ITPD20110149A1

ITPD20110149A1 - ELECTROCHEMICAL SENSOR, PARTICULARLY FOR THE QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSIS OF MOLECULES AND ITS PRODUCTION PROCEDURE

Info

Publication number: ITPD20110149A1
Application number: IT000149A
Authority: IT
Inventors: Filippo Barbaro; Vanni Ferrari
Original assignee: Ims Sensor Srl
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2012-11-13

Description

SENSORE ELETTROCHIMICO, PART ICOLARMENTE PER L'ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA DI MOLECOLE, E RELATIVO PROCEDIMENTO PRODUTTIVO ELECTROCHEMICAL SENSOR, PARTICULARLY FOR THE QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSIS OF MOLECULES, AND RELATED PRODUCTION PROCESS

DESCRIZIONE DESCRIPTION

Il presente trovato ha come oggetto un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, e relativo procedimento produttivo. The present invention relates to an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, and relative production process.

Nel settore della biologia ed, in particolare modo, nel settore delle indagini molecolari, sono noti sensori elettrochimici che si basano sulla tecnologia dei nanoelettrodi . In the field of biology and, in particular, in the field of molecular investigations, electrochemical sensors based on nanoelectrode technology are known.

Più precisamente, tali nanoelettrodi, che presentano dimensioni variabili tra il micrometro e qualche nanometro, sono realizzati con materiali elettrochimicamente sensibili come possono essere, ad esempio, i metalli nobili, il carbonio, materiali magnetici o gli ossidi metallici in genere, e sono associati ad un'elettronica, basata su micro e nanotecnologia, tale da renderli dei veri e propri biosensori in grado di effettuare analisi e misurazioni a livello cellulare. More precisely, these nanoelectrodes, which have variable dimensions between the micrometer and a few nanometers, are made with electrochemically sensitive materials such as, for example, noble metals, carbon, magnetic materials or metal oxides in general, and are associated with electronics, based on micro and nanotechnology, such as to make them real biosensors capable of carrying out analyzes and measurements at the cellular level.

Un vantaggio primario dei nanoelettrodi consiste nel fatto di possedere un'elevatissima sensibilità tale da permettere di poter analizzare/misurare parametri e grandezze di particolare rilevanza, ad esempio in reazioni elettrochimiche e biocatalitiche, che altri strumenti noti non sono in grado di analizzare/misurare . A primary advantage of nanoelectrodes is that they possess a very high sensitivity such as to allow to analyze / measure particularly important parameters and quantities, for example in electrochemical and biocatalytic reactions, which other known instruments are not able to analyze / measure.

Più dettagliatamente, il nanoelettrodo è collegato ad un microprocessore in grado di rilevare la differenza di potenziale che si instaura tra il nanoelettrodo ed un secondo nanoelettrodo di riferimento, anch'esso collegato al microprocessore. More specifically, the nanoelectrode is connected to a microprocessor capable of detecting the potential difference that is established between the nanoelectrode and a second reference nanoelectrode, also connected to the microprocessor.

Questa differenza di potenziale mette in movimento gli elettroni delle molecole della sostanza da analizzare, il cui flusso viene rilevato da almeno una superficie elettricamente sensibile a livello atomico definita dal nanoelettrodo . This potential difference sets in motion the electrons of the molecules of the substance to be analyzed, whose flux is detected by at least one electrically sensitive surface at the atomic level defined by the nanoelectrode.

Nella fattispecie, sono noti sensori elettrochimici che si basano su nanoelettrodi realizzati mediante deposizione su di un supporto di un materiale conduttivo. In this case, electrochemical sensors are known which are based on nanoelectrodes made by depositing a conductive material on a support.

Tali sensori elettrochimici di tipo noto non sono scevri da inconvenienti tra i quali va annoverato il fatto di essere particolarmente complessi da realizzare ed, in particolare modo, è assai complessa la realizzazione di una superficie elettricamente sensibile di dimensioni nanometriche . These known electrochemical sensors are not free from drawbacks, including the fact that they are particularly complex to produce and, in particular, the production of an electrically sensitive surface of nanometric dimensions is very complex.

Compito precipuo del presente trovato è quello di risolvere il problema tecnico sopra esposto, realizzando un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, in grado di rilevare molecole elettroattive e non elettroattive che sia estremante semplice da realizzare . The aim of the present invention is to solve the aforementioned technical problem, realizing an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, capable of detecting electroactive and non-electroactive molecules which is extremely simple to make.

Nell'ambito di questo compito, uno scopo del presente trovato è quello di mettere a punto un procedimento produttivo di un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, semplice da mettere in atto e le cui fasi operative siano facilmente attuabili dal tecnico del ramo. Within this aim, an object of the present invention is to provide a production process for an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, which is simple to implement and whose operating steps are easily implemented by the person skilled in the art.

Un altro scopo del trovato consiste nel fatto di realizzare un sensore elettrochimico e di mettere a punto un relativo procedimento produttivo in grado di dare le più ampie garanzie di affidabilità, qualità, ripetibilità e sicurezza nell'uso, nonché nella produzione del sensore elettrochimico . Another object of the invention is to provide an electrochemical sensor and to develop a related production process capable of giving the greatest guarantees of reliability, quality, repeatability and safety in use, as well as in the production of the electrochemical sensor.

Un ulteriore scopo del trovato consiste nel fatto di realizzare un sensore elettrochimico e di mettere a punto un relativo procedimento produttivo che siano facili da realizzare ed economicamente competitivi se paragonati alla tecnica nota. A further object of the invention is to provide an electrochemical sensor and to develop a related production process which are easy to carry out and economically competitive if compared to the known art.

