ITRM20080519A1 - Uso di acido gamma-ammino butirrico (gaba) o di una biomassa arricchita di acido gamma-ammino butirrico (gaba) per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni. - Google Patents
Uso di acido gamma-ammino butirrico (gaba) o di una biomassa arricchita di acido gamma-ammino butirrico (gaba) per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni. Download PDFInfo
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Description
Uso di acido γ-ammino butirrico (GABA) o di una biomassa arricchita di acido γ-ammino butirrico (GABA) per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni
La presente invenzione concerne l’uso di acido γ-ammino butirrico (GABA) o di una biomassa arricchita di acido γ-ammino butirrico (GABA) per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni. Più in particolare, la presente invenzione concerne l’uso di acido γ-ammino butirrico (GABA) o di una biomassa arricchita di acido γ-ammino butirrico (GABA) ottenibile mediante fermentazione con batteri lattici (LAB) su surplus agro-alimentari per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni.
Il GABA, definito come un aminoacido non naturale, à ̈ sintetizzato dall’enzima glutammato decarbossilasi (GAD) [EC 4.1.1.15], piridossal-fosfato dipendente, che catalizza la decarbossilazione irreversibile di L-glutammato in GABA. L’enzima GAD à ̈ largamente distribuito in organismi eucarioti e procarioti (38). E’ stato ampiamente dimostrato che il GABA à ̈ in grado di svolgere diverse funzioni fisiologiche nell’uomo. Esso può agire da neurotrasmettitore, induttore di ipotensione, diuretico e tranquillante (14). Trattamenti della depressione (25), di sintomi collegati all’alcolismo (23) e la stimolazione del sistema immunitario (22) sono stati associati alla somministrazione di GABA. Recenti studi in ambito dermatologico hanno dimostrato il coinvolgimento del GABA: (i) nei meccanismi di omeostasi a livello epidermico, come risposta alle radiazioni UV (41); (ii) nella regolazione di recettori di barriera per la prevenzione di disfunzioni e patologie iperproliferative dell’epidermide; e (iii) nella stimolazione dell’acido ialuronico e miglioramento della sopravvivenza cellulare dell’epidermide in seguito a stress ossidativi (13). E’ stata inoltre recentemente dimostrata la presenza di numerose sub unità del recettore per GABAAnei reni, l’assemblaggio delle subunità in un nuovo complesso recettoriale e un recettore attivo per GABAAnelle cellule tubulari prossimali dei reni.
Sulla base di queste riconosciute funzioni fisiologiche, diversi alimenti funzionali sono stati arricchiti/fortificati in GABA mediante trattamenti tecnologici, enzimatici o microbici.
Alcuni studi hanno anche considerato la sintesi di GABA da batteri lattici (20, 27), sia per la produzione di derivati lattiero-caseari funzionali e sia per comprendere il meccanismo fisiologico alla base di tale attività enzimatica. In generale, la sintesi di GABA conferisce resistenza alle cellule batteriche sottoposte a condizioni ambientali di acidità (3) ed il processo operato dall’enzima GAD à ̈ stato associato con la sintesi di energia in Lactobacillus sp. E1. La produzione di GABA nei derivati lattiero-caseari delle pubblicazioni sopra citate non ha superato la soglia di ca. 70 mg/l (ca. 0.67 mM).
Gli Autori della presente invenzione hanno precedentemente messo a punto un procedimento di preparazione di acido γ-ammino butirrico o per la preparazione di una biomassa arricchita in acido γammino butirrico mediante l’impiego di Lactobacillus plantarum DSM 19463 o Lactococcus lactis ssp. DSM 19464 (depositati il 26 giugno 2007 presso il DSMZ) come descritto nella domanda di brevetto internazionale PCTIT08000481. L. plantarum DSM 19463 à ̈ stato selezionato per la fermentazione di mosto d’uva concentrato (zuccheri totali 61,8%), diluito (zuccheri totali pari a 1%) nel rapporto 50:50 con acqua di lievito ed acqua, integrato con L-glutammato monosodico (20 mM), e modificato nel valore di pH iniziale pari a ca. 6,0. E’ stato standardizzato ed ottimizzato un protocollo di produzione di GABA da L. plantarum DSM 19463 che prevede la sua iniziale propagazione in terreno colturale MRS per 24 h a 30°C, la raccolta delle cellule per centrifugazione e lavaggio, l’inoculo in mosto d’uva diluito con acqua di lievito ed integrato con 20 mM di L-glutammato monosodico, pH ca.
6,0, e la successiva incubazione, preferenzialmente per 72-78 h a 30°C. Il processo di fermentazione mediante L. plantarum DSM 19463 ha consentito la produzione di ca. 500 mg/l (ca. 4,8 mM) di GABA al termine del processo di fermentazione del mosto d’uva, ovvero la produzione di ca. 890 mg di GABA per 100 g di sostanza secca del preparato liofilizzato. Inoltre, il preparato liofilizzato à ̈ arricchito naturalmente con cellule vive e vitali di L. plantarum DSM 19463 (ca. 10<10>ufc/g, in condizioni di laboratorio) che, sulla base di saggi in vitro, risulta possedere proprietà probiotiche.
Inoltre, sempre come descritto nella domanda di brevetto PCTIT08000481, à ̈ stato selezionato il batterio lattico Lactococcus lactis ssp. DSM 19464 che può essere impiegato nella fermentazione di mosto d’uva e, soprattutto, latticello secondo un protocollo di fermentazione analogo con rese in GABA diverse.
Gli Autori della presente invenzione hanno ora trovato che il GABA o la biomassa arricchita in acido γ-ammino butirrico menzionata sopra à ̈ in grado di stimolare l’espressione della beta-defensina 2 (HBD-2), peptide avente proprietà antimicrobiche.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione l’uso di acido γ-ammino butirrico o di una biomassa arricchita in acido γ-ammino butirrico per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni.
