ITRM20110654A1 - Combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per lo uso nel trattamento del carcinoma alla cervice uterina . - Google Patents

Description

Combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per l'uso nel trattamento del carcinoma alla cervice uterina

La presente invenzione concerne una combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche (DC) per l'uso nel trattamento del carcinoma alla cervice uterina. In particolare, invenzione concerne la vaccinazione terapeutica del carcinoma della cervice uterina basata su cellule dendritiche generate con interferon alfa in combinazione con ciclofosfamide, in cui, preferibilmente, le cellule dendritiche sono somministrate entro 48 ore dalla somministrazione di ciclofosfamide .

Negli ultimi anni le terapie antitumorali negli stadi precoci della malattia hanno conseguito notevoli successi. Tuttavia, le modalità di trattamento dei pazienti metastatici si basano ancora principalmente sulla chemioterapia. Questo tipo di terapia, sebbene molto spesso possa determinare una regressione iniziale delle lesioni metastatiche, si à ̈ rivelata sostanzialmente inefficace nella cura della malattia nel lungo periodo.

Il carcinoma della cervice uterina continua a rappresentare un importante problema sanitario: a livello mondiale à ̈ il secondo tumore maligno della donna, con circa 500.000 nuovi casi stimati nel 2002, l'80% dei quali nei Paesi in via di sviluppo. Esistono tuttavia rilevanti differenze geografiche di incidenza del carcinoma cervicale, legate soprattutto alla diversa diffusione di programmi di screening organizzati per la sua prevenzione. Infatti, nelle nazioni che hanno avviato programmi di screening basati sull'offerta del Pap-test alle donne di età compresa tra i 25 ed i 64 anni, si à ̈ assistito nelle ultime decadi a un importante decremento dell'incidenza di questa neoplasia.

Il carcinoma cervicale à ̈ il primo cancro a essere riconosciuto dall'Organizzazione mondiale della sanità come totalmente riconducibile a un'infezione. Il carcinoma della cervice uterina à ̈ infatti causato dall'infezione genitale del virus del papilloma umano (HPV). A tutt'oggi sono stati identificati più di 120 genotipi di Hpv che infettano l'uomo e, tra questi, 40 sono associati a patologie del tratto anogenitale, sia benigne che maligne. I diversi tipi di Hpv vengono infatti distinti in basso e alto rischio di trasformazione neoplastica. I genotipi a basso rischio sono associati a lesioni benigne come i condilomi anogenitali, mentre quelli ad alto rischio sono associati al cancro cervicale oltre che ad altri tumori del tratto anogenitale, come per esempio il carcinoma del pene, della vulva, della vagina e dell'ano. I genotipi virali ad alto rischio più frequentemente implicati nel carcinoma cervicale sono il 16, cui vengono attribuiti circa il 60% di tutti i casi di questa patologia neoplastica, seguito dal 18, responsabile di circa il 10% dei casi. Pertanto, complessivamente, circa il 70% di tutti i carcinomi cervicali sono associati alla presenza di Hpv 16 o 18. Generalmente il tempo che intercorre tra l'infezione e l'insorgenza delle lesioni precancerose à ̈ di circa cinque anni, mentre la latenza per l'insorgenza del carcinoma cervicale può essere di decenni. Per questo, la prevenzione del carcinoma à ̈ basata su programmi di screening, che consentono di identificare le lesioni precancerose e di intervenire prima che evolvano in carcinoma.

Essendo necessarie al mantenimento del fenotipo trasformato, le proteine virali oncogeniche E6 ed E7 sono espresse in quasi tutti i carcinomi cervicali e nelle lesioni pre-invasive. Per questo motivo, queste proteine virali, codificate da sequenze assolutamente "non-self", costituiscono l'antigene tumore-associato ideale come bersaglio di interventi immunoterapici e vaccinali. Delle proteine E6 ed E7 sono stati identificati ed estensivamente caratterizzati numerosi epitopi helper e CTL.

Il trattamento da utilizzato per la cura del tumore della cervice dipende soprattutto dallo stadio della malattia al momento della diagnosi. Negli stadi precoci con neoplasia localizzata si interviene con la exeresi locale (conizzazione). Nei tumori più estesi si procede con 1'isterectomia con eventuale rimozione di organi adiacenti come linfonodi, tube e ovaie. In alcuni casi si cerca di ridurre la malattia mediante radioterapia. In caso di malattia metastatica à ̈ prevista la somministrazione di chemioterapici come cisplatino, paclitaxel, topotecan. Tuttavia, la percentuale di fallimento per i grossi tumori in stadio avanzato contenuti nella pelvi à ̈ del 40%. Radio e chemioterapia presentano gli effetti collaterali loro propri che ne limitano l'uso e l'efficacia.

Pertanto, nonostante le conoscenze acquisite su questo tipo di tumore, à ̈ ancora sentita l'esigenza di poter disporre di nuove strategie terapeutiche che superino gli svantaggi dei trattamenti noti e presentino una maggiore tollerabilità.

Molti studi clinici di fase I e II condotti in pazienti con cancro dimostrano che la immunoterapia basata su DC può rappresentare un approccio promettente nel trattamento dei tumori (1).

Le DC sono cellule professionali presentanti l'antigene (APC) e come tali sono specializzate nella "cattura" degli antigeni (Ag) e nel loro processamento in peptidi che sono successivamente complessati con le molecole del sistema MHC e presentati alle cellule T per iniziare la risposta immunitaria. Le DC sono oggi considerate le cellule più potenti nell'attivazione del sistema immunitario verso antigeni microbici e tumorali (2). Quindi, le DC hanno un ruolo centrale come "adiuvanti cellulari" per l'induzione di una risposta immune Ag-specif ica. Evidenze recenti in modelli sperimentali e nell'uomo hanno mostrato il potenziale ruolo delle DC in strategie di immunizzazione dirette a stimolare una risposta specifica antitumorale. Le DC sono cellule ubiquitariamente distribuite nel corpo umano, soprattutto nei tessuti che fungono da barriera con l'ambiente circostante (per esempio, le cellule di Langerhans nella cute e a livello delle mucose) e negli organi linfoidi dove agiscono come "sentinelle" nei confronti degli agenti patogeni con cui l'organismo viene in contatto. Queste cellule agiscono di fatto da interfaccia tra l'ambiente e il sistema immunitario e rappresentano un importante collegamento tra la risposta immune innata e quella adattativa e determinano la qualità della risposta immunitaria stessa. Le DC rappresentano lo 0,5-1, 5% delle cellule mononucleate circolanti nel sangue umano. Sulla base dell'espressione relativa di una serie di marcatori di membrana specifici, si possono distinguere nel sangue umano diversi tipi di DC (2): una popolazione predominante CD1a+/CD11c+ e CD1a-/CD11c+ , che esprime il CD13, CD33 ed il recettore per il GM-CSF (denominata DC mieloidi), e una popolazione CD1a-/CD11c- esprimente alti livelli di CD123 (IL-3Rα), nota come DC plasmacitoidi (pDC), che rappresentano la fonte principale di IFN di tipo I prodotto dal nostro organismo in seguito ad infezione virale (3). Il principale "pool" di precursori delle DC di tipo mieloide à ̈ rappresentato dai monociti, capaci di dare origine alle DC interstiziali e alle cellule di Langherhans (LCs) (2). Le DC circolanti immature migrano verso i tessuti periferici non linfoidi mediante un processo di estravasazione per rifornire continuamente il pool di DC mieloidi residenti nei tessuti. Le DC immature acquisiscono e internalizzano un ampio spettro di antigeni, batteri, virus, corpi apoptotici e cellule necrotiche, con diversi meccanismi quali la fagocitosi convenzionale, la macropinocitosi e l'endocitosi mediata da recettori, attraverso i recettori per le lectine di tipo C, come il recettore del mannosio, il DEC-205, il DC-SIGN (CD209), il recettore per l'FCy di tipo I (CD64) e di tipo II (CD32). L'esposizione delle DC immature a citochine infiammatorie o a macromolecole derivate da batteri e virus, come LPS, DNA, RNA a doppio filamento, polyI:C promuove la loro maturazione, caratterizzata da cambiamenti fenotipici e funzionali (2). In seguito alla maturazione, le DC perdono la capacità di fagocitare e migrano verso le aree T dei tessuti linfoidi come diretta conseguenza dello "switching" della loro batteria di recettori per le chemochine. Le DC mature perdono la loro capacità di rispondere alle chemochine infiammatorie (ad esempio, CCL3, CCL4 e CCL5) e diventano sensibili alle chemochine CCL20 e CCL21 che le attraggono verso gli organi linfoidi secondari. Inoltre, le DC mature potenziano l'espressione delle molecole accessorie di membrana, come CD80, CD86 e CD40, degli antigeni MHC di classe I e II, acquisendo una potente capacità di stimolare la risposta immunitaria (4). E' da notare come le DC siano in grado di utilizzare particolari meccanismi per la presentazione degli antigeni ristretti dalla classe I del MHC. Infatti, oltre a presentare al sistema immunitario i peptidi endogeni derivati da proteine e agenti patogeni intracellulari, le DC, in particolari contesti, sono dotate della capacità di presentare in MHC di classe I gli epitopi derivati da antigeni esogeni (per esempio da cellule vicine) attraverso la loro internalizzazione e processamento intracellulare, assicurando l'efficiente "cross-priming" di linfociti CD8 citotossici (4).

Sulla base dei dati sperimentali sulla immunoterapia basata sull 'utilizzo di DC, sono stati sviluppati alcuni metodi di generazione ex vivo di DC a partire da cellule progenitrici del sangue.

