ITMI971366A1 - Metodo per individuare i linfomonociti secernenti prolattina ed utilizzo nel monitoraggio delle sindromi da immunodeficienza - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

Metodo per individuare i linfomonociti secernenti prolattina ed utilizzo nel monitoraggio delle sindromi da immunodeficienza

Stato della tecnica

La prolattina (PRL) è un ormone proteico di circa 23kDa della regione anteriore della ipofisi scoperto più di 60 aa. orsono come ormone responsabile della lattazione nei mammiferi e perciò chiamato ormone lattotropo.

Da allora però numerose altre funzioni biologiche le sono state attribuite, non ultima quella di avere un ruolo nella regolazione della risposta immunitaria. Infatti, Chen e Coll. (Chen H. W., Meier H., Heiniger H.J. and Huebner R.J. (1972) J. Nati. Cancer Inst. 49, 1145) e Nagy and Berczi (Nagy E. and Berczi I. (1978) Acta Endocrinol. 89, 530) dimostravano che la PRL esogena era capace di ripristinare le funzioni immunologiche compromesse rispettivamente nel topo con sindrome di Dwarf e nel ratto con produzione di PRL ipofisaria bloccata per ipofisectomia o a seguito di trattamento con bromocriptina. Questi dati iniziali seguiti da molti altri simili hanno portato alla convinzione che la PRL ipofisaria giochi un ruolo importante nella regolazione della risposta immunitaria.

Più recentemente però è stato scoperto che ì linfociti stessi producono una propria PRL ed esprimono i recettori per tale molecola (Di Mattia G.E., Gellersen B., Bohnet H.G. and Friesen H.G. (1988) Endocrinology 122. 2508) (Truong A.T., Duez C., Belayew A., Renard A., Pictet R., Bell G.I. and Martial J.A. (1984) EMBO J. 2- 429) suggerendo che anche la PRL linfocitaria abbia un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta immunitaria agendo in maniera autocrina come fattore di crescita per la proliferazione linfocitaria. Infatti, è stato visto "in vitro" che un antisiero anti-PRL è capace di ottenere una inibizione della proliferazione linfocitaria in risposta alla stimolazione con mitogeni come la Con-A o PHA (Hartmann D.P., Holaday J.W. and Bernton E.W. (1989) FASEB J. 2194), ed in "vivo" che il siero antilinfocitario non è in grado di indurre immunosoppressione in topi trattati con bromocriptina (Rosso di San Secondo V.E.M., Fitch C., Aniasi A., Close F.T., Sirchia G. and Freeman M.E. (1996) Transplant. Proc. 28, 3193)·

Da qui l'importanza di un metodo affidabile e facilmente eseguibile capace di individuare e quindi di determinare la quantità di linfomonociti secernenti la PRL nella ipotesi che tali cellule tramite la produzione "in loco" di PRL abbiano un valore prognostico in corso di malattie infettive quali l'AIDS e/o proliferative quali il cancro o le leucemie.

Sommario

Il metodo secondo la presente invenzione si basa sulla emolisi specifica di emazie di montone (SRBC) rivestite di anticorpi anti-PRL per mezzo della Proteina-A legata covalentemente alla superficie delle emazie (coupling). Tali emazie sono quindi capaci di fissare in modo specifico la PRL formando così un complesso antigene-anticorpo capace a sua volta di fissare e attivare il complemento che in definitiva porta alla lisi della cellula. La reazione avviene in una camera di incubazione dove le emazie trattate e le cellule secernenti PRL sono distribuite in monostrato cellulare con un rapporto linfomonociti/emazie superiore a 1/100.

In presenza di secrezione di PRL le emazie intorno al linfomonocita vanno incontro a lisi lasciando così un'area di vuoto cellulare intorno alla cellula a forma circolare chiamata placca. La dimensione della placca corrisponde alla quantità di cellule lisate e quindi è direttamente proporzionale alla quantità di PRL secreta.

I risultati sono stati possibili perchè abbiamo scoperto che contrariamente a quanto avviene con le cellule pituitarie il test con i linfomonociti funziona quando (i) meno cloruro di cromo e Proteina-A vengono utilizzati nella reazione di coupling, (ii) le cellule sono lasciate incubate per un tempo di gran lunga superiore (overnight) a quello utilizzato per le cellule pituitarie (due ore circa).

Descrizione dell'invenzione

Il test di emolisi a placche invertite (RHPA: Reverse Hemolytic Plaque Assay) è da sempre stato considerato il candidato migliore a risolvere il problema dei linfomonociti secernenti PRL in quanto nell'ultimo decennio è .stato utilizzato con successo per evidenziare le cellule ipofisarie secernenti PRL (Smith P.F., Luque E.H. and Neill J.D. (1986) In Methods in Enzymology, ed. P.M. Conn New York: Academic 124, 443). E' un test affidabile, riproducibile ed è in grado anche di misurare la quantità di PRL secreta dalla singola cellula !ipofisaria. Però nonostante tali caratteristiche nel passato ha sempre fallito ogni attesa nel caso dei linfomonociti.