Il compito sopra esposto, nonché gli scopi accennati ed altri che meglio appariranno in seguito, vengono raggiunti da un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole, caratterizzato dal fatto di comprendere almeno un elettrodo di lavoro, almeno un elettrodo di riferimento ed almeno un controelettrodo operativamente collegati ad un potenziostato atto a controllarli in maniera indipendentemente tra loro, detti elettrodi essendo parzialmente immergibili una soluzione di lavoro confinata in un contenitore di reazione. The aforementioned task, as well as the aforementioned purposes and others which will appear better later, are achieved by an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules, characterized in that it comprises at least one working electrode, at least one reference and at least one counter electrode operatively connected to a potentiostat adapted to control them independently from each other, said electrodes being partially submersible a working solution confined in a reaction container.

Ulteriormente, il compito sopra esposto, nonché gli scopi accennati ed altri che meglio appariranno in seguito, vengono raggiunti da un procedimento produttivo di un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, secondo una o più delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi per la realizzazione di almeno uno di detti elettrodi: Furthermore, the aforementioned aim, as well as the aforementioned objects and others which will appear better later, are achieved by a production process of an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, according to one or more of the claims above, characterized in that it comprises the following steps for making at least one of said electrodes:

- deposito di detto strato intermedio adesivo su detto substrato elettricamente isolante; - depositing said intermediate adhesive layer on said electrically insulating substrate;

- deposito di detto almeno uno strato conduttore su detto strato intermedio adesivo - depositing said at least one conductive layer on said adhesive intermediate layer

deposito di detto spessore di materiale elettricamente isolante su detto almeno uno strato conduttore . deposition of said thickness of electrically insulating material on said at least one conductive layer.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi risulteranno maggiormente dalla descrizione di una forma di realizzazione preferita, ma non esclusiva, di un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, illustrata a titolo indicativo e non limitativo con l'ausilio degli allegati disegni in cui: Further characteristics and advantages will emerge more clearly from the description of a preferred, but not exclusive, embodiment of an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, illustrated by way of non-limiting example with the aid of attached drawings in which:

la figura 1 è una vista schematica di una forma di realizzazione di un sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, secondo il trovato, durante il suo utilizzo; Figure 1 is a schematic view of an embodiment of an electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, according to the invention, during its use;

la figura 2 è una sezione trasversale schematizzata di un elettrodo rappresentato in figura 1; Figure 2 is a schematic cross section of an electrode shown in Figure 1;

la figura 3 è una sezione trasversale schematizzata di una variante dell'elettrodo rappresentato in figura 1; Figure 3 is a schematic cross section of a variant of the electrode shown in Figure 1;

la figura 4 è una sezione trasversale schematizzata dell'elettrodo rappresentato in figura 2 durante la sua funzionalizzazione. Figure 4 is a schematic cross section of the electrode represented in Figure 2 during its functionalization.

Con riferimento alle figure citate, il sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, indicato globalmente con il numero di riferimento 1, comprende almeno un elettrodo di lavoro, indicato nelle due variante proposte con 2a e 2b, almeno un elettrodo di riferimento 3 ed almeno un controelettrodo 4 operativamente collegati ad un potenziostato 5 atto a controllarli in maniera indipendentemente tra loro . With reference to the aforementioned figures, the electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, globally indicated with the reference number 1, comprises at least one working electrode, indicated in the two proposed variants with 2a and 2b, at least one reference electrode 3 and at least one counter electrode 4 operatively connected to a potentiostat 5 adapted to control them independently of each other.

Più precisamente, gli elettrodi 2a, 2b, 3 e 4 sono parzialmente immergibili una soluzione di lavoro 6 confinata in un contenitore di reazione 7 e compresa tra una soluzione del tipo acquosa, una soluzione costituita da liquidi ionici, una soluzione costituita da solventi aprotici a bassa costante dielettrica, ad esempio acetonitrile . More precisely, the electrodes 2a, 2b, 3 and 4 are partially submersible a working solution 6 confined in a reaction container 7 and comprised between an aqueous type solution, a solution consisting of ionic liquids, a solution consisting of aprotic solvents a low dielectric constant, for example acetonitrile.

In generale, gli elettrodi 2a, 2b, 3 e 4 possono operare in aria, gas, miscela di gas ovvero in fase liquida. In general, the electrodes 2a, 2b, 3 and 4 can operate in air, gas, gas mixture or in the liquid phase.

L'utilizzo di tali solventi estende la finestra di potenziale elettrico accessibile e consente di effettuare analisi di specie molecolari ad alto potenziale di ossidazione ovvero con potenziale di riduzione negativo. The use of these solvents extends the accessible electric potential window and allows to carry out analyzes of molecular species with a high oxidation potential or with a negative reduction potential.

Più specificatamente, in tutte e due le varianti proposte che verranno descritte nel dettaglio in seguito, gli elettrodi 2a, 2b, 3 e 4, o almeno uno di questi, comprendono almeno un substrato elettricamente isolante 8 ed almeno uno strato conduttore 9 realizzabili, rispettivamente, realizzati da un materiale scelto tra vetro, allumina, polimeri aventi una elevata costante dielettrica come il policarbonato e da un materiale aventi caratteristiche dimensionalmente nanometriche, ossia con spessore compreso tra 1 e 100 nanometri, in maniera tale da renderlo adatto a funzionare come elettrodo. More specifically, in both of the proposed variants which will be described in detail below, the electrodes 2a, 2b, 3 and 4, or at least one of these, comprise at least an electrically insulating substrate 8 and at least one conductive layer 9 which can be produced, respectively , made from a material chosen from glass, alumina, polymers having a high dielectric constant such as polycarbonate and from a material having dimensionally nanometric characteristics, i.e. with a thickness between 1 and 100 nanometers, in such a way as to make it suitable to function as an electrode.