Un primo metodo à ̈ basato sull'uso di cellule staminali CD34<+>espanse e differenziate in vitro in seguito all'esposizione ad un cocktail di citochine, tra cui GM-CSF, IL-4 e TNF-α. Un secondo metodo utilizza come precursori monociti CD14<+>, i quali sono indotti a differenziare in DC immature in presenza di GM-CSF e IL-4 o IL-13. Queste DC sono APC deboli data la scarsa espressione sulla superficie cellulare di molecole co-stimolatorie . Tuttavia, la loro attivazione/maturazione può essere promossa grazie all'esposizione a componenti batteriche, come LPS, ad un mezzo di coltura condizionato da macrofagi (MCM), o a citochine prò-infiammatorie (5). Anche se il protocollo sopra descritto ha permesso di eseguire la maggior parte degli studi clinici pubblicati fino ad ora e di definire i meccanismi di attivazione delle DC, si potrebbe sostenere che le DC generate dopo alcuni giorni di esposizione in vitro dei precursori monocitari ad alti livelli di citochine come IL-4 o IL-13 difficilmente riflettono gli eventi fisiologici di maturazione/attivazione che avvengono nell'organismo (6). E' stato anche dimostrato che le DC possono indurre sia tolleranza che immunità, a seconda delle citochine utilizzate nella loro cultura di differenziazione a partire dai monociti (7). Una modalità particolarmente efficace di differenziazione ex vivo di DC da monociti umani à ̈ stata sviluppata dagli autori della presente domanda di brevetto, utilizzando un'unica condizione di coltura (GM-CSF e IFN-α) e tempi di trattamento relativamente brevi (tre giorni) (8). Le DC generate con questo metodo, designate IFN-DC, esibiscono un fenotipo di DC parzialmente mature, dotate di un'alta capacità migratoria e immuno-stimolatoria ed in grado di indurre una risposta immunitaria di tipo Th-1 (9-14). Inoltre, le IFN-DC sono in grado di catturare e processare corpi apoptotici (15) e di indurre la cross-presentazione di antigeni ai linfociti T CD8+ (16). Le IFN-DC inoltre sono in grado di uccidere cellule tumorali attraverso meccanismi citotossici diretti (8, 17). Tutto ciò indica fortemente che le IFN-DC possono essere candidati idonei per l'immunoterapia del cancro. Per le strategie tipiche di immunoterapia, gli antigeni tumorali sono caricati sulle DC tramite approcci differenti, quali i) "pulsing" con peptidi o proteine; ii) fusione con cellule tumorali; iii) elettroporazione con RNA derivato da un tumore; iv) caricamento con lisati o corpi apoptotici del tessuto tumorale (18). Un altro approccio consiste nell'iniezione intratumorale di DC in assenza di "pulsing" in vitro con l'antigene (19). Questo approccio può sfruttare la cattura da parte delle DC di un'ampia gamma di antigeni tumorali, compresi gli antigeni unici tumore-specifici, e la loro presentazione al sistema immunitario (20-21).

La capacità delle DC di catturare, processare gli antigeni e ritenerli per un tempo idoneo per la loro presentazione ai linfociti à ̈ alla base del successo di qualsiasi tipo di immunoterapia del cancro basata questo tipo di cellule. Tuttavia, sebbene siano stati eseguiti numerosi studi clinici di terapia del cancro basati su DC, allo stato attuale, non vi à ̈ ancora un consenso sul protocollo ottimale e il tipo di DC da utilizzare .

Le terapie note per la cura dei tumori si basano generalmente sulla somministrazione di chemioterapici antineoplastici. Questi farmaci sono citotossici o citostatici che puntano all'uccisione delle cellule tumorali o all'inibizione della loro proliferazione, pertanto sono tradizionalmente considerati immunosoppressivi a causa della loro tossicità verso le cellule del sistema immunitario. Tuttavia, un numero crescente di studi indica che la chemioterapia, in determinate circostanze, può stimolare piuttosto che inibire l'induzione delle risposte immunitarie (22). Ciò à ̈ comprensibile alla luce del modello dei "segnali di pericolo", suggerito da Matzinger (23). Il modello asserisce che alcuni segnali di pericolo indotti da antigeni "non self", denominati PAMPs e DAMPs, sono tradotti dall'ospite in una panoplia di segnali che guidano la scelta della risposta immunitaria più adeguata. I chemioterapici ad azione citotossica inducono tipicamente apoptosi. Recentemente à ̈ stato dimostrato che l'apoptosi, fino ad allora considerata un tipo di morte cellulare non infiammatorio che determina la rimozione immunologicamente "silente"delle cellule danneggiate, in alcuni casi può innescare una risposta immunitaria (apoptosi "immunogenica"). In risposta ad alcuni trattamenti citotossici (come le antracicline , l'oxaliplatino o le radiazioni ionizzanti) , ma non ad altri (come ad esempio il cisplatino) , le cellule tumorali traslocano sulla superficie della membrana piasmatica la CRT, proteina normalmente ubicata nel lume del reticolo endoplasmatico, che, una volta esposta, viene riconosciuta dalle DC come un "eat me signal" favorendo pertanto la fagocitosi delle cellule apoptotiche da parte delle stesse DC (24). Questo evento, à ̈ il primo di una serie di eventi sequenziali che contraddistingue a livello biochimico e l'apoptosi immunogenica indotta da alcuni trattamenti citotossici. Di conseguenza, quando le cellule del tumore sono trattate per alcune ore con le antracicline e successivamente iniettate per via sottocutanea in topi, diventano altamente efficienti nell'induzione mediata da DC di risposte immunitarie cellulari tumore-specifiche (25). Tuttavia, la traslocazione della CRT à ̈ un evento necessario ma non sufficiente per indurre una risposta immunitaria antitumorale in seguito al trattamento con chemioterapici ad attività immunogenica. Ulteriori studi hanno rivelato che il rilascio della proteina cromatinica, non-istonica HMGB1, che avviene durante le fasi tardive del processo apoptotico à ̈ un fenomeno altrettanto necessario. HMGB1 à ̈ un ligando del Tolllike receptor 4 (TLR4) sulla superficie delle DC di cui determina l'attivazione funzionale; la sua neutralizzazione/inattivazione abolisce la presentazione TLR4-dipendente di antigeni tumorali ai linfociti T sia in vitro che in vivo da parte delle DC. Di conseguenza, il rilascio HMGB1 à ̈ richiesto per l'immunizzazione dipendente da apoptosi grazie ai suoi effetti sul TLR4.

In conclusione, la CRT Ã ̈ essenziale per la cattura delle cellule apoptotiche da parte delle DC e per la loro successiva maturazione, mentre l'interazione HMGB1-TLR-4 Ã ̈ richiesta per l'elaborazione e la presentazione degli antigeni provenienti delle cellule tumorali apoptotiche ai linfociti T (26).

Nonostante gli effetti di stimolazione di una apoptosi immunogenica da parte delle antracicline sul cellule tumorali murine di melanoma, colon carcinoma o tumore mammario, à ̈ stato osservato che molti chemioterapici, diversi dalle antracicline, non hanno capacità di indurre apoptosi immunogenica oppure non sono in grado di indurla in tutti i tipi di tumore (24, 25). Allo stato attuale, pertanto, non sussistono dati sufficienti per stabilire quali chemioterapici hanno capacità di indurre apoptosi immunogenica e su quali tipologie di cellule tumorali.

Una diversa linea di ricerca ha dimostrato che alcuni chemioterapici antineoplastici, ed in particolar modo la ciclofosfamide, un chemioterapico ampiamente usato per il trattamento di neoplasie ematologiche e solide, possono potenziare l'efficacia antitumorale dell'immunoterapia attraverso diverse proprietà immunomodulatorie (22, 27). Gli studi si riferiscono alla combinazione di ciclofosfamide e un vaccino costituito da un lisato tumorale nel trattamento di tumori murini, quali eritroleucemia o linfoma. Il trattamento con ciclofosfamide, precedente all'immunoterapia adottiva, induce la regressione di tumori impiantati più efficacemente dei due trattamenti isolati (28). I meccanismi suggeriti per spiegare tali effetti comprendono l'induzione di citochine che indirizzano la risposta immunitaria verso il fenotipo T helper 1 (Th-1) (27-29), la riduzione della frequenza di cellule T soppressorie (Treg) indotte dal tumore (30), la proliferazione omeostatica dei linfociti (27, 31) e l'attivazione delle cellule dendritiche (32). Il chemioterapico determina, grazie alla sua citotossicità per tutte le cellule in attiva proliferazione, una riduzione del numero di leucociti (leucopenia), che à ̈ seguita da una fase di espansione al fine di ripristinare il "pool" originale (proliferazione omeostatica). La proliferazione omeostatica, interessando anche i linfociti con attività antitumorale, determina un potenziamento dell'efficacia di strategie immunoterapeutiche. Inoltre, il trattamento con CTX induce nel topo l'espressione di numerose citochine e fattori solubili (cytokine storm) che inducono l'espansione dei linfociti T di memoria (31), guidano la proliferazione omeostatica e l'attivazione di diverse popolazioni cellulari, inclusi i linfociti Th1 e Th17 (27, 32, 33). In aggiunta, il trattamento con ciclofosfamide determina un aumento nell'espressione di chemochine e recettori per chemochine nel microambiente tumorale che hanno l'effetto di promuovere l infiltrazione delle DC, in particolare del subset abilitato alla crosspresentazione di antigeni tumorali, nel tessuto tumorale (32). Esperimenti di microarray nel topo hanno dimostrato che l'immunomodulazione mediata dalla ciclofosfamide, à ̈ precoce (24-48h dopo il trattamento) e transiente e che l'efficacia terapeutica della combinazione di ciclofosfamide ed immunoterapia à ̈ massimale se l'immunoterapia viene somministrata 24h dopo la chemioterapia (33).

Recentemente à ̈ stato osservato che la CTX induce, in alcune cellule tumorali murine, un'apoptosi immunogenica caratterizzata dall'esposizione CRT e dal rilascio dei fattori solubili, fra cui HMGB1 (32). Tuttavia, poiché diverse cellule tumorali possono rispondere diversamente ad uno stesso chemioterapico, non à ̈ possibile prevedere se un dato chemioterapico in grado di indurre apoptosi immunogenica in cellule murine possa avere lo stesso effetto in cellule umane né su quale tipo di cellule umane.

Gli inventori della presente invenzione hanno ora scoperto che la ciclofosfamide à ̈ in grado di indurre apoptosi immunogenica in cellule di carcinoma della cervice uterina. La ciclofosfamide può quindi essere utilizzata come un induttore di apoptosi immunogenica in cellule tumorali in condizioni tali da determinarne il rilascio di antigeni e, al tempo stesso, l'esposizione/rilascio di tutti quei segnali caratteristici di un'apoptosi immunogenica che, emessi nella giusta sequenza spazio/temporale determinano la fagocitosi dei corpi apoptotici tumorali, l'attivazione delle DC e, di conseguenza, la stimolazione della risposta immunitaria.