La biomassa arricchita in acido γ-ammino butirrico à ̈ ottenibile per fermentazione ad opera Lactobacillus plantarum DSM 19463 o Lactococcus lactis ssp. DSM 19464 su substrato scelto tra mosto d’uva o latticello. Preferibilmente, il substrato à ̈ addizionato con L-glutammato monosodico. Il mosto d’uva può essere diluito con acqua di lievito o addizionato con estratto di lievito. La diluizione può essere fatta con acqua di lievito e acqua distillata 50:50 seguita da disacidificazione mediante NaOH 1 N ad un valore di pH da 6,0 a 6,5, preferibilmente 6,0. Alternativamente, il latticello può essere addizionato con estratto di lievito (ca. 0,5%). Inoltre, il mosto d’uva o il latticello possono essere addizionati di piridossale 5fosfato.
Preferibilmente, la biomassa comprende almeno 890 mg di acido γ-ammino butirrico per 100 g di sostanza secca. Inoltre, la biomassa comprende ulteriormente vitamine, minerali, polifenoli e batteri lattici vivi e vitali. Alternativamente, può essere impiegata la biomassa non più vitale inattivata per trattamento termico con una qualsiasi tecnica standard quali la tindalizzazione o la pastorizzazione. In questo modo la biomassa rimane comunque ricca di GABA che non à ̈ termolabile. Pertanto, costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione, l’uso della biomassa ottenibile come descritto sopra, sottoposta a inattivazione termica del lattobacillo e successivo essiccamento o liofilizzazione del substrato di fermentazione.
Sulla base di quanto detto sopra, l’acido γ-ammino butirrico può quindi essere estratto dalla biomassa come definita sopra.
Le infezioni che possono essere trattate con GABA o con la miscela arricchita di GABA sono quelle causate da batteri, funghi, virus o protozoi. In particolare, l’uso della presente invenzione si riferisce a un insieme di patologie che hanno in comune la eziologia infettiva virale o batterica e che quindi possono essere curate mediante produzione endogena di beta defensina. Costituisce pertanto oggetto della presente invenzione l’uso di GABA o di una biomassa arricchita di GABA per la preparazione di un medicamento per:
- il trattamento di infezioni della pelle come ad esempio tinea pedis, impetigo, verruche, molluscum contagiosum, varicella, infezione genitale da virus herpes, candidosi, herpes zoster, herpes simplex, pustole, dermatite atopica (prevenzione e trattamento delle componenti infettive), ferite, o di herpes simplex virus;
- il trattamento o la prevenzione delle malattie gastrointestinali infiammatorie comprendenti la colite ulcerosa, la sindrome dell’intestino irritabile, la diverticolite acuta;
- il trattamento di raffreddore, influenza;
- il trattamento di riniti, rinorrea piogenica, sinusite;
- il trattamento di periodontiti, stomatiti, carie dentali;
- la prevenzione o il trattamento di gastriti, tumori, sindrome di immunodeficienza acquisita, tripanosomiasi.
Il GABA o la biomassa arricchita in GABA potranno essere formulati in diverse forme quali la forma farmaceutica, cosmetica, alimentare o come integratori e in base alla via di somministrazione più idonea, come ad esempio, sulla pelle o sulla regione labiale, alla cavità nasale e/o faringea, alla cavità orale, per via sistemica o oftalmica.
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:
la figura 1 mostra la cinetica di acidificazione (unità pH) e crescita (Log CFU/ml) (B) e sintesi di GABA (mg/l) (C) durante la fermentazione (30°C per 96 h) di mosto d’uva, diluito a 1% (peso/vol) di carboidrati totali con la miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco (rapporto 1:1), da parte di L. plantarum DSM 19463. I dati sono una media di tre esperimenti indipendenti ± deviazioni standard (n=3) analizzati in duplicato.
Figura 2 mostra l’effetto della concentrazione dei carboidrati (0,3-1,3%, peso/vol) sulla sintesi si GABA (mg/ml) dopo fermentazione (30°C per 72 h) di mosto d’uva, diluito con la miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco (rapporto 1:1), mediante Lactobacillus plantarum DSM19463. I dati sono medie di tre esperimenti indipendenti ± deviazioni standard (n=3) analizzati in duplicato.
Figura 3 mostra la cinetica di acidificazione (unità di pH) (A) e sintesi di GABA (mg/l) (B) durante la fermentazione (30°C per 96h) di mosto d’uva, diluito a 1% (peso/vol) di carboidrati totali con la miscela di acqua distillata ed estratto di lievito fresco (rapporto 1:1), da parte L. plantarum DSM 19463. La densità di cellule iniziale di L. plantarum DSM 19463 era ca Log 10,0 CFU/ml. I dati sono medie di tre esperimenti indipendenti ± deviazioni standard (n=3) analizzati in duplicato.
Figura 4 mostra la produttività (g l<-1>h<-1>) (♦) e la resa [GABA prodotto (mg/l)/L-glutammato consumato (mg/l)] (â– ) di GABA durante la fermentazione (30°C per 72 h) in mosto d’uva, diluito a 1% (peso/vol) di carboidrati totali con la miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco (rapporto 1:1), mediante L. plantarum DSM 19463. I dati sono medie di tre esperimenti indipendenti ± deviazioni standard (n=3) analizzati in duplicato.
Figura 5 mostra l’espressione del gene della HBD-2
<®>umano in SkinEthic Reconstructed Human Epidermis (RHE) determinata mediante RT-PCR usando 89 mg/l (A) o 267 mg/l (B) di GABA contenuto in mosto d’uva fermentato (30°C per 72 h), diluito a 1% (peso/vol) di carboidrati totali con la miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco (rapporto 1:1) mediante L. plantarum DSM 19463. Percentuali di espressione sono state calcolate come dati di Quantificazione Relativa (RQ). I dati sono medie di tre esperimenti indipendenti ± deviazioni standard (n=3).