Ulteriormente, ciascun strato conduttore 9 può essere realizzato da una lamina elettrochimicamente attiva in un materiale scelto, ad esempio, tra un metallo nubile ad esempio oro, una lega metallica e nanostrutture elettroconduttive . Furthermore, each conductive layer 9 can be made from an electrochemically active foil in a material chosen, for example, from a nubile metal, for example gold, a metal alloy and electroconductive nanostructures.

Il substrato elettricamente isolante 8 ed lo strato conduttore 9 sono associati reciprocamente mediante un strato intermedio 10 adesivo, ad esempio, del tipo metallico. The electrically insulating substrate 8 and the conductive layer 9 are mutually associated by means of an adhesive intermediate layer 10, for example, of the metal type.

Inoltre, lo strato conduttore 9 è rivestito da uno spessore di materiale elettricamente isolante il realizzato, ad esempio, in un materiale scelto tra policarbonato, polimetacrilato, polivinilpiridina , polistirene e loro derivati o copolimeri o copolimeri fenol-aldeidici o resine fotosensibili . Furthermore, the conductive layer 9 is coated with a thickness of electrically insulating material 11 made, for example, of a material selected from polycarbonate, polymethacrylate, polyvinylpyridine, polystyrene and their derivatives or copolymers or phenol-aldehyde copolymers or photosensitive resins.

Con riferimento alle figure 2 e 4, l'elettrodo di lavoro 2a comprende un solo substrato elettricamente isolante 8, la cui geometria costruttiva è funzione della tipologia applicativa richiesta dall'utiliz zatore , ed un solo strato conduttore 9 associati reciprocamente mediante lo strato intermedio 10 adesivo, con lo strato conduttore 9 rivestito da uno spessore di materiale elettricamente isolante 11 adatto ad applicazioni litografiche o nanografiche. With reference to Figures 2 and 4, the working electrode 2a comprises a single electrically insulating substrate 8, whose construction geometry is a function of the type of application required by the user, and a single conductive layer 9 mutually associated by means of the intermediate layer 10 adhesive, with the conductive layer 9 coated with a thickness of electrically insulating material 11 suitable for lithographic or nanographic applications.

Come già detto, l'elettrodo di lavoro 2a presenta uno spessore del perimetro dimensionalmente variabile da 1 a 100 nanometri e presenta una sola superficie elettrochimicamente attiva . As already mentioned, the working electrode 2a has a thickness of the perimeter dimensionally variable from 1 to 100 nanometers and has a single electrochemically active surface.

Con riferimento alla figura 3, l'elettrodo di lavoro 2b comprende un substrato elettricamente isolante 8, una pluralità di strati conduttori 9 ed una pluralità di spessori di materiale elettricamente isolante 11 associati ed alteranti tra loro. With reference to Figure 3, the working electrode 2b comprises an electrically insulating substrate 8, a plurality of conductive layers 9 and a plurality of thicknesses of electrically insulating material 11 associated and mutually altering.

In tale maniera, rispetto all'elettrodo di lavoro 2a rappresentato in figura 2, l'elettrodo di lavoro 2b presenta un aumento della superficie elettrochimicamente attiva quando le lamine sono collegate al medesimo potenziostato 5. Infatti, gli strati conduttori 9 sono elettricamente indipendente tra loro al fine di consentire rilevazioni multiple. In this way, with respect to the working electrode 2a shown in Figure 2, the working electrode 2b has an increase in the electrochemically active surface when the foils are connected to the same potentiostat 5. In fact, the conducting layers 9 are electrically independent of each other. in order to allow multiple surveys.

In questo caso si prevede l'utilizzo di almeno due strati conduttori 9 con funzione di elettrodo di riferimento e di controelettrodo . In this case, the use of at least two conductive layers 9 is envisaged with the function of reference electrode and counter electrode.

Con riferimento alla figura 4, l'elettrodo di lavoro 2a è del tipo funzionalizzato, Questo significa che il sensore elettrochimico 1 presenta una superficie modificata, mediante opportune reazioni chimiche, con la presenza di molecole di varia tipologia e natura, gergalmente denominate sonde molecolari 12 e 14 e ponti molecolari 13 e 15. With reference to figure 4, the working electrode 2a is of the functionalized type.This means that the electrochemical sensor 1 has a modified surface, by means of appropriate chemical reactions, with the presence of molecules of various types and nature, jargonally called molecular probes 12 and 14 and molecular bridges 13 and 15.

Tali sonde molecolari 12, 13, 14 e 15 rendono il sensore elettrochimico 1 analiticamente selettivo, in termini sia qualitativi che quantitativi, nei confronti di una o più specie atomiche o molecolari o biologiche, come ad esempio ioni metallici, molecole inorganiche, molecole organiche, cellule, microrganismi, virus, presenti nell'ambiente di lavoro, essendo capaci di legarsi specificatamente ad esse. These molecular probes 12, 13, 14 and 15 make the electrochemical sensor 1 analytically selective, in both qualitative and quantitative terms, towards one or more atomic or molecular or biological species, such as for example metal ions, inorganic molecules, organic molecules, cells, microorganisms, viruses, present in the work environment, being able to bind specifically to them.

È possibile distinguere tre tipologie di funzionalizzazione dell'elettrodo di lavoro 2a che possono essere applicate anche agli altri due elettrodi 3 e 4. It is possible to distinguish three types of functionalization of the working electrode 2a which can also be applied to the other two electrodes 3 and 4.

La prima è detta funzionalizzazione diretta e consiste nel far legare una sonda molecolare 12 alla superficie non elettrochimicamente attiva dell'elettrodo di lavoro 2a. Ad esempio, citiamo l'interazione anticorpo-antigene , dove l'anticorpo agisce come sonda molecolare nei confronti dell 'antigene presente nell'ambiente di lavoro e ancora gli aptameri a DNA o gli aptameri a RNA selettivamente sviluppati per il riconoscimento (e il relativo legame) con uno o più ioni metallici o molecole ovvero cellule, microrganismi, virus presenti nell'ambiente di lavoro . The first is called direct functionalization and consists in making a molecular probe 12 bond to the non-electrochemically active surface of the working electrode 2a. For example, we cite the antibody-antigen interaction, where the antibody acts as a molecular probe towards the antigen present in the working environment and again the DNA aptamers or the RNA aptamers selectively developed for recognition (and the relative bond) with one or more metal ions or molecules or cells, microorganisms, viruses present in the work environment.