Pertanto, la somministrazione combinata di ciclofosfamide e cellule dendritiche à ̈ in grado di produrre un effetto sinergico che potenzia enormemente gli effetti della sola immunoterapia basata sulle cellule dendritiche per la cura del carcinoma alla cervice uterina.

Nel contesto della stimolazione antigenica ai fini dell'induzione di una risposta immunitaria, la prima tappa fondamentale à ̈ la cattura degli antigeni da parte delle DC le quali, un volta inglobati gli antigeni tumorali, li processano e li espongono ai linfociti T e B. In questa operazione à ̈ molto importante che le DC siano particolarmente efficaci nel riconoscimento, inglobamento e processamento dell'antigene. A questo scopo le DC vengono prodotte in vitro a partire da precursori monocitari in seguito a coltivazione con opportune miscele di fattori di crescita e di differenziamento cellulari. Il metodo più diffuso utilizza terreni di coltura addizionati con GMCSF e IL-4. Un metodo alternativo, che utilizza GMCSF e IFN-alfa ha dato risultati molto migliori in termini di efficienza nella capacità di presentare l'antigene,· le DC così ottenute sono chiamate IFN-DC. Analizzando in dettaglio il meccanismo di processamento dell'antigene , à ̈ stato possibile dimostrare come, nelle IFN-DC, gli endosomi precoci quelli deputati al riciclo funzionino da efficienti organi subcellulari di immagazzinamento di molecole MHC di classe I prontamente disponibili per la presentazione degli epitopi generati. In particolare, le IFN-DC mostrano una ridotta attività degradativa endosomiale associata ad una prolungata ritenzione degli antigeni proprio nel comparto degli early-endosomes . Questa tardiva proteolisi consente alle IFN-DC di indirizzare l'antigene esogeno preferenzialmente verso le vie di processamento che generano epitopi destinati all'associazione con le molecole MHC di classe I, ma anche di prolungare nel tempo la presentazione di questi epitopi ai linfociti T CD8 specifici .

Secondo la presente invenzione, pertanto, le IFN-DC possono essere inoculate entro breve tempo (preferibilmente entro 48 ore) dal trattamento del paziente con ciclofosfamide, direttamente nella lesione tumorale dove acquisirebbero gli antigeni tumorali dai corpi apoptotici generatisi come diretta conseguenza della chemioterapia, traendo il massimo vantaggio dalla loro già spiccata, intrinseca capacità di indirizzare tali antigeni verso la presentazione in associazione alle molecole MHC di classe I.

Alternativamente, le IFN-DC potrebbero essere preventivamente caricate con antigeni o corpi apoptotici ottenuti in vitro, dopo trattamento delle cellule tumorali con ciclofosfamide, prima del loro inoculo nel paziente. I dati dimostrano come la rallentata degradazione delle proteine endocitate o fagocitate dalle IFN-DC corrisponda ad una prolungata capacità di ritenere e presentare l'antigene. Considerando che i complessi MHC-I-peptide sulla membrana cellulare risultano relativamente instabili e caratterizzati da un elevato turnover, mentre la migrazione delle DC dalla periferia ai linfonodi può durare da 1 a 3 giorni, il lento processamento delle IFN-DC favorirebbe la prolungata persistenza dell'antigene negli organi linfoidi, aumentando di conseguenza la probabilità di interazione delle DC con i linfociti T CD8 antigene-specifici a bassa frequenza e favorendo un "signalling" prolungato attraverso il TCR corrispondente, per una più ampia ed energica risposta.

Inoltre, secondo la presente invenzione, le IFN-DC possono essere caricate con antigeni HPV-specifici (E6 e/o E7) e inoculate, preferibilmente entro 48 ore, dopo una singola somministrazione di ciclofosfamide per il trattamento immunoterapeutico in pazienti con carcinoma della cervice uterina-HPV positivo, estendibile a tutti quei tumori ad eziologia virale riconducibile ad infezione da HPV (ad esempio carcinoma della vulva, della vagina, del pene, e dell'ano). Come detto sopra, infatti, la ciclofosfamide à ̈ un agente chemioterapico che somministrato in certi dosaggi, risulta capace di determinare un "reset" della risposta antitumorale attraverso una deplezione preferenziale dei linfociti Treg capaci di sopprimere la risposta immune al tumore e l'induzione dell'espressione di numerose citochine e fattori solubili (cytokine storm) capaci di stimolare l'attivazione/espansione linfocitaria. Secondo gli studi condotti dagli inventori, la ciclofosfamide risulta altresì in grado di indurre l'apoptosi immunogenica delle cellule di carcinoma cervicale. Pertanto, secondo la presente invenzione, le IFN-DC caricate con la proteina virale E6 e/o E7 o con corpi apoptotici del tumore autologo, contenenti gli antigeni tumorali, possono essere inoculate in sede intradermica in vicinanza dei linfonodi drenanti, preferibilmente entro 48 ore dopo una singola somministrazione di ciclofosfamide . Le IFN-DC, in virtù della loro peculiare capacità di presentare l'antigene per tempi prolungati, dovuta alla loro ritardata e ridotta degradazione nel comparto lisosomiale delle proteine internalizzate , saranno in grado di migrare ai linfonodi regionali e stimolare in modo efficiente e persistente i linfociti specifici. Inoltre, grazie alla capacità di fagocitare attivamente 1 corpi apoptotici, le IFN-DC saranno anche in grado di ìnternalizzare il materiale apoptotico derivante dal tumore dopo il trattamento con ciclofosfamide. Questo approccio risulterebbe in grado di indurre un "antigen spreading" cioà ̈ l'estensione della risposta immune ad antigeni tumorali sconosciuti non contenuti nel vaccino cellulare somministrato alla paziente.

Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione una combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per l'uso separato o sequenziale nel trattamento del carcinoma della cervice uterina, in particolare di quello positivo a HPV, in cui le cellule dendritiche sono preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha. Come detto sopra, le IFN-DC si ottengono coltivando i monociti esclusivamente in terreno di coltura in presenza delle sole citochine IFN-alpha e GM-CSF, ossia a condizione che non siano presenti altre citochine. La IL-4 non à ̈ prevista e non à ̈ necessaria, anzi, la sua presenza altera le IFN-DC. Lo stesso dicasi per altri eventuali fattori che non siano quelli già presenti nel terreno di coltura che, preferibilmente, à ̈ un terreno di coltura senza siero. I monociti vengono coltivati nelle condizioni sopra menzionate per 3 giorni. Già dal terzo giorni le cellule dendritiche, preparate nelle condizioni sopra descritte, sono caratterizzate dalla presenza contemporanea di marcatori di maturazione quali, CDllc, CD123, CD80 e CD86.

Per uso separato si intende la somministrazione, nello stesso tempo, di ciclofosfamide e cellule dendritiche in forme farmaceutiche distinte. Per uso sequenziale si intende la somministrazione dei due principi attivi ciclofosfamide e cellule dendritiche, uno di seguito all'altro, ciascuno in forme farmaceutiche distinte. Preferibilmente, la ciclofosfamide à ̈ somministrata prima della cellule dendritiche.

Le cellule dendritiche, IFN-DC o di altro tipo, possono essere caricate con antigeni o con corpapoptotici di carcinoma della cervice uterina mediante incubazione in vitro di dette cellule dendritiche con antigeni o corpi apoptotici di cellule di carcinoma della cervice uterina in cui à ̈ stata indotta apoptosi immunogenica mediante trattamento con un metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro quale ad esempio mafosfamide o fosforamide.

Secondo un'ulteriore forma di realizzazione, le cellule dendritiche possono essere caricate con antigeni HPV specifici E6 e/o E7 o con corpi apoptotici di cellule tumorali potenzialmente contenenti antigeni non ancora noti.

Secondo la presente invenzione, la ciclofofamide può essere somministrata per una sola volta prima della somministrazione delle cellule dendritiche. Preferibilmente, le cellule dendritiche sono somministrate entro 48 ore dalla somministrazione di ciclofosfamide.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione l'uso di un metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro, quale ad esempio mafosfamide o fosforamide, per la preparazione in vitro di cellule dendritiche cariche di antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni derivanti dalla apoptosi immunogenica indotta dalla ciclofosfamide su cellule di carcinoma alla cervice uterina. Come detto sopra, le cellule dendritiche da caricare con antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni possono essere cellule dendritiche preparate mediante un procedimento che comprende o consìste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha.

La presente invenzione concerne quindi un metodo di preparazione in vitro di cellule dendritiche cariche di antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni contro il carcinoma alla cervice uterina, detto metodo comprendendo o consistendo nelle seguenti fasi: a) trattare una coltura di cellule di carcinoma della cervice uterina con un metabolita attivo in vitro della ciclofosfamide, quale ad esempio mafosfamide, o un suo analogo quale fosforamide, allo scopo di indurre apoptosi immunogenica; b) incubare cellule dendritiche con la coltura di cellule della fase a) o con gli antigeni o i corpi apoptotici da essa derivati affinché dette cellule dendritiche fagocitino gli antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni derivanti dalla apoptosi immonogenica di dette cellule di carcinoma alla cervice uterina. Successivamente alla fase a), le cellule dendritiche possono essere incubate direttamente nella coltura di cellule tumorali in cui à ̈ stata indotta apoptosi o, preferibilmente, gli antigeni o corpi apoptotici liberati a seguito della apoptosi immunogenica possono essere purificati e concentrati prima dell'incubazione con le cellule dendritiche.

Preferibilmente, le cellule dendritiche sono preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha.

Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per l'uso separato o sequenziale nel trattamento dei tumori ad eziologia virale riconducibile ad infezione da HPV, come ad esempio carcinoma della vulva, della vagina, del pene, e dell'ano, oltre naturalmente al carcinoma della cervice uterina, in cui dette cellule dendritiche sono caricate con antigeni HPV specifici E6 e/o E7. Anche in questo caso, le cellule dendritiche sono preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha. La ciclofofamide può essere somministrata per una sola volta prima della somministrazione delle cellule dendritiche. Le cellule dendritiche sono somministrate preferibilmente entro 48 ore dalla somministrazione di ciclofosfamide.

