KR102270811B1 - Electrochemical biosensor based on hybrid graphene electrode - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 하이브리드 그래핀 전극 기반 알츠하이머 특이항원 검출용 전기화학 바이오 센서에 관한 것으로, 보다 자세하게는 금속나노입자와 그패핀의 가교결합에 의한 3차원 구조 형성 및 이러한 구조적 특징에 의한 높은 전기화학 특성을 갖는 바이오센서를 이용하여, 저농도의 알츠하이머 특이항원에 대해 선택성 및 특이성이 우수한 특징이 있는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서에 관한 것이다. The present invention relates to an electrochemical biosensor for detecting Alzheimer's-specific antigen based on a hybrid graphene electrode, and more particularly, the formation of a three-dimensional structure by crosslinking of metal nanoparticles and graphene, and high electrochemical properties due to these structural features. It relates to a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor having excellent selectivity and specificity for a low concentration of Alzheimer's-specific antigen by using a biosensor with
전기화학 바이오센서란 전기화학 반응을 이용해 전극으로 바이오 물질의 특정정보를 신호로 변화시키는 센서를 의미한다. 즉, 전기화학적 생화학반응을 발생시키는 물질 (효소, 유기용매 등)과 효소 반응 물질을 반응시키게 되면 효소 반응 결과 물질이 발생하고, 이 결과 물질을 전기화학 반응으로 측정하는 전극을 이용해 바이오 물질의 특정 정보를 정량적인 신호로 변환시키는 바이오센서를 의미한다.The electrochemical biosensor refers to a sensor that converts specific information of a biomaterial into a signal with an electrode using an electrochemical reaction. In other words, when a material that generates an electrochemical biochemical reaction (enzyme, organic solvent, etc.) and an enzyme reaction material are reacted, a material is generated as a result of the enzyme reaction, and an electrode that measures the resultant material by an electrochemical reaction is used to identify the biomaterial. It refers to a biosensor that converts information into quantitative signals.
바이오센서 중에 생물학적 인식과정에서 발생하는 생물학적 특이성(Specificity)을 갖도록 항원-항체 결합을 기반으로하는 면역센서는 바이오마커와 같이 임상진단에서 질병과 관련된 물질을 감지하는데 널리 사용되고 있다. 전기화학 신호를 발생시키는 효소 등의 물질을 항체에 연결하여 효소 반응으로 발생한 전기화학 물질을 측정하면, 항원에 대한 항체의 특이결합에 때문에 선택적으로 바이오마커인 항원을 검출한다.Among biosensors, immune sensors based on antigen-antibody binding so as to have biological specificity generated in the biological recognition process are widely used to detect disease-related substances such as biomarkers in clinical diagnosis. When a substance such as an enzyme that generates an electrochemical signal is connected to an antibody and an electrochemical substance generated by an enzyme reaction is measured, an antigen, which is a biomarker, is selectively detected due to the specific binding of the antibody to the antigen.
면역센서는 샌드위치형(sandwich-type) 면역센서와 비표지(label-free)면역 센서 두 가지 종류가 있다. 비표지면역 센서는 항원-항체 결합을 바로 측정할 수 있어 편이성, 신속성 및 민감도 등이 뛰어날뿐만 아니라 비용이 절감되어 경제성이 뛰어나 주목할만한 바이오마커 검출 분석 도구이다.There are two types of immune sensors: a sandwich-type immune sensor and a label-free immune sensor. The non-labeled immune sensor is a remarkable biomarker detection and analysis tool because it can directly measure antigen-antibody binding, so it is not only excellent in convenience, speed and sensitivity, but also economical due to reduced cost.
이와 달리, 샌드위치형은 기재표면에 항원과 결합할 수 있는 일차(primary)항체가 고정되고, 전립선 특이항원과 결합할 수 있는 표지된 항체(labeled antibody)가 이차(secondary)항체로서 사용된다. 샌드위치형에서는 일차 및 표지된 이차항체를 사용함으로서 항원-항체 결합 효율, 선택성, 민감도 및 신호 증폭 효과를 얻을 수 있다. In contrast, in the sandwich type, a primary antibody capable of binding an antigen is immobilized on the surface of a substrate, and a labeled antibody capable of binding a prostate-specific antigen is used as a secondary antibody. In the sandwich type, antigen-antibody binding efficiency, selectivity, sensitivity and signal amplification effects can be obtained by using primary and labeled secondary antibodies.
본 발명에서는 전기화학 반응을 측정하는 샌드위치형(sandwich-type) 면역센서에 관한 것으로 면역센서가 특이 항원을 감지할 수 있도록 민감도가 금속-하이브리드 그래핀 복합체로 구성된 면역 센서에 관한 것이다. The present invention relates to a sandwich-type immunosensor for measuring an electrochemical reaction, and to an immune sensor composed of a metal-hybrid graphene complex having a sensitivity so that the immune sensor can detect a specific antigen.
그래핀은 전기적, 기계적, 화학적 특성이 매우 안정적이고 뛰어날 뿐만 아니라 우수한 전도성 물질로서 실리콘 보다 약 100 배 빠르게 전자를 이동시키며 구리보다도 약 100 배 가량 더 많은 전류를 흐르게 할 수 있는 물질로서, 이의 제조 및 응용에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다.Graphene is a material that can move electrons about 100 times faster than silicon and flow about 100 times more current than copper as an excellent conductive material as well as very stable and excellent electrical, mechanical, and chemical properties. Research on the application is actively progressing.
이를 응용한 바이오센서로 항원-항체 결합을 기반으로하는 면역센서에 활용될 수 있다. 면역센서는 바이오마커와 같이 임상진단에서 질병과 관련된 물질을 감지하는데 널리 사용되고 있다. 효소기반 면역분석법(ELISA, Enzyme Liked Imuuno-Sorbant Assay)는 효소가 연결된 항체가 항원에 특이적으로 결합하게 되고, 효소 반응으로 발생하는 물질을 측정하여 선택적으로 바이오마커인 항원을 검출하는 방법이다. 본 발명은 효소 반응으로 발생하는 전기화학물질을 하이브리드 그래핀 전극으로 측정하는 전기화학 바이오센서를 제공한다.As a biosensor to which this is applied, it can be used for immune sensors based on antigen-antibody binding. Immune sensors are widely used to detect disease-related substances in clinical diagnosis, such as biomarkers. Enzyme-based immunoassay (ELISA, Enzyme Liked Imuuno-Sorbant Assay) is a method of selectively detecting an antigen, a biomarker, by measuring a substance produced by an enzyme-linked antibody specifically binding to an antigen and enzymatic reaction. The present invention provides an electrochemical biosensor that measures an electrochemical material generated by an enzymatic reaction with a hybrid graphene electrode.
그리하여 바이오센서 등에 그래핀을 적용하는 연구가 활발히 이루어지고 있고 그래핀이 극히 높은 민감도를 가지는 전기화학적 바이오센서의 개발에 효과적으로 기여할 수 있는 것으로 알려져있다.Therefore, research on applying graphene to biosensors is being actively conducted, and it is known that graphene can effectively contribute to the development of electrochemical biosensors with extremely high sensitivity.
한국 등록특허 제1400976호에서는 환원된 그래핀 산화물 층에 분자 링커를 연결하고 금속 나노입자 층을 더한 바이오센서를 개시하고 있으나, 수평적 구조로 되어 있어 3차원 구조가 아니며 분자 링커가 제한되고, 한국 등록특허 1339403에서는 환원 그래핀 산화물-금속 나노입자 복합필름을 개시하고 있으나 이를 바이오센서로서 이용할수 있는 가능성 정도만이 제시된 것으로 보인다.Korean Patent Registration No. 1400976 discloses a biosensor in which a molecular linker is connected to a reduced graphene oxide layer and a metal nanoparticle layer is added, but it has a horizontal structure, so it is not a three-dimensional structure, and the molecular linker is limited. Registered Patent 1339403 discloses a reduced graphene oxide-metal nanoparticle composite film, but it seems that only the degree of possibility of using it as a biosensor is presented.
이에 본 발명자는 광화학 및 광열 조사를 이용하여 제조한 3차원 형태의 은나노파우더(AgNP)-그래핀 복합체를 이용하여 인터디지테이티드 전극을 개발하였으며, 상기 전극은 선택성, 특이성, 경제성뿐만 아니라 높은 민감도를 가지고 재현성이 뛰어나 본 발명의 전기화학 바이오센서로 활용될 수 있다. Accordingly, the present inventors developed an interdigitated electrode using a three-dimensional silver nanopowder (AgNP)-graphene composite prepared using photochemical and photothermal irradiation, and the electrode has high sensitivity as well as selectivity, specificity, and economy. It has excellent reproducibility and can be used as the electrochemical biosensor of the present invention.
