ITPD970183A1

ITPD970183A1 - Metodo per la determinazione della concentrazione di un analita median te l'utilizzo di un bioelemento e dispositivo operante secondo tale

Info

Publication number: ITPD970183A1
Authority: IT
Inventors: Maria Scarpa
Original assignee: Nika Srl
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1997-08-08
Publication date: 1999-02-08
Also published as: EP1027602B1; IT1294642B1; DE69832090D1; AU8646398A; EP1027602A1; WO1999008106A1; DE69832090T2; ES2251776T3

Description

Metodo per la determinazione della concentrazione di un analita mediante l'utilizzo di un bioelemento e dispositivo operante secondo tale metodo"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la determinazione della concentrazione di un analita mediante l'utilizzo di un bioelemento secondo il preambolo della rivendicazione principale.

L’invenzione riguarda altresì un dispositivo per la determinazione della concentrazione di un analita secondo il metodo di questa invenzione.

Metodi per la determinazione della concentrazione di un composto, di seguito indicato come analita, rivestono particolare interesse nel settore bio-medico, industriale, ambientale ed agro-alimentare. Questi metodi prevedono l’impiego di biomolecole, quali ad esempio enzimi, anticorpi, cellule o simili, capaci di interagire in modo specifico con l'analita di cui si vuole determinare la concentrazione.

L'interazione, sia essa di tipo chimico, chimico-fisico o fisico, è tale da determinare una variazione delle caratteristiche del sistema analita-bioelemento che può essere opportunamente trasformata in un segnale, ad esempio di tipo elettrico, correiabile con la concentrazione deil'analita. In questi metodi è previsto l'impiego di trasduttori destinati a rilevare le suddette variazioni ed a trasformare le medesime in segnali normalmente di tipo elettrico (con trasduttori di tipo amperometrico, potenziometrico, conduttometrico, piezoelettrico, ottico, termico, etc.) che possono essere opportunamente amplificati, processati, nonché visualizzati e/o registrati.

Tra i metodi noti che prevedono l'impiego di sistemi analita-bioelemento (altrimenti denominati bio-sensori) sono indicati quelli descritti dalle pubblicazioni seguenti:

- J. Mor, R. Guarnaccia (1977) Analytical Biochemistrv Z£, 319-328;

- D. Francis, H. Hill, W. Aston, W. Higgins, E. Plotkin, E. Scott, A. Tumer (1984) Analvtical Chemistrv ≤g, 667-671 ;

- M. Arnold, S. Glazier (1984) Biotech.Letters 6, 313 - 328;

- A. Turner, I. Karube, G. Wilson editors (1989) "Biosensors. Fundamentals and applications" Oxford University Press, 1-700;

- T. Ruzgas, J. Emneus, L. Gorton, G. Marko-Varga (1995) Analvtica Chimica Acta 311, 245 - 253.

In accordo con i metodi noti, la determinazione della concentrazione dell'analita è in genere basata sulla misura della velocità di interazione analita-bioelemento ovvero sulla velocità di trasporto dell'analita al bioelemento. Tali velocità dipendono da fattori quali l'attività del bioelemento, la temperatura, la viscosità ed il pH nonché la natura e le caratteristiche fisiche della matrice che immobilizza il bioelemento. Ciò impone per ogni misura di concentrazione dell'analita o gruppo di misure, la realizzazione di una curva di calibrazione die correli il segnale generato dal trasduttore alla concentrazione dell'analita. L'impiego di questi metodi analitici quindi, pur comportando complessivamente costi spesso inferiori a quelli delle strumentazioni analitiche tradizionali, è tuttavia limitato dalla instabilità del bioelemento, dal suo costo nonché dalla necessità di richiedere accurate calibrazioni.

Il problema alla base della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un metodo ed un dispositivo per la determinazione della concentrazione di un analita con impiego di un bioelemento mediante i quali siano superati tutti gli inconvenienti lamentati con riferimento alla tecnica nota citata.

Questo problema è risolto dall'invenzione mediante un metodo ed un dispositivo per la determinazione della concentrazione di un analita mediante l'impiego di un bioelemento in accordo con le rivendicazioni che seguono.