Esempio 1: Sintesi di una biomassa arricchita di GABA e studio sulla espressione del gene HBD-2 indotta da GABA MATERIALI E METODI
Lactobacillus plantarum DSM19463 à ̈ stato isolato da formaggio, precedentemente identificato e caratterizzato (35). L. plantarum PPV1 appartenente alla Collezione di Colture del Dipartimento di Protezione delle Piante e Microbiologia Applicata dell’Università degli Studi di Bari à ̈ stato usato come ceppo negativo produttore di GABA (35). I ceppi sono stati propagati e coltivati a 30°C per 24 h in MRS (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England). Dopo 24 ore le cellule sono state raccolte per centrifugazione (9000 x g per 15 min a 4°C), lavate due volte con tampone di fosfato di potassio sterile 0,05M, pH 7,0 e risospese in una aliquota di mosto d’uva o latticello diluiti con una densità cellulare di circa Log 9,0 CFU/ml.
Mosto d’uva concentrato (ca. 60% peso/vol di carboidrati totali), senza SO2aggiunta, à ̈ stato diluito alla concentrazione di carboidrati totali di 0,3-1,5% (peso/vol) con acqua distillata o con una miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco (rapporto 1:1), aggiunta di NaOH 1N per portare il pH a 4,5 o a 6,0 e sterilizzazione in autoclave a 120 °C per 15 minuti. Il latticello à ̈ stato fornito da una industria locale di preparazione del formaggio. La principale composizione del latticello era la seguente: lattosio 4,8% (peso/vol), proteine (0,8%, peso/vol), grasso (0,4%, peso/vol) e pH 6,0. Il latticello era trattato a caldo in autoclave a 100°C per 5 minuti e filtrato attraverso un filtro con dimensione dei pori di 0,22 m.
L’estratto di lievito fresco era preparato secondo il seguente protocollo. 60 grammi di lievito per pane commerciale erano sospesi in ca 300 ml di acqua distillata, sterilizzati in autoclave a 120°C per 30 minuti, conservati a 4°C per 12 ore e centrifugati a 6.000 x g per 10 min a 4°C per recuperare il supernatante, principalmente contenente l’estratto citoplasmatico di lievito di panificazione.
Fermentazione
Mosto d’uva diluito o latticello à ̈ stato inoculato con 4% (vol/vol) della sospensione di L. plantarum DSM 19463. La densità di cellule iniziale era ca. Log 7,0 CFU/ml. Ai substrati sono stati aggiunti 20mM (ca 3,38 g/l) di L-glutammato (Sigma Chemical Co. Milano, Italia) e in alcuni casi, 0,1 mM di piridossal fosfato (Sigma Chemical Co.). La fermentazione era permessa a 30 °C per 72-96 ore. Quando L. plantarum DSM19463 era usato a densità cellulare elevata, il numero di cellule iniziale era ca Log 10,0 CFU/ml. Ciascun batch di fermentazione era condotto in triplicato.
Enumerazione di L. plantarum DSM19463 e determinazione di acido gamma ammino butirrico (GABA)
I campioni di mosto d’uva o latticello (10 ml) erano diluiti in 90 ml di soluzione di citrato di sodio. Sono state fatte diluizioni seriali in soluzione di “Ringer quarter strength†(soluzione fisiologica) e le diluizioni sono state piastrate su MRS (Oxoid LTD) a 30 °C per 48 ore. Le cinetiche di crescita sono state determinate e costruite secondo l’equazione di Gompertz come modificata da Zwietering et al. (43): y= k A exp {- exp [(maxo Vmaxe/A)(-t) 1]}; in cui y à ̈ la crescita espressa come log CFU ml<-1>min<-1>al tempo t; k à ̈ il livello iniziale della variabile dipendente da costruire (log CFU/ml); A à ̈ la differenza nella densità cellulare tra inoculo e fase stazionaria; maxà ̈ la velocità massima specifica di crescita espressa come log CFU ml<-1>h<-1>; à ̈ la lunghezza della fase ritardo espressa in ore; e t à ̈ il tempo. I dati sperimentali sono stati elaborati mediante la procedura di regressione lineare del programma di statistica per Windows (Statsoft, Tulsa, Oklahoma, USA).
Le concentrazioni di GABA e L-glutammato sono state analizzate mediante Analizzatore di Amminoacidi serie Biochrom 30 (Biochrom Ltd., Cambridge Science park, England) con una colonna a scambio cationico Na (20 per 0,46 cm di diametro interno). Una miscela di amminoacidi a concentrazione nota (Sigma Chemical Co) alla quale sono stati aggiunti acido cisteico, metionina sulfossido, metionina sulfone, triptofano, ornitina, L-glutammato e GABA à ̈ stata usata come standard. Le proteine e i peptidi nei campioni sono stati precipitati per addizione del 5% (vol/vol) di acido sulfosalicilico solido freddo, mentenuto a 4°C per 1 ora e centrifugando a 15.000 x g per 15 min. Il supernatante à ̈ stato filtrato attraverso un filtro con grandezza dei pori 0,22 Î1⁄4m e diluito, quando necessario, con tampone di sodio citrato (0,2 M, pH 2,2). Gli amminoacidi sono stati derivatizzati post colonna con reagente ninidrina e rilevati mediante assorbanza a 570nm.
