ITMI980344A1 - Procedimento per la produzione di proteine/peptidi tossici - Google Patents
Procedimento per la produzione di proteine/peptidi tossiciInfo
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "PROCEDIMENTO PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE/PEPTIDI TOSSICI"
La presente invenzione fornisce un procedimento per la produzione di proteine/peptidi tossici in cellule eucariote.
La produzione di alcuni tipi di proteine ricombinanti in cellule eucariote può essere ostacolata dalla tossicità che la proteina ricombinante esercita verso la cellula ospite utilizzata per l'espressione.Sebbene in alcuni casi questo problema sia stato aggirato utilizzando ospiti procarioti, in altri casi questa strategia non è applicabile. Infatti, molte proteine (ad esempio ligandi, ormoni o anticorpi) richiedono un particolare ambiente subcellulare e specifiche modificazioni cotraduzionali e posttraduzionali come la formazione di ponti disulfuro o la glicosilazione per potersi ripiegare correttamente ed essere quindi prodotte in forma biologicamente attiva. Gli enzimi responsabili di molte di queste modificazioni non sono presenti negli ospiti procarioti, rendendo questi ultimi inadatti per la produzione di tali proteine ricombinanti. In particolare, le cellule eucariote posseggono un sistema di endomembrane che è il sito di sintesi, modificazione e ripiegamento delle proteine destinate ad essere trasportate ad una serie di altri compartimenti subcellulari o ad essere secrete. Alcune modificazioni che avvengono esclusivamente nel sistema di endomembrane, e più precisamente nel reticolo endoplasmatico, non possono essere riprodotte nel citosol batterico, rendendo quindi le cellule procariote inadatte alla produzione di proteine il cui. ripiegamento e/o attività biologica dipendono da tali tipi di modificazione.
D'altra parte, come già anticipato, la produzione di alcune proteine ricombinanti in cellule eucariote può però essere ostacolata dalla loro tossicità verso la cellula ospite. Tale tossicità può essere dovuta a svariati motivi, uno dei quali può essere l'effetto diretto della proteina su una o più funzioni vitali per la cellula.Nel caso di proteine tossiche di secrezione (quindi segregate nel reticolo endoplasmatico), se l'attività tossica è diretta a componenti presenti nel citosol, ci si potrebbe attendere una assenza di tossicità in conseguenza della differente localizzazione subcellulare della proteina ricombinante e del componente cellulare su cui si esplica l'attività tossica.E ' tuttavia chiaro che questa segregazione non è mai completa, o per errata localizzazione della proteina (la cui sintesi iniziale comunque avviene sui ribosomi citosolici) o per la presenza di meccanismi che consentono la retrotraslocazione della proteina dal reticolo endoplasmatico al citosol (Sommer and Wolf,1997).
Si è ora trovato, ed è oggetto della presente invenzione, un procedimento che permette di produrre peptidi o proteine ad attività tossica in cellule eucariote.
Il procedimento prevede che la cellula ospite venga "immunizzata" mediante anticorpi o loro frammenti attivi che siano localizzati nelcitosol o in altri opportuni comparti subcellulari e che siano in grado di riconoscere e neutralizzare i peptidi o le proteine tossiche che si vogliono fare esprimere dalle cellule stesse.
Secondo un primo aspetto, 1'"immunizzazione" viene attuata mediante la trasfezione delle cellule con sequenze codificanti la proteina/peptide tossici e con sequenze codificanti anticorpi citosolici o diversamente localizzati, o loro frammenti,ad attività neutralizzante verso la proteina/peptide tossici. Tipicamente, e come mostrato nella esemplificazione della procedura, la proteina tossica è indirizzata al reticolo endoplasmatico, e quindi secreta, e gli anticorpi o frammenti anticorpali sono localizzati nel citosol. Tuttavia, altre combinazioni che prevedono l'indirizzamento della proteina tossica ad un diverso comparto subcellulare, ed una eventuale localizzazione non citosolica dell'anticorpo o frammento anticorpale, sono similmente praticabili. La scelta della localizzazione subcellulare degli anticorpi neutralizzanti dipenderà primariamente dalla localizzazione del componente cellulare su cui si esplica l'attività della proteina/peptide tossici. Alle sequenze codificanti gli anticorpi o loro frammenti possono essere aggiunte sequenze di DNA in grado di attivare o reprimere l'espressione organo- o tessuto-specifica di geni in animali transgenici o in piante transgeniche. In particolare, tali sequenze moduleranno l'espressione organo- o tessuto-specifica di geni in determinate fasi dello sviluppo embrionale, della vita fetale o dell'età adulta, oppure in particolari circostanze ambientali quali la senescenza, lo stress, le alterazioni metaboliche in animali o in piante.