La seconda funzionalizzazione è detta indiretta e consiste nel far legare la sonda molecolare alla superficie non elettrochimicamente attiva dell'elettrodo di lavoro 2a tramite un'altra sonda molecolare 13 che agisce come ponte . The second functionalization is called indirect and consists in making the molecular probe bond to the non-electrochemically active surface of the working electrode 2a by means of another molecular probe 13 which acts as a bridge.

In tale senso i silani e in particolare la 3-(trietossisilil )-propil-ammina ed il 3(glicidossipropil) -trimetossi -siiano, sono particolarmente indicati essendo caratterizzati da eccellente stabilità nonché dalla possibilità di sostituire i loro gruppi funzionali terminali (anche in una fase successiva a quella strettamente legata alla produzione del sensore elettrochimico 1) con altro gruppo funzionale reattivo eventualmente più adatto a legarsi ad una specifica sonda molecolare. In this sense, silanes and in particular 3- (triethoxysilyl) -propyl-amine and 3 (glycidoxypropyl) -trimethoxy-siiano, are particularly suitable as they are characterized by excellent stability as well as the possibility of replacing their terminal functional groups (also in a phase subsequent to that strictly linked to the production of the electrochemical sensor 1) with another reactive functional group possibly more suitable for binding to a specific molecular probe.

Infine, la terza funzionalizzazione viene effettuata sulla superficie elettrochimicamente attiva e si realizza tramite l'impiego di ponti molecolari 13 e 15 dotati di gruppi funzionali capaci di reagire con lo strato conduttore 9 proprio del nanoelettrodo . Finally, the third functionalization is carried out on the electrochemically active surface and is carried out through the use of molecular bridges 13 and 15 equipped with functional groups capable of reacting with the conductive layer 9 of the nanoelectrode.

In questo modo, ad esempio, se lo strato conduttore 9 è in oro l'utilizzo di ponti molecolari 13 e 15 caratterizzati dal possedere un gruppo funzionale mercaptanico (-SH) permetterà a quest 'ultimi di formare dei legami covalenti con la superficie aurea. In this way, for example, if the conductive layer 9 is in gold, the use of molecular bridges 13 and 15 characterized by having a mercaptan functional group (-SH) will allow the latter to form covalent bonds with the gold surface.

In generale materiali funzionalizzabili sono i polimeri o copolimeri dotati di gruppi funzionali amminici, carbonilici, carbossilici o con anelli aromatici o eterociclici sostituiti; pertanto adatti allo scopo sono il policarbonato, il polimetacrilato, la polivinilpiridina , il polistirene e i loro derivati; ancora tra i copolimeri possono essere utilizzati il polimet ilmetacrilato con acido polivinilacetico, polivinilpirrolidone, polivinilalcool o polistirene . In general functionalizable materials are polymers or copolymers endowed with amino, carbonyl, carboxylic functional groups or with substituted aromatic or heterocyclic rings; therefore suitable for the purpose are polycarbonate, polymethacrylate, polyvinylpyridine, polystyrene and their derivatives; again among the copolymers polymethylmethacrylate with polyvinylacetic acid, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol or polystyrene can be used.

Allo stesso modo si possono utilizzare copolimeri del polistirene con acido polivinilacetico, polivinilpiridina o anche del polistirene con gruppi amminici, carbossilici o fenolici aventi dei gruppi funzionali sostituiti a livello dell'anello aromatico. In the same way, it is possible to use copolymers of polystyrene with polyvinylacetic acid, polyvinylpyridine or also of polystyrene with amino, carboxylic or phenolic groups having functional groups substituted at the level of the aromatic ring.

Infine può essere impiegata una resina fotosensibile tipo Novolac. Finally, a Novolac-type photosensitive resin can be used.

Diverse sono le tecniche di esecuzione della funzionalizzazione, a titolo di esempio citiamo il metodo della deposizione in fase di vapore (Chemical Vapour Deposition o CVD) nota per la sua semplicità, economicità e riproducibilità. There are several techniques for carrying out functionalization, by way of example we cite the method of vapor deposition (Chemical Vapor Deposition or CVD) known for its simplicity, cost-effectiveness and reproducibility.

Il funzionamento del sensore elettrochimico 1, secondo il presente trovato, è il seguente. The operation of the electrochemical sensor 1, according to the present invention, is as follows.

In figura 1 è disegnato il sensore elettrochimico 1 immerso nella soluzione di lavoro 6, nella quale è presente almeno una specie molecolare con funzioni di mediatore elettrochimico, ad esempio Blu di Metilene o Ferrocianuro di Potassio, specifico per il composto da analizzare. Figure 1 shows the electrochemical sensor 1 immersed in the working solution 6, in which there is at least one molecular species with electrochemical mediator functions, for example Methylene Blue or Potassium Ferrocyanide, specific for the compound to be analyzed.

Il mediatore elettrochimico agisce trasferendo elettroni dalla molecola biologica in analisi (eventualmente legata ad una sonda molecolare 12 o 14 ad essa complementare) all'elettrodo di lavoro 2a o 2b, come rappresentato in figura 4. The electrochemical mediator acts by transferring electrons from the biological molecule under analysis (possibly linked to a molecular probe 12 or 14 complementary thereto) to the working electrode 2a or 2b, as shown in Figure 4.