Produttività e resa di GABA
La produttività e la resa di GABA sono state calcolate mediante le seguenti equazioni:
produttività (mg 1<-1>h<-1>) = [GABA prodotto per volume di mosto d’uva (mg/l) per tempo di fermentazione (ore)]; resa = GABA prodotto (mg/I)/L-glutammato consumato (mg/l)
Caratterizzazione del mosto d’uva fermentato
La concentrazione dei carboidrati totali (glucosio e fruttosio) à ̈ stata determinata mediante metodi enzimatici (DHIFFCHAMB Italia Srl, Italia). La concentrazione di Cu++, Zn++ e Mg++ liberi à ̈ stata determinata nel laboratiro Redox SNC, Monza, Italia secondo il metodo del Inductively Coupled Plasma (I.C.P.) mediante assorbimento atomico (IRIS Intrepid, Thermo Elementhal, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e fiamma ad aria/acetilene.
La niacina à ̈ stata determinata mediante analisi HPLC come descritto da Ward e Trenerry (40). La analisi à ̈ stata condotta con pompa 600E HPLC, modello 700 WISP e un apparato rilevatore fotodiodo 996 usando una cartuccia da 4 mm C8 NOVAPAK Radial-PAK (8-100 mm) equipaggiata con una precolonna C18 (Waters Corporation, Milford, MA, USA). La fase mobile consisteva in 15% di metanolo, 85% miscela acquosa deionizzata contenente Reagente PIC A 0,005M. La velocità di flusso dell’eluente era 1,5 ml/min, L’acido nicotinico era rilevato a 254 nm. Le aree dei picchi ottenuti da un sistema di dati Waters Millennium sono state usate per il calcolo.
I polifenoli sono stati determinati spettrofotometricamente mediante lettura dell’assorbanza a 750nm (metodo Folin-Ciocalteau) e usando acido gallico come standard (36).
Modello di epidermide ricostruita
RHE (Reconstructed Human Epidermis, SkinEthic®) consiste di una coltura di cheratinociti dell’epidermide umana normale coltivati per formare un multi strato, modello ben differenziato di epidermide umana in vitro. Il modello di epidermide usato à ̈ costituito interamente di colture di epidermide umana differenziata ricostruita tridimensionalmente cresciuta su una interfaccia aria liquido per 17 giorni (superficie 0,63 cm<2>; origini biologiche: prepuzio; età donatori: 1-4 anni o addome; età dei donatori: adulta). Il modello à ̈ prodotto in inserti di filtro di policarbonato in un mezzo chimicamente definito libero da siero (28, 29). Gli inserti contenenti SkinEthic<®>RHE sono stati immersi in una soluzione nutriente contenente gel di agarosio e posti in piastre multi pozzetto a temperatura ambiente. I mezzi di mantenimento e di crescita sono stati raffreddati con gel refrigerante durante il trasporto. Ciascun batch epidermico à ̈ stato controllato dal produttore (SkinEthic Laboratories, Nice, France).
Le informazioni sulla istologia (colorazione alla ematossilina-eosina) e sulla vitalità dei tessuti (MTT-test) sono state fornite per ciascun batch come controllo di qualità standard.
Dopo fermentazione, il mosto d’uva à ̈ stato liofilizzato o sottoposto a centrifugazione (9.000 x g per 15 min a 4°C), filtrato attraverso un filtro con dimensione dei fori di 0,22 Î1⁄4m per rimuovere le cellule microbiche e liofilizzato. Le preparazioni liofilizzate sono state disciolte in acqua distillata per raggiungere concentrazioni di GABA di 89 (0,86 mM) o 267 mg/l (2,59 mM) e 50 Î1⁄4l di queste soluzioni sono stati aggiunti alla superficie di RHE. L’incubazione a 37 °C à ̈ stata condotta per 24 ore; dopo 24 ore sono stati eseguiti lavaggi con soluzione salina (0,9% peso/vol) e ulteriore incubazione per 24 ore per stressare la risposta del tessuto; e per 48 e 72 ore. RHE trattata solo con soluzione salina à ̈ stata usata come controllo. Dopo trattamento, RHE à ̈ stata lavata con soluzione salina e il tessuto à ̈ stato conservato in azoto liquido per l’ulteriore estrazione di RNA.
Regolazione trascrizionale di Beta-defensina-2 umana (HBD-2)
RNA Ã ̈ stato estratto con kit RNAqueous secondo il protocollo del produttore (Applied Biosystems, Monza, Italia). Il cDNA Ã ̈ stato sintetizzato da 2 Î1⁄4g di templato di RNA in un volume di reazione pari a 20 Î1⁄4l usando il Kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). 10 microlitri di RNA totale sono stati aggiunti a Master Mix e sottoposti a trascrizione inversa in un termal cycler (Applied Biosystems ABI PRISM 7500 Real Time PCR System) sotto le seguenti condizioni: 25°C per 10 min, 37 °C per 60 min, e 85°C per 5 s. RT-PCR Ã ̈ stata condotta usando il saggio TaqMan<®>. Il cDNA Ã ̈ stato amplificato usando TaqMAn Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e il saggio di espressione genica TaqMan, contenente HBD-2 (sonda Taqman DEFB4) e GAPDH umano, come gene housekeeping. Amplificazioni PCR sono state condotte usando 25ng di cDNA in un volume totale di 25 Î1⁄4l. In particolare, la miscela di reazione conteneva 12,5 Î1⁄4l di 2X TaqMan Universal PCR Master Mix, 1,25 Î1⁄4l di saggio di espressione genica 20X TaqMan, 6,25 Î1⁄4l di acqua e 5 Î1⁄4l di cDNA. Le condizioni di PCR erano 95°C per 10 min seguiti da 40 cicli di amplificazione (95°C per 15 s; 60°C per 1 min). Le analisi sono state condotte in triplicato. Le percentuali di espressione sono state calcolate come dati di Quantificatione relativa (RQ) con variazioni considerate significative quando RQ era diminuito o aumentato di due volte rispetto al controllo.