Secondo un secondo aspetto, l'"immunizzazione" può essere condotta anche attraverso l'iniezione diretta nelle cellule degli anticorpi neutralizzanti o di loro frammenti, mentre l'espressione della proteina/peptide tossici può essere attuata per iniezione delle cellule con le sequenze di DNA corrispondenti alla proteina/peptide tossici, oppure per iniezione delle stesse con i corrispondenti mRNA.
Il procedimento può essere condotto sia su cellule in coltura, dalle quali la proteina ricercata può essere isolata per frazionamento subcellulare o lisi diretta ed estrazione oppure, se la proteina viene secreta,per purificazione dal mezzo di coltura; in alternativa,possono essere utilizzati organismi transgenici che producono stabilmente anticorpi neutralizzanti o loro frammenti e la proteina/peptide tossici anche espressi in maniera tessuto-specifica o regolata durante le fasi dello sviluppo dell'organismo.
Le fasi del procedimento secondo il primo aspetto dell'invenzione possono essere così schematizzate:
1) isolamento delle sequenze codificanti per gli anticorpi o frammenti anticorpali ed eventuale aggiunta di sequenze codificanti per opportuni segnali di localizzazione sub-cellulare;
2) clonazione delle sequenze del punto 1) e della sequenza codificante la proteina d'interesse in opportuni vettori per l'espressione nelle cellule o negli organismi scelti per la produzione della proteina tossica;
3) trasfezione delle cellule prescelte per l'espressione o generazione di organismi transgenici;
4) purificazione della proteina
Per quanto riguarda la fase 1), è possibile selezionare, a partire da ibridomi che secernono anticorpi monoclonali diretti contro il polipeptide tossico, uno o più monoclonali capaci di neutralizzare l'attività tossica. Ad esempio, ibridomi producenti anticorpi monoclonali neutralizzanti sono stati ottenuti nel caso della catena A della tossina ricina (Youle and Colombatti, 1987) e del virus dell'arricciamento maculato del carciofo (Tavladoraki et al.1993).
Nel secondo caso è stata dimostrata l'efficacia dell'espressione citosolica di un frammento di anticorpo monoclonale.
Qualora l'ottenimento di anticorpi monoclonali fosse impedito per esenpio dalla estrema tossicità della proteina, tale da precludere la possibilità di immunizzare animali, o dalla scarsa immunogenicità, o ancora dalle difficoltà di selezione di anticorpi con attività neutralizzante, è possibile utilizzare strategie .alternative che prevedono l'isolamento di sequenze codificanti per frammenti anticorpali da repertori di fagi esprimenti tali frammenti sulla loro superficie. Inoltre, è possibile costruire librerie fagiche a partire da sequenze isolate da animali immunizzati con l'antigene di interesse.
Tra i segnali di localizzazione subcellulare, le cui sequenze geniche possono essere aggiunte alle sequenze codificanti gli anticorpi, si possono citare per esempio il peptide segnale per 1'indirizzamento al reticolo endoplasmatico (Rapport et al., 1996), i segnali per l'indirizzamento ai perossisomi (Subramani 1993), i segnali per l'indirizzamento ai mitocondri (Schatz and Dobberstein 1996), i segnali per 1'indirizzamento ai cloroplasti (Henry and Cline,1996).
Per quanto riguarda le fasi 2 e 3, si possono seguire due differenti strategie:
i) isolare inizialmente cloni cellulari stabili od organismi transgenici esprimenti frammenti anticorpali neutralizzanti e successivamente supertrasformare tali linee od organismi con costrutti per la espressione della proteina ricombinante.
ii) utilizzare vettori per la coespressione di frammenti anticorpali neutralizzanti e della proteina ricombinante.