본 발명의 목적은 은나노파우더(AgNP)와 그패핀의 가교결합에 의한 3차원 구조 형성 및 이러한 구조적 특징에 의한 높은 전기 전도성 특성을 이용한 IDA 전극의 전기화학 바이오센서는 저농도의 항원에 대해 선택성 및 특이성이 우수하며, 특히 치매 특이항원의 검출을 위한 면역센서에 최적화된 치매 특이항원 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서를 제공하는 것에 있다. It is an object of the present invention to form a three-dimensional structure by crosslinking silver nanopowder (AgNP) and graphene and to provide an electrochemical biosensor of an IDA electrode using high electrical conductivity properties due to these structural features selectivity and specificity for a low concentration of antigen This is excellent, in particular, to provide a dementia-specific antigen hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor optimized for an immune sensor for the detection of dementia-specific antigen.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명은 생화학 반응을 발생시키는 효소; 상기 효소와 반응하는 반응 물질; 상기 효소 반응에 의해 발생되는 결과 물질; 상기 효소 반응 결과물질을 감지하는 측정 전극으로 구성되되, 상기 측정 전극은 미세금속입자(Micro Metal Particle)와 그래핀 복합층이 혼합된 구조를 가지는 그래핀 금속 복합체로 구성되고, 상기 그래핀 금속 복합체를 통하여 전자의 흐름이 발생하는 것에 특징이 있는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오 센서를 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention provides an enzyme for generating a biochemical reaction; a reactant reacting with the enzyme; a resultant produced by the enzymatic reaction; It is composed of a measuring electrode for detecting the resultant material of the enzyme reaction, wherein the measuring electrode is composed of a graphene metal composite having a structure in which micro metal particles and a graphene composite layer are mixed, and the graphene metal composite To provide a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor characterized in that electrons flow through it.
또한 본 발명은 반응챔버; 상기 반응챔버 내면에 결합된 알츠하이머 1차항체; 효소와 결합된 2차항체; 상기 1차항체 및 2차항체와 동시에 결합되는 알츠하이머 질병인자 항원; 상기 효소와 반응하는 효소기질; 상기 효소기질과 효소와 반응에 의해 발생되는 전기화학물질; 상기 전기화학 물질에 의해 발생되는 전류 신호를 감지하는 그래핀 금속 복합체로 구성되되, 상기 그래핀 금속 복합체는 미세금속입자(Micro Metal Particle)와 그래핀 복합층이 혼합된 구조인 것에 특징이 있는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오 센서를 제공한다. In addition, the present invention is a reaction chamber; Alzheimer's primary antibody bound to the inner surface of the reaction chamber; enzyme-conjugated secondary antibody; Alzheimer's disease factor antigen simultaneously bound to the primary and secondary antibodies; an enzyme substrate reacting with the enzyme; an electrochemical substance generated by a reaction between the enzyme substrate and the enzyme; It is composed of a graphene metal composite that senses a current signal generated by the electrochemical material, wherein the graphene metal composite is a hybrid characterized in that it has a structure in which micro metal particles and a graphene composite layer are mixed. A graphene electrode-based electrochemical biosensor is provided.
또한 본 발명은 상기 그래핀 복합층은 여러 층의 그래핀이 적층되고 임의의 방향으로 굽혀져 있는 3차원 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오 센서를 제공한다. In addition, the present invention provides a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor, characterized in that the graphene composite layer has a three-dimensional structure in which several layers of graphene are stacked and bent in an arbitrary direction.
또한 본 발명은 상기 미세금속입자 사이 빈 공간의 일부가 그래핀 복합층으로 채워진 형태의 다공성 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오 센서를 제공한다. In addition, the present invention provides a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor, characterized in that a part of the empty space between the fine metal particles is filled with a graphene composite layer to form a porous structure.
또한 본 발명은 상기 하이브리드 그래핀 전극은 상기 금속 복합체로 제조된 두 개의 분리된 전극이 인접하게 위치한 인터디지테이티드 전극으로 구성되어 외부 전자의 유입 혹은 방출이 발생하는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오 센서를 제공한다. In the present invention, the hybrid graphene electrode is composed of an interdigitated electrode in which two separate electrodes made of the metal composite are located adjacent to each other, so that the inflow or emission of external electrons occurs in the hybrid graphene electrode-based electrochemical bio sensor is provided.
또한 본 발명은 상기 생화학 반응은 알츠하이머 질병인자를 검출하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오 센서를 제공한다. In addition, the present invention provides a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor, characterized in that the biochemical reaction detects Alzheimer's disease factors.
또한 본 발명은 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 분리된 혈장에 포함된 질병인자 항원이 효소가 연결된 2차항체와 결합하는 단계; 상기 항원과 결합된 2차항체가 반응챔버로 이동하는 단계; 이동된 항원이 반응챔버 내면에 고정된 1차항체와 결합하는 단계; 반응챔버 내면을 세척용액으로 세척하는 단계;효소기질이 포함된 용액을 챔버로 이동시켜 상기 2차항체와 연결된 효소와 반응시키는 단계; 및 상기 효소기질과 효소가 반응하여 발생되는 전류신호를 감지하는 단계;로 구성된 하이브리드 그래핀 전극 기반 특이항원 검출방법를 제공한다. The present invention also comprises the steps of separating plasma from blood; a step of binding the disease agent antigen contained in the separated plasma to an enzyme-linked secondary antibody; moving the antigen-bound secondary antibody to a reaction chamber; binding the transferred antigen to the primary antibody immobilized on the inner surface of the reaction chamber; Washing the inner surface of the reaction chamber with a washing solution; Moving the solution containing the enzyme substrate into the chamber to react with the enzyme linked to the secondary antibody; and detecting a current signal generated by the reaction between the enzyme substrate and the enzyme; provides a hybrid graphene electrode-based specific antigen detection method consisting of.
또한 본 발명은 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 상기 분리된 혈장에 포함된 알츠하이머 질병인자 항원과 반응챔버 내면에 고정된 1차항체와 결합하는 단계; 상기 1차항체와 결합되지 않은 질병인자 항원을 세척하는 단계; 효소와 연결된 2차항체가 상기 1차항체와 결합된 질병인자 항원에 결합하는 단계; 상기 질병인자 항원과 결합되지 않은 효소와 연결된 2차항체를 세척하는 단계; 및 효소기질이 포함된 용액을 챔버로 이동시켜 상기 2차항체와 연결된 효소와 반응시키는 단계; 및 상기 효소기질과 효소가 반응하여 발생되는 전류신호를 감지하는 단계;로 구성된 하이브리드 그래핀 전극 기반 특이항원 검출방법를 제공한다. The present invention also comprises the steps of separating plasma from blood; binding to the Alzheimer's disease factor antigen contained in the separated plasma and the primary antibody immobilized on the inner surface of the reaction chamber; washing the disease agent antigen not bound to the primary antibody; binding the secondary antibody linked to the enzyme to the disease agent antigen bound to the primary antibody; washing the secondary antibody linked to the enzyme not bound to the disease agent antigen; and moving the solution containing the enzyme substrate into the chamber to react with the enzyme linked to the secondary antibody; and detecting a current signal generated by the reaction between the enzyme substrate and the enzyme; provides a hybrid graphene electrode-based specific antigen detection method consisting of.
본 발명은 은나노파우더(AgNP)와 그패핀의 가교결합에 의한 3차원 구조 형성 및 이러한 구조적 특징에 의한 높은 전기 전도성 특성을 이용한 IDA 전극의 전기화학 바이오센서를 이용하는 것으로, 저농도의 항원에 대해 선택성 및 특이성이 우수하며, 특히 치매 특이항원의 검출을 위한 최적화된 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서의 특징을 갖는다. The present invention uses an electrochemical biosensor of an IDA electrode using a three-dimensional structure formation by crosslinking of silver nanopowder (AgNP) and graphene and high electrical conductivity by such structural features, and selectivity and It has excellent specificity and, in particular, has the characteristics of an optimized hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor for the detection of dementia-specific antigen.
도 1은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 하이브리드 그래핀 전극의 전자현미경(SEM) 사진이다.
도 2는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 하이브리드 그래핀 전극(그래핀 금속 복합체)과 금속전극, 그래핀 전극의 전기 전도성 특성을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 하이브리드 그래핀 전극(그래핀 금속 복합체)과 금속전극, 그래핀 전극의 전기화학 측정물질(PAP)의 농도에 따른 측정 전류를 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 하이브리드 그래핀 전극(그래핀 금속 복합체)과 금속전극, 그래핀 전극에 대해 같은 농도의 PAP에 대해 측정한 전류신호의 차이를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 전기화학 반응을 통해 인터디지테이티드 전극에서 신호를 측정하는 원리를 보여주는 개념도이다.
도 6은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 전기화학 반응을 측정하기 위해 본 발명에서 제작한 인터디지테이트 전극의 개념도이다.
도 7은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 사진과 전극을 구성하는 금속 그래핀 복합체의 전자현미경(SEM) 사진이다.
도 8은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 복합체를 이용한 인터디지테이티드 전극(IDE)의 성능을 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극으로 금(Au)박막을 사용할 경우 PAP 농도에 따른 측정전류값을 보여준다.
도 10a, 도 10b, 도 10c는 알츠하이머 생체지표(biomaker)의 종류에 따른 전기화학 바이오센서의 민감도를 나타내는 그래프이다.
도 11a, 도 11b는 본 발명인 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서를 이용한 알츠하이머 특이항원 검출방법에 대한 두개의 순서도이다.
도 12a, 도 12b는 본 발명인 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서 기반 알츠하이머 특이항원 검출방법에 대한 두개의 모식도이다. 1 is an electron microscope (SEM) photograph of a hybrid graphene electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention.
2 is a graph comparing the electrical conductivity characteristics of the hybrid graphene electrode (graphene metal composite), the metal electrode, and the graphene electrode of the interdigitated electrode for the electrochemical biosensor of the present invention.