Qui viene ora descritto un metodo di RHPA capace di evidenziare per la prima volta i linfomonociti secernenti PRL con il metodo della emolisi a placche invertite e l'applicazione dello stesso metodo nella immunodeficienza acquisita da virus.

Di seguito sono riportate le modalità di esecuzione del metodo suddivise in quattro parti: (a) preparazione delle SRBC (emazie di montone) con Proteina-A covalentemente legata alla superficie cellulare tramite l'uso di cloruro di cromo (CrCI3.6Η20) chiamata coupling, (b) preparazione della camera di incubazione, (c) esecuzione del test delle placche, (d) uso del test di RHPA nella immunodeficienza acquisita da virus nel topo.

a) Coupling della Proteina-A alle SRBC {emazie di montone} Vengono utilizzate SRBC (Colorado Serum) da due a tre settimane dal prelievo e mantenute a 4°C.in Alsever al 20% fino al momento dell’uso. Al momento del coupling, l'equivalente di 1,0 mi di emazie peccate viene lavato (800g x 10 min) con soluzione fisiologica (0,9% NaCl in acqua distillata) almeno tre volte per rimuovere il buffy-coat contenente i leucociti. Dopo l'ultimo lavaggio alle cellule vengono aggiunti 5.0 mi di soluzione fisiologica, 5.0 mi di soluzione di cloruro di cromo (in diluizioni da 0,025 a 1,5 mg/ml in soluzione fisiologica) e 1,0 mi di Proteina-A (in diluizioni da 0,025 a 1,5 mg/ml in soluzione fisiologica). Incubazione a 30"C per 1 ora seguita da diluizione con cinque volumi di soluzione fisiologica e quattro lavaggi con Alsever. Dopo l'ultimo lavaggio'le emazie vengono sospese al 4% in Alsever o alternativamente in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBC0) e conservate a 4°C fino al momento dell'uso e comunque non oltre una settimana.

E' da notare che la soluzione di cloruro di cromo in soluzione fisiologica va utilizzata non prima di 3 settimane e non oltre 6 mesi dalla preparazione e va tenuta protetta dalla luce e a 4°C. Alternativamente, si può utilizzare una soluzione di cloruro di cromo preparata in acqua distillata, ma in questo caso deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione e nelle seguenti proporzioni:,ad 1,0 mi di emazie peccate vengono aggiunti 9.9 volumi di soluzione fisiologica, 0,1 volume di soluzione di cloruro di cromo in acqua distillata, 1,0 volume di Proteina-A preparata in soluzione fisiologica.

b) Preparazione della Camera di incubazione

Il test è eseguito in una camera di Cunningham (Cunningham A.J. and Szenberg A. (1968) Immunology 14 , 599) modificata utilizzando una piastra di colture cellulari a 6 pozzetti piatti (CORNING). I pozzetti vengono ricoperti con un vetrino coprioggetto di 22 mm dove ai due lati opposti sono applicate due strisce di 5 mm di Scotch Doubled Coated Tape per tenere il vetrino ben fissato alla superficie del pozzetto. La camera cosi formata ha una profondità di circa 90 μm, una superficie di circa 440 x 10<6>μm<2 >ed un volume di circa 30 μl e rimane aperta per i due rimanenti lati opposti. Le,soluzioni vengono aggiunte per capillarità da un lato libero ed il fluido in eccesso viene fatto fluire per gravità dal lato opposto, essendo la piastra inclinata di circa 45 gradi. La piastra prima dell'applicazione del vetrino coprioggetto viene rivestita con poli-L-lisina (0,25 mg/ml in acqua distillata) per 20 minuti a temperatura ambiente, a cui seguono almeno tre lavaggi con acqua distillata, per permettere la formazione di un monostrato di cellule fortemente attaccato alla superficie dei pozzetti. Il coating con poli-L-lisina deve essere preparato appena prima della esecuzione del test.

c) Esecuzione del test di RHPA

La separazione dei linfomonociti è ottenuta dal sangue periferico per sedimentazione con destrano (3% destrano 500. Pharmacia) o per gradiente di densità (Boyum A. (1968) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, Suppl. 97.1)· Nel.topo e nel ratto possono essere utilizzati i linfomonociti della milza (splenociti).

I linfomonociti vengono sospesi in DMEM ed aggiunti alla concentrazione finale di 1x10^ cellule/ml ad una sospensione di 2 % SRBC pretrattate con Proteina-A e sospese in DMEM. La camera di incubazione viene quindi riempita per capillarità con la sospensione cellulare di emazie (2% SRBC) e linfomonociti (lxl0°/ml) e lasciata incubare a 37°C per 45 minuti, in presenza di 5% CO2 e 95% di umidità, per permettere una forte adesione delle cellule alla poli-L-lisina. Ad adesione avvenuta prima di incubare la coltura cellulare overnight a 37°C, in presenza di.5% CO2 e 95% di umidità, vengono aggiunti 60 μΐ di antisiero anti-PRL ottenuto come altrove descritto (Lerant A.A. and Nagy G.M. (199^) Neuroprotocols 198), diluito con DMEM 0,1% BSA in un range da 1:10 a 1:160. Alla fine della incubazione con anticorpo anti-prolattina alla coltura vengono aggiunti 60 μΐ di complemento di cavia diluiti in un range da 1:20 a 1:80 con DMEM 0,1% BSA e la coltura viene incubata per ulteriori 30 minuti a 37°C, in presenza di 5% CO2 e 95% di umidità. Le cellule sono quindi fissate con infusione di glutaraldeide (4% in tampone Sorensen pH 7.4) o altro fissativo. Le cellule sono poi colorate per permettere una migliore identificazione con blu di toluidina (0,5% in acqua distillata) od altra colorazione per i leucociti e il test letto al microscopio ottico.