Nella fase 4), nel caso in cui la procedura sia volta all'ottenimento della proteina in forma purificata, si possono utilizzare tecniche convenzionali di separazione cromatografica, applicabili al lisato,all'estratto di frazioni subcellulari,o al mezzo di coltura delle linee cellulari trasformate. Nel caso di utilizzo di organismi transgenici la proteina tossica potrà essere purificata o da estratti ottenuti dai tessuti dell'organismo transgenico o da prodotti ottenuti dai medesimi organismi, quale il latte (Wilmut and Whitelaw, 1994)o le urine (Kerr et al,1998).
Il metodo dell'invenzione può convenientemente essere applicato, per esempio, alla produzione di immuno-tossine, cioè tossine veicolate contro bersagli cellulari specifici, per un uso come agenti antitumorali (Fitgerald, 1996); oppure può essere applicato alla produzione di "mitotossine",cioè tossine veicolate attraverso fattori di crescita e/o ligandi a recettori specifici, che sono state utilizzate per uccidere selettivamente alcuni tipi cellulari (Lappi et al., 1994) in patologie da iperproliferazione o per bersagliare alcune aree cerebrali al fine di creare opportuni modelli animali di patologie (Mantyh et al., 1997). Le cellule stesse immunizzate esprimenti la proteina/peptide tossici possono essere direttamente utilizzate per applicazioni in vivo.
Una realizzazione dell'invenzione consiste nella produzione della tossina chimerica ATF-saporina, avente attività antitumorale contro cellule ad elevato potenziale metastatico sovra-esprimenti il recettore della urochinasi umana sulla loro superficie.
La ATF-saporina è costituita dal peptide segnale seguito dal frammento amino-terminale della urochinasi umana (ATF), in grado di legare il recettore della urochinasi, fuso ad una tossina vegetale. La saporina,appartiene a una famiglia di proteine tossiche vegetali capaci di inattivare la sintesi proteica per la loro attività depurinante su di una adenina specifica, posta in struttura altamente conservata nel RNA ribosomale di tutte le specie {Soria et al., 1992). La saporina appartiene perciò alla famiglia delle RIP (ribosome-inactivating-protein o proteine inattivanti i ribosomi - Fattorini et al, 1997a) il cui membro più noto è la ricina. Tali tossine sono in grado di inibire in modo irreversibile la sintesi proteica provocando la morte cellulare.
La chimera di fusione tra ATF e saporina (ATF-SAP), nella corretta conformazione necessaria alla sua attività,è stata espressa nel citòsol di E. coli con estrema difficoltà per via dell'esistenza di 6 ponti disulfuro nel dominio ATF. La caratterizzazione della elevata attività RIP di tale chimera ricombinante è stata già documentata in dettaglio.
Date queste premesse, appaiono evidenti i vantaggi di potere produrre la proteina di fusione tossica in una cellula eucariota.
Come sistema di espressione di ATF-saporina, è stato scelto 1'oocita di Xenopus laevis, che permette di riprodurre fedelmente gli eventi co e post-traduzionali (Cerìotti et al., 1991; Fabbrini et al., 1991 e 1993); inoltre è noto che l'RNA ribosomale di Xenopus è sensibile all'attività di depurinazione della ricina, quando questa tossina viene microiniettata nel citosol degli oociti (Saxena et al., 1989).Pertanto, gli oociti di Xenopus rappresentano un ottimo modello sperimentale per la valutazione del procedimento di "immunizzazione" citosolica nella sintesi della chimera tossica pre ATF-saporina.
Gli esperimenti in cui venivano coiniettati RNA sintetici di pre ATF-saporina e anticorpi neutralizzanti anti-saporina hanno dimostrato l’efficacia del metodo dell'invenzione. In particolare, si è visto che gli anticorpi neutralizzati rendono gli oociti capaci di sintetizzare oltre 20 volte più ATF-saporine rispetto agli oociti non "immunizzati".
1 dettagli degli esperimenti vengono illustrati negli esempi seguenti.
