified by strontium.
При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа выполнено исследование детского населения, проживающего в различных по содержанию стронция в питьевой воде условиях среды обитания. Группу наблюдения составили 26 детей, потребляющих воду с содержанием стабильного стронция в ней, превышающим предельно-допустимую концентрацию до 1.3 раза. Группа контроля - 24 детей, потребляющих воду с допустимым содержанием стронция. Группа наблюдения и контрольная группа были сопоставимы по полу, возрасту, соматической заболеваемости.When conducting tests to implement the proposed method, a study was carried out of the child population living in different environmental conditions of strontium in drinking water. The observation group consisted of 26 children consuming water with a stable strontium content in it exceeding the maximum permissible concentration up to 1.3 times. Control group - 24 children consuming water with an acceptable strontium content. The observation group and the control group were comparable by sex, age, somatic incidence.
Кроме того, для подтверждения точности и достоверности оценки влияния стронция на развитие нарушения иммунологической реактивности предлагаемым способом, схема реализации которого приведена выше, у указанных детей были установлены уровень иммуноглобулина G (далее -IgG) к стронцию и содержание белка RANKL. RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) - мембранный белок, цитокин семейства факторов некроза опухоли, играет важнейшую роль в формировании патологии костной системы, патофизиологии костной ткани при остеопорозе, в патогенезе которого может принимать участие стронций при его избыточном содержание в среде обитания. IgG и мембранный белок RANKL являются маркерами нарушения иммунологической реактивности. Они позволяют достоверно установить наличие атопии (сенсибилизации) к стронцию, как результат нарушенной генетической программы по генам врожденной атопизации (TLR4 A8595G rs1927911), а также проявления аутоиммунной агрессии, как результат нарушенной генетической программы по генам гистосовместимости HLA-DR С/Т rs3135388.In addition, to confirm the accuracy and reliability of assessing the effect of strontium on the development of impaired immunological reactivity by the proposed method, the implementation scheme of which is given above, the level of immunoglobulin G (hereinafter-IgG) to strontium and the RANKL protein content were established in these children. RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) - a membrane protein, a cytokine of the family of tumor necrosis factors, plays a crucial role in the formation of bone system pathology, bone pathophysiology in osteoporosis, in the pathogenesis of which strontium may be involved in case of its excessive content in the medium habitat. IgG and RANKL membrane protein are markers of impaired immunological reactivity. They make it possible to reliably establish the presence of atopy (sensitization) to strontium, as a result of a violated genetic program for congenital atopization genes (TLR4 A8595G rs1927911), as well as manifestations of autoimmune aggression, as a result of a violated genetic program for histocompatibility genes HLA-DR C / T rs3135388.
Установление уровня IgG проводили по методике: Зайцева Н.В., Беляев Е.Н., Долгих О.В. Способы диагностики сенсибилизации к низкомолекулярным химическим соединениям / Методические рекомендации. - М., 2002. - С. 29.The determination of IgG level was carried out according to the methodology: Zaitseva N.V., Belyaev E.N., Dolgikh O.V. Methods for the diagnosis of sensitization to low molecular weight chemical compounds / Methodical recommendations. - M., 2002 .-- S. 29.
Установление содержания белка RANKL проводили по методике иммуноферментного теста «Свободный растворимый лиганд рецептора-активатора ядерного фактора каппа б (sRANKL) высокочувствительный (ampli sPANKL human) (набор sRANKL, Biomedica, Австрия)».The RANKL protein content was determined by the method of the immunoassay test “Free soluble ligand of the kappa b nuclear factor activator receptor activator (sRANKL) highly sensitive (ampli sPANKL human) (sRANKL kit, Biomedica, Austria)”.
Полученные данные приведены в таблице 1.The data obtained are shown in table 1.
Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что при сочетании вариантного (гетерозиготное или патологическое гомозиготное состояние генотипа) аллеля гена TLR4 A8595G (rs1927911) и/или гена HLA-DR С/Т (rs3135388) и концентрации виновного фактора (стронция) выше референтной концентрации (0,077 мг/л) не менее, чем на 20%, наблюдается повышение по сравнению с физиологической нормой уровня IgG к стронцию и повышение содержание белка RANKL. То есть при этом фиксируется реализация стронцием негативной генетической программы у ребенка. Тогда как при допустимом (на уровне референтной концентрации) содержании стронция в крови, даже в условиях наследования вариантного генотипа указанных генов, указанные показатели находятся в пределах физиологической нормы. И, наоборот, в случае превышения содержания стронция в крови не менее, чем на 20% по сравнению с референтным уровнем, но при отсутствии полиморфных изменений указанных генов, уровень IgG к стронцию и содержание белка RANKL также находятся в пределах физиологической нормы. Это указывает на то, что только одновременное превышение содержания стронция в крови по отношению к референтному уровню и наличие полиморфных генотипов генов TLR4 A8595G (rs1927911) и/или гена HLA-DR С/Т (rs3135388) характеризуется появлением негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к стронцию и RANKL, и таким образом подтверждает точность и достоверность предлагаемого способа.The data presented in table 1 show that, when a variant (heterozygous or pathological homozygous state of the genotype) combination is allele of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and / or the HLA-DR C / T gene (rs3135388) and the concentration of the guilty factor (strontium) is higher than the reference concentration (0.077 mg / l) of not less than 20%, there is an increase compared with the physiological norm of the level of IgG to strontium and an increase in the protein content of RANKL. That is, at the same time, the implementation by strontium of a negative genetic program in a child is recorded. Whereas at a permissible (at the reference concentration level) strontium content in the blood, even under conditions of inheritance of the variant genotype of the indicated genes, these indicators are within the physiological norm. Conversely, if the strontium content in the blood is not less than 20% higher than the reference level, but in the absence of polymorphic changes in these genes, the level of strontium IgG and the RANKL protein content are also within the physiological norm. This indicates that only a simultaneous excess of strontium in the blood relative to the reference level and the presence of polymorphic genotypes of the TLR4 A8595G (rs1927911) genes and / or the HLA-DR C / T gene (rs3135388) is characterized by the appearance of negative effects in the form of a deviation from the norm the level of IgG to strontium and RANKL, and thus confirms the accuracy and reliability of the proposed method.
Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и этнической принадлежности из группы пациентов с повышенным содержанием стронция в крови и наличием полиморфности генотипа (гетерозиготного и вариантного гомозиготного генотипа) гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена HLA-DR С/Т (rs3135388), и превышением Sr в крови не менее, чем на 20% по сравнению с референтным уровнем; с повышенным содержанием стронция в крови и отсутствием полиморфности генотипов гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена HLA-DR С/Т (rs3135388).To illustrate the implementation of the proposed method, two examples are given for specific patients of the same age and ethnicity from a group of patients with high strontium in the blood and the presence of polymorphism of the genotype (heterozygous and variant homozygous genotype) of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and the HLA-DR C / T gene (rs3135388), and the excess of Sr in the blood is not less than 20% compared with the reference level; with an increased content of strontium in the blood and lack of polymorphism of the genotypes of the TLR4 gene A8595G (rs1927911) and the HLA-DR C / T gene (rs3135388).