Il trattamento oggetto dell'invenzione può trovare due diversi tipi di applicazione nei pazienti con lesioni pre-invasive o in pazienti con tumore in stadio avanzato. In particolare, la prima applicazione riguarda pazienti con CIN III (stadio 3, grave displasia cervicale, carcinoma in situ) in associazione con trattamenti convenzionali quali: chirurgia laser, conizzazione, criochirurgia. La seconda riguarda pazienti con carcinoma cervicale, (HPV 16-18 positivo) "ricorrente", locale o metastatico, in stadio avanzato, non trattabile chirurgicamente o mediante chemioterapia e radioterapia. Per esempio in stadio IIIa IIIb con diffusione pelvica, ed ai linfonodi locali oppure in stadio IVa IVb con diffusione oltre la regione pelvica La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati.

Figura 1. La figura mostra la prolungata sopravvivenza dell 'antigene e lenta acidificazione endosomiale nelle IFN-DC (A, B) Analisi, mediante citometria a flusso, della cinetica di internalizzazione e processamento dell'Ag nelle DC. Le cellule sono state caricate con OVA-FITC (A) o DQ-OVA (B) per 15 min a 37°C, lavate e rimesse in coltura per i tempi indicati, in assenza di Ag. In figura viene mostrato un esperimento rappresentativo di 5 . In ogni pannello sono indicati i valori dell'intensità media di fluorescenza. (C) Analisi, mediante CLSM (sezioni ottiche centrali) , dei compartimenti acidi in DC non fissate e marcate con il colorante lysosensorTM yellow/blue DND-160 (pseudo-colore grigio) . Scala 10Î1⁄4m. (D) Analisi, mediante citofluorimetria a flusso, di DC non fissate e colorate con il colorante lysosensorTM Green DND-189. (E) Analisi citofluorimetrica di DC caricate con la proteina OVA per i tempi indicati e successivamente marcate con il colorante lysosensorTM Green DND-18 9 (media ± SD di tre esperimenti indipendenti) . (F) Espressione di NOX-2 e Rac2 in DC fissate, permeabilizzate e marcate con gli anticorpi anti-NOX-2 o anti-Rac2 (pseudo-colore grigio) . I nuclei sono evidenziati in blue (DAPI). Scala ΙΟÎ1⁄4m. I pannelli mostrati sono rappresentativi di cinque (NOX-2) o tre (Rac2) esperimenti indipendenti. (G) Western blot (uno di tre) eseguito con cellulari totali di DC caricate con OVA per 15 min, lavate e rimesse in coltura per 2 o 18h in assenza di Ag. I filtri di nitrocellulosa sono stati incubati con gli anticorpi anti-NOX-2 e anti-OVA. L'actina à ̈ stata usata come controllo quantitativo del caricamento.

Figura 2. E' da notare che le immagini di immunofluorescenza mostrano la localizzazione di antigeni marcati o in rosso o in verde. Quando i due antigeni colocalizzano, ne risulta una colorazione gialla. Nella stampa in bianco e nero le colorazioni rossa e verde dei singoli antigeni sono quasi completamente perdute e risultano nere, mentre la colorazione gialla risulta chiara. In tal modo, nella stampa in bianco e nero si evidenzia solo la colocalizzazione degli antigeni analizzati. La figura mostra la distribuzione intracellulare delle molecole MHC di classe I (A, B) Analisi, di microscopia confocale (sezioni ottiche centrali), di DC analizzate usando differenti marcatori al fine di identificare la localizzazione delle molecole MHC-I (verde) nel RE (calnexina), negli endosomi precoci (Rab5 ed EEA-1) e negli endosomi tardivi (Rab7), mostrati in rosso. Le cellule sono state marcate con anti-TAP-1 (verde) o anti-calreticulina (rosso) associati rispettivamente con Rab5 (rosso) ed EEA-1 (verde), al fine di valutare la distribuzione di queste molecole all'interno degli endosomi precoci. Le zone di co-localizzazione sono mostrate in giallo. Gli inserti rappresentano le immagini delle singole fluorescenze. (C, D) Tripla marcatura delle DC, usando i marcatori calnexina (rosso), MHC-I (grigio) ed EEA-1 (verde). Le zone di co-localizzazione sono mostrate nelle immagini sovrapposte. Gli esperimenti in tutti i pannelli sono stati ripetuti indipendentemente almeno tre volte con risultati simili.

Figura 3. E' da notare che le immagini di immunofluorescenza mostrano la localizzazione di antigeni marcati o in rosso o in verde. Quando i due antigeni colocalizzano, ne risulta una colorazione gialla. Nella stampa in bianco e nero le colorazioni rossa e verde dei singoli antigeni sono quasi completamente perdute e risultano nere, mentre la colorazione gialla risulta chiara. In tal modo, nella stampa in bianco e nero si evidenzia solo la colocalizzazione degli antigeni analizzati. La figura mostra il traffico dell'antigene (Ag) verso il pathway di processamento in classe I. Analisi, mediante microscopia confocale, di DC caricate con le proteine solubili (verde) OVA-FITC (A) o NS3 (B) per 15 min a 37°C, lavate e marcate per l'osservazione intracellulare delle molecole MHC-I (rosso). Nei pannelli in (B) le cellule sono state marcate anche con un anticorpo anti-NS3 per visualizzare l'antigene internalizzato . Gli inserti rappresentano le immagini delle singole fluorescenze. Le zone di colocalizzazione sono mostrate in giallo. Gli esempi riportati sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti .

Figura 4. E' da notare che le immagini di immunofluorescenza mostrano la localizzazione di antigeni marcati o in rosso o in verde. Quando i due antigeni colocalizzano , ne risulta una colorazione gialla. Nella stampa in bianco e nero le colorazioni rossa e verde dei singoli antigeni sono quasi completamente perdute e risultano nere, mentre la colorazione gialla risulta chiara. In tal modo, nella stampa in bianco e nero si evidenzia solo la colocalizzazione degli antigeni analizzati. La figura mostra il traffico intracellulare della proteina NS3 (panneli A, B) . Analisi, mediante microscopia laser confocale di DC caricate con la proteina NS3 per 15 min, lavate e poi rimesse in coltura per i tempi indicati. Le cellule sono state marcate con diversi marcatori al fine di valutare la localizzazione dell'Ag NS3 internalizzato (rosso) all'interno degli endosomi precoci (EEA-1 e Rab5), degli endosomi tardivi (Rab7), delle vescicole riciclanti (Rabll) e del RE (calnexina) , tutti rilevati in verde. Le cellule sono state marcate con gli anticorpi anti-NOX-2 ed anti-MHC-I, per valutare la distribuzione delle molecole NOX-2 (verde) e MHC-I (verde) negli organelli NS3+. Le aree di co-localizzazione sono mostrate in giallo. I dati mostrati sono rappresentativi di sette esperimenti indipendenti .

Figura 5. La figura mostra l'analisi della cinetica di internalizzazione della proteina NS3 . Analisi di microscopia confocale di DC non trattate (CTR) o caricate con la proteina NS3 (grigio) per 15 min, lavate e rimesse in coltura per i tempi indicati. Per analizzare la localizzazione intracellulare della proteina NS3 , le cellule sono state marcate con l' anticorpo anti-NS3. I nuclei sono riportati in blue (DAPI). Scala 20Î1⁄4m. I dati sono rappresentativi di sette esperimenti indipendenti .

Figura 6. La figura mostra il saggio funzionale del processamento intracellulare di NS3 (A) Analisi, mediante saggio ELISPOT, del rilascio di IFN-γ da parte del clone CD8+ NS31406-1415-specifico coltivato per 18h con DC precedentemente caricate con la proteina NS3 per 16h, lavate ed usate nel saggio di cross-presentazione . I risultati sono espressi come media SD di dieci esperimenti indipendenti. (B, C) Valutazione degli spots formanti IFN-γ in co-colture di IFN-DC (B) o IL-4-DC (C) incubate con gli inibitori specifici prima del caricamento con la proteina NS3 per 16h, lavate e usate nel saggio di cross-presentazione al clone CD8+ NS31406-1415-specif ico (media ± SD di cinque esperimenti indipendenti) . (D) Analisi della produzione di IFN-γ in DC caricate con la proteina NS3 per Ih, lavate e usate dopo 3 giorni nel saggio di crosspresentazione al clone CD8+ NS31406-1415-specifico (media ± SD, n=4). L'analisi statistica dei dati in tutti i pannelli à ̈ stata effettuata con il test di Mann-Whitney , * P < 0.05. ;Figura 7. E' da notare che le immagini di immunof luorescenza mostrano la localizzazione di antigeni marcati o in rosso o in verde. Quando i due antigeni colocalizzano, ne risulta una colorazione gialla. Nella stampa in bianco e nero le colorazioni rossa e verde dei singoli antigeni sono quasi completamente perdute e risultano nere, mentre la colorazione gialla risulta chiara. In tal modo, nella stampa in bianco e nero si evidenzia solo la colocalizzazione degli antigeni analizzati. La figura mostra il ruolo del riciclo nella cross -presentazione di NS3 . (A) Analisi, mediante saggio ELISPOT, del rilascio di lFN-γ dalla co-coltura di DC caricate con la proteina NS3 per Ih, lavate, fissate in glutaraldeide 0.05% e poi usate nel saggio di crosspresentazione al clone CD8+ NS31406 -1415-specifico . I risultati sono espressi come media ± SD di quattro esperimenti indipendenti. (B) Espressione delle molecole MHC-I (verde) e Rab11 (rosso) in DC di controllo (CTR) e in DC caricate con la proteina NS3 (15 min) e poi rimesse in coltura per 30 min. Le zone di co-localizzazione tra le molecole MHC-I e Rabll sono mostrate in giallo. Gli inserti rappresentano le immagini delle singole fluorescenze. E' stato riportato un esperimento rappresentativo di tre. (C, D) Valutazione degli spots formanti IFN-γ in co-colture di DC trattate con Primachina prima e durante le 16h di stimolazione con la proteina NS3, lavate e poi usate in un saggio di cross-presentazione con un clone CD8+ NS31406-1415-specif ico (media ± SD di cinque esperimenti indipendenti). L'analisi statistica dei dati in (A, C e D) à ̈ stata effettuata con il test di Mann-Whitney, * P < 0.05.

Figura 8. La figura mostra l'analisi della cinetica di internalizzazione della proteina E7 di HPV. Analisi di microscopia confocale di DC non trattate (CTR) o caricate con la proteina E7 (Rosso) per 15 min, lavate e rimesse in coltura per i tempi indicati. Per analizzare la localizzazione intracellulare della proteina E7, le cellule sono state marcate con 1'anticorpo anti-E7. I nuclei sono riportati in blue (DAPI). Scala 20Î1⁄4m. I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti.