Le caratteristiche ed i vantaggi dell'invenzione meglio risulteranno dalla descrizione dettagliata che segue di un suo preferito esempio di attuazione illustrato, a titolo indicativo e non limitativo, con riferimento agli uniti disegni in cui:

- la figura 1 è una vista schematica in pianta dall'alto di un dispositivo realizzato secondo l'invenzione,

- la figura 2 è una vista in sezione secondo la linea IMI di figura 1.

Con riferimento alle suddette figure, con 1 è complessivamente indicato un dispositivo per la determinazione della concentrazione di un analita mediante impiego di un bioelemento secondo la presente invenzione,

II dispositivo 1 comprende una camera 2 destinata a contenere il campione in cui è presente l'analita di cui si vuole determinare la concentrazione. La camera 2 è definita da una prima e da una seconda superficie contrapposte, rispettivamente indicate con 3 e 4 e da una ulteriore superficie laterale 5.

Nella superficie 4 sono ricavate aperture che mettono in comunicazione la camera 2 con un primo ed un secondo condotto 6,7 capillari, rispettivamente di ingresso e di uscita dalla camera 2 dei campione contenente l'analita da analizzare.

La camera 2 è realizzata mediante sovrapposizione di due elementi lastriformi definenti le superfici 3 e 4 con l'interposizione tra di essi dì una guarnizione a pellicola 8 il cui spessore, indicato con H in figura 2, definisce la distanza tra le superfici 3 e 4 anzidette. Nella guarnizione 8 è ricavata una apertura delimitante la superficie laterale 5 della camera e di conformazione in pianta allungata nella direzione delle luci di ingresso ed uscita della camera, come illustrato in figura 1 dove con D è indicata la misura dell'ampiezza della camera lungo la direzione di allungamento della medesima.

Lo spessore H della camera 2, pari alla distanza fra le superfici 3 e 4, è scelto di valore uguale o inferiore a 500 micrometri e convenientemente comprese micrometri.

il rapporto tra l'ampiezza D e lo spessore H (distanza tra le superfici 3 e 4) della camera 2 è preferibilmente compreso tra 50 e 500.

La superficie 4 è preferibilmente definita dalla superficie attiva di un trasduttore 9, solo schematicamente rappresentato in figura 1 , capace di rilevare le variazioni chimiche, chimico-fisiche o fisiche dovute all'interazione dell'analita con un prescelto bioelemento introdotto nella camera 2 e trasformare dette variazioni in una grandezza fisica misurabile e correlata con la concentrazione dell'analita da determinare, come meglio verrà chiarito nel seguito della descrizione. In funzione della grandezza fisica da rilevare il trasduttore può essere di tipo elettrochimico (amperometrico, potenziometrico, conduttometrico), ottico, piezoelettrico, termico o altro. E' previsto che la superficie 4 possa essere anche trasparente al segnale utilizzato per la misura dell'interazione bioelemento-analita per permettere la rilevazione con un trasduttore esterno.

Sulla superficie 3 contrapposta al trasduttore 9 è predisposto il bioelemento prescelto per interagire con l'analita. Il bioelemento può essere immobilizzato sulla superficie 3 chimicamente e/o fisicamente. In alternativa il bioelemento può essere introdotto nella camera 2 direttamente con il campione contenente l'analita da analizzare. In ulteriore alternativa il bioelemento può essere immobilizzato sulla stessa superficie del trasduttore ovvero le due superfici fanno parte dello stesso trasduttore.

L'elemento lastriforme definente la superficie 3 sulla quale può essere immobilizzato il bioelemento è intercambiabilmente associato al dispositivo 1 e può essere ad esempio realizzato in forma di una lastra di vetro.

La determinazione della concentrazione dell'analita presente nel campione avviene nel modo seguente. Innanzitutto il campione contenente l'analita da s 1 a cui eventualmente è aggiunto un tampone, un mediatore e/o altra sostanza capaci di facilitare l'interazione con il trasduttore 9, viene introdotto nella camera 2 attraverso il condotto di ingresso 6, per capillarità o per semplice iniezione. L'interazione dell'analita con il bioelemento, che può essere predisposto sulla superficie 3 o introdotto direttamente con il campione nella camera 2, determina una variazione delle caratteristiche chimiche, chimico-fisiche e/o fisiche de! sistema analita-bioelemento.

