ITMI960484A1 - PROCEDURE FOR DETERMINING AND MONITORING IMMUNOGLOBULINS IN FARMED SEA BASS - Google Patents
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Description
OGGETTO OBJECT
La presente invenzione ha per oggetto un procedimento per la determinazione ed il monitoraggio delle immunoglobuline di spigola di allevamento. The present invention relates to a process for the determination and monitoring of farmed sea bass immunoglobulins.
Pure oggetto della presente invenzione e' la realizzazione di un corredo o kit per la determinazione ed il monitoraggio delle immunoglobuline di spigola di allevamento . Also object of the present invention is the realization of a kit or kit for the determination and monitoring of the immunoglobulins of farmed sea bass.
DESCRIZIONE DESCRIPTION
Come e' noto, negli ultimi anni gli impianti di allevamento in acquacoltura per le specie ittiche commestibili hanno assunto sempre piu' grande importanza. Infatti, la commercializzazione di prodotti ittici provenienti da allevamenti rappresenta una consistente fetta di mercato e consente di equilibrare il fabbisogno nazionale. As is well known, in recent years the aquaculture breeding systems for edible fish species have become increasingly important. In fact, the marketing of fish products from farms represents a substantial slice of the market and allows for the balancing of national needs.
Rivestono particolare interesse, gli impianti di allevamento di specie ittiche commestibili pregiate, quali ad esempio gli impianti di allevamento in acquacoltura di spigole, anche note come branzini, che, come noto, hanno carni molto gustose e sono considerate specie ricercate. Of particular interest are the breeding systems of valuable edible fish species, such as for example the breeding systems in aquaculture of sea bass, also known as sea bass, which, as is known, have very tasty meat and are considered sought after species.
Tali allevamenti pero', devono necessariamente soddisfare certi requisiti, principalmente di tipo sanitario, a garanzia della qualit?' del prodotto destinato al consumatore. Attualmente, tali requisiti vengono verificati mediante un controllo sanitario effettuato di routine dalle autorit?' preposte, che a livello nazionale sono, ad esempio, USL e NAS. However, these farms must necessarily satisfy certain requisites, mainly of a sanitary type, to guarantee quality. of the product intended for the consumer. Currently, these requirements are verified through a health check carried out routinely by the authorities. in charge, which at national level are, for example, USL and NAS.
Tali controlli, che come gi?' detto sono obbligatori, vengono oggi quasi esclusivamente effettuati mediante prelievo casuale di alcuni esemplari dalle vasche dell'allevamento in esame. Those checks, which as already? ' said they are mandatory, today they are almost exclusively carried out by randomly taking some specimens from the tanks of the breeding in question.
Il metodo di controllo attualmente impiegato si basa sull'effettuazione di un'autopsia degli esemplari prelevati casualmente ed in seguito soppressi, e consiste in una serie di analisi anatomo-patologiche eseguite su campioni di detti esemplari. The control method currently used is based on carrying out an autopsy of the specimens taken randomly and subsequently suppressed, and consists of a series of anatomo-pathological analyzes carried out on samples of said specimens.
Appare quindi evidente che tale metodo di controllo presenta lo svantaggio di poter essere impiegato soltanto per un numero limitato di esemplari. It therefore appears evident that this control method has the disadvantage of being able to be used only for a limited number of specimens.
Inoltre e' un metodo laborioso, che richiede tempi di realizzazione piuttosto lunghi e che non consente di ottenere una elevata riproducibilit?' dei risultati. Scopo pertanto del presente trovato e' quello di mettere a disposizione un procedimento che consenta di effettuare un controllo sanitario sulle spigole, in particolare spigole di allevamento, che risulti di semplice e rapida realizzazione, e che consenta di ottenere una elevata riproducibilit?' dei risultati. Pure scopo del presente trovato e' quello di mettere a disposizione un procedimento che consenta di effettuare un controllo sanitario sulle spigole, in particolare di allevamento, che consenta di valutare la presenza di infezioni batteriche e/o virali in atto, e che sia applicabile ad un numero di esemplari elevato. Furthermore, it is a laborious method, which requires rather long realization times and which does not allow to obtain a high reproducibility. of the results. Therefore, the object of the present invention is to provide a process which allows to carry out a health check on sea bass, in particular farmed sea bass, which is simple and rapid to produce, and which allows to obtain a high reproducibility. of the results. Another object of the present invention is to provide a method which allows to carry out a health check on sea bass, in particular for breeding, which allows to assess the presence of bacterial and / or viral infections in progress, and which is applicable to a high number of specimens.