Figura 9. E' da notare che le immagini di immunofluorescenza mostrano la localizzazione di antigeni marcati o in rosso o in verde. Quando i due antigeni colocalizzano, ne risulta una colorazione gialla. Nella stampa in bianco e nero le colorazioni rossa e verde dei singoli antigeni sono quasi completamente perdute e risultano nere, mentre la colorazione gialla risulta chiara. In tal modo, nella stampa in bianco e nero si evidenzia solo la colocalizzazione degli antigeni analizzati. La figura mostra l'analisi della localizzazione intracellulare della proteina E7. Analisi CLSM (sezioni ottiche centrali) delle DC dopo essere state caricate con E7 per 15 min, lavate ed esaminate al tempo indicato, sono state marcate con anticorpo anti-E7. Al fine di identificare la localizzazione intracellulare della proteina E7(rosso), sono stati usati marcatori degli endosomi precoci (EEA-l) e degli endosomi tardivi (Rab7). Le aree di co-localizzazione (Merge) sono state identificate in giallo.

Figura 10. La figura mostra l'ELISPOT della risposta cellulare T CD3+ anti-E7. Le barre rappresentano il numero di cellule T CD8+/CD4+ producenti IFN-γ in risposta a IFN-DC caricate con proteina E7, dopo tre immunizzazioni a intervalli di una settimana.

Figura 11. La figura mostra l'analisi ELISPOT risposta anti-E7 di cellule T CD8+. Topi SCID, dopo ricostituzione, hanno ricevuto tre immunizzazioni con IFN-DC caricate con proteina E7 a intervalli di una settimana. I sacrifici sono stati effettuati una settimana dopo l'ultima immunizzazione. Cellule umane recuperate dalla milza o dal lavaggio peritoneale di tre topi Hu-PBL-SCID, per ogni gruppo sperimentale le cellule sono state raggruppate. Nel saggio Elispot sono state utilizzate come stimolatori IFN-DC autologhe caricate e non con la proteina E7.

Figura 12. La figura mostra la protezione di topi hu-PBL-SCID vaccinati con IFN-DC pulsate con proteina E7 al challenge di cellule di carcinoma della cervice uterina. Topi SCID ricostituiti con PBL umani HLA-A2 positivi sono stati sottoposti ad un protocollo di vaccinazione con IFN-DC autologhe pulsate con proteina E7 ricombinante. Quattro giorni prima dell'ultima vaccinazione di richiamo, le xenochimere sono state quindi inoculate sottocute con cellule di carcinoma della cervice uterina ( CaSki ) HLA-A2+ e monitorate per la crescita tumorale

Figura 13. La figura mostra la misura della produzione di IFN-γ da parte di cellule CD8+ /CD4+ T in risposta a IFN-DC o mlL-4-DC. Le barre rappresentano i pg/ml di IFN-γ secreto da cellule CD8+ /CD4+ T in risposta a IFN-DC o mIL-4-DC (maturate con TNF-alpha, IL1-beta, IL-6 e PGE-2a) pulsate con E7 dopo due immunizzazioni .

Figura 14. La figura mostra l'analisi della produzione di IFN-γ in ELISA ed ELISPOT da parte di cellule T CD3+anti-E7. Nel pannello superiore à ̈ rappresentata l'analisi dell'apoptosi ed espressione di Calreticulina e HSP70 nelle cellule CaSki trattatate con Mafosfamide (10ug/ml) per 72h e l'analisi della fagocitosi dei corpi apoptotici. Pannello inferiore. IFN-DC pulsate con cellule CaSki apo sono state utilizzate nel priming di linfociti T autoioghi derivati da donatori sani. La risposta T à ̈ stata valutata mediante saggi ELISA ed ELISPOT per la produzione di IFN-γ.

Figura 15. La figura l'effetto della chemio-immuno terapia sulla regressione del tumore umano CaSki inoculato s.c. in topi Hu-PBL-SCID vaccinati con IFN-DC autologhe pulsate con corpi apoptotici dello stesso tumore. Topi SCID sono stati inoculati s.c. con 4xl0<6>cellule CaSki (HLA-A2+). Dopo 16 giorni i topi sono stati ricostituiti con 4xl0<7>PBMc da donatore HLA-A2+. Il giorno 20 dall'inoculo del tumore alcuni animali sono stati inoculati i.p. con 50 mg/Kg di ciclofosfamide e il giorno dopo sono stati trattati con 2xl0<6>IFN-DC provenienti dallo stesso donatore, caricate con corpi apoptotici dello stesso tumore. L'esperimento prevedeva i seguenti bracci di trattamento: A) Hu-PBL-SCID Tumore; B) Hu-PBL-SCID IFN-DC; C) Hu-PBL-SCID Tumore CTX; D) Hu-PBL-SCID+Tumore IFN-DC+CTX.

ESEMPIO 1: Procedura di produzione di IFN-DC per uso clinico

La produzione di IFN-DC compatibili con l'uso clinico viene effettuata secondo una procedura che impiega materiali conformi alle Norme di Buona Fabbricazione (Good Manufacturing Practice, GMP). Brevemente, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono ottenute dal paziente mediante la procedura di linfocitoaferesi. Il prodotto aferetico viene successivamente sottoposto alla procedura di elutriazione che permette di ottenere l'arricchimento percentuale della popolazione d'interesse, cioà ̈ i monociti. Dalla coltivazione dei monociti nelle opportune condizioni di coltura, cioà ̈ in terreno privo di siero ed in presenza di GM-CSF ed INFα, si ottengono, in tre giorni, le IFN-DC. L'intero processo à ̈ schematizzato di seguito:

Giorno 0

Raccolta e conta dei monociti

Vitalità

Recupero

Immunofenotipo

Sterilità

mm 20 min

Risospensione dei monociti per la

coltivazione (2 x 10° cells/ml >

Raccolta e conta delle IFN-DC Vitalità

Resa

Giorno 3 Immunofenotipo

Endotossina

Micoplasma

Centrifugazione rpm 20 min 20° C Sterilità

Conta delle cellule e risospensione in terreno

di congelamento (19x10^/0.5 ml

Congelamento Vitalità

Recupero

Immunofenotipo

Endotossina

Sterilità

Uptake

Materiale di partenza - Cellule mononucleate del sangue periferico raccolte mediante linfocitoaferesi (per le preparazioni utilizzate a fini di ricerca si utilizzano buffy coat ottenuti da donazioni) . Il prodotto aferetico deve avere le seguenti caratteristiche :

Volume 100/150ml

PBMC: > 5/30 x 10<9>

Monociti: > 1 x 109

Granulociti: < 20 %

Globuli rossi: < 7.5 mL.

Purificazione dei monociti - La sacca di raccolta del prodotto aferetico viene collegata direttamente ad un sistema di tubi e sacche monouso, sterile e apirogeno, che permette di sottoporre direttamente i PBMC al processo di elutriazione. L'elutriazione à ̈ uno speciale tipo di centrifugazione in controflusso in grado di separare popolazioni cellulari miste in base alla grandezza e alla complessità delle cellule in esse contenute. Con questo procedimento à ̈ possibile ottenere monociti altamente purificati grazie ad un sistema che sfrutta solo le caratteristiche fisiche delle cellule senza l'introduzione di ulteriori componenti, quali biglie immunomagnetiche , nel processo di produzione. Al termine dell 'elutriazione vengono effettuati i controlli necessari ad attestare la conformità delle cellule recuperate ai parametri di qualità predeterminati :

Vitalità;

Purezza,

Sterilità

Recupero (espresso come rapporto tra i monociti ottenuti ed il numero totale di monociti contenuti nell'aferesi).

Condizioni di coltura - I monociti ottenuti vengono risospesi alla concentrazione di 2xl0<6>/mi in terreno senza siero (CellGro<®>DC medium) contenente GM-CSF (600 IU/ml) e IFN-α (10.000 IU/ml) e incubati a 37°C in termostato con il 5% C02 . Dopo 3 giorni di coltura in sacca, le cellule vengono raccolte, contate sottoposte ad ulteriori controlli di qualità:

Vitalità

Resa

Immunofenotipo

Contenuto di endotossina

Contaminazione da Micoplasma

Sterilità.

Preparazione del farmaco IFN-DC - Le IFN-DC ottenute al termine della coltura vengono contate e risospese alla concentrazione di 1-2x10<7>cellule/ml in terreno di congelamento, costituito da 9 volumi di Albumina Umana al 5% e 1 volume di Dimetilsolfossido (DMSO), e quindi distribuite in aliquote di 0,5 mi. Le aliquote, che rappresentano le dosi vaccinali, vengono sottoposte ad un processo di congelamento controllato in un apposito apparecchio e quindi conservate in vapori di azoto liquido.

Sul prodotto finito vengono effettuati ulteriori controlli allo scopo di accertarne la qualità e la sicurezza per il paziente:

Vitalità

Recupero

Immunofenotipo

Endotossina

Sterilità

Uptake.

ESEMPIO 2: Studio sulle proprietà delle cellule IFN-DC e degli effetti in vivo sul carcinoma della cervice dell'uso combinato di ciclofosfamide e IFN-DC caricate con corpi apoptotici

MATERIALI E METODI

Separazione e colture cellulari

Le IFN-DC e le IL4-DC convenzionali sono state ottenute selezionando i monociti CD14+ da cellule mononucleate del sangue periferico di donatori sani, e messe in coltura ad una concentrazione di 2x10<6>cell/ml, in CellGro DC Medium (Celi Genix), con l'aggiunta di GM-CSF (500U/ml) associato a IFNa-2b (10.000U/ml) per 3 giorni o IL-4 (250U/ml) per 5 giorni (19).

Analisi al citofluorimetro

Le DC (0.5 xlO<6>) sono state incubate per 15 min a 37°C con 10yg/ml di OVA-FITC o DQ-OVA. In seguito le cellule sono state lavate e rimesse in coltura con il terreno a tempi diversi, in assenza di proteina solubile. La fluorescenza à ̈ stata analizzata mediante citofluorimetria a flusso. Le DC incubate con OVA-FITC o DQ-OVA a 4°C sono state usate come controllo. Per osservare la colorazione intracellulare delle vescicole acide, le DC sono state incubate con il colorante LysoSensorTM Green DND-189 (1Î1⁄4Îœ) e analizzate al citofluorimetro.