3 is a graph showing the measured current according to the concentration of the electrochemical measuring material (PAP) of the hybrid graphene electrode (graphene metal composite), the metal electrode, and the graphene electrode of the interdigitated electrode for the electrochemical biosensor of the present invention; to be.
4 is a graph showing the difference in current signals measured for PAP of the same concentration with respect to the hybrid graphene electrode (graphene metal composite), the metal electrode, and the graphene electrode of the interdigitated electrode for the electrochemical biosensor of the present invention; to be.
5 is a conceptual diagram illustrating a principle of measuring a signal in an interdigitated electrode through an electrochemical reaction of the interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention.
6 is a conceptual diagram of an interdigitated electrode manufactured in the present invention to measure the electrochemical reaction of the interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention.
7 is a photograph of an interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention and an electron microscope (SEM) photograph of a metal graphene composite constituting the electrode.
8 is a graph analyzing the performance of an interdigitated electrode (IDE) using the complex for an electrochemical biosensor according to the present invention.
9 shows measured current values according to PAP concentration when a gold (Au) thin film is used as an interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention.
10A, 10B, and 10C are graphs showing the sensitivity of the electrochemical biosensor according to the type of Alzheimer's biomarker.
11A and 11B are two flow charts for the Alzheimer's-specific antigen detection method using the electrochemical biosensor based on the hybrid graphene electrode according to the present invention.
12A and 12B are two schematic diagrams of the method for detecting an Alzheimer's specific antigen based on an electrochemical biosensor based on a hybrid graphene electrode according to the present invention.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. First, in describing the present invention, detailed descriptions of related known functions or configurations are omitted so as not to obscure the gist of the present invention.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 '약', '실질적으로' 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.As used herein, the terms 'about', 'substantially' and the like are used in or close to the numerical value when manufacturing and material tolerances inherent in the stated meaning are presented, and provide an understanding of the present invention. To help, precise or absolute figures are used to prevent unfair use by unscrupulous infringers of the stated disclosure.
본 발명은 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서에 관한 것으로 구성은 아래와 같다. The present invention relates to a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor, and the configuration is as follows.
생화학 반응을 발생시키는 효소; 상기 효소와 반응하는 반응 물질; 상기 효소 반응에 의해 발생되는 결과 물질; 상기 효소 반응 결과물질을 감지하는 측정 전극으로 구성되되, 상기 측정 전극은 미세금속입자(Micro Metal Particle)와 그래핀 복합층이 혼합된 구조를 가지는 그래핀 금속 복합체로 구성될 수 있으며,enzymes that cause biochemical reactions; a reactant reacting with the enzyme; a resultant produced by the enzymatic reaction; It consists of a measuring electrode for sensing the resultant material of the enzyme reaction, wherein the measuring electrode may be composed of a graphene metal composite having a structure in which micro metal particles and a graphene composite layer are mixed,
상기 그래핀 금속 복합체를 통하여 전자의 흐름이 발생하는 것에 특징이 있는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서에 관한 것이다. It relates to a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor characterized in that electrons flow through the graphene metal composite.
또한 본 발명은 반응챔버; 상기 반응챔버 내면에 결합된 알츠하이머 1차항체; 효소와 결합된 2차항체; 상기 1차항체 및 2차항체와 동시에 결합되는 알츠하이머 질병인자 항원; 상기 효소와 반응하는 효소기질; 상기 효소기질과 효소와 반응에 의해 발생되는 전류 신호를 감지하는 인터디지테이티드 전극으로 구성될 수 있다. In addition, the present invention is a reaction chamber; Alzheimer's primary antibody bound to the inner surface of the reaction chamber; enzyme-conjugated secondary antibody; Alzheimer's disease factor antigen simultaneously bound to the primary and secondary antibodies; an enzyme substrate reacting with the enzyme; It may be composed of an interdigitated electrode that detects a current signal generated by the reaction between the enzyme substrate and the enzyme.
이때 상기 인터디지테이티드 전극은 일부가 연결된 다공성 구조의 은나노파우더(AgNP)와 상기 다공성 구조가 그래핀으로 채워진 구조의 복합체로 구성된다. In this case, the interdigitated electrode is composed of a composite of silver nanopowder (AgNP) having a partially connected porous structure and a structure in which the porous structure is filled with graphene.
본 발명 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서는 알츠하이머 특이항원을 검출할 수 있으며 크게 반응챔버와 인터디지테이티드 전극으로 2개의 구성으로 구분될 수 있다. The hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor of the present invention can detect Alzheimer's-specific antigen and can be largely divided into two components: a reaction chamber and an interdigitated electrode.
먼저 반응챔버에 대해 설명을 하면, 반응챔버내에서는 효소면역정량법(ELISA)반응으로 진행된다. 효소면역정량법은 오늘날 가장 널리 이용되는 면역정량법이다. 알츠하이머 질병인자 항원이 1차항체 및 2차항체와 동시에 결합된다. 이때 1차 항체는 반응챔버 내면에 고정되어 있다. First, the reaction chamber is explained, and an enzyme immunoassay (ELISA) reaction is carried out in the reaction chamber. Enzyme immunoassay is the most widely used immunoassay method today. The Alzheimer's disease factor antigen is simultaneously bound to the primary antibody and the secondary antibody. At this time, the primary antibody is fixed on the inner surface of the reaction chamber.
상기 2차항체는 효소(Alkaline Phosphatase, 이하 AP)가 붙여진 상태이며, 이후 전기 활성 효소기질 p-아미노 페닐포스페이트(이하 PAPP) 용액을 반응 챔버로 이동시키면 PAPP가 AP효소와 반응하여 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)로 변환된다. 즉, 본 발명에서 생화학 반응을 발생시키는 효소는 AP이고, 이와 반응하는 반응물질이 효소기질 p-아미노 페닐포스페이트이며, 상기 효소 반응에 의해 발생되는 결과 물질이 p-아미노 페놀 (PAP)에 해당된다. The secondary antibody has an enzyme (Alkaline Phosphatase, hereinafter, AP) attached thereto, and then, when the electroactive enzyme substrate p-aminophenyl phosphate (hereinafter PAPP) solution is moved to the reaction chamber, the PAPP reacts with the AP enzyme and the electroactive product p -Converted to aminophenol (PAP). That is, in the present invention, the enzyme that generates the biochemical reaction is AP, the reactant reacting with it is the enzyme substrate p-amino phenyl phosphate, and the resultant material generated by the enzyme reaction corresponds to p-aminophenol (PAP). .
여기까지는 반응챔버에서 발생되는 면역반응에 대해서 설명을 한 것이며, 이후는 효소기질과 효소와 반응에 의해 발생되는 전류 신호를 감지하는 인터디지테이티드 전극(이하 IDA 전극)에 대해서 설명한다. The immune reaction generated in the reaction chamber has been described so far, and the interdigitated electrode (hereinafter, IDA electrode) that detects the current signal generated by the reaction with the enzyme substrate and the enzyme will be described.
본 발명은 유리 기판위에 새로운 금속 하이브리드(Metal-Hybrid) 다공성 그래핀 재료를 제조하여 이를 이용해 그래핀 IDA 전극에 활용하는 것이다. 미세 금속입자(즉, 미세 은(Ag) 입자)를 그래핀과 가교시키는 것으로 미세금속입자의 비율이 증가할수록, 금속 하이브리드(Metal-Hybrid) 그래핀 전극의 전도성이 증가한다. 미세금속입자와 함께 그래핀의 SP2 탄소 원자 결합을 생성하여 높은 전자 이동 특성과 매우 넓은 표면적을 가진다.The present invention is to prepare a new metal-hybrid porous graphene material on a glass substrate and use it for a graphene IDA electrode. As the ratio of fine metal particles increases by crosslinking fine metal particles (ie, fine silver (Ag) particles) with graphene, the conductivity of the metal-hybrid graphene electrode increases. It has high electron transfer properties and a very large surface area by creating SP 2 carbon atom bonding of graphene with fine metal particles.
도 12는 본 발명에서 효소기질과 효소가 산화환원 반응에 의해 발생되는 전류신호의 모식도(a) 및 발생된 전류신호를 감지하는 IDA전극(b)에 대한 설명도이다. 12 is a schematic diagram (a) of a current signal generated by a redox reaction between an enzyme substrate and an enzyme in the present invention and an explanatory diagram of an IDA electrode (b) for sensing the generated current signal.