Più dettagliatamente, il mediatore elettrochimico si caratterizza per un valore di potenziale di ossidoriduzione adatto allo scopo e nel caso di analisi multiparametriche i diversi mediatori elettrochimici potenzialmente utilizzabili devono essere selezionati in modo tale da evitare sovrapposizioni dei singoli valori del potenziale di ossidoriduzione . More in detail, the electrochemical mediator is characterized by a redox potential value suitable for the purpose and in the case of multiparametric analyzes the various potentially usable electrochemical mediators must be selected in such a way as to avoid overlapping of the single redox potential values.

Infine, anche i mediatori elettrochimici possono eventualmente essere ancorati al materiale funzionaliz zabile utilizzando opportuni ponti molecolari . Finally, also the electrochemical mediators can optionally be anchored to the functionalizable material by using suitable molecular bridges.

Per quanto concerne il procedimento produttivo del sensore elettrochimico 1, questo comprende le seguenti fasi per la realizzazione di almeno uno degli elettrodi 2a, 2b, 3 e 4. As far as the manufacturing process of the electrochemical sensor 1 is concerned, this comprises the following steps for manufacturing at least one of the electrodes 2a, 2b, 3 and 4.

Inizialmente si deposita lo strato intermedio 10 adesivo sul substrato elettricamente isolante 8, ad esempio policarbonato, di opportuno spessore e di geometria prefigurata a seconda delle esigenze dell'utilizzatore, mediante tecniche diverse tra le quali, a titolo di esempio, l'evaporazione sottovuoto, l'elettrodeposizione, la deposizione per riduzione (electroless). Initially, the adhesive intermediate layer 10 is deposited on the electrically insulating substrate 8, for example polycarbonate, of suitable thickness and of a prefigured geometry according to the user's needs, by means of different techniques including, by way of example, vacuum evaporation, electrodeposition, electroless deposition.

Successivamente, si deposita lo strato conduttore 9 costituito da un metallo o lega o nanostrutture elettroconduttive (es. Nanotubi in carbonio) . Subsequently, the conductive layer 9 is deposited, consisting of a metal or alloy or electroconductive nanostructures (eg carbon nanotubes).

La suddetta deposizione può essere eseguita con tecniche diverse tra le quali, a titolo di esempio, l'evaporazione sottovuoto, l'elettrodeposizione, la deposizione per riduzione (electroless) , ecc... The aforementioned deposition can be performed with different techniques including, for example, vacuum evaporation, electrodeposition, deposition by reduction (electroless), etc ...

Lo spessore del perimetro della lamina dello strato conduttore 9 conduttore (dimensionalmente variabile da 1 a 100 nanometri) costituisce la superficie elettrochimicamente attiva del nanoelettrodo (e quindi del sensore elettrochimico 1) · The thickness of the perimeter of the lamina of the conductive layer 9 (dimensionally variable from 1 to 100 nanometers) constitutes the electrochemically active surface of the nanoelectrode (and therefore of the electrochemical sensor 1)

Poi si deposita lo spessore di materiale elettricamente isolante 11 quale, ad esempio, della resina fotosensibile tipo Novolac. Then the thickness of electrically insulating material 11 is deposited, such as, for example, the photosensitive resin of the Novolac type.

Più precisamente, lo spessore di materiale elettricamente isolante 11 deve ricoprire tutta la superficie planare dell'elettrodo di lavoro 2a ad eccezione di una piccola porzione opportunamente dimensionata e sagomata, che fungerà da contatto con il potenziostato 5. More precisely, the thickness of the electrically insulating material 11 must cover the entire planar surface of the working electrode 2a with the exception of a small portion suitably sized and shaped, which will act as contact with the potentiostat 5.

Nella versione monolamellare, ossia quella rappresentata in figura 2, può essere prevista una fase di stampa dell'elettrodo di riferimento 3 e del controelettrodo 4 utilizzando tecniche litografiche o nanolitografiche, preferibilmente del tipo Ag/AgCl. In the monolamellar version, ie the one shown in Figure 2, a printing step of the reference electrode 3 and the counter electrode 4 can be provided using lithographic or nanolithographic techniques, preferably of the Ag / AgCl type.

Per ottenere l'elettrodo di lavoro 2b, ossia quello nella versione multistrato o multi lamellare, si procede con una pluralità di fasi di deposito di strati conduttori 9 sul substrato elettricamente isolante 8 e di fasi deposito di spessori di materiale elettricamente isolante il su ciascun strato conduttore 9 in maniera alternata tra loro. To obtain the working electrode 2b, i.e. the one in the multilayer or multi-lamellar version, one proceeds with a plurality of deposition phases of conductive layers 9 on the electrically insulating substrate 8 and deposition phases of thicknesses of electrically insulating material 11 on each layer conductor 9 alternately with each other.

Qualora specifiche esigenze analitiche lo richiedano, può essere prevista una fase di funzionalizzazione dell'elettrodo di lavoro 2a o 2b nei confronti di una o più molecole di analite. Whenever specific analytical needs require it, a functionalization step of the working electrode 2a or 2b with respect to one or more analyte molecules can be envisaged.

Il processo di funzionalizzazione può coinvolgere sia il materiale costituente il substrato elettricamente isolante 8, sia il materiale costituente il substrato elettricamente isolante il e sia il materiale costituente lo strato conduttore 9. The functionalization process can involve both the material constituting the electrically insulating substrate 8 and the material constituting the electrically insulating substrate 11 and the material constituting the conducting layer 9.

Infine , è preferibile eseguire una fase di pulizia della superficie elettrochimicamente attiva dell'elettrodo di lavoro 2a o 2b. Finally, it is preferable to carry out a cleaning step of the electrochemically active surface of the working electrode 2a or 2b.