Microscopia confocale a scansione laser (CSLM) Le DC (5 xlO<4>) sono state seminate su vetrini Polilisinati. Per l'analisi dei compartimenti acidi le cellule sono state colorate sul vetrino per 3 min con il colorante LysoSensorTMYellow/Blue DND-160 (5Î1⁄4Îœ) ed esaminate rapidamente al CSLM.

Per analizzare il traffico intracellulare degli Ag internalizzati, le DC sono state caricate per 15 min con OVA-FITC (10Î1⁄4g/ml) o con la proteina NS3 di HCV o con la proteina E7 di HPV16 (50Î1⁄4g/ml), rimesse in coltura per tempi differenti (dai 15 min alle 4h) e poi osservate al microscopio. Ad ogni tempo, le cellule adagiate sul vetrino polilisinato venivano fissate con paraformaldeide al 3%, permeabilizzate con Triton X-100 (0.5%), e incubate con gli anticorpi monoclonali anti-HCV-NS3 c33c, anti E7, anti-human HLA-ABC, anti-EEA-l , anti-Rab5 e anti-Lamp-1, e policlonali anti-Rab4, anti-Rab5, anti-Rab7, anti-Rabll, anti-NOX-2, anti-TAP-l, anti-OVA, anti-calnexina, anti-calreticulina ed anti-Rac2. Frammenti F(ab)2 di anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor<®>-488, -594, -647 sono stati usati per la rivelazione degli anticorpi primari. Il DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) Ã ̈ stato usato per visualizzare i nuclei delle cellule.

L'analisi al CSLM Ã ̈ stata eseguita con lo strumento Leica TCS SP2 (software Leica Confocal), utilizzando i laser a 405, 488, 594 e 633 nm e il programma Adobe Photoshop (Adobe System Incorporated) per 1'elaborazione delle immagini. Molte cellule sono state analizzate per ogni condizione sperimentale e i risultati rappresentativi sono mostrati nelle figure.

Analisi di Western Blotting

L'espressione delle proteine nei lisati cellulari totali à ̈ stata valutata in estratti cellulari ottenuti U sando le cellule nella soluzione RIPA. I filtri di nitrocellulosa sono stati incubati con gli anticorpi policlonali anti-OVA e anti-NOX-2. L'actina à ̈ stata utilizzata come controllo quantitativo del caricamento.

Analisi di cross-presentazione e stimolazione antigeni ca

Le IFN-DC e IL-4-DC sono state pretrattate per 30 min con ΙΟΟÎ1⁄4Îœ di Chlorochina, 2,5Î1⁄4g/ml di Brefeldina A, 50Î1⁄4Îœ di Lactacistina, ΙΟΟÎ1⁄4Îœ di MG132 o 100Î1⁄4Îœ, 50Î1⁄4Îœ e 25Î1⁄4Îœ di Primachina e in seguito caricate con la proteina solubile ricombinante HCV-NS3 c33c (50Î1⁄4g/ml) per 16h, in assenza di inibitori. Soltanto il trattamento con la Primachina à ̈ stato mantenuto nelle 16h di coltura con l'Ag. In seguito, le DC sono state co-coltivate con il clone CD8+ antigene-specif ico al rapporto 1:1, per 18h a 37°C in piastre Elispot e analizzate per rilevare la presenza di lFN-γ.

Modello Hu-PBL-SCID

I topi SCID sono stati ricostituiti con 4x10<7>PBL umani e dopo 3-4 giorni immunizzati con tre somministrazioni di IFN-DC (2x10<6>cellule) pulsate o meno con antigene. Negli esperimenti con la linea CaSki, i topi sono stati inoculati s.c. con 4x10<6>cellule tumorali 4 giorni prima dell'ultima immuni zzazione .

Analisi statistica

Tutti i risultati sono espressi come medie ± deviazioni standard (SD) , e la significatività dei risultati à ̈ stata eseguita mediante il test di Mann-Whitney .

RISULTATI

Maggiore sopravvivenza dell'antigene e rallentata acidificazione del compartimento endosomiale nelle IFN-DC

E' stato dimostrato che le IFN-DC sono particolarmente efficienti nell'indurre il crosspriming dei linfociti T CD8+ rispetto alle DC convenzionali immature, abilità non dipendente dalla maggiore capacità di captare antigeni esogeni (16). Al fine di analizzare in dettaglio il destino intracellulare degli antigeni internalizzati, sono state eseguite delle cinetiche con 1'antigene classico Ovalbumina (OVA), la cui endocitosi à ̈ principalmente mediata dal recettore del mannosio-6-fosfato. Le IFN-DC sono state caricate quindi con OVA-FITC per 15 min e analizzate mediante citofluorimetria dopo essere state rimesse in coltura per vari tempi in assenza di antigene (1-24h). Dopo una rapida internalizzazione, i livelli di OVA-FITC rimanevano sostanzialmente inalterati fino alle 6h e una moderata fluorescenza à ̈ stata osservata alle 24h in tutte le cellule analizzate (Fig. 1A). Al contrario, nelle DC convenzionali (IL-4-DC) il segnale di OVA-FITC veniva progressivamente perso a cominciare dalle 3h fino alla completa scomparsa dopo 24h, segno di una più rapida degradazione rispetto alle IFN-DC. Per meglio caratterizzare i processi di degradazione, le DC sono state caricate con DQ-OVA (15 min), una variante di OVA che mostra fluorescenza solo dopo degradazione endosomiale proteasi-dipendente. Mentre nelle IL-4-DC il segnale di DQ-OVA raggiungeva i suoi livelli massimi dopo 3h di coltura, per decadere completamente entro le 24h, nelle IFN-DC soltanto una piccola quantità di DQ-OVA veniva degradata nelle prime 3h, mostrando la massima fluorescenza dopo 24h, segno chiaro di una più ritardata proteolisi (Fig. 1B). L'internalizzazione di OVA-FITC, così come la sua degradazione, non sembrano essere influenzati dalla stimolazione delle DC con differenti ligandi dei Toll-like receptors (TLRs), coinvolti nella regolazione del processamento degli antigeni .

E' stato riportato che una bassa attività proteolitica e una rallentata acidificazione dei compartimenti endosomiali favoriscano il caricamento dei peptidi su molecole MHC di classe I (34). Al fine di valutare il relativo contributo dell'acidificazione al processamento degli Ag, le DC sono state incubate con lysosensor, un colorante che si accumula nelle vescicole intracellulari e mostra tanta fluorescenza quanto più i compartimenti sono acidi. Le IFN-DC non soltanto sono risultate provviste di una minore quantità di compartimenti acidi (Fig. 1C e D) ma, a seguito di internalizzazione dell'antigene OVA, hanno mostrato una maggiore resistenza all'acidificazione esibendo una prolungata alcalinizzazione intracellulare (Fig. 1E). Poiché 1'alcalinizzazione dei compartimenti endosomiali durante i processi di endocitosi/fagocitosi à ̈ criticamente dipendente dall'attività dell'enzima NADPH ossidasi NOX-2, à ̈ stata valutata l'espressione intracellulare di questo enzima nelle DC. Analisi di western blot e osservazioni al microscopio confocale hanno rivelato che NOX-2 à ̈ fortemente espresso nelle IFN-DC rispetto alle IL-4-DC, sia in cellule non trattate (Fig. 1F) che in cellule che hanno internalizzato OVA (Fig. 1G). Non soltanto NOX-2, ma anche la GTPasi Rac2 che ne controlla 1'assemblamento e l'attività a livello degli endosomi, à ̈ risultata maggiormente espressa nelle IFN-DC (Fig. 1F), suggerendo che l'azione concertata di NOX-2 e Rac2 potrebbe essere fortemente responsabile della maggiore alcalinizzazione osservata in queste cellule e della conseguente protezione dell'Ag da una rapida degradazione .

Questi risultati indicano chiaramente che le IFN-DC hanno la straordinaria capacità di promuovere la sopravvivenza intracellulare di un Ag internalizzato, ritardando fortemente l'acidificazione dei compartimenti endosomiali, fenomeno riportato favorire la cross-presentazione.

Localizzazione delle molecole MHC di classe I negli endosomi precoci

E' noto che la cross-presentazione di Ag solubili avviene in compartimenti distinti da quelli deputati alla presentazione di Ag endogeni (35-38), sebbene lo specifico compartimento intracellulare dove i peptidi derivati da Ag esogeni interagiscano con MHC-I non sia stato ancora ben definito.

Mediante microscopia confocale à ̈ stata analizzata in dettaglio la distribuzione delle molecole MHC-I, che nelle IFN-DC apparivano localizzate principalmente negli endosomi precoci e solo parzialmente nel Reticolo Endoplasmatico (ER), una distribuzione fortemente diversa da quella riscontrata in DC convenzionali (Fig. 2A. Non solo molecole MHC-I, ma anche altre proteine appartenenti al "complesso di caricamento MHC-I", quali TAP-1 e calreticulina, apparivano localizzati negli endosomì precoci nelle IFN-DC (Fig. 2A), ma non nelle IL-4 DC (Fig. 2B).

Mediante analisi di tripla marcatura, Ã ̈ stato inoltre osservato che le IFN-DC sono provviste di specializzati compartimenti misti "ER-endosoma" contenenti MHC-I, molto probabilmente corrispondenti alle vescicole "ER-like" ben descritte durante la formazione del fagosoma ed efficientemente coinvolte nella cross-presentazione (39,40).

Trafficking degli antigeni esogeni verso gli endosomì contenenti MHC-I.

Mediante analisi di microscopia confocale à ̈ stato osservato che le IFN-DC sono straordinariamente efficienti nell'indirizzare gli Ag esogeni captati verso il pathway di processamento in classe I.

Infatti, dopo soli 15 min dall'internalizzazione, gli Ag apparivano principalmente localizzati in vescicole contenenti MHC-I (Fig. 3A), sia se gli Ag erano stati internalizzati mediante endocitosi recettore-mediata (Ã ̈ riportato l'esempio della proteina OVA), sia se entravano per macropinocitosi (Ã ̈ riportato l'esempio della proteina strutturale NS3 del virus dell'epatite C).

Questo particolare traffico intracellulare non à ̈ stato osservato nelle DC convenzionali, dove soltanto una discreta quantità di Ag veniva rapidamente indirizzata verso i compartimenti contenenti MHC-I (Fig. 3B) , essendo la maggior parte dell'Ag probabilmente destinato alla degradazione nei lisosomi.