인터디지테이티드(Inter Digitated Array, IDA) 전극은 전기화학 방식으로 전해물질(본 발명에서는 PAP)의 농도를 측정한다. IDA 전극은 전기화학적 산화 환원 반응이 최대한 넓은 면적에서 발생할 수 있도록, 손가락 모양으로 제작된 양극과 음극의 작동 전극을 교차시켜서 여러 개의 손가락 쌍 (Finger Pair) 구조로 제작된다. 본 발명은 금속 하이브리드(Metal-Hybrid) 그래핀을 이용하여 IDA 전극을 제작하였으며, 측정되는 신호를 최대화하기 위하여 여러 쌍의 작동 전극을 5mm x 3mm의 넓은 감지 영역으로 설계함이 바람직하다. 또한, 금속 하이브리드(Metal-Hybrid) IDA의 각 핑거 전극은 너비가 400μm이고, 전극 사이의 간격은 100μm이 바람직하다. 더욱이, 카운터 및 기준 전극은 또한 작업 전극과 함께 제조되었다. MHG IDA 전극은 전기 화학적 검출을 위한 두 손가락 전극 사이에서 우수한 감도, 높은 전기 촉매 성능 및 우수한 전자 이동으로 나타낸다.An inter digitated array (IDA) electrode measures the concentration of an electrolyte (PAP in the present invention) by an electrochemical method. The IDA electrode is fabricated in a multi-finger pair structure by crossing the working electrodes of the anode and cathode made in the shape of a finger so that the electrochemical redox reaction can occur over a wide area. In the present invention, an IDA electrode is fabricated using metal-hybrid graphene, and it is preferable to design several pairs of working electrodes with a wide sensing area of 5 mm x 3 mm in order to maximize the measured signal. In addition, each finger electrode of the metal-hybrid IDA has a width of 400 μm, and an interval between the electrodes is preferably 100 μm. Moreover, counter and reference electrodes were also fabricated with working electrodes. The MHG IDA electrode exhibits excellent sensitivity, high electrocatalytic performance and good electron transfer between two finger electrodes for electrochemical detection.
또한 IDA의 전기 화학적 반응은 두 전극 핑거 사이의 산화 환원 반응에 기초한다. 산화 환원 반응은 IDA 전극의 민감한 전기 화학적 검출을 위해 2개의 전극 사이에서 전류를 증폭시키는데 영향을 미친다. 산화 환원 반응 동안, 산화 환원 종은 양극과 음극 사이에서 재순환된다. 애노드(하나의 핑거 전극)는 산화되어 환원 된 분자를 생성 할 수 있고 캐소드(다른 핑거 전극)는 산화된 분자를 생성하도록 환원 될 수 있다. 산화 환원 분자의 재활용으로 인해, 전기 화학적 신호가 동시에 증폭된다. IDA의 치수 (즉, 전극 폭, 전극 핑거 쌍의 수 및 전극 갭)는 산화 환원 사이클을 최대화하기 위해 서로 맞물린 빗 구조로 설계된 것으로 결과적으로, 두 전극 사이의 갭은 전극의 손가락을 최대화하고 큰 전극 폭은 주어진주기에서 산화 환원주기의 수를 증가시킨다. 본 발명에서는 이러한 산화 환원 반응을 극대화하기 위하여, 전자의 방출과 유입이 우수하며 넓은 표면적을 가지는 그래핀과 전기 저항을 낮추기 위한 미세금속입자가 혼합된 금속 그래핀 복합체로 전극을 제작하였다. 이를 통해 매우 낮은 농도의 치매 바이오 마커를 측정할 수 있는 하이브리드 그래핀 IDA 전기화학 바이오센서를 개발하였다. In addition, the electrochemical reaction of IDA is based on the redox reaction between the two electrode fingers. The redox reaction affects the amplification of the current between the two electrodes for sensitive electrochemical detection of the IDA electrode. During redox reactions, redox species are recycled between the anode and cathode. The anode (one finger electrode) can be oxidized to produce reduced molecules and the cathode (the other finger electrode) can be reduced to produce oxidized molecules. Due to the recycling of redox molecules, the electrochemical signal is simultaneously amplified. The dimensions of the IDA (i.e., electrode width, number of electrode finger pairs, and electrode gap) are designed with interdigitated comb structures to maximize redox cycles. As a result, the gap between the two electrodes maximizes the fingers of the electrode and creates a larger electrode. The width increases the number of redox cycles in a given cycle. In the present invention, in order to maximize the oxidation-reduction reaction, an electrode was made of a metal graphene composite in which graphene having a large surface area and excellent emission and inflow of electrons and fine metal particles for lowering electrical resistance were mixed. Through this, a hybrid graphene IDA electrochemical biosensor capable of measuring very low concentrations of dementia biomarkers was developed.
본 발명에서 반응챔버 내의 ELISA 과정에서 효소(Enzyme) 반응에 의해 발생된 p-aminophenol(PAP)에 기반한 전기화학 신호를 IDA 전극에서 측정하여 알츠하이머를 진단하는 전기화학 바이오센서에 관한 것이다. The present invention relates to an electrochemical biosensor for diagnosing Alzheimer's disease by measuring an electrochemical signal based on p-aminophenol (PAP) generated by an enzyme reaction in an ELISA process in a reaction chamber at an IDA electrode.
Alkaline Phosphate(AP) 효소는 p-aminophenylphosphate(PAPP)와 반응하여, p-aminophenol(PAP)를 생성한다. 생성된 PAP는 나노간극 IDA의 산화전극에서 산화되어 Quinoneimine (QI)를 생성하고, QI는 환원전극에서 환원되어 PAP를 다시 생성시키는 순환 과정(Redox Cycle)을 통해 전류의 흐름을 발생시킨다. Alkaline Phosphate (AP) enzyme reacts with p-aminophenylphosphate (PAPP) to produce p-aminophenol (PAP). The generated PAP is oxidized at the anode of the nanogap IDA to generate quinoneimine (QI), and QI is reduced at the cathode to generate a current flow through the redox cycle to regenerate PAP.
이때 산화전극과 환원전극의 표면적이 넓고 전자의 흡수 및 방출 효율이 좋으면 신호가 더 커지며, 산화 환원 순환(Redox Cycle) 효율이 높아지면 단위시간당 전자의 흐름인 전류가 커진다. 따라서 같은 농도의 효소가 PAPP와 반응할 때, 전극의 표면적이 넓고 전자의 흡수 방출 효율이 우수하면 더 많은 전류를 발생시켜서 고감도 측정이 가능하다. At this time, when the surface area of the anode and the cathode is wide and the absorption and emission efficiency of electrons is good, the signal becomes larger, and when the redox cycle efficiency is increased, the current, which is the flow of electrons per unit time, is increased. Therefore, when an enzyme of the same concentration reacts with PAPP, if the electrode has a large surface area and excellent electron absorption and emission efficiency, more current is generated and high-sensitivity measurement is possible.
도 10a, 도 10b, 도 10c는 알츠하이머 생체지표(biomaker)의 종류에 따른 전기화학 바이오센서의 민감도를 나타내는 그래프이다. 10A, 10B, and 10C are graphs showing the sensitivity of the electrochemical biosensor according to the type of Alzheimer's biomarker.
(a), (b)는 효소 반응 시간에 따라 발생하는 전기화학 신호를 보여주는 그래프이다. 결과에서 나타나듯이 시간이 지날수록 효소 반응으로 발생되는 전기화학 물질인 PAP가 증가되지만 일정 시간이 지난 뒤에는 포화되는 현상을 보인다. (a), (b) are graphs showing electrochemical signals generated according to the enzyme reaction time. As shown in the results, PAP, the electrochemical material generated by the enzymatic reaction, increases as time passes, but after a certain period of time, it shows a phenomenon of saturation.
(c), (d)는 아밀로이드베타 42의 농도별로 ELISA 반응 후에 전기화학 신호를 측정한 것이다. 아밀로이드 베타 42의 농도가 낮을수록 신호의 크기는 낮아지며 본 개발 결과로 측정된 검출한계(LOD, Limit of Detection)는 0.102 fg/ml의 농도까지 측정되었다. 기존 기술의 검출한계는 1 pg/ml 인 것을 고려하면, 본 개발의 전기화학 바이오센서는 기존 기술 대비 10,000 배 높은 민감도를 보여준다.(c) and (d) are electrochemical signals measured after the ELISA reaction for each concentration of
(e), (f)는 아밀로이드베타 40의 농도별로 ELISA 신호를 측정한 것이고, (g), (h)는 p-tau의 농도별 ELISA 신호이고, (i), (j)는 t-tau의 농도별 ELISA 신호이다. 측정된 LOD는 아밀로이드베타-40은 0.112 fg/ml, p-tau는 0.134 fg/ml, t-tau는 0.138 fg/ml 이다. 측정된 LOD는 기존 기술 대비 대략 10,000배나 낮은 것으로서 기존 기술의 측정한계를 월등하게 뛰어넘는다는 것을 보여준다.(e), (f) are ELISA signals measured for each concentration of
본 발명에서는 현재 치매진단을 위해 측정되는 4개의 질병인자인 아밀로이드베타 40, 아밀로이드베타 42, 인산화타우(p-tau, phosphorylated tau), 총타우(t-tau, total tau)를 ELISA 방식 기반의 하이브리드 그래핀 전극으로 측정하였다. 뇌속에 존재하는 치매 바이오마커는 뇌와 혈관의 장벽 (Blood-Brain Barrier)로 인하여 혈액속으로 유입되기가 어렵기 때문에 혈액속에는 극히 미량이 포함되어 있다. In the present invention, four disease factors currently measured for dementia diagnosis,
따라서 이를 측정하기 위해서는 높은 민감도를 갖는 바이오센서의 개발이 매우 필요하다. 본 발명에서는 기존 기술 대비 10,000 배나 높은 민감도를 갖는 ELISA 기반의 하이브리드 그래핀 전극을 이용한 전기화학 바이오센서를 개발함으로서, 기존 기술의 한계를 월등하게 뛰어넘고 알츠하이머 진단을 위한 핵심 기술임을 실험 데이터를 통해 보여준다.Therefore, it is very necessary to develop a biosensor with high sensitivity to measure it. In the present invention, by developing an electrochemical biosensor using an ELISA-based hybrid graphene electrode having a sensitivity 10,000 times higher than that of the existing technology, it significantly surpasses the limitations of the existing technology and shows through experimental data that it is a key technology for Alzheimer's diagnosis .