ESEMPIO 1
Costruzione di una versione secretoria della tossina chimerica ricombinante ATF-saporina e produzione di RNA sintetico per preATF-saporina
La sequenza codificante gli amminoacidi 1-155 della urochinasì umana (plasmidio pSfiPPUK, Lucia Monaco, Dibit-HSR) è stata amplificata per PCR utilizzando i seguenti oligonucleotidi:
Il frammento prodotto è stato digerito con gli enzimi Sali e Seal, e poi ligato ad un frammento Scal-EcoKI derivato dal plasmidio pETlldATF-SAP3 (Fabbrini et al., 1997b). Il prodotto di ligazione è stato poi clonato nel vettore pBluescript KS (tagliato Sall-EcoRI), ottenendo il plasmidio pBSPAS. Il frammento Sall-EcoRI di pBSPAS è stato poi isolato, le sue estremità sono state rese piatte ed è stato subclonato nel vettore pSP64T,ottenendo il plasmidio pSP630.
Per sintetizzare RNA in vitro. pSP630 è stato linearizzato con EcoRI e trascritto in vitro come descritto in Ceriotti et al. (Ceriotti and Colman, 1995). Le procedure ivi descritte sono state inoltre utilizzate per la purificazione dell'RNA prodotto, che è poi risospeso in acqua a una concentrazione di circa 1 mg/mi.
ESEMPIO 2
Purificazione degli anticorpi neutralizzanti
Anticorpi policlonali anti-saporina nativa prodotti in capra sono stati purificati con la seguente procedura:
1 mi di soluzione di anticorpi parzialmente purificati con precipitazione in ammonio solfato è stato diluito con 9 mi di Na2HP04pH7 20 mM (Tampone A) ed applicato ad una colonna HiTrap Protein G (Pharmacia)equilibrata nello stesso tampone. La colonna è stata lavata con 35 mi di tampone A e poi le immunoglobuline sono state eluite con 8 ml di tampone B (0,1 M glicina, pH 2,7) e immediatamente neutralizzate con 1M Tris-HC1 pH 9,0. Il picco proteico è stato centrifugato e poi dializzato contro soluzione fisiologica e la concentrazione proteica (13,3 mg/ml) è stata determinata usando un kit BioRad e tiroglobulina bovina come standard.
Immunoglobuline da siero non immune sono state purificate con analoga procedura, ottenendo una soluzione contenente 13,8 mg/ml di immunoglobuline.
ESEMPIO 3
Espressione di preATF-saporina (pATFSAP) in oociti di Xenopus laevis Oociti sono stati prelevati da femmine di Xenopus laevis, isolati manualmente ed iniettati secondo procedure pubblicate (Ceriotti and Colman, 1995). Gli oociti sono mantenuti in soluzione di Barth modificata,contenente penicillina (10 yg/ml),streptomicina (10 yg/ml), gentamicina (50 yg/ml) e nistatina (10000 U/l) (MBS) e iniettati il giorno successivo utilizzando un sistema di microiniezione Narishige (IM-1 con timer).
Oociti sono stati iniettati con le seguenti miscele:
1-RNasin (Promega) 0,5 U/μl
2-RNasin (Promega) 0,5 U/μl Immunoglobuline non immuni 6,7 yg/μl 3-RNasin (Promega)0,5 U/μl Immunoglobuline immuni 6,5 yg/μl
4-mRNA pATFSAP 250 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μl
5-mRNA pATFSAP 250 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μl Immunoglobuline non immuni 6,7 yg/μl
6-mRNA pATFSAP 250 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μl Immunoglobuline immuni 6,5 yg/μl
7-mRNA faseolina 33 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μl
8-nRNA faseolina 33 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μl Immunoglobuline non immuni 6,7 μg/μl
9-mRNA faseolina 33 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μl Immunoglobuline immuni 6,5 pg/μl
Il giorno successivo, gli oociti sono stati marcati radioattivamente per 2 ore in 5 μl/oocita di MBS contenente 0,65 μCi/μl di S35pro-Mix (Amersham). Gli oociti sono stati poi omogenati in 40 μΐ per oocita di tampone di omogeneizzazione (Ceriotti and Colman, 1995), contenente 1 mM fenilmetilsulfonilfluoride e 2x Complete (Boehringer).