Più dettagliatamente, detta fase di pulizia comprende il lavaggio della superficie elettrochimicamente attiva con una soluzione acida seguito da una sequenza di scansioni potenziometriche (a potenziostato 5 attivato) a bassa velocità. Utile può rivelarsi una serie di cicli di scansione potenziometrica , in presenza di un mediatore elettrochimico di riferimento, al fine di valutare le performance del sensore sia in condizioni di funzionamento standard che dopo funzionalizzazione della superficie. More specifically, said cleaning step comprises washing the electrochemically active surface with an acid solution followed by a sequence of potentiometric scans (with potentiostat 5 activated) at low speed. A series of potentiometric scanning cycles may be useful, in the presence of a reference electrochemical mediator, in order to evaluate the performance of the sensor both in standard operating conditions and after surface functionalization.

A puro titolo esemplificativo e non limitativo, è riportato di seguito un esempio operativo del sensore elettrochimico 1 secondo il trovato . Purely by way of non-limiting example, an operational example of the electrochemical sensor 1 according to the invention is given below.

Scopo dell'esperimento: valutazione del segnale elettrochimico generato dall'elettrodo di lavoro 2a funzionalizzato con anticorpi antileucociti umani. Aim of the experiment: evaluation of the electrochemical signal generated by the working electrode 2a functionalized with human leukocyte antibodies.

I reagenti impiegati sono: The reagents used are:

anticorpo monoclonale murino anti CD2 umano coniugato FITC clone GAI10 isotipo Ms IgGl mouse monoclonal antibody anti human CD2 conjugated FITC clone GAI10 isotype Ms IgGl

con specificità: 1' antigene CD2 è il recettore di CD58 (LFA-3) altrimenti noto come LFA-2 ovvero recettore per gli eritrocit i di pecora. CD2 viene espresso in circa l'80i>dei linfociti T periferici, su più del 953⁄4 dei timociti e in una sottopopolazione di linfocit:i NK con sensibilità 0,01 mg/mL (ottimizzazione tramite la risoluzione della popolazione cellulare CD2 rispetto alla popolazione cellulare CD2 Analisi citof luorimetrica di sangue periferico umano) with specificity: The CD2 antigen is the CD58 receptor (LFA-3) otherwise known as LFA-2 or sheep erythrocyte receptor. CD2 is expressed in approximately 80i> of peripheral T lymphocytes, on more than 953⁄4 of thymocytes and in a subpopulation of lymphocytes: i NK with sensitivity 0.01 mg / mL (optimization by resolution of the CD2 cell population with respect to CD2 cell population Flow cytometric analysis of human peripheral blood)

Gli elettrodi di lavoro 2a impiegati, detti anche nanosensori, sono i seguenti: The working electrodes 2a used, also called nanosensors, are the following:

N.2 nanosensori non funzionalizzati (anticorpo CD2 0 ug/mL) 2 non-functionalized nanosensors (CD2 antibody 0 ug / mL)

N .2 nanosensori funzionalizzati con anticorpo CD2 5 ug/mL 2 nanosensors functionalized with 5 ug / mL CD2 antibody

N .2 nanosensori funzionalizzati con anticorpo CD2 10 ug/mL 2 nanosensors functionalized with CD2 10 ug / mL antibody

N .2 nanosensori funzionalizzati con anticorpo CD2 20 ug/mL 2 nanosensors functionalized with 20 ug / mL CD2 antibody

In particolare modo, si è eseguita la seguente funzionalizzazione (COATING) del nanosensore: i nanosensori sono stati puliti per tre volte con Tween 20 alla concentrazione del 1% in tampone PBS . Successivamente si è proceduto alla loro funzionalizzazione (COATING) mediante incubazione per 18 ore a 4°C in una soluzione di tampone bicarbonato 0,1M pH8,4 contenente l'anticorpo CD2 alle concentrazioni sopra riportate. Al termine della procedura i nanosensori sono stati lavati per tre volte con BSA 1% in tampone PBS addizionato con 0,09% di Sodio Azide con pH finale 7,3 - 7,4. In particular, the following functionalization (COATING) of the nanosensor was performed: the nanosensors were cleaned three times with Tween 20 at a concentration of 1% in PBS buffer. Subsequently, their functionalization (COATING) was carried out by incubation for 18 hours at 4 ° C in a 0.1M pH8.4 bicarbonate buffer solution containing the CD2 antibody at the concentrations indicated above. At the end of the procedure the nanosensors were washed three times with 1% BSA in PBS buffer added with 0.09% Sodium Azide with final pH 7.3 - 7.4.

Come campione biologico sono stati utilizzati linfociti T ottenuti per purificazione da sangue umano applicando tecniche procedurali standard pubblicate in molti studi di settore. All'analisi citof luorimetrica il campione impiegato nella sperimentazione ha una concentrazione finale di 100.000 leucociti per mL di soluzione di cui il 65% era costituito da linfociti T. Di questi, infine, l'80% era CD2+ pari a una concentrazione assoluta di 290.000 linfociti T CD2+ per mL di soluzione . As a biological sample, T lymphocytes obtained by purification from human blood were used by applying standard procedural techniques published in many sector studies. At the flow cytometric analysis, the sample used in the experimentation has a final concentration of 100,000 leukocytes per mL of solution of which 65% consisted of T lymphocytes. Finally, 80% of these were CD2 + equal to an absolute concentration of 290,000 CD2 + T lymphocytes per mL of solution.