Ancora scopo del presente trovato e' quello di mettere a disposizione un corredo o kit per effettuare detto controllo sanitario sulle spigole che sia di facile impiego e fornisca risultati affidabili in breve tempo. Questi ed altri scopi ancora e relativi vantaggi che piu' chiaramente saranno evidenziati dalla descrizione che segue, vengono raggiunti da un procedimento per il controllo di infezioni batteriche e/o virali nelle spigole, il quale procedimento, secondo il presente trovato consiste nella determinazione e nel monitoraggio dei livelli di immunoglobuline di spigola per mezzo di un anticorpo monoclonale. Another object of the present invention is to provide a kit or kit for carrying out said health check on sea bass which is easy to use and provides reliable results in a short time. These and other objects and related advantages which will be more clearly highlighted by the following description, are achieved by a method for the control of bacterial and / or viral infections in sea bass, which method according to the present invention consists in the determination and in the monitoring of sea bass immunoglobulin levels by means of a monoclonal antibody.
Piu' particolarmente, secondo la presente invenzione, detto anticorpo monoclonale e' un anticorpo DLIg3 (sottoclasse IgGl). More particularly, according to the present invention, said monoclonal antibody is a DLIg3 antibody (IgG1 subclass).
Sempre secondo il presente trovato, dette spigole sono spigole di allevamento; inoltre, sempre secondo il trovato, dette immunoglobuline di spigola sono immunoglobuline totali e/o specifiche e sono indotte da infezioni batteriche e/o virali. Still according to the present invention, said sea bass are farmed sea bass; furthermore, again according to the invention, said sea bass immunoglobulins are total and / or specific immunoglobulins and are induced by bacterial and / or viral infections.
Pure, secondo la presente invenzione, viene realizzato un corredo o kit per il controllo ed il monitoraggio delle infezioni batteriche e/o virali in spigole, in particolare di allevamento, detto corredo o kit essendo realizzato in base al suddetto procedimento, in particolare per la determinazione delle immunoglobuline totali e/o specifiche mediante anticorpo monoclonale DLIg3. Also, according to the present invention, a kit or kit is provided for the control and monitoring of bacterial and / or viral infections in sea bass, in particular from breeding, said kit or kit being made on the basis of the aforementioned procedure, in particular for the determination of total and / or specific immunoglobulins using DLIg3 monoclonal antibody.
Si ? visto infatti che l'anticorpo monoclonale DLIg3 consente di identificare il suo antigene sia quando presente nella forma denaturata e ridotta, che quando presente nella sua conformazione nativa. Yup ? in fact, since the monoclonal antibody DLIg3 allows to identify its antigen both when present in the denatured and reduced form, and when present in its native conformation.
Detto anticorpo monoclonale DLIg3 (sottoclasse IgGl) pu?' essere impiegato, secondo il presente trovato, come sopranatante di coltura intero o diluito dell 'ibridoma che lo produce. Said monoclonal antibody DLIg3 (subclass IgGl) can? be used, according to the present invention, as a whole or diluted culture supernatant of the hybridoma that produces it.
Quando l'antigene e' presente in forma denaturata, l'anticorpo riconosce tramite immunoblotting principalmente un antigene ad un peso molecolare di 27.000 Daltons (catena leggera delle immunoglobuline), e con una intensit?' minore un antigene a 80.000 Daltons (catena pesante delle immunoglobuline) presenti nel siero. When the antigen is present in denatured form, the antibody recognizes by immunoblotting mainly an antigen with a molecular weight of 27,000 Daltons (immunoglobulin light chain), and with an intensity? lower an antigen to 80,000 Daltons (immunoglobulin heavy chain) present in the serum.
L'anticorpo DLIg3 riconosce cellule che portano immunoglobuline sulla loro membrana (linfociti B) tramite analisi immunoistochimica di sezioni di organi e di tessuti di spigola. Ci?' viene effettuato fissando in fissativo di Bouin's il materiale biologico prelevato da spigole sane o infettate, tagliando al microtomo delle sezioni incluse in paraffina, ed incubando le sezioni con DLIg3. La positivit?' viene rilevata tramite un anticorpo secondario marcato con biotina o perossidasi, e l'analisi dei preparati viene effettuata tramite microscopia ottica. The DLIg3 antibody recognizes cells that carry immunoglobulins on their membrane (B lymphocytes) by immunohistochemical analysis of organ and tissue sections of sea bass. There?' it is carried out by fixing biological material taken from healthy or infected sea bass in Bouin's fixative, microtome cutting of the sections embedded in paraffin, and incubating the sections with DLIg3. The positivity? ' it is detected by a secondary antibody labeled with biotin or peroxidase, and the analysis of the preparations is carried out by optical microscopy.