Пример 1. Пациент, 7 лет, русский. Определяется уровень стронция в крови более чем на 20% выше референтного уровня - 0,169 мг/дм. Определяется наличие вариантного гомозиготного генотипа гена TLR4 A8595G (rs1927911) - GG и гетерозиготного генотипа гена HLA-DR С/Т (rs3135388) - СТ. Значение содержания IgG к стронцию: 0,55 у.е., т.е. в 5,5 раза выше верхней границы нормы. Содержание белка RANKL - костного цитокина - 79,7 пг/см3, т.е. выше диапазона нормы (5,5-11,5 пг/см3). Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к стронцию и содержания белка RANKL на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем на 20% содержания стронция в крови, а также наличие вариантного гомозиготного полиморфизма гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гетерозиготного полиморфизма гена HLA-DR С/Т (rs3135388), кодирующих белки ответственные за атопию и аутоиммунитет, что указывает на реализацию нарушений иммунологической реактивности у данного пациента, инициированной действием стронция.Example 1. Patient, 7 years old, Russian. The level of strontium in the blood is determined more than 20% above the reference level - 0.169 mg / dm. The presence of the variant homozygous genotype of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) - GG and the heterozygous HLA-DR C / T gene genotype (rs3135388) - CT is determined. The value of the content of IgG to strontium: 0.55 cu, i.e. 5.5 times higher than the upper limit of the norm. The protein content of RANKL - a bone cytokine is 79.7 pg / cm3, i.e. above the normal range (5.5-11.5 pg / cm3). Thus, high levels of IgG to strontium and RANKL protein content were established against a background of an increase in blood strontium content relative to the reference level of more than 20%, as well as the presence of variant homozygous polymorphism of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and heterozygous HLA gene polymorphism -DR C / T (rs3135388) encoding the proteins responsible for atopy and autoimmunity, which indicates the implementation of impaired immunological reactivity in this patient, initiated by the action of strontium.
Пример 2. Пациент, 8 лет, русский. Определяется уровень стронция в крови более, чем на 20%, выше референтных уровней - 0,149 мг/дм3. Отсутствуют полиморфные (вариантные) аллели гена TLR4 A8595G (rs1927911) и гена HLA-DR С/Т (rs3135388). Значение содержания IgG к стронцию: 0,092 у.е. - в диапазоне нормы. Содержание белка RANKL - костного цитокина - 9,88 пг/см3 - не превышает диапазон нормы (5,5-11,5 пг/см3). Таким образом, отсутствии полиморфизма генов TLR4 A8595G (rs1927911) и гена HLA-DR С/Т (rs3135388) на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, более чем на 20%, содержания стронция в крови, не приводит к развитию негативных эффектов в виде отклонения от нормы уровня IgG к стронцию и RANKL, то есть в отсутствии негативной генетической программы превышение референтной концентрации стронция в крови не формирует развитие атопических и аутоиммунных процессов и не меняет состояние иммунологической реактивности у данного пациента.Example 2. Patient, 8 years old, Russian. The level of strontium in the blood is determined by more than 20%, above the reference levels - 0.149 mg / dm 3 . There are no polymorphic (variant) alleles of the TLR4 A8595G gene (rs1927911) and the HLA-DR C / T gene (rs3135388). The value of the content of IgG to strontium: 0,092 cu - in the normal range. The protein content of RANKL - a bone cytokine - 9.88 pg / cm3 - does not exceed the normal range (5.5-11.5 pg / cm3). Thus, the absence of polymorphism of the TLR4 A8595G (rs1927911) genes and the HLA-DR C / T gene (rs3135388) against the background of a strontium content increased by more than 20% in the blood does not lead to the development of negative effects in the form deviations from the normal level of IgG to strontium and RANKL, that is, in the absence of a negative genetic program, an excess of the reference concentration of strontium in the blood does not form the development of atopic and autoimmune processes and does not change the state of immunological reactivity in this patient.
Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием предлагаемых критериев по содержанию стронция в крови и вариантов гетерозиготного и вариантного гомозиготного генотипов генов TLR4 A8595G (rs1927911) и/или гена HLA-DR С/Т (rs3135388) обеспечивается его назначение.Thus, the above data show that when implementing the proposed method using the proposed criteria for the content of strontium in the blood and variants of the heterozygous and variant homozygous genotypes of the TLR4 A8595G genes (rs1927911) and / or the HLA-DR C / T gene (rs3135388), its purpose is ensured .