Almeno una di tali caratteristiche varia nel tempo dall'istante iniziale dell'interazione analita-bioelemento sino ad un istante finale in cui tutto l'analita ha interagito con il bioelemento. Le caratteristiche del sistema analita-bioelemento sono rilevate e trasformate dal trasduttore 9 in un segnale variabile nell'intervallo di tempo compreso tra gli istanti iniziale e finale anzidetti in funzione dell'attività del bioelemento e tendente ad un valore costante o a zero a seguito della completa interazione analitabioelemento.

Se il campione, in cui è presente l'analita, contiene altri composti in grado di interagire direttamente o indirettamente con il trasduttore, il segnale rilevato in assenza del bioelemento è sottratto al segnale rilevato in una misura condotta in presenza del bioelemento così da isolare il solo segnale generato per effetto dell'interazione analitabioelemento.

L'elevato rapporto tra l'ampiezza D e lo spessore H della camera, rappresentativo del rapporto superficie-volume della camera unitamente al ridotto spessore H della medesima, consentono di ottenere una rapida diffusione dell'analita tra le superfici 3 e 4 della camera 2 in tempi dell'ordine del minuto o inferiori.

Si noti che la misura è effettuata in condizione di sostanziale quiete della soluzione da analizzare, ovvero sfruttando i soli moti di diffusione molecolare del sistema analita-bioelemento e non condizioni che prevedano il flusso e/o l'agitazione della soluzione anzidetta.

Con un elevato rapporto D/H ed uno spessore H ridotto è inoltre ottenuta una concentrazione elevata del bioelemento all'interno della camera 2 e di conseguenza una grande attività del bioelemento per unità di volume, anche con un numero ridotto di molecole di bioelemento (ad esempio è sufficiente predisporre sulla superficie 3 uno strato monomolecolare del bioelemento prescelto). Ciò fa sì che tutte le molecole dell'analita presenti nella camera 2 interagiscano in tempi estremamente ridotti con il bioelemento ed i prodotti dell'interazione diffondano rapidamente sulla superficie del trasduttore con tempi di diffusione dell'ordine del minuto o inferiori. In ogni caso la quantità di bioelemento nella camera 2 ed i tempi di diffusione fra le superfici 3,4 delimitanti la camera sono tali da garantire l'interazione di tutto l'analita con il bioelemento in tempi dell'ordine di qualche minuto.

A seguito della interazione di tutto l'analita con il bioelemento, il segnale rilevato dal trasduttore tende ad un valore sostanzialmente costante entro l'errore sperimentale. La grandezza misurata ovvero la sua variazione è proporzionale alla concentrazione iniziale dell'analita come meglio risulterà dalla descrizione degli esempi seguenti. La misura di tale grandezza risulta pertanto indipendente dall'attività del bioelemento.

Mediante il dispositivo della presente invenzione la determinazione della concentrazione dell'analita avviene in funzione della natura dell’analita, di quella del bioelemento e del tipo di interazione analita-bioelemento.

Ad esempio, nel caso della determinazione della concentrazione dello ione solfito (analita) usando come bioelemento la solfito ossidasi in presenza dì un ossidante come il ferricianuro, la superficie 4 è costituita da una sottile lamina di un metallo nobile (Au, Pt, etc.) il cui potenziale elettrico, misurato rispetto ad un elettrodo di riferimento, ad esempio in Ag-AgCI, varia in funzione del rapporto molare [ferricianuro]/[ferrocianuro] dove il ferrocianuro rappresenta il prodotto della reazione del sistema solfito-solfito ossidasi-ferricianuro, essendo la solfito ossidasi (bioelemento) immobilizzata sulla superficie 3 ed il ferricianuro (mediatore) in soluzione. In alternativa, si può utilizzare al posto della lamina di metallo nobile un elettrodo a vetro e misurare la variazione di pH che accompagna la reazione di cui sopra. In entrambi i casi il trasduttore impiegato è di tipo potenziometrico.