80 μΐ di ogni lisato sono stati utilizzati per la immunoprecipitazione con siero policlonale anti-saporina (1 μl/campione) e siero policlonale anti-faseolina (0,5 μl per campione), in 1 mi di NET-gel buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaC1, 0,1% Nonodet-P40, 0,25% gelatina, 0,02% Sodio Azìde). I campioni sono stati incubati 1 ora in ghiaccio, e poi sono stati aggiunti 150 μΐ di Proteina A-Sepharose CL 4B (Pharmacia) 10% in NET-buffer (NET-gel senza gelatina) e messi a incubare con agitazione a 4"C. Il giorno successivo, le resine sono state lavate 3 volte con NET-gel, e le proteine adsorbite sono state eluite in buffer di carico per elettroforesi (10 mM Tris-HCl pH 8,6, 6% sodio dodecil solfato, 50 mM ditiotreitolo, 0,003% blu di bromefenolo) per 5 minuti a 100“C. I campioni sono stati caricati su un gel di poliacrilammide al 15%, con rapporto acrilammide-bisacrilammide di 200:1. A termine della corsa, il gel è stato impregnato con PPO, seccato ed esposto ad una lastra per fluorografia.
I risultati sono riportati in fig.1.
Si evince da quanto mostrato in Figura 1 che la sintesi ATF-saporina è compromessa negli oociti non protetti con immunoglobuline non immuni (corsie 4 e 5) mentre alti livelli di sintesi si sono ottenuti in oociti protetti con immunoglobuline neutralizzanti anti-saporina (corsia 6).Le stesse immunoglobuline non hanno alcun effetto sulla sintesi della proteina faseolina, che viene sintetizzata efficientemente in tutte le condizioni prese in esame (corsie 7-9).
4 Saggio per la valutazione dell'attività di secrezione di ATF-saporina in Xenopus laevis
Oociti di Xenopus laevis sono stati preparati e iniettati come descritto nell'esempio 3, con la seguente miscela:
mFNA pATFSAP 250 ng/μl RNasin (Promega) 0,5 U/μΙ Immunoglobuline immuni 6,5 pg/μl
Il giorno successivo, gli oociti sono stati marcati per 2 ore in 5 μl/oocita di MBS contenente 0,65 μCi/μl di Pro-Mix (Amersham). Il mezzo di marcatura è stato poi rimosso e gli oociti sono stati lavati con MBS. Gli oociti sono stati poi incubati in MBS supplementato con 6% di siero fetale bovino dializzato contro MBS, e campioni di oociti e relativo mezzo di incubazione sono stati prelevati 24 e 48 ore dopo. Gli oociti recuperati alla fine della marcatura (Oh Chase) e a 24 o 48 ore postmarcatura (24h e 48h chase) sono stati omogenati a 80 μl di omogenato 6 10 μl di mezzo di incubazione sono stati utilizzati per l'immunopreccitazione con 1 μl di siero policlonale anti saporina,come sopra descritto. Le proteine immuniprecipitate sono state poi separate su gel di poliacrilammide e visualizzate per autoradiografia (Fig.2). ATF-saporina è efficientemente secreta dagli oociti (corsie 4 e 6) e solo una piccola frazione è modificata proteoliticamente e ritenuta dentro la cellula (corsie 3 e 5).
Dopo aver dosato la concentrazione della proteina attiva nei mezzi di incubazione degli oociti, tramite un dosaggio di tipo Elisa già descritto in precedenza (Fabbrini et al., 1997a), il mezzo di incubazione degli oociti iniettati con Ig anti-saporina e RNA per preATF-saporina o quello di oociti iniettati solo con Ig antisaporina è stato saggiato per verificare l'attività biologica della proteina secreta. Sia in esperimenti di inibizione della sintesi proteica in vitro, in reticoliciti di coniglio, che in saggi di citotossicità su opportuni modelli cellulari, il mezzo condizionato degli oociti secementi ATF-saporina è risultato attivo. In particolare, la concentrazione della chimera nel mezzo condizionato degli oociti è stata valutata attorno ai 10-6 M, mentre la concentrazione di ATF-saporina in grado di inibire il 50% della sintesi proteica in vitro (IC50) è nell'ordine dei 2x 10-11 e simile quindi alla IC50 della tossina nativa (Fabbrini et al., 1997b).La potenza nei saggi di citotossicità di ATF-saporina, secreta dagli oociti, è paragonabile a quella determinata per la chimera ricombinante propriamente ripiegata.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1: Elettroforesi in gel di acrilammide al 15%, con rapporto acrilammide/bisacrilammide 200:1. Le corsie 1-9 corrispondono ai campioni 1-9 riportati nell'Esempio 3.