상기 IDA 전극은, 예를 들어 전극간 간격이 10 내지 1000㎛, 10 내지 900㎛, 10 내지 800㎛, 10 내지 700㎛, 10 내지 600㎛, 10 내지 500㎛, 10 내지 450㎛, 10 내지 400㎛, 10 내지 350㎛, 10 내지 300㎛, 10 내지 250㎛, 10 내지 200㎛ 또는 10 내지 150㎛ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The IDA electrode has, for example, an inter-electrode spacing of 10-1000 μm, 10-900 μm, 10-800 μm, 10-700 μm, 10-600 μm, 10-500 μm, 10-450 μm, 10-400 μm. μm, 10 to 350 μm, 10 to 300 μm, 10 to 250 μm, 10 to 200 μm, or 10 to 150 μm, but is not limited thereto.
도 1은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 하이브리드 그래핀 전극의 전자현미경(SEM) 사진이다. (a)는 은(Ag)미세입자입자를 보여주는 사진으로 구형 형상의 입자 지름은 약 5 ㎛를 갖는다. (b)는 광화학 및 광열 조사를 사용하여 은(Ag)미세입자의 표면이 용융된 상태에서 인접 파우더와 결합 응고된 사진이다. 일부 파우더는 연결되지 않아 빈 공간이 형성된 것에 특징이 있다. (c)는 미세금속입자에 혼합될 그래핀의 사진이다. 1 is an electron microscope (SEM) photograph of a hybrid graphene electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention. (a) is a photograph showing fine silver (Ag) particles. The spherical particle diameter is about 5 μm. (b) is a photograph of the surface of silver (Ag) fine particles in a molten state using photochemical and photothermal irradiation, bonding and coagulation with adjacent powder. Some powders are not connected, so it is characterized in that an empty space is formed. (c) is a photograph of graphene to be mixed with fine metal particles.
그래핀은 탄소의 동소체 중 하나이며 탄소 원자들이 모여 2차원 평면을 이루고 있는 구조이다. 각 탄소 원자들은 육각형의 격자를 이루며 육각형의 꼭짓점에 탄소 원자가 위치하고 있는 모양이다. 나노 사이즈에서는 2차원 평면의 그래핀이 겹치거나 굽힌 구조로 불규칙적인 형상이 특징이다. Graphene is one of the allotropes of carbon and has a structure in which carbon atoms are gathered to form a two-dimensional plane. Each carbon atom forms a hexagonal lattice, and carbon atoms are located at the vertices of the hexagon. At the nano size, two-dimensional flat graphene is overlapped or bent, and its irregular shape is characteristic.
(d)는 본 발명의 하이브리드 그래핀 전극의 SEM 사진으로 (a)의 용융전 미세금속입자와 광화학 및 광열 반응으로 제조된 그래핀이 은(Ag)미세입자의 빈공간(b)에 위치하여 고정된 구조를 보여주고 있다. (d) is an SEM photograph of the hybrid graphene electrode of the present invention. The graphene prepared by photochemical and photothermal reaction with the micrometal particles before melting of (a) is located in the empty space (b) of the silver (Ag) microparticles. It shows a fixed structure.
기존 그래핀의 경우 고온 공정을 비롯해 복잡한 과정이 필요하지만, 광열 혹은 광화학 합성 그래핀은 원스텝 공정으로 비교적 간단하게 합성할 수 있다. Conventional graphene requires complicated processes including high-temperature processes, but photothermal or photochemically synthesized graphene can be synthesized relatively simply through a one-step process.
도 2는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 하이브리드 그래핀 전극(그래핀 금속 복합체)과 금속전극, 그래핀 전극의 전기 전도성 특성을 측정하여 비교한 그래프이다. 금(Au) 박막으로 제작된 전극의 경우에 비하여, 그래핀 전극은 측정된 전류 신호가 더 커지게 된다. 이는 다공성 구조로 인하여 전극의 표면적이 넓고 그래핀을 통해 전자의 유입 및 방출이 우수해 전기화학 반응으로 발생하는 전자의 흐름이 더 크기 때문이다. 그래핀 금속 복합체 전극의 경우에는 그래핀 전극의 장점을 모두 가지면서 금속 입자로 인해 전도성이 좋아져서 전극의 저항이 매우 낮아지게 된다. 따라서 3가지 종류의 전극을 이용하여 전기화학 신호를 측정할 때, 그래핀 금속 복합체 전극으로 측정할 때 가장 큰 전류 신호를 발생시키게 된다. 2 is a graph comparing the electrical conductivity characteristics of the hybrid graphene electrode (graphene metal composite), the metal electrode, and the graphene electrode of the interdigitated electrode for the electrochemical biosensor of the present invention. Compared to the electrode made of the gold (Au) thin film, the measured current signal of the graphene electrode becomes larger. This is because, due to the porous structure, the electrode has a large surface area and excellent electron inflow and outflow through graphene, so that the electron flow generated by the electrochemical reaction is greater. In the case of the graphene metal composite electrode, while having all the advantages of the graphene electrode, conductivity is improved due to the metal particles, so that the resistance of the electrode is very low. Therefore, when measuring an electrochemical signal using three types of electrodes, the largest current signal is generated when measuring with a graphene metal composite electrode.
이때, 민감도는 측정 전류 신호(signal)의 절대값이 클수록 우수하다. 따라서 본 발명의 그래핀 금속 복합 전극은 그래핀의 넓은 표면적과 전자의 흡수 및 방출에 의한 전기화학 반응을 더욱 효율적으로 발생시키는 특성과 금속입자의 낮은 저항의 장점이 활용되면 발생되는 신호의 SNR(Signal to Noise Ratio)이 매우 커서, 낮은 농도의 타겟 물질까지 검출할 수 있는 특징이 있다. In this case, the sensitivity is excellent as the absolute value of the measurement current signal increases. Therefore, the graphene metal composite electrode of the present invention has a large surface area of graphene, a characteristic of more efficiently generating an electrochemical reaction by absorption and emission of electrons, and a signal SNR ( Signal to Noise Ratio) is very large, so it has the feature of being able to detect even a low concentration target material.
광열 및 광화학 반응에 의해 SP2 탄소원자결합된 그래핀이 생성되고 생성된 그래핀은 인접한 미세금속입자에 연결되어 높은 전기 전도성을 갖게되고 전자의 방출 및 유입이 용이하도록 표면적이 극대화된 3차원 다공성 복합체 형태의 전극을 구성하게 된다. Graphene bonded to SP 2 carbon atoms is produced by photothermal and photochemical reactions, and the resulting graphene is connected to adjacent fine metal particles to have high electrical conductivity and three-dimensional porosity with a maximized surface area to facilitate electron emission and inflow. A composite electrode is formed.
또한 본 발명의 미세금속입자는 구리 금속 표면에 은(Ag)으로 코팅하여 사용할 수 있다. 은 입자가 전도성이 우수하나 비용등을 고려할때 코팅으로 사용하여도 입자의 표면이 전도성에 기여도가 큰 것을 감안하면 바람직한 구조일 수 있다. In addition, the fine metal particles of the present invention can be used by coating the surface of the copper metal with silver (Ag). Although silver particles have excellent conductivity, it may be a desirable structure considering that the surface of the particles contributes to conductivity even when used as a coating in consideration of cost.
도 3은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 하이브리드 그래핀 전극(그래핀 금속 복합체)과 금속전극, 그래핀 전극의 전기화학 측정물질(PAP)의 농도에 따른 측정 전류를 보여주는 그래프이다. 각각의 전극에 대해 PAP 농도에 따라 전류 신호의 크기가 점점 커지게 된다. 금속 전극에 비해 표면적과 전자 유입 및 방출의 장점이 있는 그래핀 전극의 신호가 더 크게 되고, 그래핀 전극 대비 저항이 작은 그래핀 금속 복합전극의 신호가 더 크게 측정됨을 알 수 있다. 3 is a graph showing the measured current according to the concentration of the electrochemical measuring material (PAP) of the hybrid graphene electrode (graphene metal composite), the metal electrode, and the graphene electrode of the interdigitated electrode for the electrochemical biosensor of the present invention; to be. For each electrode, the magnitude of the current signal gradually increases according to the PAP concentration. It can be seen that the signal of the graphene electrode, which has advantages of surface area and electron inflow and emission, is larger than that of the metal electrode, and the signal of the graphene metal composite electrode having a small resistance compared to the graphene electrode is measured to be larger.
도 4는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 하이브리드 그래핀 전극(그래핀 금속 복합체)과 금속전극, 그래핀 전극에 대해 같은 농도의 PAP에 대해 측정한 전류신호의 차이를 보여주는 그래프이다. 같은 농도에서 그래핀 금속 복합체 전극으로 측정된 신호의 크기가 비교 전극들에 비하여 매우 크다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명인 그래핀 금속 복합체 전극의 전류신호가 비교 전극들에 비해 더 큰 신호를 발생시켜서 SNR(Signal to Noise Ration, 신호대 잡음비)이 비교 전극에 비해 더 크다는 것을 알 수 있다. 4 is a graph showing the difference in current signals measured for PAP of the same concentration with respect to the hybrid graphene electrode (graphene metal composite), the metal electrode, and the graphene electrode of the interdigitated electrode for the electrochemical biosensor of the present invention; to be. It can be seen that the magnitude of the signal measured by the graphene metal composite electrode at the same concentration is very large compared to the comparative electrodes. Therefore, it can be seen that the current signal of the graphene metal composite electrode according to the present invention generates a larger signal than that of the comparison electrodes, so that the signal to noise ratio (SNR) is larger than that of the comparison electrode.