Risultati
Selezione del substrato
Preliminarmente, il mosto d’uva diluito a 1 % (peso/vol) dei carboidrati totali con acqua distillata, pH 6.0 e il latticello, pH 6.0, sono stati usati come substrati per la crescita di L. plantarum DSM 19463. Dopo 43 ore a 30°C, la densità era Log 8.1±0,2 e 8,5±0,3 CFU/ml per cellule cresciute in mosto d’uva e latticello, rispettivamente. Quando il mosto d’uva veniva diluito con la miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco (rapporto 1:1), la densità cellulare di L. plantarum DSM 19463 aumentava a 9,4±0,2 CFU/ml. L’addizione di estratto di lievito (0,5-1,0 peso/vol) a latticello non aumentava la resa delle cellule rispetto al latticello da solo. Durante la crescita nel mosto d’uva diluito con acqua distillata e estratto di lievito fresco, e latticello, la sintesi di GABA era ca. 90 (ca 0,89 mM) e 10 (ca 0,11 mM) mg/l, rispettivamente. Sulla base di questi risultati, il mosto d’uva à ̈ stato scelto come il substrato per i saggi successivi.
Ottimizzazione della sintesi di GABA
Al mosto d’uva, diluito a 1% (peso/vol) di carboidrati totali con miscela di acqua distillata e estratto di lievito fresco, à ̈ stato aggiunto L-glutammato 20mM e la fermentazione à ̈ avvenuta a 30°C per 96 ore. La acidificazione del mezzo à ̈ stata completata durante 24 di fermentazione raggiungendo il valore costante di pH 3,72 (Fig. 1A). La fase stazionaria di crescita à ̈ stata raggiunta dopo 24-30 ore di fermentazione ottenendo una densità delle cellule finale di log 9,4 CFU/ml (Fig. 1B). I dati nelle 48 ore sono stati riportati secondo l’equazione di Gompertz. I valori di A, Î1⁄4maxe λ erano Log 9,35 CFU/ml, Log 0,25 CFU ml<-1>h<-1>e 1,55 h, rispettivamente. Dopo 48 h di fermentazione, la vitalità delle cellule di L. plantarum DSM19463 diminuiva leggermente e raggiungeva Log 8,83±0,2CFU/ml a 96h. La sintesi di GABA mediante L. plantarum DSM19463 aumentava progressivamente fino a quando si raggiungevano 72 h di fermentazione (Fig. 1C). In quel momento, c’erano circa 500mg/l (ca 4,83 mM).
L’addizione di piridossal fosfato 0,1 mM al mosto d’uva diluito, come cofattore per l’attività della glutammato decarbossilasi (GAD), non modificava la sintesi di GABA. Quando il valore iniziale di pH era 4,5, la sintesi di GABA a 72 h diminuiva a ca 40mg/l (ca 0,39 mM). Questo valore di pH inoltre aveva un effetto negativo sulla resa cellulare che diminuiva a Log 8,03 ± 0,1 CFU/ml. L’aumento della temperatura di fermentazione a 37°C non modificava la sintesi di GABA. L’effetto della concentrazione dei carboidrati totali sulla sintesi di GABA à ̈ mostrato in Fig. 2. La produzione di GABA da parte di L. plantarum DSM19463 aumentava progressivamente da ca 380 mg/l (ca 3,65 mM) (0,3% peso/vol) a ca 500 mg/l (ca 4,83 mM) quando veniva usato all’1% (peso/vol)di carboidrati totali.
Nel mezzo non à ̈ stato trovato glucosio né fruttosio dopo 72 ore di fermentazione. Aumenti ulteriori di concentrazione di carboidrati totali non influenzano la sintesi di GABA. Quando la densità cellulare iniziale di L. plantarum DSM19463 era aumentata a ca Log 10,0 CFU/ml, la concentrazione di GABA diminuiva. La acidificazione del mezzo era completata durante 12 h di fermentazione raggiungendo il valore di pH 3,73 (Fig. 3A) e la concentrazione di GABA non superava ca 270 mg/l (ca 2,66mM) (Fig. 3B).
La produzione e la resa di GABA erano determinate sotto condizioni ottimali: 72 h di fermentazione a 30°C, pH 6,0 iniziale, mosto d’uva diluito a 1% (peso/vol) e aggiunta di L-glutammato 20mM e densità cellulare iniziale di ca Log 7,0 CFU/ml. Il valore medio di produttività di GABA era ca 6,1 mg l<-1>h<-1>(ca 0,06 mM/h) (fig. 4). La produttività più alta à ̈ stata trovata a 72 h di fermentazione (ca 18 mg l<-1>h<-1>, corrispondente a ca 0,17 mM/h). Secondo la Fig. 1C, la produttività si fermava a 72h. La resa di GABA, calcolata rispetto al consumo di L-glutammato, aumentava progressivamente fino a raggiungere 72 h di fermentazione (massimo valore di 0,204). Dopo 72h, sono stati trovati ca 4,77 mM (ca 0,7 g/l) di L-glutammato residuo nel mosto d’uva fermentato. La percentuale di conversione di L-glutammato era ca 76%. Tuttavia, l’addizione di L-glutammato in quantità minore di 20mM sembrava influenzare negativamente la concentrazione totale e la produttività di GABA.
Prima dell’uso di SkinEthic<®>Reconstructed Human Epidermis (RHE), il mosto d’uva fermentato era sottoposto a liofilizzazione. Questa preparazione conteneva principalmente ca 8,9 g/kg di GABA e ca Log 10,0 CFU/g di cellule vitali di L. plantarum DSM19463. La tabella 1 mostra la concentrazione di GABA (g/kg), niacina e minerali (mg/kg), polifenoli totali (g/kg) e cellule vitali di L. plantarum DSM19463 (Log CFU/g) in mosto d’uva fermentato e liofilizzato.