Traffico Intracellulare della proteina NS3

Al fine di valutare se anche un Ag captato per macropinocitosi avesse un destino differente nelle IFN-DC rispetto alle IL-4-DC, come descritto per la proteina endocitata OVA, le DC sono state caricate con la proteina strutturale NS3 per 15 min ed osservate in microscopia confocale dopo vari tempi di coltura. Sebbene la proteina NS3 fosse pinocitata con efficienza paragonabile, dopo 18h di coltura soltanto le IFN-DC risultavano positive per NS3, indice di una maggiore persistenza intracellulare dell'Ag in analogia a quanto già osservato per la proteina OVA (Fig. 5).

Nelle IFN-DC l'Ag NS3, subito dopo l'internalizzazione, veniva preferenzialmente convogliato verso una popolazione di endosomi precoci esprimenti EEA-1 (altro marcatore degli endosomi precoci), ma non Rab5, che veniva acquisito 10-15 min più tardi assieme a Rab7 (Fig. 4 A). Sebbene la coespressione dei tipici marcatori degli endosomi precoci e tardivi sia un chiaro segnale di transizione dell'organello verso i lisosomi, entrambi i marcatori degli endosomi precoci EEA-1 e RAb5 venivano trattenuti sulle vescicole NS3+ per almeno 2h, indice di una maturazione estremamente lenta (Fig. 4A). Tra l'altro, à ̈ stato riportato che, nonostante l'acquisizione di Rab7, una vescicola in transizione potrebbe ancora essere indirizzata verso il pathway di recycling. La forte co-localizzazione della proteina NS3 con Rabll a tutti i tempi di osservazione suggeriva chiaramente che parte di queste vescicole NS3+ fosse realmente indirizzata verso gli organelli riciclanti (Fig. 4A) e la notevole e persistente associazione di NS3 con NOX-2 confermava ulteriormente questa tendenza ad ostacolare la maturazione dell'endosoma, evitando l'acidificazione dell'organello . A differenza di quanto osservato con la proteina OVA, le vescicole pinocitate NS3+ molto rapidamente mostravano associazione con la proteina calnexina (tipico marcatore del RE), suggerendo un'interazione con il tradizionale compartimento del RE oppure con le particolari strutture endosomiali "ER-like" osservate in queste cellule e ben descritte nel promuovere la cross-presentazione (Fig. 4A).

Come atteso, nelle IL-4-DC, l'Ag NS3 andava incontro ad un fato nettamente differente, poiché le vescicole pinocitate NS3+ molto rapidamente venivano indirizzate verso gli endosomi tardivi e la perdita repentina di EEA-1 e NOX-2 confermava questa inesorabile maturazione verso i lisosomi (Fig. 4B). Anche l'interazione con il compartimento del RE risultava molto più rallentata e giustificava la parziale associazione di NS3 con le molecole MHC-I (Fig. 4B).

Analisi funzionale del processaniento della proteina NS3

La presentazione dei peptidi derivati dal processamento della proteina NS3 di HCV a un clone CD8+ NS3-specif ico, HLA-A2-ristretto (1406-1415), à ̈ stata studiata valutando la produzione di IFN-γ con un saggio ELISPOT. In questi esperimenti sono stati utilizzati dieci diversi donatori HLA-A2 positivi. Coerentemente con i nostri precedenti risultati, un numero significativamente più elevato di cellule producenti IFN-γ era osservato quando le IFN-DC venivano utilizzate come stimolatori, rispetto alle colture stimolate con IL-4-DC (P < 0,05) (Fig. 6A), a conferma della maggiore efficacia delle IFN-DC nell'indurre l'attivazione del clone T CD8+. Al fine di chiarire i meccanismi alla base della spiccata capacità delle IFN-DC di indurre cross-presentazione , le DC sono state trattate con vari inibitori che interferiscono con specifici pathways di processamento : la Clorochina (che aumenta il pH endosomiale), la Brefeldina A (che blocca il trasporto RE-Golgi) , la Lactacistina ed MG132 (che interferiscono con il proteasoma) . Inibendo il classico trasporto RE-Golgi o l'attività del proteasoma si osservava una riduzione della presentazione antigenica sia nelle IFN-DC che nelle IL-4-DC (Fig. 6B e C), mentre il trattamento con Clorochina induceva soltanto nelle IL-4-DC una più elevata capacità di presentazione dell 'antigene (Fig. 6C e B), in accordo con quanto già riportato in letteratura. Questo risultato era piuttosto atteso, se si considera che le IFN-DC di per sé già presentano un ambiente intracellulare meno acido e mediante l'asse Rac2-NOX-2 efficientemente prevengono l'acidificazione degli endosomi (Fig. 1). Inoltre, per verificare se la prolungata persistenza dell 'antigene corrispondesse a una più duratura efficienza nella presentazione antigenica, le IFN-DC sono state caricate con la proteina NS3 per Ih, lasciate in coltura per 3 giorni e successivamente usate per attivare il clone CD8+ specifico. Anche in queste condizioni una maggiore produzione di IFN-γ à ̈ stata rilevata quando la stimolazione del clone veniva effettuata con le IFN-DC caricate con NS3 rispetto alle IL-4-DC (Fig. 6D), suggerendo che la prolungata persistenza dell'antigene nelle IFN-DC à ̈ associata ad una più sostenuta capacità di indurre cross-presentazione.

Ruolo del recycling nella cross -presentazione della proteina NS3

In seguito all'osservazione che nelle IFN-DC la proteina NS3 veniva rapidamente indirizzata verso gli endosomi contenenti MHC-I (Fig. 3B), à ̈ stata analizzata la capacità di queste cellule di cross -presentare i peptidi derivati dal processamento di NS3 al clone CD8+ specifico dopo precoce internalizzazione dell' antigene . Le IFN-DC sono state caricate con la proteina NS3 per Ih, fissate con gluteraldeide e utilizzate nel saggio di cross-presentazione. I risultati hanno evidenziato che le IFN-DC hanno una maggiore capacità di crosspresentare la proteina NS3 al clone specifico rispetto alle IL-4-DC (Fig. 7A), segno chiaro che le IFN-DC sono provviste di molecole MHC-I già pronte e disponibili per il caricamento dell'Ag e la rapida traslocazione in membrana .

Infatti, Ã ̈ stato osservato che, nelle IFN-DC, le molecole MHC di classe I venivano rapidamente convogliate agli endosomi riciclanti Rabll+ (Fig. 7B), suggerendo che, in queste cellule, il pathway del recycling potrebbe svolgere un ruolo importante nella rapida presentazione degli antigeni esogeni. Per verificare questa ipotesi, le IFN-DC sono state trattate con la Primachina (inibitore del recycling), che induceva una significativa inibizione concentrazione-dipendente della cross-presentazione (Fig. 7C). Al contrario, le IL-4-DC non sono state influenzate dal trattamento con la Primachina in nessuna delle concentrazioni testate (Fig. 7D).

Questi risultati indicano che le IFN-DC utilizzano pathways distinti e paralleli rispetto alle IL-4-DC nella cross-presentazione di antigeni esogeni, incluso il recycling delle vescicole endocitate.

Capacità delle IFN-DC di indurre cross-priming verso la proteina E7 di HPV 16

E' stato avviato uno studio sulla capacità di strategie vaccinali basate sulle IFN-DC di evocare in vitro ed in vivo (modello hu-PBL-SCID) una risposta cellulare verso la proteina E7 di HPV 16, antigene virale espresso in lesioni di alto grado e dalla maggior parte dei tumori cervicali.

Le IFN-DC sono state ottenute da monociti di sangue periferico, di donatori sani, coltivati per tre giorni in presenza di IFN-α e GM-CSF, caricate con proteina E7 ricombinante. Per valutare l'efficacia del processamento antigenico della proteina E7, abbiamo effettuato studi comparativi di antigenuptake/processing nelle IFN-DC e nelle DC convenzionali (IL-4-DC), quindi analizzato i pathway intracellulari e la compartimentalizzazione dell'antigene solubile di HPV. IFN-DC e IL-4-DC sono risultate esibire una paragonabile attività di antigen uptake, evidenziata come internalizzazione di proteina E7 di HPV16 (Figura 8).

Questi esperimenti hanno però permesso di osservare come a 2 ore dall' "antigen uptake" le IFN-DC compartimentalizzino e ritengano preferenzialmente la proteina fagocitata (E7) negli "early endosomes" (evidenziati con marcatura di EEA-1) mentre le IL-4-DC la veicolino rapidamente soprattutto nei "late endosomes" (evidenziati attraverso marcatura con Rab7) (Figura 9). L'analisi della compartimentalizzazione intracellulare ha mostrato come dopo 18-20 ore dall'uptake della proteina, questa sia ancora parzialmente evidenziabile nelle IFN-DC (probabilmente nel compartimento lisosomiale) mentre sia pressoché assente nelle IL-4-DC, suggerendo una più rapida cinetica di processamento ed una più precoce fusione degli endosomi con il compartimento lisosomiale nelle IL-4-DC (Figura 8).

In esperimenti di immunizzazione in vitro, IFN-DC derivate da donatori sani sono state pulsate con proteina E7 ed utilizzate nel priming di linfociti T autoioghi dopo 18h . La risposta T à ̈ stata valutata mediante saggio ELISPOT per la produzione di IFN-gamma utilizzando come target (S:E ratio 1:1) IFN-DC autologhe caricare con proteina E7. I risultati ottenuti hanno mostrato che le IFN-DC sono in grado di indurre una risposta caratterizzata da un numero significativamente alto di cellule producenti IFN-γ (Figura 10).