본 발명인 전기화학 바이오센서용 복합체는 일종의 금속-하이브리드 그래핀(MHG, Metal-Hybrid Graphene)소재로 인터디지테이티드 전극(IDA)의 형태로 제작된다. 인터디지테이티드 전극(IDA)의 손가락 모양의 두 전극 사이에서 전기화학 반응에 의해 전자가 이동되면서 전류를 만들어 내는 특징이 있다. MHG 인터디지테이티드 전극(IDA)을 이용하여 전기 화학 효소-연결 전기화학 바이오 흡착 분석 (ELISA) 측정을 사용하면 알츠하이머 병의 초 고감도 전기 화학 검출을 할 수 있다.The composite for the electrochemical biosensor of the present invention is manufactured in the form of an interdigitated electrode (IDA) with a kind of metal-hybrid graphene (MHG) material. Electrochemical reaction between the two finger-shaped electrodes of the interdigitated electrode (IDA) creates an electric current as electrons move. The use of electrochemical enzyme-linked electrochemical biosorbent assay (ELISA) measurements using MHG interdigitated electrodes (IDA) enables ultra-sensitive electrochemical detection of Alzheimer's disease.
미국 국립노화연구소와 알츠하이머협회(National Institute of Aging and Alzheimer Association, NIA-AA)는 알츠하이머 바이오마커로 뇌와 뇌척수액의 아밀로이드 베타(Amyloid beta, Aβ) Aβ-40 및 Aβ-42와 신경세포 손상을 반영하는 뇌척수액 타우단백질(total tau protein, t-tau)과 인산화 타우단백질(phosphorylated tau protein, p-tau)을 제시하였다. Aß-42 및 Aß-40와 t-tau 및 p-tau를 전기 화학적으로 측정하기 위해, 알칼리성 포스파타제 (AP)는 일반적으로 ELISA에 대한 효소 표지로서 사용된다. AP는 이차 항체에 붙어있어서, 알츠하이머 바이오마커가 많을수록 더 많은 AP 효소가 고정화되어 더 큰 전기화학 신호를 발생한다. 전기 활성 효소-기질 p-아미노 페닐포스페이트 (PAPP)는 효소 생성물과의 화학 반응에서 발생하여 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)을 생성한다. PAP는 MHG 인터디지테이티드 전극(IDA) 표면에서 p-퀴논 이민 (PQI)으로 산화 된 다음 PQI가 PAP로 환원되어 PAP의 산화 환원주기를 초래한다. 알츠하이머 바이오마커의 농도가 증가하면, 반응 챔버에 더 많은 AP 효소가 고정되어 전기 화학적 신호를 증가시킨다.The National Institute of Aging and Alzheimer's Association (NIA-AA) is an Alzheimer's biomarker that reflects brain and cerebrospinal fluid amyloid beta (Aβ) Aβ-40 and Aβ-42 and neuronal damage. cerebrospinal fluid tau protein (total tau protein, t-tau) and phosphorylated tau protein (p-tau) were presented. For the electrochemical determination of Aß-42 and Aß-40 and t-tau and p-tau, alkaline phosphatase (AP) is commonly used as an enzymatic label for ELISA. AP is attached to the secondary antibody, so the more Alzheimer's biomarkers, the more AP enzymes are immobilized, resulting in a larger electrochemical signal. The electroactive enzyme-substrate p-amino phenylphosphate (PAPP) occurs in a chemical reaction with the enzyme product to produce the electroactive product p-amino phenol (PAP). PAP is oxidized to p-quinone imine (PQI) on the surface of the MHG interdigitated electrode (IDA), and then PQI is reduced to PAP, resulting in a redox cycle of PAP. As the concentration of the Alzheimer's biomarker increases, more AP enzymes are immobilized in the reaction chamber, increasing the electrochemical signal.
상기와 같은 원리를 이용하여 초기 알츠하이머 진단에서 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)의 측정은 중요하여 매우 적은 양을 구분할 수 있는 전극으로 본 발명의 하이브리드 그래핀 전극을 응용할 수 있다. The measurement of the electroactive product p-aminophenol (PAP) in the initial diagnosis of Alzheimer's disease using the above principle is important, so that the hybrid graphene electrode of the present invention can be applied as an electrode that can distinguish a very small amount.
따라서 전기화학 바이오센서용 복합체의 미세금속입자의 형상은 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)의 측정의 민감도에 영향을 미치며, 은(Ag)미세입자 입자의 구형 형상이 가장 민감도가 우수함을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the shape of the fine metal particles of the electrochemical biosensor complex affects the sensitivity of the electroactive product p-aminophenol (PAP), and the spherical shape of the silver (Ag) fine particles has the best sensitivity. can
또한 PAP 분자의 농도가 증가하고, PAP 분자의 산화 환원 주기도 증가하며, 결과적으로 전류는 MHG 인터디지테이티드 전극(IDA)에 의해 측정 된 것과 선형적으로 증가된다.Also, the concentration of PAP molecules increases, the redox cycle of PAP molecules also increases, and consequently the current increases linearly with that measured by the MHG interdigitated electrode (IDA).
도 5는 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 전기화학 반응을 통해 인터디지테이티드 전극에서 신호를 측정하는 원리를 보여주는 개념도이다. 전기 활성 효소-기질 p-아미노 페닐포스페이트 (PAPP)는 효소 생성물과의 화학 반응에서 발생하여 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)을 생성한다. PAP는 MHG 인터디지테이티드 전극(IDA) 표면에서 p-퀴논 이민 (PQI)으로 산화 된 다음 PQI가 PAP로 환원되어 PAP의 산화 환원주기를 초래한다. 알츠하이머 바이오마커의 농도가 증가하면, 반응 챔버에 더 많은 AP 효소가 고정되어 전기 화학적 신호를 증가시킨다. 5 is a conceptual diagram illustrating a principle of measuring a signal in an interdigitated electrode through an electrochemical reaction of the interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention. The electroactive enzyme-substrate p-amino phenylphosphate (PAPP) occurs in a chemical reaction with the enzyme product to produce the electroactive product p-amino phenol (PAP). PAP is oxidized to p-quinone imine (PQI) on the surface of the MHG interdigitated electrode (IDA), and then PQI is reduced to PAP, resulting in a redox cycle of PAP. As the concentration of the Alzheimer's biomarker increases, more AP enzymes are immobilized in the reaction chamber, increasing the electrochemical signal.
상기와 같은 원리를 이용하여 초기 알츠하이머 진단에서 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)의 측정은 중요하여 매우 적은 양을 구분할 수 있는 전극으로 본 발명의 면역 센서용 복합체을 응용할 수 있다. The measurement of the electroactive product p-aminophenol (PAP) is important in the early diagnosis of Alzheimer's disease using the above principle, and thus the complex for an immune sensor of the present invention can be applied as an electrode capable of discriminating a very small amount.
따라서 면역 센서용 복합체의 미세금속입자(Micro Metal Particle)의 형상은 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)의 측정의 민감도에 영향을 미치며, 미세금속입자 입자의 구형 형상이 가장 민감도가 우수함을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the shape of the micro-metal particle of the immune sensor complex affects the sensitivity of the measurement of the electroactive product p-aminophenol (PAP), and the spherical shape of the micro-metal particle has the best sensitivity. can
또한 PAP 분자의 농도가 증가하고, PAP 분자의 산화 환원 주기도 증가하며, 결과적으로 MHG 인터디지테이티드 전극(IDA)에 의해 측정 된 전류 신호의 크기도 증가된다.In addition, the concentration of the PAP molecule increases, the redox cycle of the PAP molecule also increases, and as a result, the magnitude of the current signal measured by the MHG interdigitated electrode (IDA) also increases.
도 6은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 전기화학 반응을 측정하기 위해 본 발명에서 제작한 인터디지테이트 전극의 개념도이다. 전기화학 반응을 측정하는 인터디지테이티드 전극은 작업전극 1(Working Electrode1), 작업전극 2(Working Electrode2), 기준전극 (Reference Electrode), 대조전극 (Counter Electrode)으로 구성된다. 2개의 작업전극에서는 산화-환원 반응에 의해 전류신호가 발생하게 되고, 기준전극은 산화-환원 전압을 인가해주기 위한 기준전압을 세팅해준다. 대조전극은 기준전극에서 전류가 발생하면 기준전압의 변동이 발생하기 때문에, 기준전극의 기준전압을 일정하게 유지해주면서 기준전극을 대신하여 전류를 발생시키는 역할을 해주게 된다. 6 is a conceptual diagram of an interdigitated electrode manufactured in the present invention to measure the electrochemical reaction of the interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention. The interdigitated electrode for measuring the electrochemical reaction consists of a working electrode 1 (Working Electrode1), a working electrode 2 (Working Electrode2), a reference electrode (Reference Electrode), and a control electrode (Counter Electrode). A current signal is generated by the oxidation-reduction reaction in the two working electrodes, and the reference electrode sets a reference voltage for applying the oxidation-reduction voltage. Since the reference voltage fluctuates when a current is generated in the reference electrode, the control electrode serves to generate a current instead of the reference electrode while maintaining the reference voltage of the reference electrode constant.