I dati analitici si basano sulla misura della intensità di corrente elettrica generata dal nano sensore funzionalizzato, dovuta al processo di ossidoriduzione del mediatore elettrochimico Ferrocianuro di Potassio presente nella soluzione di lavoro costituita da tampone PBS. Suddetta intensità di corrente elettrica subisce una variazione che è inversamente proporzionale alla concentrazione degli anticorpi anti linfociti T CD2+ legati alla superficie del nano sensore. Tale effetto è causato dall'impedimento sterico generato dalla massa molecolare degli anticorpi anti CD2+ stessi oltre che dal successivo legame tra questi e i linfociti T CD2+. Il potenziostato 5 lavorava in voltametria ciclica con una velocità di scansione di 25 mV/secondo, range di potenziale impostato da -0,6 a 0,6 Volt; tempo d incubazione pre-analitico di 60 minuti, volume finale della soluzione di lavoro 3 mL. The analytical data are based on the measurement of the electric current intensity generated by the functionalized nano sensor, due to the redox process of the electrochemical mediator Potassium Ferrocyanide present in the working solution consisting of PBS buffer. The aforesaid intensity of electric current undergoes a variation which is inversely proportional to the concentration of antibodies against CD2 + T lymphocytes bound to the surface of the nano sensor. This effect is caused by the steric hindrance generated by the molecular mass of the anti CD2 + antibodies themselves as well as by the subsequent binding between them and the CD2 + T lymphocytes. Potentiostat 5 worked in cyclic voltametry with a scanning speed of 25 mV / second, potential range set from -0.6 to 0.6 Volt; pre-analytical incubation time of 60 minutes, final volume of working solution 3 mL.

I risultati ottenuti sono i seguenti: nanosensore non funzionalizzato (blank) : alle condizioni analitiche sopra specificate la voltametria ciclica evidenzia l'ossidazione e la riduzione del mediatore elettrochimico Ferrocianuro di Potassio. Il valore medio rilevato in ossidazione è stato di 0,998 milliampere, The results obtained are the following: non-functionalized nanosensor (blank): under the analytical conditions specified above, the cyclic voltametry highlights the oxidation and reduction of the electrochemical mediator Potassium Ferrocyanide. The average value detected in oxidation was 0.998 milliamps,

nanosensore funzionalizzato con anticorpi anti CD2 (10 ug/mL): alle condizioni analitiche sopra specificate la voltametria ciclica evidenzia l'ossidazione e la riduzione del mediatore elettrochimico Ferrocianuro di Potassio. Il valore medio rilevato in ossidazione è stato di 0,876 milliampere. L'impedimento sterico generato dalla funzionalizzazione (coating) del nanosensore con gli anticorpi anti CD2 provocava una caduta media del segnale elettrico di circa 0,120 microampere, nanosensore funzionalizzato con anticorpi anti CD2 (20 ug/mL) e incubato con linfociti T CD2+: alle condizioni analitiche sopra specificate la voltametria ciclica evidenzia l'ossidazione e la riduzione del mediatore elettrochimico Ferrocianuro di Potassio. Il valore medio rilevato in ossidazione è stato di 0,106 milliampere. nanosensor functionalized with anti CD2 antibodies (10 ug / mL): at the analytical conditions specified above, the cyclic voltametry shows the oxidation and reduction of the electrochemical mediator Potassium Ferrocyanide. The average value detected in oxidation was 0.876 milliamps. The steric hindrance generated by the functionalization (coating) of the nanosensor with anti CD2 antibodies caused an average drop in the electrical signal of about 0.120 microamps, nanosensor functionalized with anti CD2 antibodies (20 ug / mL) and incubated with CD2 + T cells: under the conditions analytical methods specified above, the cyclic voltametry highlights the oxidation and reduction of the electrochemical mediator Potassium Ferrocyanide. The average value detected in oxidation was 0.106 milliamps.

1/ impedimento sterico generato dalla funzionalizzazione (coating) del nanosensore con gli anticorpi anti CD2 e dal legame dei linfociti T CD2+ agli anticorpi stessi provocava una caduta media del segnale elettrico di circa 0,770 milliampere rispetto al nanosensore funzionaliz zato con soli anticorpi anti CD2 e di circa 0,878 milliampere rispetto al nanosensore non funzionaliz zato (blank), 1 / steric hindrance generated by the functionalization (coating) of the nanosensor with anti CD2 antibodies and by the binding of the CD2 + T lymphocytes to the antibodies themselves caused an average drop in the electrical signal of about 0.770 milliamps compared to the nanosensor functionalized with only anti CD2 antibodies and about 0.878 milliamps compared to the non-functionalized nanosensor (blank),

nanosensore funzionalizzato con anticorpi anti CD2 (10 ug/mL) e incubato con linfociti T CD2+: alle condizioni analitiche sopra specificate la voltametria ciclica evidenzia l'ossidazione e la riduzione del mediatore elettrochimico Ferrocianuro di Potassio. Il valore medio rilevato m ossidazione è stato di 0,420 milliampere. nanosensor functionalized with anti CD2 antibodies (10 ug / mL) and incubated with CD2 + T lymphocytes: under the analytical conditions specified above the cyclic voltametry shows the oxidation and reduction of the electrochemical mediator Potassium Ferrocyanide. The mean oxidation value detected was 0.420 milliamps.

1/ impedimento sterico generato dalla funzionalizzazione (coating) del nanosensore con gli anticorpi anti CD2 e dal legame dei linfociti T CD2+ agli anticorpi stessi provocava una caduta media del segnale elettrico di circa 0,478 milliampere rispetto al nanosensore funzionaliz zato con soli anticorpi anti CD2 e di circa 0,578 milliampere rispetto al nanosensore non funzionaliz zato (blank). 1 / steric hindrance generated by the functionalization (coating) of the nanosensor with anti CD2 antibodies and by the binding of CD2 + T lymphocytes to the antibodies themselves caused an average drop in the electrical signal of about 0.478 milliamps compared to the nanosensor functionalized with only anti CD2 antibodies and about 0.578 milliamps compared to the non-functionalized nanosensor (blank).