L'anticorpo DLIg3 riconosce cellule che portano immunoglobuline sulla loro membrana (linfociti B) tramite analisi per immunofluorescenza indiretta di cellule provenienti da organi e tessuti di spigola. Questo tipo di analisi pu?' essere effettuato sia tramite microscopia a fluorescenza che tramite l'uso di un citofluorimetro. The DLIg3 antibody recognizes cells that carry immunoglobulins on their membrane (B lymphocytes) by indirect immunofluorescence analysis of cells from sea bass organs and tissues. This type of analysis can be performed both by fluorescence microscopy and by the use of a flow cytometer.
Quando l'antigene e' presente in forma nativa, ad esempio nel siero e/o nei fluidi biologici, l'anticorpo DLIg3 e' capace di riconoscerlo in maniera qualitativa e quantitativa tramite dosaggio immunoenzimatico (ELISA) . When the antigen is present in its native form, for example in serum and / or biological fluids, the DLIg3 antibody is able to recognize it in a qualitative and quantitative manner by means of immunoenzymatic assay (ELISA).
L'anticorpo monoclonale DLIg3 viene quindi impiegato secondo il presente trovato, nella determinazione ed nel monitoraggio del contenuto di immunoglobuline totali e/o specifiche per un dato antigene in esemplari di spigole provenienti da impianti di allevamento in acquacoltura . The monoclonal antibody DLIg3 is therefore used according to the present invention, in the determination and monitoring of the content of total and / or specific immunoglobulins for a given antigen in sea bass specimens coming from aquaculture farms.
Sempre secondo il presente trovato, detto anticorpo monoclonale DLIg3 viene impiegato per la realizzazione di corredi o kit per effettuare la determinazione ed il monitoraggio del contenuto di immunoglobuline totali e/o specifiche per un dato antigene. Always according to the present invention, said monoclonal antibody DLIg3 is used for the production of kits for carrying out the determination and monitoring of the total and / or specific immunoglobulin content for a given antigen.
A titolo esemplificativo, viene qui di seguito riportata la composizione di un corredo o kit di semplice impiego in laboratorio per la determinazione ed il monitoraggio del contenuto di immunoglobuline totali e/o specifiche per un dato antigene. By way of example, the composition of a kit or kit that is simple to use in the laboratory for determining and monitoring the content of total and / or specific immunoglobulins for a given antigen is reported below.
ESEMPIO 1 EXAMPLE 1
- piastre a micropozzetti in polistirene n. 1 - tampone di adsorbimento ml 10 - tampone di lavaggio ml 50 - tampone di bloccaggio ml 10 - anticorpo monoclonale DLIg3 ml 1 - standard di controllo negativo - polystyrene microwell plates n. 1 - 10 ml adsorption buffer - 50 ml washing buffer - 10 ml blocking buffer - DLIg3 monoclonal antibody ml 1 - negative control standard
costituito da tampone e conservanti ml 1 - standard di controllo positivo consisting of 1 ml buffer and preservatives - positive control standard
costituito da immunoglobuline purificate ml 1 - anticorpo di rivelazione costituito da consisting of purified immunoglobulins ml 1 - detection antibody consisting of
un anti-topo marcato con perossidasi ml 10 - sistema di rivelazione costituito dal an anti-mouse labeled with peroxidase 10 ml - detection system consisting of
substrato e dal cromogeno ml 10 La suddetta composizione e' stata impiegata come corredo o kit per l'analisi di campioni di sangue prelevati ed isolati da esemplari di spigole in allevamento. substrate and chromogen ml 10 The above composition was used as a kit or kit for the analysis of blood samples taken and isolated from specimens of sea bass in breeding.
I campioni di sangue sono stati sottoposti a centrifugazione ed il siero e' stato separato e conservato a -30 ?C. Al momento dell'analisi, i campioni sono stati scongelati e diluiti 1:50 con il tampone di adsorbimento (sodio carbonato - bicarbonato 50 mM pH 9,4), ulteriori diluizioni sono state effettuate con il tampone di adsorbimento fino ad una diluizione finale di 1:20.000. Di ciascuna diluizione sono stati depositati nella piastra di polistirene 0,1 ml per ogni pozzetto almeno in duplicato. Lo standard di controllo positivo e' stato diluito nella stessa soluzione ed ulteriori diluizioni sono state effettuate allo stesso modo depositando poi 0,1 ml per ogni pozzetto almeno in duplicato. The blood samples were centrifuged and the serum was separated and stored at -30 ° C. At the time of analysis, the samples were thawed and diluted 1:50 with the adsorption buffer (sodium carbonate - 50 mM bicarbonate pH 9.4), further dilutions were made with the adsorption buffer up to a final dilution of 1: 20,000. Of each dilution, 0.1 ml for each well were deposited in the polystyrene plate at least in duplicate. The positive control standard was diluted in the same solution and further dilutions were carried out in the same way, depositing 0.1 ml for each well at least in duplicate.