mRNA -:nessuno
ATF-SAP:mRNA codificante pre ATF-saporina
PHSL:mRNA codificante per faseolina
Ig -:nessuna
ni: non immuni
i: immuni
La posizione di migrazione di marcatori di peso molecolare di 30 e 46 kDa è mostrata a sinistra della Figura.
Figura 2: Elettroforesi in gel di acrilammide al 15% con rapporto acrilammide/bisacrilammide 200:1.
L:ATF-Saporina da Usato di oociti
M:ATF-Saporina da mezzo di incubazione
0:materiale recuperato alla fine della marcatura
24:materiale recuperato 24 ore post-marcatura
48:materiale recuperato 48 ore post-marcatura
Asterisco:ATF-Saporina
Freccia:prodotto di degradazione di ATF-Saporina
La posizione di migrazione di marcatori di peso molecolare di 30 e 46 kDa è mostrata a sinistra della Figura.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la produzione di peptidi o proteine ad attività tossica in cellule eucariote, in cui le cellule eucariote vengono trasfettate con le sequenze codificanti la proteina/peptide tossici e con sequenze codificanti anticorpi o loro frammenti ad attività neutralizzante verso la proteina/peptide tossici che possono essere localizzati in vari compartimenti cellulari.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui le cellule vengono cotrasfettate con vettori per la coespressione di anticorpi o loro frammenti ad attività neutralizzante e della proteina/peptide tossici.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui le cellule eucariote sono cellule di organismo transgenico esprimente frammenti anticorpali neutralizzanti, che successivamente vengono trasfettate con la sequenza del peptide/proteina tossici.
- 4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-3, in cui alle sequenze codificanti l'anticorpo neutralizzante e la proteina/peptide tossici sono aggiunte sequenze per l'espressione organo- o tessuto-specifica.
- 5. Procedimento per la produzione di peptidi o proteine ad attività tossica in cellule eucariote, in cui le cellule esprimenti la proteina/peptide tossici vengono iniettate con anticorpi o frammenti degli stessi aventi capacità neutralizzante la proteina/peptide tossici.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui l'espressione della proteina/peptide tossici viene attuata per iniezione delle cellule con le corrispondenti sequenze di DNA o per iniezione delle stesse con i corrispondenti mRNA.
- 7. Procedimento secondo le rivendicazioni 5-6, in cui dette cellule sono oociti di Xenopus laevis.
- 8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7, per la produzione di immunotossine.
- 9. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7, per la produzione di mitotossine.
- 10. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7, per la produzione della proteina chimerica ATF-saporina.
- 11. Cellule eucariote trasfettate con le sequenze codificanti la proteina/peptide tossici e con sequenze codificanti anticorpi o loro frammenti ad attività neutralizzante verso la proteina/peptide tossici, eventualmente con l'aggiunta di sequenze per l'espressione organo- o tessuto-specifica.
- 12. Uso delle cellule della rivendicazione 11 per la produzione di peptidi o proteine ad attività tossica in cellule eucariote.
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| ITMI980344 IT1298437B1 (it) | 1998-02-20 | 1998-02-20 | Procedimento per la produzione di proteine/peptidi tossici |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1298437B1 (it) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2280063A1 (en) | 2009-07-28 | 2011-02-02 | Consiglio Nazionale delle Ricerche | Pichia pastoris as a host for the production of the ribosome-inactivating protein (RIP) saporin and saporin fusion chimaeras |
-
1998
- 1998-02-20 IT ITMI980344 patent/IT1298437B1/it active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1298437B1 (it) | 2000-01-10 |
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