도 7은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극의 사진과 전극을 구성하는 금속 그래핀 복합체의 전자현미경(SEM) 사진이다.7 is a photograph of an interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention and an electron microscope (SEM) photograph of a metal graphene composite constituting the electrode.
도 8은 본 발명인 전기화학 바이오센서용 복합체를 이용한 인터디지테이티드 전극(IDE)의 성능을 분석한 그래프이다. (a)(b) 전극의 갭, (c)(d)PAP농도차에 의한 감지할 수 있는 전류의 값을 나타내는 그래프이다. 8 is a graph analyzing the performance of an interdigitated electrode (IDE) using the complex for an electrochemical biosensor according to the present invention. (a)(b) It is a graph showing the value of the current that can be sensed by the gap between the electrodes, and (c)(d) the difference in PAP concentration.
또한 (c)에서는 인터디지테이티드 전극(IDE)에서 전극간 거리에 따라 감지할 수 있는 전류의 값이 변화됨을 보여준다. 전극간의 거리가 짧을수록 측정되는 전류신호의 크기(절대값 수치)는 더 커지고 결국 인터디지테이티드 전극(IDE)의 민감도는 증가하는 것이며, (d)에서는 인터디지테이티드 전극(IDE)의 거리가 300㎛이상의 경우 민감도 감소폭이 작아짐을 알 수 있다. In addition, (c) shows that the value of the detectable current in the interdigitated electrode IDE changes according to the distance between the electrodes. As the distance between the electrodes is shorter, the magnitude (absolute value) of the measured current signal becomes larger and the sensitivity of the interdigitated electrode IDE increases. In (d), the distance of the interdigitated electrode IDE increases. It can be seen that the decrease in sensitivity is small when is more than 300㎛.
또한 (e)에서는 본 발명의 인터디지테이티드 전극(IDE)에서 측정할 수 있는 알츠하이머 진단에서 전기 활성 생성물 p-아미노 페놀 (PAP)의 농도에 따른 감지할 수 있는 전류의 값이 변화됨을 보여준다. p-아미노 페놀 (PAP)의 농도가 증가할수록 감지할 수 있는 전류의 값은 증가하며, 피코몰(pico mole, 10-12 mole) 이상의 농도부터는 농도에 비례하여 전류가 측정되며, 피코몰(pico mole, 10-12 mole)이하의 펨토몰(femto mole, 10-15 mole)까지 측정됨을 알 수 있다. In addition, (e) shows that the value of the detectable current changes according to the concentration of the electroactive product p-aminophenol (PAP) in Alzheimer's diagnosis that can be measured by the interdigitated electrode (IDE) of the present invention. As the concentration of p-aminophenol (PAP) increases, the value of the detectable current increases, and from a concentration above pico mole (10 -12 mole), the current is measured in proportion to the concentration, and the current is measured in proportion to the concentration. mole, 10 -12 mole) or less femto mole (femto mole, 10 -15 mole) can be seen to be measured.
도 9는 (a)(b) 본 발명인 전기화학 바이오센서용 인터디지테이티드 전극으로 금(Au)박막을 사용할 경우 PAP 농도에 따른 측정전류값을 보여준다. (c)(d)는 그래핀 전극을 사용할 경우 PAP 농도에 따른 측정전류값을 보여준다. 금 또는 그래핀으로 구성된 IDA 전극의 검출 한계(LOD)는 1 나노몰(nano mole, 10-9 mole)임을 알 수 있다. 9(a)(b) shows measured current values according to PAP concentration when a gold (Au) thin film is used as an interdigitated electrode for an electrochemical biosensor according to the present invention. (c)(d) shows the measured current value according to the PAP concentration when a graphene electrode is used. It can be seen that the limit of detection (LOD) of the IDA electrode composed of gold or graphene is 1 nanomol (nano mole, 10 -9 mole).
금박막 전극 및 그래핀 전극과 본 발명의 그래핀 금속 복합체(MHG) 전극을 비교해 보면 PAP 농도에 따른 측정가능한 IDA 전극의 검출 한계(LOD)를 보면 본 발명의 인터디지테이티드 전극(IDE)에서 미세금속입자 및 그래핀으로 구성된 복합체가 p-아미노 페놀 (PAP)의 검출 한계(LOD)면에서 더 우수하고 같은 농도에 대한 측정신호도 더 크다는 것 을 알 수 있다. When comparing the gold thin film electrode and the graphene electrode with the graphene metal composite (MHG) electrode of the present invention, the limit of detection (LOD) of the measurable IDA electrode according to the PAP concentration was observed in the interdigitated electrode (IDE) of the present invention. It can be seen that the complex composed of fine metal particles and graphene is better in terms of the limit of detection (LOD) of p-amino phenol (PAP) and the measurement signal for the same concentration is also larger.
이하에서는 금속-하이브리드 그래핀 복합체 기반 알츠하이머 특이항원 검출방법에 대해서 설명한다. Hereinafter, a method for detecting Alzheimer's-specific antigen based on a metal-hybrid graphene complex will be described.
도 11a, 도 11b는 본 발명인 금속-하이브리드 그래핀 복합체 기반 알츠하이머 특이항원 검출방법에 대한 두개의 순서도이다. 도 12a, 도 12b는 본 발명의 금속-하이브리드 그래핀 복합체 기반 알츠하이머 특이항원 검출방법에 대한 두개의 모식도이다. 11A and 11B are two flow charts for the method for detecting a metal-hybrid graphene complex-based Alzheimer's-specific antigen according to the present invention. 12A and 12B are two schematic diagrams of the method for detecting a metal-hybrid graphene complex-based Alzheimer's-specific antigen of the present invention.
본 발명의 알츠하이머 특이항원 검출방법은 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 분리된 혈장에 포함된 알츠하이머 질병인자 항원이 효소가 연결된 2차항체와 결합하는 단계; 상기 항원과 결합된 2차항체가 반응챔버로 이동하는 단계; 이동된 항원이 반응챔버 내면에 고정된 1차항체와 결합하는 단계; 반응챔버 내면을 세척용액으로 세척하는 단계; 효소기질이 포함된 용액을 챔버로 이동시켜 상기 2차항체와 연결된 효소와 반응시키는 단계; 및 상기 효소기질과 효소가 반응하여 발생되는 전류신호를 감지하는 단계로 구성된다.The Alzheimer's-specific antigen detection method of the present invention comprises the steps of separating plasma from blood; binding the Alzheimer's disease factor antigen contained in the separated plasma to a secondary antibody linked with an enzyme; moving the antigen-bound secondary antibody to a reaction chamber; binding the transferred antigen to the primary antibody immobilized on the inner surface of the reaction chamber; washing the inner surface of the reaction chamber with a washing solution; moving the solution containing the enzyme substrate into the chamber to react with the enzyme linked to the secondary antibody; and sensing a current signal generated by the reaction between the enzyme substrate and the enzyme.
또는 혈액으로부터 혈장을 분리하는 단계; 상기 분리된 혈장에 포함된 알츠하이머 질병인자 항원과 반응챔버 내면에 고정된 1차항체와 결합하는 단계; 상기 1차항체와 결합되지 않은 알츠하이머 질병인자 항원을 세척하는 단계; 효소기질이 포함된 용액과 2차항체와 반응시켜 2차항체와 효소와 연결시키는 단계; 효소와 연결된 2차항체를 1차항체와 반응시키는 단계;상기 1차항체와 결합되지 않은 효소와 연결된 2차항체를 세척하는 단계; 및 효소기질이 포함된 용액을 상기 2차항체와 연결된 효소와 반응시켜 발생되는 전류신호를 감지하는 단계;로 구성될 수 있다. or isolating plasma from blood; binding to the Alzheimer's disease factor antigen contained in the separated plasma and the primary antibody immobilized on the inner surface of the reaction chamber; washing the Alzheimer's disease factor antigen not bound to the primary antibody; linking the secondary antibody with the enzyme by reacting the solution containing the enzyme substrate with the secondary antibody; A method comprising: reacting a secondary antibody linked to an enzyme with a primary antibody; washing a secondary antibody linked to an enzyme that is not bound to the primary antibody; and sensing a current signal generated by reacting a solution containing an enzyme substrate with an enzyme linked to the secondary antibody.
상기 두가지 방법의 차이는 항원이 2차항체와 먼저 반응(a)하는지 1차항체와 먼저 반응(b)하는지에 따라 구분될 뿐 ELISA반응의 결과는 동일하다. The difference between the two methods is differentiated depending on whether the antigen reacts first with the secondary antibody (a) or with the primary antibody first (b), but the result of the ELISA reaction is the same.
항원이 2차항체와 먼저 반응하는 (a)경우를 설명하면, When explaining (a) the case in which the antigen reacts first with the secondary antibody,
먼저 혈액에서 혈장 성분만을 분리하여 반응챔버로 이동시키고, 혈장에 포함된 질병인자(항원)을 반응 챔버에 고정된 1차항체에 의해 포획시킨다. First, only plasma components are separated from blood and moved to a reaction chamber, and disease factors (antigens) contained in plasma are captured by primary antibodies fixed in the reaction chamber.