Tabella 1
Composto/batteri Concentrazione/numero di lattici cellule
GABA 8.9 ± 0.18 g/kg
Niacina 258 ± 2.87 mg/kg
Zn++ 281 ± 3.11 mg/kg
Cu++ 11.1 ± 0.16 mg/kg
Mg++ 1550 ± 17.9 mg/kg
Polifenoli totali 20.9 ± 0.34 g/kg
L. plantarum DSM19463 Log 10 ± 0.3 CFU/g
I dati sono medie di tre esperimenti indipendenti ± deviazioni standard (n=3) analizzati in duplicato.
Grazie all’uso del mosto d’uva come substrato, sono stati trovati vari livelli di altri composti come la niacina, Cu++, Zn++ e Mg++ liberi e polifenoli totali (tabella 1).
Regolazione trascrizionale di beta defensina 2 umana (HBD-2)
Preliminarmente, il mosto d’uva fermentato e liofilizzato à ̈ stato saggiato per la tossicità verso RHE alle concentrazioni di GABA di 89 o 267 mg/l. Dopo esposizione acuta per 24, 48 e 72 h, gli effetti citotossici verso le cellule vitali sono stati esclusi utilizzando il test di vitalità MTT o la valutazione isto-morfologica (dati non mostrati).
La regolazione trascrizionale di HBD-2 à ̈ stata determinata usando RT-PCR, e il gene GAPDH à ̈ stato usato come controllo endogeno per normalizzare la variabilità durante il saggio. La soluzione salina usata come controllo non causava variazioni del livello di espressione del gene HBD-2. L’espressione del gene HBD-2 in RHE a seguito di aggiunta di mosto fermentato e liofilizzato (concentrazioni di GABA di 89 o 267 mg/l) à ̈ mostrata in Fig. 5A e B. Rispetto al controllo, à ̈ stata trovata una iniziale sopra-regolazione significativa (P<0,05) del gene HBD-2 dopo 24 h dall’esposizione acuta. RHE trattata con mosto d’uva fermentato e liofilizzato corrispondente a 89mg/l di GABA mostrava la più alta espressione del gene HBD-2 dopo 24 h di trattamento seguito da lavaggio con soluzione salina e ulteriore incubazione di 24 h (RQ ca 6) (Fig. 5A). La sopra-regolazione del gene HBD-2 à ̈ stata confermata con l’addizione di mosto d’uva fermentato e liofilizzato corrispondente a 267 mg/l di GABA (Fig. 5B). Sotto queste condizioni, l’espressione del gene HBD-2 raggiungeva il valore RQ di ca 20 dopo 72 h di trattamento acuto. Il mosto d’uva diluito fermentato con L. plantarum PPV1 (ceppo produttore GABA negativo) a pH ca 3,61 à ̈ stato liofilizzato e usato per l’analisi trascrizionale HBD-2. Eccetto che per l’assenza di GABA, questa preparazione aveva quasi la stessa composizione chimica e microbica di quella riportata in Tabella 1.
Il trattamento di RHE non mostrava variazione dei livelli di espressione del gene HBD-2. Al contrario, il trattamento di RHE con il sopranatante della coltura di L. plantarum DSM19463 aveva quasi lo stesso effetto di quello riportato in fig. 5.
DISCUSSIONE
Mosto d’uva diluito à ̈ stato usato come substrato per la sintesi di GABA da parte di L. plantarum DSM19463, previamente isolato da varietà di formaggio Italiano (35).Il surplus di vino à ̈ stato stimato in ca. 3,32 10<6>tonnellate (http://www.fao.org/). Pertanto, l’uso alternativo di mosto d’uva come substrato per la conversione biotecnologica ha costi molto limitati e a causa della sua composizione chimica può meritare interessanti prospettive nutrizionali per le applicazioni industriali. Sotto condizioni ottimali, la sintesi di GABA in mosto d’uva diluito da parte di L. plantarum DSM19463 era ca 500 mg/l (ca 4,83 mM). Mosto d’uva fermentato e liofilizzato conteneva ca 8,9 g/kg di GABA. Grazie all’uso di mosto d’uva diluito come substrato, la preparazione conteneva anche vitamina, minerali e polifenoli. Inoltre, un numero elevato di cellule di L. plantarum DSM19463 rimaneva vitale. Previamente, à ̈ stato mostrato che la sintesi di GABA da parte L. plantarum DSM19463 (precedentemente denominato L. plantarum C48) avveniva anche in condizioni gastrointestinali simulate (35).
Altri batteri lattici sono stati impiegati per sintetizzare GABA. La maggior parte dei processi di fermentazione sono stati condotti in mezzo di coltura, e quando sono stati usati altri substrati la sintesi di GABA à ̈ stata minore rispetto a quanto rilevato in questo studio. L. paracasei (16), L. brevis (12) e Lc. Lactis subsp. Lactis (20) sono stati fatti crescere in mezzo di coltura e il GABA sintetizzato alle concentrazioni di 6180 (in presenza di L-glutammato 100 mM), 5090 (L-glutammato 100 mM) e 69,6 Î1⁄4g/ml in assenza di L-glutammato, rispettivamente. L. paracasei NFRI 7415, isolato da funa–zushi, à ̈ stato usato per la produzione di GABA nel brodo MRS e durante la preparazione di una bevanda fermentata fatta di crusca di riso e latte bovino (17). La concentrazione di GABA nella bevanda era ca 1 g/kg di sostanza secca. Durante la fermentazione RSM a 30°C per 24 ore, i batteri lattici isolati da formaggio sintetizzavano concentrazioni di GABA (99,9-15 mg/l) (35) più alte rispetto a quelle trovate per altri starter per formaggio nel latte scremato (20) e Bifidobacterium longum (26). Lactobacillus buchneri à ̈ stato coltivato in MRS e ha prodotto GABA alla concentrazione di 251 mM con una percentuale di conversione in GABA del 94% (2). Complessivamente, l’attività GAD di Escherichia coli era probabilmente quella maggiormente caratterizzata. Questa à ̈ stata inoltre indotta da L-glutammato e la produzione media di GABA era ca 10 mg/l (7).