Nel caso della determinazione della concentrazione di un antigene (analita), ad esempio albumina umana, usando come bioelemento un anticorpo in grado di legare in modo altamente specifico l'albumina, il trasduttore utilizzato comprende un cristallo piezoelettrico sulla cui superficie 4 sono immobilizzati gli anticorpi anzidetti. La determinazione della concentrazione dell'analita avviene tramite la misura della variazione della frequenza di risonanza del cristallo piezoelettrico dovuta alla variazione della massa del sistema cristallo piezoelettrìco-anticorpo a seguito del totale legame dell'antigene all’anticorpo immobilizzato. In questo caso il trasduttore scelto è di tipo piezoelettrico.

Nel caso della determinazione della concentrazione di un analita che nell'interazione con il bioelemento produce l'emissione di uno o più fotoni come nel caso della determinazione dell'ATP (adenosina trifosfato) con il sistema luciferinaluciferasi, la superficie 4 è costituita da quella di un fototubo (trasduttore) o da quella di un mezzo otticamente trasparente ai fotoni emessi, comunque tale da permettere l'interazione dei fotoni con il trasduttore. La determinazione della concentrazione dell'analita avviene tramite la misura del numero di fotoni emessi nell'interazione di tutto l'ATP con la luciferasi (bioelemento) in presenza di un eccesso di luciferina, essendo la luciferasi immobilizzata sulla superficie 3. In questo caso il trasduttore impiegato è di tipo ottico.

Si riportano di seguito due esempi di determinazione della concentrazione di analiti mediante il metodo ed il dispositivo della presente invenzione.

Esempio 1

Determinazione della concentrazione del glucosio mediante l'utilizzo di enzimi glucosio ossidasi e perossidasi con impiego di un trasduttore amperometrico.

In questa applicazione i bioelementi (glucosio ossidasi e perossidasi) sono stati immobilizzati covalentemente sulla superficie di una lastrina di vetro opportunamente predisposta, che definisce una superficie della camera. La quantità di glucosio ossidasi e perossidasi immobilizzate sono tali da garantire la completa conversione del glucosio presente nella camera in tempi inferiori al minuto. La contrapposta superficie è definita da un trasduttore comprendente un elettrodo di grafite vetrosa costituente l'elettrodo di lavoro di un circuito voltammetrico che comprende ulteriormente un elettrodo di riferimento ed un controelettrodo. Lo spessore H della camera è pari a 100 micrometri con un volume della camera pari a 2 microlitri. Il campione da analizzare, costituito da una soluzione di glucosio, è stato diluito mediante una soluzione concentrata di sodio fosfato a pH 6.5 contenente idrochinone 1 mM (millimolare), per ottenere una soluzione 0.1 mM di glucosio. Dopo l'introduzione della soluzione così ottenuta nella camera, è stato applicato all'elettrodo di lavoro un potenziale di -300 mV rispetto all'elettrodo di riferimento in Ag/AgCI e si è misurata la corrente elettrica circolante nel circuito elettrochimico, sino a quando il valore della corrente dovuta alla riduzione del chinone, formato nell'ossidazione del glucosio via glucosio ossidasi - perossidasi, decadeva sostanzialmente a zero, vale a dire sino alla riduzione completa del chinone che si era formato in quantità equivalente al glucosio. Il segnale di corrente elettrica generato è stato integrato nel tempo e la quantità di carica elettrica così misurata è risulta'

di 39 microcoulomb, valore che coincide, entro l'errore sperimentale, con il valore calcolato teoricamente sulla base del glucosio presente nella camera.

Esempio 2

Determinazione della concentrazione di urea mediante l'utilizzo dell'enzima ureasi con impiego di un trasduttore conduttometrico.