Lo standard di controllo negativo e' stato effettuato depositando in almeno 4 pozzetti 0,1 ml di tampone di adsorbimento. La piastra contenente i vari campioni viene chiusa con coperchio per evitare l'evaporazione e lasciata per 12 ore a 4 ?C. I campioni nei vari pozzetti vengono eliminati ed i pozzetti lavati 3 volte con 0,1 mi di tampone di lavaggio (Tris 50mM pH 7,4; NaCl 0,15M; Tween-20 0,05%), quindi incubati con 0,1 ml tampone di bloccaggio (3% albumina in tampone di lavaggio), lavati ancora 3 volte con tampone di lavaggio come sopra, ed incubati con 0,1 ml dell'anticorpo monoclonale DLIg3 per 90 minuti a temperatura ambiente. I pozzetti vengono lavati 3 volte come sopra ed addizionati con 0,1 ml di anticorpo di rivelazione per 90 minuti a temperatura ambiente. I pozzetti vengono lavati 3 volte come sopra ed addizionati con 0,1 ml di sistema di rivelazione, che viene lasciato sviluppare per 15 minuti. I valori di assorbanza relativi vengono letti alla lunghezza d'onda di 492 nanometri tramite un colorimetro automatico per la lettura delle piastre. E' stata calcolata la media dei conteggi per ogni gruppo di due campioni, dopo aver sottratto il valore di fondo. Sono state tracciate delle curve standard su grafico lineare-logaritmico riportando in ordinata i valori medi di assorbanza ottenuti ed in ascissa il logaritmo del reciproco della diluizione dell'antigene. Le concentrazioni di antigene (immunoglobuline sieriche) in mg/ml sono state quindi ricavate direttamente dalla curva standard The negative control standard was carried out by depositing 0.1 ml of adsorption buffer in at least 4 wells. The plate containing the various samples is closed with a lid to avoid evaporation and left for 12 hours at 4 ° C. The samples in the various wells are discarded and the wells washed 3 times with 0.1 ml of washing buffer (Tris 50mM pH 7.4; NaCl 0.15M; Tween-20 0.05%), then incubated with 0.1 ml blocking buffer (3% albumin in wash buffer), washed again 3 times with wash buffer as above, and incubated with 0.1 ml of the DLIg3 monoclonal antibody for 90 minutes at room temperature. The wells are washed 3 times as above and added with 0.1 ml of detection antibody for 90 minutes at room temperature. The wells are washed 3 times as above and added with 0.1 ml of detection system, which is left to develop for 15 minutes. The relative absorbance values are read at the wavelength of 492 nanometers by means of an automatic colorimeter for reading the plates. The average of the counts was calculated for each group of two samples, after subtracting the background value. Standard curves were plotted on a linear-logarithmic graph, reporting the mean absorbance values obtained on the ordinate and the logarithm of the reciprocal of the antigen dilution on the abscissa. The antigen concentrations (serum immunoglobulins) in mg / ml were then taken directly from the standard curve
Nelle Figure 1 e 2 sono riportati a titolo esemplificativo, i grafici relativi ad un esperimento pilota; per entrambe le Figure, in ordinata e' riportata l'assorbanza a 492 nm, mentre in ascissa di Figura 1, che corrisponde al dosaggio di immunoglobuline totali, e' riportato il logaritmo del reciproco della diluizione dei sieri, ed in ascissa di Figura 2, che corrisponde alla curva di riferimento standard, e' riportata la concentrazione dell'antigene (ng/pozzetto). Figures 1 and 2 show, by way of example, the graphs relating to a pilot experiment; for both Figures, the absorbance at 492 nm is reported in the ordinate, while the logarithm of the reciprocal of the serum dilution is reported in the abscissa of Figure 1, which corresponds to the total immunoglobulin dosage, and in the abscissa of Figure 2 , which corresponds to the standard reference curve, the antigen concentration (ng / well) is reported.
I risultati ottenuti con il procedimento secondo il presente trovato, vengono tradotti come quantit? di immunoglobuline per millilitro di sangue. I valori ottenuti non necessitano di alcuna conversione, in quanto rappresentano direttamente una quantit?'. The results obtained with the process according to the present invention are translated as quantity? of immunoglobulins per milliliter of blood. The values obtained do not require any conversion, as they directly represent a quantity.
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| IT96MI000484A IT1288109B1 (en) | 1996-03-13 | 1996-03-13 | MONOCLONAL ANTIBODY FOR THE DETERMINATION AND MONITORING OF IMMUNOGLOBULINS IN FARMED SEAS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | IT1288109B1 (en) |
-
1996
- 1996-03-13 IT IT96MI000484A patent/IT1288109B1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1288109B1 (en) | 1998-09-10 |
| ITMI960484A0 (en) | 1996-03-13 |
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Legal Events
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| 0001 | Granted |