Le condizioni ottimali per sintetizzare GABA variavano in modo dipendente dal ceppo di batteri lattici. Complessivamente, il pH à ̈ il parametro intrinseco di fermentazione con l’effetto più pronunciato. La produzione di GABA da L. paracasei NFRI 7415 in MRS dipendeva dalla regolazione del pH del mezzo di coltura a pH 5,0 (16). L’attività GAD in L. paracasei mostrava un profilo di pH da 4,5 a 5,5, ma era relativamente alto a pH 4,0 (18). Il pH iniziale di 5,0 era anche ottimale per la crescita di L. buchneri in MRS (2). Gli estratti cellulari di colture di starter di formaggio mostravano attività GAD ottimale a pH 4,7. Durante la preparazione del formaggio, GABA aumentava in modo lineare man mano che il pH del formaggio decresceva (20). Sotto le condizioni ottimali di questo studio, il valore iniziale del pH era fissato a 6,0 e diminuiva progressivamente al valore sotto 4,0. A 72 ore, la produttività più alta di L. plantarum DSM19463 à ̈ stata trovata in corrispondenza di pH 3,72. Complessivamente à ̈ stato trovato che ceppi ad alta produzione di GABA (ad esempio L. paracasei e L. brevis) mostravano elevata attività GAD sotto pH 4,0 (39). Al contrario, sono stati trovati bassi livelli di attività GAD per ceppi a bassa produzione di GABA (ad esempio L. lactis subsp. Lactis) a pH sotto 4,0 (20). Questi risultati suggerivano che concentrazioni alte di GABA possono essere importanti per i batteri lattici che mostravano marcata resistenza agli acidi (8, 32, 31).
Grazie alla composizione chimica e ricchezza di batteri latici vitali, il mosto d’uva diluito arricchito di GABA presenta un interesse notevole come cibo funzionale. Sono in corso studi in vivo per valutare le diverse funzioni fisiologiche (ad esempio ACE-inibizione). In vista di una nuova applicazione per prodotti cosmetici, la preparazione di GABA à ̈ stata liofilizzata e saggiata su RHE. Quest’ultimo à ̈ istologicamente simile alla epidermide umana in vivo e mostra una barriera funzionale di permeabilità che rappresenta una delle funzioni principali della pelle vitale. Il Centro Europeo per la Validazione di metodi Alternativi (ECVM) ha considerato il modello RHE come riproducibile, sia all’interno sia tra laboratori e nel tempo (15). Seguendo un approccio simile a quello di questo studio, RHE à ̈ stato recentemente usato per analizzare la regolazione dell’espressione del gene HBD-2 in risposta a lipopolisaccaridi microbici (LPS) (1). Come organo barriera, la pelle umana à ̈ sempre in contatto con l’ambiente ed à ̈ rivestita da microbioti caratteristici (19). Microrganismi residenti sono presenti in modo piuttosto stabile e inaspettato in numero basso. Questo fenomeno può essere spiegato dalla particolare strategia che la pelle ha sviluppato per proteggere dalle infezioni. Gli elementi importanti di questa strategia sono la barriera fisica intatta, consistente nello strato corneo della pelle e muco delle mucosa, e la fagocitosi dei microrganismi invadenti. Inoltre, i composti sintetizzati nelle parti principali della pelle possono inoltre controllare la crescita dei microrganismi (34). HBD-2 à ̈ un peptide antimicrobico a basso peso molecolare cationico ricco di cisteina scoperto nelle lesioni della pelle dovute a psoriasi (11). Si può quindi pensare che HBD-2 sia un componente dinamico del sistema di difesa epiteliale locale della pelle. Le cellule epiteliali dei tessuti sani esprimono il gene HBD-2 a bassi livelli. Tuttavia, il gene à ̈ fortemente sopra regolato a seguito del trattamento di cellule epiteliali colturali con citochine proinfiammatorie (ad esempio TNF- e IL-1), LOS batterico, batteri e lieviti o mediatori chimici della infiammazione della pelle (ad esempio esteri del forbolo) (4, 37). Per prima cosa, questo studio ha mostrato che l’espressione del gene HBD-2, misurata mediante RT-PCR, era marcatamente indotta da GABA. L’induzione di HBD-2 da composti chimici esogeni e non correlati all’infiammazione possono aprire la via a strategie completamente nuove per la terapia antimicrobica in cosmetica e in campo medico. E’ ragionevole pensare che GABA può indurre la produzione locale di HBD-2. Tale sistema può prevenire le infezioni batteriche e fungine assumendo un ruolo protettivo.
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Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Uso di acido γ-ammino butirrico o di una biomassa arricchita in acido γ-ammino butirrico per la preparazione di un medicamento per la prevenzione e/o il trattamento delle infezioni.
- 2. Uso secondo la rivendicazione 1, in cui la biomassa arricchita in acido γ-ammino butirrico à ̈ ottenibile per fermentazione ad opera di Lactobacillus plantarum DSM 19463 o Lactococcus lactis ssp. DSM 19464 su substrato scelto tra mosto d’uva o latticello.
- 3. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui il substrato à ̈ addizionato con L-glutammato monosodico.
- 4. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui il mosto d’uva à ̈ diluito con acqua di lievito o addizionato con estratto di lievito.
- 5. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui il mosto d’uva à ̈ diluito con acqua di lievito e acqua distillata 50:50 e disacidificato mediante NaOH 1 N ad un valore di pH da 6,0 a 6,5, preferibilmente 6,0.