Предлагаемый способ идентификации нарушения иммунологической реактивности, связанной с водной экспозицией стронцием, позволит установить наличие ранних проявлений атопических, аутоиммунных нарушений, в том числе остеопоретических изменений костной ткани.The proposed method for identifying a violation of immunological reactivity associated with water exposure to strontium will allow us to establish the presence of early manifestations of atopic, autoimmune disorders, including osteoporotic bone changes.
Примечание: 1. АА - нормальный гомозиготный генотип гена TLR4 (A8595G) (rs1927911); AG - вариантный гомозиготный генотип гена TLR4 (A8595G) (rs1927911); GG - гетерозиготный генотип гена TLR4 (A8595G) (rs1927911);Note: 1. AA is the normal homozygous genotype of the TLR4 gene (A8595G) (rs1927911); AG - variant homozygous genotype of the TLR4 gene (A8595G) (rs1927911); GG - heterozygous genotype of the TLR4 gene (A8595G) (rs1927911);
2. СС - нормальный гомозиготный генотип гена HLA-DR С/Т (rs3135388); СТ - гетерозиготный генотип гена HLA-DR С/Т (rs3135388);); ТТ - вариантный гомозиготный генотип гена HLA-DR С/Т (rs3135388);2. SS - normal homozygous genotype of the HLA-DR C / T gene (rs3135388); CT - heterozygous genotype of the HLA-DR C / T gene (rs3135388);); TT - variant homozygous genotype of the HLA-DR C / T gene (rs3135388);
3. Зависимость уровня IgG к стронцию и содержания белка RANKL от концентрации стронция в крови (мг/л) достоверна (R2=0,65-0.81; р<0,05), где R2 - коэффициент детерминации; р – вероятность.3. The dependence of the level of IgG to strontium and the protein content of RANKL on the concentration of strontium in the blood (mg / l) is significant (R 2 = 0.65-0.81; p <0.05), where R 2 is the coefficient of determination; p is the probability.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017126444A RU2651038C1 (en) | 2017-07-21 | 2017-07-21 | Method for detecting disorders in children of immunological reactivity in conditions of excessive exposure to strontium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017126444A RU2651038C1 (en) | 2017-07-21 | 2017-07-21 | Method for detecting disorders in children of immunological reactivity in conditions of excessive exposure to strontium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2651038C1 true RU2651038C1 (en) | 2018-04-18 |
Family
ID=61977030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017126444A RU2651038C1 (en) | 2017-07-21 | 2017-07-21 | Method for detecting disorders in children of immunological reactivity in conditions of excessive exposure to strontium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2651038C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747486C1 (en) * | 2020-07-27 | 2021-05-05 | Александр Наумович Наровлянский | Method for detecting activity of innate immunity |
| RU2805862C1 (en) * | 2023-04-13 | 2023-10-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method of genotyping tlr4 gene using rs4986790 polymorphism and a set of oligonucleotide primers and probes for its implementation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0969015A2 (en) * | 1998-06-15 | 2000-01-05 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Peptide diagnostic markers for human disorders |
| RU2494401C2 (en) * | 2011-12-08 | 2013-09-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Diagnostic technique for immune status disorder in children under chemical contamination |
-
2017
- 2017-07-21 RU RU2017126444A patent/RU2651038C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0969015A2 (en) * | 1998-06-15 | 2000-01-05 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Peptide diagnostic markers for human disorders |
| RU2494401C2 (en) * | 2011-12-08 | 2013-09-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") | Diagnostic technique for immune status disorder in children under chemical contamination |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SENKOYLU A. et al. Effect of strontium ranelate on hydrogen peroxide-induced apoptosis of CRL-11372 cells / Biochem Genet., 2008 Apr; 46(3-4), pages 197-205. * |
| ПЕРКОВСКАЯ А.Ф. Особенности иммунного статуса детей в современных экологических условиях Республики Беларусь. Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук// М., 1999, 25 с. * |