In questa applicazione le contrapposte superfici della camera sono definite da due elettrodi piani di un circuito conduttometrico. La soluzione da analizzare contiene una concentrazione 1 mM di urea (analita). Dopo aver misurato, in condizioni analoghe a quelle dell'esempio precedente, la conducibilità della soluzione da analizzare, è stato aggiunto alla soluzione contenente l'analita una piccola quantità di una soluzione contenente l'enzima ureasi (questa soluzione era in quantità pari ad un centesimo del volume della soluzione di analita e la concentrazione finale dellenzima nella camera era tale da permettere la completa conversione dell'urea in un tempo inferiore al minuto) ed è stato misurato l'aumento della conducibilità della soluzione dovuta alla conversione completa dell'urea in ione ammonio e ione bicarbonato. L'aumento della conducibilità misurato, pari a 5.2 mSiemens, è approssimativamente coincidente, entro l'errore sperimentale, con il valore calcolato teoricamente sulla base della concentrazione iniziale dell'urea nella camera.

L'invenzione risolve così il problema proposto conseguendo numerosi vantaggi rispetto alle soluzioni note.

Innanzitutto con il dispositivo dell'invenzione si ottiene che tutte le molecole di analita presenti nel volume della camera interagiscano con il bioelemento con tempi di diffusione tra le superfici della camera estremamente ridotti, in modo che tutto l’analita interagisca con il bioelemento in tempi dell'ordine del minuto od inferiori.

Inoltre, poiché la misura del segnale generato dal trasduttore, proporzionale alla concentrazione deil'analita, è effettuata a seguito dell'interazione di tutto l'analita con il bioelemento, variazioni dell'attività del bioelemento anche molto accentuate non si riflettono sulla variazione del segnale rilevato e pertanto non è richiesta alcuna calibrazione della strumentazione per ogni misura o gruppo di misure da effettuare.

Un altro vantaggio è costituito dal fatto che per effetto del volume estremamente ridotto della camera del dispositivo dell'invenzione, la quantità di bioelemento necessaria per la determinazione della concentrazione deil'analita è fortemente ridotta con conseguente riduzione dei costi di analisi.

Ulteriore vantaggio legato ai volumi ridotti della camera del dispositivo dell'invenzione è costituito dal fatto che con una stessa lastra sulla quale è predisposto il bioelemento è possibile condurre più determinazioni di analita relative al bioelemento immobilizzato.

Inoltre, l'intercambiabilità della lastra sulla quale è predisposto il bioelemento permette di misurare la concentrazione di analiti diversi in funzione del tipo di bioelemento prescelto.