- 6. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui il latticello à ̈ addizionato con estratto di lievito (ca. 0,5%).
- 7. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui il mosto d’uva o il latticello sono addizionati di piridossale 5-fosfato.
- 8. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui la biomassa comprende almeno 890 mg di acido γammino butirrico per 100 g di sostanza secca.
- 9. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui la biomassa comprende ulteriormente vitamine, minerali, polifenoli e batteri lattici vivi e vitali.
- 10. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni 1-8, in cui la biomassa dopo la fermentazione viene sottoposta a inattivazione termica e successivo essiccamento o liofilizzazione.
- 11. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui l’acido γ-ammino butirrico à ̈ estratto dalla biomassa come definita in ognuna delle rivendicazioni da 2 a 10.
- 12. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui le infezioni sono causate da batteri, funghi, virus o protozoi.
- 13. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti in cui le infezioni sono infezioni della pelle su base immune o infiammatoria, o degli occhi.
- 14. Uso secondo la rivendicazione 13, in cui le infezioni della pelle sono tinea pedis, impetigo, verruche, molluscum contagiosum, varicella, infezione genitale da virus herpes, candidosi, herpes zoster, herpes simplex, pustole, dermatite atopica o ferite.
- 15. Uso secondo la rivendicazione 13, in cui le infezioni degli occhi sono congiuntiviti virali, o batteriche o hordeolum e il medicamento à ̈ formulato in una forma per la somministrazione sugli occhi.
- 16. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, per il trattamento o la prevenzione delle malattie gastrointestinali infiammatorie.
- 17. Uso secondo la rivendicazione 16, in cui le malattie gastrointestinali infiammatorie sono scelte tra la colite ulcerosa, la sindrome dell’intestino irritabile o la diverticolite acuta.
- 18. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, per il trattamento di raffreddore, influenza.
- 19. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, per il trattamento di riniti, rinorrea piogenica, sinusite.
- 20. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, per il trattamento di periodontiti, stomatiti, carie dentali.
- 21. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, per prevenire o trattare gastriti, tumori, sindrome di immunodeficienza acquisita, tripanosomiasi.
- 22. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui l’acido γ-ammino butirrico o la biomassa arricchita in acido γ-ammino butirrico sono formulati come composizione farmaceutica o cosmetica, alimento o integratore.
- 23. Uso secondo ognuna delle rivendicazioni precedenti, in cui le formulazioni sono adatte alla somministrazione topica quale quella oftalmica, sulla pelle o sulla regione labiale, nella cavità nasale e/o faringea, nella cavità orale, oppure alla somministrazione per via sistemica enterale o parenterale.
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| ITRM2008A000519A IT1391023B1 (it) | 2008-10-01 | 2008-10-01 | Uso di acido gamma-ammino butirrico (gaba) o di una biomassa arricchita di acido gamma-ammino butirrico (gaba) per la prevenzione e/o il trattamento di infezioni. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1391023B1 (it) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19712977A1 (de) * | 1997-03-27 | 1998-10-01 | Laves Arzneimittel Gmbh | Verwendung von y-Aminobuttersäure als Antidiarrhoicum |
| WO1999004784A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Cultor Corporation | A prophylactic |
| JP2004313032A (ja) * | 2003-04-14 | 2004-11-11 | Sadaji Yokoyama | 機能性素材の製法 |
| WO2008023662A1 (fr) * | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Sapporo Breweries Limited | Souche bactérienne possédant une activité immunostimulante, et boisson, aliment et agent immunostimulant comprenant la souche bactérienne |
| WO2008023665A1 (fr) * | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Sapporo Breweries Limited | Souche bactérienne possédant une activité anti-allergique et immunostimulante, et boisson, aliment, agent anti-allergique et agent immunostimulant comprenant la souche bactérienne |
| WO2009011008A1 (en) * | 2007-07-17 | 2009-01-22 | Giuliani S.P.A. | Process for the preparation of gamma-ami no butyric acid (gaba) by the use of lactic acid bacteria (lab) on agro- and food-industry surplus |
-
2008
- 2008-10-01 IT ITRM2008A000519A patent/IT1391023B1/it active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19712977A1 (de) * | 1997-03-27 | 1998-10-01 | Laves Arzneimittel Gmbh | Verwendung von y-Aminobuttersäure als Antidiarrhoicum |
| WO1999004784A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | Cultor Corporation | A prophylactic |
| JP2004313032A (ja) * | 2003-04-14 | 2004-11-11 | Sadaji Yokoyama | 機能性素材の製法 |
| WO2008023662A1 (fr) * | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Sapporo Breweries Limited | Souche bactérienne possédant une activité immunostimulante, et boisson, aliment et agent immunostimulant comprenant la souche bactérienne |
| WO2008023665A1 (fr) * | 2006-08-21 | 2008-02-28 | Sapporo Breweries Limited | Souche bactérienne possédant une activité anti-allergique et immunostimulante, et boisson, aliment, agent anti-allergique et agent immunostimulant comprenant la souche bactérienne |
| WO2009011008A1 (en) * | 2007-07-17 | 2009-01-22 | Giuliani S.P.A. | Process for the preparation of gamma-ami no butyric acid (gaba) by the use of lactic acid bacteria (lab) on agro- and food-industry surplus |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| TSUCHIYA Y ET AL: "EFFECTS OF OMEGA AMINO-ACIDS AND RELATED COMPOUNDS ON STAPHYLOCOCCAL INFECTIONS IN MICE A COMBINED PROPHYLACTIC THERAPEUTIC PROCEDURE", APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 19, no. 5, 1970, pages 813 - 817, XP002529952, ISSN: 0003-6919 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1391023B1 (it) | 2011-10-27 |
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