그 후, 혈장에 포함된 기타 불순물을 제거하기 위하여 정제수를 반응 챔버로 이동하여 챔버를 세척한다. Thereafter, purified water is moved to the reaction chamber to remove other impurities contained in plasma, and the chamber is washed.
포획된 질병인자를 검출하기 위하여, 효소(Alkaline Phosphatase, AP)가 붙여진 2차 항체를 반응 챔버로 이동시켜 포획된 질병인자(항원)에 고정시킨다. In order to detect the captured disease agent, the secondary antibody to which the enzyme (Alkaline Phosphatase, AP) is attached is moved to the reaction chamber and fixed to the captured disease agent (antigen).
결합되지 않은 2차 항체는 노이즈 신호를 생성하기 때문에 정제수를 이동시켜서 반응챔버를 다시 세척한다. Since the unbound secondary antibody generates a noise signal, purified water is transferred to wash the reaction chamber again.
마지막으로 효소기질인 PAPP 용액을 반응 챔버로 이동시키면 PAPP가 AP 효소와 반응하여 PAP로 변환되고 PAP는 금속-하이브리드 그래핀 복합체로 구성된 IDA 전극의 산화전극과 환원전극 사이에서 순환하면서 전류 신호를 만들어 낸다. Finally, when the PAPP solution, which is an enzyme substrate, is moved into the reaction chamber, the PAPP reacts with the AP enzyme and is converted into PAP, which circulates between the anode and cathode of the IDA electrode composed of a metal-hybrid graphene complex to create a current signal. pay
이때, 질병 인자의 양이 많으면 PAP로 변환 되는 양이 많아져서 측정되는 전류의 크기가 더욱 커지게 된다. At this time, if the amount of the disease factor is large, the amount converted into PAP increases, and thus the magnitude of the measured current becomes larger.
따라서 반응 후에 PAP로 변환된 용액을 측정 챔버로 이동시키고 여기서 IDA 전극으로 측정하게 되면 혈액 내에 포함된 질병인자의 양을 정량적으로 검사할 수 있게 된다.Therefore, after the reaction, the solution converted into PAP is moved to the measurement chamber and measured with the IDA electrode there, so that the amount of disease factors contained in the blood can be quantitatively tested.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다. The present invention described above is not limited by the above-described embodiments and accompanying drawings, and it is common in the technical field to which the present invention pertains that various substitutions, modifications and changes are possible within the scope without departing from the technical spirit of the present invention. It will be clear to those who have the knowledge of
Claims (8)
상기 효소와 반응하는 반응 물질;
상기 효소 반응에 의해 발생되는 결과 물질;
상기 효소 반응 결과물질을 감지하는 측정 전극으로 구성되되,
상기 측정 전극은
미세금속입자(Micro Metal Particle)와 그래핀 복합층의 일부가 연결된 그래핀 금속 복합체로 구성되고,
상기 그래핀 복합층은 여러 층의 그래핀이 적층되고 임의의 방향으로 굽혀져 있는 3차원 구조를 가지고,
상기 미세금속입자 사이 빈 공간의 일부는 상기 그래핀 복합층이 채워져 상호 연결된 다공성 구조이며,
상기 그래핀 금속 복합체를 통하여 전자의 흐름이 발생되는 것에 특징이 있는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서.
enzymes that cause biochemical reactions;
a reactant reacting with the enzyme;
a resultant produced by the enzymatic reaction;
It consists of a measuring electrode for sensing the resultant material of the enzyme reaction,
The measuring electrode is
It consists of a graphene metal composite in which micro metal particles and a part of the graphene composite layer are connected,
The graphene composite layer has a three-dimensional structure in which several layers of graphene are stacked and bent in an arbitrary direction,
A part of the empty space between the fine metal particles is filled with the graphene composite layer and has a porous structure interconnected,
A hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor, characterized in that the flow of electrons is generated through the graphene metal composite.
상기 반응챔버 내면에 결합된 알츠하이머 1차항체;
효소와 결합된 2차항체;
상기 1차항체 및 2차항체와 동시에 결합되는 알츠하이머 질병인자 항원;
상기 효소와 반응하는 효소기질;
상기 효소기질과 효소와 반응에 의해 발생되는 전기화학물질;
상기 전기화학 물질에 의해 발생되는 전류 신호를 감지하는 그래핀 금속 복합체로 구성되되,
상기 그래핀 금속 복합체는
미세금속입자(Micro Metal Particle)와 그래핀 복합층의 일부가 연결된 것으로,
상기 그래핀 복합층은 여러 층의 그래핀이 적층되고 임의의 방향으로 굽혀져 있는 3차원 구조를 가지고,
상기 미세금속입자 사이 빈 공간의 일부는 상기 그래핀 복합층이 채워져 상호 연결된 다공성 구조인 미세금속입자(Micro Metal Particle)와 상기 그래핀 복합층이 혼합된 구조인 것에 특징이 있는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서.
reaction chamber;
Alzheimer's primary antibody bound to the inner surface of the reaction chamber;
enzyme-conjugated secondary antibody;
Alzheimer's disease factor antigen simultaneously bound to the primary and secondary antibodies;
an enzyme substrate reacting with the enzyme;
an electrochemical substance generated by a reaction between the enzyme substrate and the enzyme;
Doedoe composed of a graphene metal composite that senses a current signal generated by the electrochemical material,
The graphene metal composite is
A part of the graphene composite layer is connected with micro metal particles.
The graphene composite layer has a three-dimensional structure in which several layers of graphene are stacked and bent in an arbitrary direction,
A part of the empty space between the fine metal particles is based on a hybrid graphene electrode, characterized in that the graphene composite layer is filled and the graphene composite layer is mixed with micro metal particles, which are interconnected porous structures, and the graphene composite layer Electrochemical biosensor.
상기 하이브리드 그래핀 전극은 상기 금속 복합체로 제조된 두 개의 분리된 전극이 인접하게 위치한 인터디지테이티드 전극으로 구성되어 외부 전자의 유입 혹은 방출이 발생하는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서.
3. The method of claim 1 or 2,
The hybrid graphene electrode is a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor in which the inflow or emission of external electrons occurs by being composed of an interdigitated electrode in which two separate electrodes made of the metal composite are positioned adjacently.
상기 생화학 반응은 알츠하이머 질병인자를 검출하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서.
According to claim 1,
The biochemical reaction is a hybrid graphene electrode-based electrochemical biosensor, characterized in that detecting Alzheimer's disease factors.
분리된 혈장에 포함된 질병인자 항원이 효소가 연결된 2차항체와 결합하는 단계;
상기 항원과 결합된 2차항체가 반응챔버로 이동하는 단계;
이동된 항원이 반응챔버 내면에 고정된 1차항체와 결합하는 단계;
반응챔버 내면을 세척용액으로 세척하는 단계;
효소기질이 포함된 용액을 챔버로 이동시켜 상기 2차항체와 연결된 효소와 반응시키는 단계; 및
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서를 이용하여, 상기 상기 효소기질과 효소가 반응하여 발생되는 전류신호를 감지하는 단계;
로 구성된 하이브리드 그래핀 전극 기반 특이항원 검출방법.
separating plasma from blood;
a step of binding the disease agent antigen contained in the separated plasma to an enzyme-linked secondary antibody;
moving the antigen-bound secondary antibody to a reaction chamber;
binding the transferred antigen to the primary antibody immobilized on the inner surface of the reaction chamber;
washing the inner surface of the reaction chamber with a washing solution;
moving the solution containing the enzyme substrate into the chamber to react with the enzyme linked to the secondary antibody; and
Using the electrochemical biosensor based on the hybrid graphene electrode of any one of claims 1 to 6, detecting a current signal generated by the reaction between the enzyme substrate and the enzyme;
A hybrid graphene electrode-based specific antigen detection method consisting of
상기 분리된 혈장에 포함된 알츠하이머 질병인자 항원과 반응챔버 내면에 고정된 1차항체와 결합하는 단계;
상기 1차항체와 결합되지 않은 질병인자 항원을 세척하는 단계;
효소와 연결된 2차항체가 상기 1차항체와 결합된 질병인자 항원에 결합하는 단계;
상기 질병인자 항원과 결합되지 않은 효소와 연결된 2차항체를 세척하는 단계; 및
효소기질이 포함된 용액을 챔버로 이동시켜 상기 2차항체와 연결된 효소와 반응시키는 단계; 및
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 하이브리드 그래핀 전극 기반 전기화학 바이오센서를 이용하여, 상기 상기 효소기질과 효소가 반응하여 발생되는 전류신호를 감지하는 단계 ;
로 구성된 하이브리드 그래핀 전극 기반 특이항원 검출방법.separating plasma from blood;
binding to the Alzheimer's disease factor antigen contained in the separated plasma and the primary antibody immobilized on the inner surface of the reaction chamber;
washing the disease agent antigen not bound to the primary antibody;
binding the secondary antibody linked to the enzyme to the disease agent antigen bound to the primary antibody;
washing the secondary antibody linked to the enzyme not bound to the disease agent antigen; and
moving the solution containing the enzyme substrate into the chamber to react with the enzyme linked to the secondary antibody; and
Using the electrochemical biosensor based on the hybrid graphene electrode of any one of claims 1 to 6, detecting a current signal generated by the reaction between the enzyme substrate and the enzyme;
A hybrid graphene electrode-based specific antigen detection method consisting of
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2020
- 2020-06-30 KR KR1020200080235A patent/KR102270811B1/en active IP Right Grant
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