| ПЕРКОВСКАЯ А.Ф. Особенности иммунного статуса детей в современных экологических условиях Республики Беларусь. Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук// М., 1999, 25 с. SENKOYLU A. et al. Effect of strontium ranelate on hydrogen peroxide-induced apoptosis of CRL-11372 cells / Biochem Genet., 2008 Apr; 46(3-4), pages 197-205. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2747486C1 (en) * | 2020-07-27 | 2021-05-05 | Александр Наумович Наровлянский | Method for detecting activity of innate immunity |
| RU2805862C1 (en) * | 2023-04-13 | 2023-10-24 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method of genotyping tlr4 gene using rs4986790 polymorphism and a set of oligonucleotide primers and probes for its implementation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bari et al. | Effect of donor KIR2DL1 allelic polymorphism on the outcome of pediatric allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation | |
| Pinedo et al. | Candidate gene polymorphisms (BoIFNG, TLR4, SLC11A1) as risk factors for paratuberculosis infection in cattle | |
| Reed et al. | Presence of de novo mutations in autosomal dominant polycystic kidney disease patients without family history | |
| JP6707181B2 (en) | Kits or packages for identifying pregnant women at risk of preterm birth and use of such kits or packages | |
| Khorshid et al. | Early fetal gender determination using real-time PCR analysis of cell-free fetal DNA during 6th-10th weeks of gestation | |
| Chiras et al. | Development of novel LOXL1 genotyping method and evaluation of LOXL1, APOE and MTHFR polymorphisms in exfoliation syndrome/glaucoma in a Greek population | |
| RU2587540C1 (en) | Method of diagnosing condition of immune system of patient and set of primers, probes and standard samples for quantitative estimation of dna molecules trec, krec and number of genome equivalents of dna | |
| Nordqvist et al. | Histidine-rich glycoprotein polymorphism and pregnancy outcome: a pilot study | |
| Clausen et al. | Reliable test for prenatal prediction of fetal RhD type using maternal plasma from RhD negative women | |
| Elpidio et al. | Killer-cell immunoglobulin-like receptors associated with polycystic ovary syndrome | |
| US20170058347A1 (en) | Predicting increased risk for alzheimer's disease | |
| RU2651038C1 (en) | Method for detecting disorders in children of immunological reactivity in conditions of excessive exposure to strontium | |
| RU2474823C1 (en) | Method for prediction of embryo quality in extracorporeal fertilisation programme | |
| JP6644328B2 (en) | Method for evaluating the risk of onset or severity of atopic disease | |
| RU2759147C1 (en) | Method for assessing the reproductive function in men with idiopathic infertility | |
| Von Linsingen et al. | MICA-129 A/G dimorphism, its relation to soluble mica plasma level and spontaneous preterm birth: a case-control study | |
| RU2655658C1 (en) | Method of detecting disorders of physiological immunosuppression in children in first generation through parental lineage with hereditary tainted in conditions of aluminum excessive exposure | |
| RU2719411C1 (en) | Method for determining predisposition to reproductive disorders in females in conditions of excessive phenol contamination | |
| RU2621155C1 (en) | Method for evaluation of strontium impact on apoptosis, associated with allellic variants of fas gene in children | |
| Orzińska et al. | Preliminary results of fetal Rhc examination in plasma of pregnant women with anti‐c | |
| RU2498314C1 (en) | Method for prediction of risk of disturbed fertility in males suffering obesity | |
| RU2585091C1 (en) | Method for identification of anti-allogenic hla-g antibodies | |
| de Sousa Dias et al. | New COL6A6 variant detected by whole-exome sequencing is linked to break points in intron 4 and 3′-UTR, deleting exon 5 of RHO, and causing adRP | |
| Ozyilmaz et al. | Early prediction of sarcoidosis prognosis with HLA typing: A 5 year follow-up study | |
| Derderian et al. | Feto-Maternal Cell Trafficking and Labor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190722 |