Per concludere, il procedimento sperimentale impiegato dimostra che il nanosensore può essere facilmente funzionalizzato utilizzando dei protocolli chimici ampiamente consolidati, la misura della variazione della intensità di corrente può, inoltre, fornire un parametro oggettivo di controllo della procedura di funzionalizzazione stessa. L'impedimento sterico generato dal legame dell 'anticorpo con il suo antigene condiziona in modo quantitativo il segnale elettrico prodotto dal processo di ossidoriduzione del mediatore elettrochimico presente nella soluzione di lavoro (Ferrocianuro di Potassio) ; pertanto è possibile ottenere una misura quantitativa di un antigene a concentrazione incognita previa taratura del nanosensore con soluzioni del medesimo a concentrazione nota. To conclude, the experimental procedure used demonstrates that the nanosensor can be easily functionalized using well-established chemical protocols, the measurement of the variation of the current intensity can also provide an objective control parameter of the functionalization procedure itself. The steric hindrance generated by the binding of the antibody with its antigen quantitatively conditions the electrical signal produced by the redox process of the electrochemical mediator present in the working solution (Potassium Ferrocyanide); therefore it is possible to obtain a quantitative measurement of an antigen with an unknown concentration after calibrating the nanosensor with solutions of the same at a known concentration.

Si è in pratica constatato come il sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, ed il relativo procedimento produttivo, secondo il presente trovato, assolvano il compito nonché gli scopi prefissati in quanto con un procedimento semplice è possibile realizzare uno o più nanoelettrodi le cui proprietà si concretizzano in un esponenziale miglioramento del rapporto segnale/rumore e nel conseguente incremento della sensibilità analitica. In practice it has been found that the electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, and the relative production process, according to the present invention, accomplish the intended aim and objects since with a simple process it is possible realize one or more nanoelectrodes whose properties are realized in an exponential improvement of the signal / noise ratio and in the consequent increase of the analytical sensitivity.

Il sensore elettrochimico, particolarmente per l'analisi qualitativa e quantitativa di molecole di varia specie, ed il relativo procedimento produttivo, così concepiti sono suscettibili di numerose modifiche e varianti tutte rientranti nell'ambito del concetto inventivo. The electrochemical sensor, particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules of various species, and the relative production process, thus conceived, are susceptible of numerous modifications and variations, all of which are within the scope of the inventive concept.

Inoltre, tutti i dettagli potranno essere sostituiti da altri elementi tecnicamente equivalenti . Furthermore, all the details can be replaced by other technically equivalent elements.

In pratica, i materiali impiegati, purché compatibili con l'uso specifico, nonché le dimensioni e le forme contingenti potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze. In practice, the materials employed, so long as they are compatible with the specific use, as well as the contingent shapes and dimensions, may be any according to requirements.

Claims

CLAIMS 1. Electrochemical sensor (1), particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules, characterized in that it comprises at least one working electrode (2a, 2b), at least one reference electrode (3) and at least one counter electrode (4) operatively connected to a potentiostat (5) adapted to control them independently from each other, said electrodes (2a, 2b, 3, 4) being partially submersible a working solution (6) confined in a reaction container (7).

2. Electrochemical sensor (1) according to claim 1, characterized in that said working solution (6) is comprised between a solution of the aqueous type, a solution consisting of ionic liquids, a solution consisting of aprotic solvents with a low dielectric constant.

Electrochemical sensor (1) according to claim 1 or 2, characterized in that said at least one working electrode (2a) comprises an electrically insulating substrate (8) and a conductive layer (9) mutually associated by means of an intermediate layer (10 ) adhesive, said conductive layer (9) being coated with a thickness of electrically insulating material (11), the thickness of the perimeter of said at least one working electrode (2a) being dimensionally variable from 1 to 100 nanometers and said at least one work (2a) presenting a single electrochemically active surface.

4. Electrochemical sensor (1) according to claim 1 or 2, characterized in that said at least one working electrode (2b) comprises an electrically insulating substrate (8), a plurality of conductive layers (9) and a plurality of thicknesses of electrically insulating material (il) associated and altering each other.

5. Electrochemical sensor (1) according to claim 4, characterized in that each of said conductive layers (9) are electrically independent from each other in order to allow multiple detections.

Electrochemical sensor (1) according to one or more of claims 1 to 3, characterized in that said at least one working electrode (2a) is of the functionalized type.

7. Electrochemical sensor (1) according to claim 6, characterized in that said at least one working electrode (2a) is made by direct functionalization.

8. Electrochemical sensor (1), according to claim 6, characterized in that said at least one working electrode (2a) is made by indirect functionalization.

Electrochemical sensor (1) according to claim 6, characterized in that said at least one working electrode (2a) is made by functionalization of the electrochemically active surface.

10. Process for manufacturing an electrochemical sensor (1), particularly for the qualitative and quantitative analysis of molecules, according to one or more of the preceding claims, characterized in that it comprises the following steps for manufacturing at least one of said electrodes ( 2a, 2b, 3, 4): - depositing said intermediate adhesive layer (10) on said electrically insulating substrate (8); - depositing said at least one conductive layer (9) on said intermediate adhesive layer (10); depositing said thickness of electrically insulating material (11) on said at least one conductive layer (9).

11. Process according to claim 10, characterized in that it comprises a step of printing said reference electrode (3) and said counter electrode (4) on said thickness of electrically insulating material (11).

12. Process according to claim 10, characterized in that it comprises a plurality of deposition steps of said conductive layers (9) on said electrically insulating substrate (8) and of deposition steps of said thicknesses of electrically insulating material (11) on each of said conductive layers (9) in an alternating manner.

13. Process according to claim 10, characterized in that it comprises a functionalization step of said working electrode (2a) towards one or more analyte molecules.

14. Process according to one or more of claims 10 to 13, characterized in that it comprises a step for cleaning the electrochemically active surface of said working electrode (2a).

15. Process according to claim 14, characterized in that said cleaning step comprises washing said electrochemically active surface with an acid solution followed by a sequence of low speed potentiometric scans.