E' da notare che una volta conosciuta l'ottimale diluizione dell 'antisiero e del complemento si può utilizzare una sola diluizione di entrambi, fino all'estinzione dei relativi batches e comunque non oltre 6 mesi se viene conservato a -40°C 1'antisiero e a -80°C il complemento.

d) Uso del test di RHPA nella immunodeficienza acquisita da virus nel topo.

Il test delle placche testé descritto è stato utilizzato nei topi normali ed infettati con virus LP-BM5 MuLV per sviluppare una immunodeficienza acquisita simile a quella umana e chiamata MAIDS (Murine Acquired Iramunodeficiency Syndrome).

Sono stati utilizzati topi femmine C57b/6N (Charles River) di 22-24 grammi infettati con iniezione intraperitoneale di 0,2 mi di una sospensione cellulare in soluzione fisiologica contenente 1x10<5 >cellule SC-1 transfettate col virus. Per controllo sono stati utilizzati topi inoculati con 0,2 ml di soluzione fisiologica. Dopo 3 mesi dall'inoculo, a malattia conclamata (estesa linfoadenopatia sottocutanea) i linfomonociti della milza ottenuti come descritto altrove (Rosso di San Secondo V.E.M., Aniasi A., Piccolo G., Mascaretti L. and Sirchia G. (1994) Transplant. Proc. 26, 3221) sono stati utilizzati nel test delle placche testé descritto.

Inaspettatamente è stato osservato un enorme aumento del numero delle placche e delle dimensioni delle placche nei topi infettati rispetto a quelli di controllo come si può osservare dalla tabella.

TABELLA. Linfomonociti formanti placche

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1 . Metodo per individuare i linfomonociti secernenti prolattina ed utilizzo nel monitoraggio delle sindromi da immunodeficienza acquisita da virus, caratterizzato dal fatto che: a) emazie di montone lavate con soluzione fisiologica sono sospese in soluzione fisiologica e addizionate con una soluzione di cloruro di cromo e con Proteina-A; b) la sospensione del punto a).viene incubata e poi diluita con soluzione fisiologica e lavata con Alsever; c) le emazie lavate del punto b) vengono sospese in Alsever o in DMEM; d) linfomonociti da sangue periferico o da milza sono sospesi in DMEM;’ e) la sospensione delle emazie del punto c) in DMEM viene aggiunta alla sospensione dei linfomonociti del punto d); f) la sospensione del punto e) viene incubata in una camera di incubazione avente la piastra rivestita con poli-L-lisina, per formare un monostrato di cellule adese alla piastra; g) alle cellule del punto f) si aggiunge antisiero antiprolattina; h) le cellule del punto g) vengono incubate overnight a 37°C in presenza di 3% di CO2 e 33% di umidità; i) alle cellule provenienti d’al punto h) viene aggiunto complemento di cavia e le cellule vengono incubate per 30 minuti a 37°C, in presenza di 3% di CO2 e 35% di umidità; 1) le cellule provenienti dal punto i) vengono fissate, colorate ed esaminate al microscopio ottico per determinare l'area di vuoto cellulare o placca determinata dalla quantità di prolattina secreta.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti linfomonociti quando prelevati da soggetti affetti da immunodeficienza acquisita da virus danno un enorme aumento delle dimensioni della placca e del numero delle placche rispetto ai linfomonociti di controllo.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di cloruro di cromo è una soluzione di CrCl36H2O in soluzione fisiologica a concentrazione da 0,025 a 1,5 mg/ml da utilizzare non prima di 3 settimane e non dopo 6 mesi dalla preparazione.
4. 4. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta soluzione di cloruro di cromo è una soluzione di CrCl36H2O in acqua distillata a concentrazione da 0,025 a 1,5 mg/ml da utilizzare immediatamente. 5- Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta Proteina-A è impiegata a concentrazione da 0,025 a 1.
5. 5 mg/ml in soluzione fisiologica.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta incubazione del punto b) è condotta a 30"C per un'ora.
7. 7- Metodo secondo la rivendicazione 1. caratterizzato dal fatto che detta sospensione delle emazie del punto c) è una sospensione al 4%.
8. 8. Metodo secondò la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta sospensione di linfomonociti del punto d) è di 1x10<6>/ml e quella delle emazie del punto c) è una sospensione al 2%. 9- Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta incubazione del punto f) è condotta a 37°C per 45 minuti in presenza di 3% CO2 e 93% di umidità.