Non ultimo il vantaggio che, grazie ai rapporti dimensionali tra ampiezza e spessore della camera del dispositivo dell'invenzione, l'interazione analita-bioelemento e la diffusione deil'analita tra le superfici avvengono senza richiedere alcuna agitazione della soluzione contenente il campione da analizzare eliminando in tal modo le possibili variazioni di segnale dovute ad eventuali variazioni della velocità di agitazione.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione della concentrazione di un analita mediante utilizzo di un bioelemento, comprendente le fasi di: - introdurre in una camera, comprendente una prima ed una seconda superficie contrapposte, un campione contenente detto analita ed una quantità di un bioelemento, prescelto per la sua capacità di interagire specificamente con detto analita, determinando una variazione delle caratteristiche chimiche, fisiche e/o chimicofisiche del sistema analita-bioelemento, - predisporre mezzi trasduttori su almeno una di dette superfici atti a trasformare detta variazione in una grandezza fisica variabile nel tempo in funzione dell'interazione analita-bioelemento e correlare detta grandezza con il valore della concentrazione dell'analita, caratterizzato dal fatto che l'interazione analita-bioelemento avviene nello spessore di detta camera, pari alla distanza tra dette superfici e scelto di valore minore od uguale a 500 micrometri così da assicurare una rapida diffusione dell'analita tra dette superfici, dal fatto che la quantità di bioelemento prescelto è tale da garantire l'interazione di tutto l'analita con il bioelemento, e dal fatto che la concentrazione dell'analita è determinata a seguito della interazione di tutto l'analita con il bioelemento quando detta grandezza tende ad assumere un valore approssimativamente costante e proporzionale alla concentrazione dell'analita nonché indipendente dall'attività del bioelemento.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1 , in cui detta variazione delle caratteristiche chimiche, fisiche e/o chimico-fisiche del sistema analita-bioelemento è trasformata in un segnale di corrente elettrica e detta grandezza fisica rappresenta la carica elettrica totale ottenuta per integrazione del l'ampiezza del segnale di corrente elettrica nell'intervallo di tempo compreso tra l'istante iniziale dell'interazione analitabioelemento e l'istante in cui detta variazione tende a zero o detta grandezza tende ad un valore sostanzialmente costante, la quantità di carica elettrica totale essendo proporzionale alla concentrazione dell'analita stesso.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 , in cui detta grandezza è rappresentata dalla conducibilità elettrica di una soluzione contenente il sistema analita-bioelemento, detta conducibilità elettrica essendo misurata a seguito dell'interazione di tutto l'analita con il bioelemento quando essa tende ad un valore sostanzialmente costante, il valore misurato di detta conducibilità essendo proporzionale alla concentrazione dell'analita.
4. Dispositivo per la determinazione della concentrazione di un analita mediante utilizzo di un bioelemento secondo il metodo di una delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente una camera destinata a contenere il sistema analita-bioelemento e mezzi trasduttori associati a detta camera per rilevare la variazione delle caratteristiche chimiche, fisiche e/o chimico-fisiche del sistema analita-bioelemento e trasformare dette variazioni in una grandezza fisica correiabile con la concentrazione dell'analita, caratterizzato dal fatto che detta camera comprende una prima superficie, sulla quale sono predisposti almeno parte di detti mezzi trasduttori, ed una contrapposta seconda superfìcie, lo spessore di detta camera, pari alla distanza tra dette superfici, essendo minore od uguale a 500 micrometri.
5. Dispositivo secondo la rivendicazione 4, in cui detta distanza è compresa tra 2 e 200 micrometri.
6. Dispositivo secondo la rivendicazione 4 o 5, in cui il rapporto tra l'ampiezza e lo spessore di detta camera, pari alla distanza tra dette superfici, è compreso tra 50 e 500.
7. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 6, in cui almeno una di dette superfici è definita da detto trasduttore.
8. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui il bioelemento è predisposto su almeno una di dette superfici.
9. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 8, in cui il bioelemento è predisposto sulla superficie contrapposta al trasduttore.
10. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 8, in cui il bioelemento è predisposto sulla superficie definita da detto trasduttore.
11. Dispositivo secondo la rivendicazione 9, in cui il bioelemento è immobilizzato chimicamente e/o fisicamente su detta superficie contrapposta al trasduttore.
12. Dispositivo secondo la rivendicazione 8, in cui la superficie su cui è predisposto il bioelemento è definita su di un elemento lastriforme intercambiabilmente associato a detto dispositivo.
13. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui il bioelemento è in soluzione.
14. Dispositivo secondo una delie rivendicazioni da 4 a 13, in cui dette superfici sono separate da una guarnizione delimitante una superficie laterale della camera, il dispositivo comprendendo almeno un condotto per l'ingresso e l'uscita da detta camera della soluzione contenente l'analita.
15. Dispositivo secondo la rivendicazione 14, in cui detti condotti sono condotti capillari.
16. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 4 ad 15, in cui detta camera è allungata secondo una direzione preferenziale.
17. Dispositivo secondo la rivendicazione 16, in cui detta camera è allungata nella direzione di detti condotti.
18. Dispositivo secondo la rivendicazione 7, in cui la superficie della camera definita da detto trasduttore è sostanzialmente uguale alla contrapposta superficie sulla quale è predisposto il bioelemento.
19. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni da 4 a 18, in cui detti mezzi trasduttori sono di tipo potenziometrico.
20. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni da 4 a 18, in cui detti mezzi trasduttori sono di tipo piezoelettrico.
21. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni da 4 a 18, in cui detti mezzi trasduttori sono di tipo ottico.
22. Dispositivo secondo una o più delle rivendicazioni da 4 a 18, in cui detti mezzi trasduttori sono di tipo amperometrico o conduttometrico.