Il modello xenochimerico hu-PBL-SCID à ̈ stato utilizzato per valutare la risposta cellulare CD8 in vivo, in seguito a vaccinazione con proteina E7. Topi SCID ricostituiti con PBL umani sono stati vaccinati con IFN-DC autologhe pulsate con E7 e sottoposti a due successivi richiami. Dopo una settimana dall'ultimo richiamo, le xenochimere sono state sacrificate, le cellule umane sono state recuperate ed i linfociti CD8 saggiati in ELISPOT con IFN-DC autologhe caricare con proteina E7. Sia nelle milze che nelle cavità peritoneali delle xenochimere si rilevava una vigorosa risposta T CD8 umana per E7 di HPV16, evidenziabile come produzione specifica di IFN-γ (Figura 11). Pertanto, siamo successivamente passati ad uno studio preliminare rivolto a valutare la possibilità di proteggere le xenochimere vaccinate dall'inoculo della linea di carcinoma cervicale CaSKI (esprimenti l'aplotipo HLA-A2). Topi SCID ricostituiti con PBL umani HLA-A2 positivi sono stati sottoposti ad un protocollo di vaccinazione con IFN-DC autologhe pulsate con proteina E7 ricombinante. Quattro giorni prima dell'ultima vaccinazione di richiamo, le xenochimere sono state quindi inoculate sottocute con la linea CaSKI e monitorate per la crescita tumorale. Il followup dei diversi gruppi di topi inoculati ha evidenziato come il 50% delle xenochimere vaccinate si mantenga esente da crescita di masse tumorali fino a 60 giorni dall'inoculo, contrariamente ai gruppi di controllo, in cui il 100% dei topi inoculati sviluppa il tumore (Figura 12).

Abbiamo parallelamente condotto ulteriori studi pilota in vitro rivolti ad analizzare la capacità delle IFN-DC di stimolare una risposta contro la proteina E7 in comparazione con le IL-4-DC maturate con un cocktail maturativo comprendente TNF-α, IL-6 , IL-1β ,PGE2. I dati ottenuti hanno dimostrato anche in questo caso una superiore capacità della IFN-DC di indurre una forte risposta CD4/CD8, misurata in termini di produzione di IFN-gamma analizzata in saggi ELISA (Figura 13).

Capacità delle IFN-DC caricate con corpi apoptotici derivati da cellule di carcinoma della cervice di indurre crosa-priming verso la proteina E7 di HPV 16

Abbiamo valutato la capacità delle IFN-DC pulsate con corpi apoptotici derivati da cellule CaSki (HLA-A2+) di indurre una risposta verso le cellule di tumore cervicale. L'apoptosi à ̈ stata indotta mediante trattamento chemioterapico in vitro, utilizzando l'agente alchilante mafosfammide (MaFo), analogo della ciclofosfamide ma che non necessita di attivazione metabolica in vivo da parte del enzima epatico Citrocromo-P450 . Le cellule Caski sono state trattate con 10Î1⁄4g/ml di MaFo per 72h, l'apoptosi à ̈ stata monitorata attraverso l'analisi citofluorimetrica delle cellule tumorali marcate con annexina-V e Ioduro di Propidio, evidenziando la morte cellulare pressoché completa tra il secondo ed il terzo giorno dal trattamento, l'espressione in membrana delle molecole Calreticulina e HSP70 à ̈ stata analizzata sempre mediante analisi citof luorimetrica per valutare il livello di apoptosi immunogenica ottenuta mediante trattamento con MaFo (Figura 14A). Il monitoraggio delle della capacità delle IFN-DC di fagocitare i corpi apoptotici ha evidenziato come circa il 90% delle DC fossero in grado di fagocitare efficientemente i corpi apototici marcati con il fluorocromo vitale PHK67 (Figura 14A). I8h dopo essere state caricate con i corpi apototici, le DC sono state utilizzate nel priming di linfociti T HLA-A2+ derivati da donatori sani. La risposta T à ̈ stata valutata mediante saggi ELISA ed ELISPOT per la produzione di IFN-γ utilizzando come target (S:E ratio 1:1) IFN-DC e IL-4-DC autologhe caricare con proteina E7. I risultati ottenuti hanno mostrato che le IFN-DC sono in grado di indurre una risposta caratterizzata da un numero significativamente alto di cellule producenti IFN-γ (Figura 14B) a confermare la capacità delle IFN-DC di fagocitare attivamente le cellule tumorali indotte in vitro all'apoptosi mediante trattamento chemioterapico con agente alchilante e stimolare una potente risposta T (verosimilmente ascrivibile alla risposta CD4 di tipo Thl e cellulare CD8) verso il tumore stesso.

Effetto sinergico della chemio-immunoterapia con ciclofosfamide (CTX) e IFN-DC caricate con corpi apoptotici derivati da cellule di carcinoma della cervice di indurre il rigetto delle cellule di carcinoma della cervice impiantate in topi Hu-PBL-SCID Abbiamo valutato l'effetto immunopotenziante del pretrattamento con ciclofosfamide (CTX) sulla capacità delle IFN-DC pulsate con corpi apoptotici derivati da cellule CaSki (HLA-A2<+>) di indurre il rigetto di cellule di tumore cervicale nel modello xenochimerico hu-PBL-SCID. A tal fine, topi SCID sono stati inoculati s.c. con 4xl0<6>cellule CaSki (HLA-A2<+>). Dopo 16 giorni i topi sono stati ricostituiti con 4xl0<7>PBMc da donatore HLA-A2<+>. Il giorno 20 dall'inoculo del tumore alcuni animali sono stati inoculati i.p. con 50 mg/Kg di ciclofosf amide e il giorno dopo sono stati trattati con 2xl0<6>IFN-DC provenienti dallo stesso donatore, caricate con corpi apoptotici dello stesso tumore. L'esperimento prevedeva i seguenti bracci di trattamento: A) Hu-PBL-SCID Tumore; B) Hu-PBL-SCID Tumore IFN-DC; C) Hu-PBL-SCID Tumore CTX; D) Hu-PBL-SCID Tumore IFN-DC+CTX (Fig. 15).

L' insieme di dati ottenuti da questa serie di esperimenti supporta il concetto dell 'utilizzo delle IFN-DC come adiuvanti cellulari capaci di stimolare ed espandere una risposta cellulare contro la proteina E7 di HPV e quindi di essere utilizzate come farmaci cellulari nel trattamento immunoterapeutico di neoplasie della cervice uterina positive per la presenza del virus e dimostra come il trattamento con CTX determini apoptosi immunogenica di cellule del carcinoma della cervice umano e potenzi la risposta immunitaria indotta dalla vaccinazione

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Claims (14)

1. RIVENDICAZIONI 1) Combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per l'uso separato o sequenziale nel trattamento del carcinoma della cervice uterina, in cui dette cellule dendritiche sono preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha.
2. 2) Combinazione secondo la rivendicazione 1 per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette cellule dendritiche sono caricate con antigeni o con corpi apoptotici di carcinoma della cervice uterina mediante incubazione in vitro di dette cellule dendritiche con antigeni o corpi apoptotici di cellule di carcinoma della cervice uterina in cui à ̈ stata indotta apoptosi immunogenica mediante trattamento con un metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro, in cui detto metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro à ̈ scelto nel gruppo che consiste in mafosfamide o fosforamide..
3. 3) Combinazione secondo la rivendicazione 1 per l'uso secondo la rivendicazione 1, in cui dette cellule dendritiche sono caricate con antigeni HPV specifici E6 e/o E7.
4. 4) Combinazione secondo ognuna delle rivendicazioni 1-3 per l'uso secondo ognuna delle rivendicazione 1-3, in cui la ciclofofamide à ̈ somministrata per una sola volta prima della somministrazione delle cellule dendritiche.
5. 5) Combinazione secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4 per l'uso secondo ognuna delle rivendicazione 1-4, in cui dette cellule dendritiche sono somministrate entro 48 ore dalla somministrazione di ciclofosfamide.
6. 6) Uso di un metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro per la preparazione in vitro di cellule dendritiche cariche di antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni derivanti dalla apoptosi immunogenica indotta da detto metabolita della ciclofosfamide su cellule di carcinoma alla cervice uterina, in cui detto metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro à ̈ scelto nel gruppo che consiste in mafosfamide o fosforamide .
7. 7) Uso secondo la rivendicazione 6, in cui le cellule dendritiche da caricare con antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni sono cellule dendritiche preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha.
8. 8) Metodo di preparazione in vitro di cellule dendritiche cariche di antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni contro il carcinoma alla cervice uterina, detto metodo comprendendo o consistendo nelle seguenti fasi: a) trattare una coltura di cellule di carcinoma della cervice uterina con un metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro allo scopo di indurre apoptosi immunogenica, in cui detto metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro à ̈ scelto nel gruppo che consiste in mafosfamide o fosforamide ; b) incubare cellule dendritiche con la coltura di cellule della fase a) o con gli antigeni o i corpi apoptotici da essa derivati affinché dette cellule dendritiche fagocitino gli antigeni e/o corpi apoptotici immunogeni derivanti dalla apoptosi immonogenica di dette cellule di carcinoma alla cervice uterina.
9. 9) Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui dette cellule dendritiche sono preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha.
10. 10) Combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per l'uso separato o sequenziale nel trattamento dei tumori ad eziologia virale riconducibile ad infezione da HPV, in cui dette cellule dendritiche sono preparate mediante un procedimento che comprende o consiste nel coltivare monociti umani in adatto terreno di coltura in presenza delle citochine GM-CSF e IFN-alpha e sono caricate con antigeni HPV specifici E6 e/o E7.
11. 11) Combinazione secondo la rivendicazione 10 per l'uso secondo la rivendicazione 10 , in cui la ciclofofamide à ̈ somministrata per una sola volta prima della somministrazione delle cellule dendritiche.
12. 12) Combinazione secondo ognuna delle rivendicazioni 10-11 per l'uso secondo ognuna delle rivendicazione 10-11, in cui dette cellule dendritiche sono somministrate entro 48 ore dalla somministrazione di ciclofosfamide.
13. 13) Combinazione secondo ognuna delle rivendicazioni 10-12 per l'uso secondo ognuna delle rivendicazione 10-12, in cui detti tumori ad eziologia virale riconducibile ad infezione da HPV sono scelti nel gruppo che consiste in carcinoma della vulva, della vagina, del pene, e dell'ano.
14. 14) Combinazione di ciclofosfamide e cellule dendritiche per l'uso separato o sequenziale nel trattamento del carcinoma della cervice uterina, in cui dette cellule dendritiche sono caricate con antigeni o con corpi apoptotici di carcinoma della cervice uterina mediante incubazione in vitro di dette cellule dendritiche con antigeni o corpi apoptotici di cellule di carcinoma della cervice uterina in cui à ̈ stata indotta apoptosi immunogenica mediante trattamento con un metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro, in cui detto metabolita della ciclofosfamide attivo in vitro à ̈ scelto nel gruppo che consiste in mafosfamide o fosforamide .