ITMI960194A1 - Terreno di arricchimento preliminare e sistema rapido per il riconoscimento delle salmonelle - Google Patents
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Abstract
La presente invenzione si riferisce ad un terreno liquido selettivo per la crescita delle Salmonelle, dotato di una selettività differenziata per le altre Enterobatteriacee, e, in particolare, della capacità di inibire del tutto la crescita dei vari tipi di Proteus e dei germi Gram positivi, anche se inizialmente presenti nel campione in forte concentrazione.L'elevata fertilità per le Salmonelle ne favorisce la crescita, con intenso arricchimento anche per cariche iniziali molto basse.E' così possibile, dopo opportuna incubazione in tal terreno, mediante trapianto, per infissione, di quantità minime, in un terreno solido altamente selettivo, ottenere la crescita selettiva delle Salmonelle con modifiche di aspetto del terreno caratteristiche, specifiche, ed avere la possibilità di eseguire direttamente la tipizzazione sierologica usando la patina di crescita superficiale.
Description
DESCRIZIONE
I principali problemi posti dalla ricerca delle Salmonelle in materiali vari, sia clinici (feci, urine) sia di tipo igienistico (alimenti freschi o conservati, acque ecc.) sono legati alla carica batterica, alle condizioni dei germi più o meno stressati' , alla flora batterica concomitante, alla influenza sulla loro crescita delle caratteristiche fisiche, chimiche e biochimiche del materiale in cui le Salmonelle sono contenute .
La scarsità della carica, la ridotta vitalità, la presenza di inibitori nel materiale in esame, sono fattori che, specie se presenti contemporaneamente, agiscono negativamente sulla crescita delle Salmonelle.
Tali fattori possono venire esaltati dall'uso i terreni di coltura con selettività elevata n cui, in condizioni sfavorevoli, anche la crescita delle Salmonelle può essere ostacolata, con il rischio di causare false negatività.
Questi terreni, inoltre, contengono solitamente selenito di sodio, attualmente vietato dalle disposizioni antiinquinamento.
Il terreno di prearricchimento qui presentato, indicato da qui in avanti con la sigla PRA, ha lo scopo di potenziare elettivamente la crescita delle Salmonelle, evitando false negatività, di bloccare lo sviluppo delle varie specie di Proteus, che sono i microorganismi che, per le loro caratteristiche biochimiche, più possono interferire con il successivo riconoscimento delle Salmonelle. Esso è inoltre privo di selenito in ottemperanza alle disposizioni anti-inquinamento.
La presenza di un tensioattivo assicura la limpidità del terreno ed evita la formazione di precipitati durante la crescita batterica, per cui le torbidità, che appaiono durante l'incubazione, sono esclusivamente in rapporto con tale crescita e permettono di seguirla nel tempo valutandola quantitativamente .
Il suddetto terreno di prearricchimento (PRA) è un terreno liquido, contenente gli ingredienti qui appresso elencati nell'ambito delle quantità indicate nella Tabella seguente:
La valutazione delle crescita mediante conteggio in piastra, eseguito in parallelo, ha dimostrato la validità delle misure turbidimetriche . Queste hanno messo in rilievo (Fig- 1 e 2) un'ottima fertilità per le Salmonelle, anche a concentrazioni iniziali molto basse, e un blocco completo dei Proteus e dello Staphylococcus aureus anche per cariche iniziali elevate (1.10<6>) Unità Formatrici Colonie - UFC) e inoltre la possibilità di crescita delle Shigelle, germi notoriamente difficili da coltivare.
L'aggiunta di tampone fosfato a pH 7,0 contribuisce, mediante la stabilizzazione del pH, a impedire la formazione dei precipitati, a permettere di prolungare i tempi di incubazione e quindi di aumentare 1'arricchimento anche per cariche iniziali molto basse, evitando fenomeni di autoinibizione, possibili specie in presenza di materiale fecale. I fosfati costituiscono inoltre un ulteriore elemento di crescita.
Il terreno PRA sembra perciò presentare le caratteristiche ideali per un terreno di prearricchimento per le Salmonelle.
Evidentemente, non contenendo inibitori di crescita, tranne i sali biliari, che agiscono solo sui Proteus e sui germi Gram-positivi, esso permette una crescita abbondante anche di altre Enterobatteriacee la cui interferenza deve essere eliminata nei passaggi successivi per isolare le Salmonelle allo stato puro.
Per ottenere tali risultati si può ricorrere al metodo classico di isolamento su piastra con o senza passaggio intermedio su terreno selettivo liquido, oppure per trapianto mediante infissione in un terreno solido ad alta selettività.
Quest'ultima soluzione è stata da noi preferita per la maggior semplicità di esecuzione, il costo molto inferiore e la rapidità di risposta molto superiore in confronto a quelli dei sistemi classici.
Tali risultati hanno potuto essere ottenuti mediante la messa a punto di un apposito terreno molto selettivo e con indicatori specifici di crescita delle Salmonelle.
Crescita e riconoscimento di Salmonelle per trapianto mediante infissione dal terreno di prearricchimento (PRA) in terreno solido fortemente selettivo e con indicatori specifici.
Il suddetto terreno viene indicato con la sigla Es = Evidenziazione Salmonelle.
_ La sua composizione è la seguente (per litro)
L'invenzione riguardante l'uso accoppiato dei due terreni PRA ed ES è qui di seguito illustrata da esempi di preparazione dei terreni stessi e da un esempio di confronto durante una epidemia di Salmonellosi, del sistema proposto con i procedimenti noti.
ESEMPIO 1
Si prepara un terreno PRA con i seguenti
La caratteristica più importante del terreno ES è la concentrazione molto elevata in sali biliari che potenziano l'azione dell'antibiotico selettivo novobiocina nei confronti delle varie Enterobatteriaceae al di fuori delle Salmonelle.
La presenza di lattosio permette di rivelare eventuali lattosio fermentanti qualora qualcuno di questi fosse presente con cariche tanto elevate da superare l'effetto inibente.
Come indicatore di reazione è stato usato il blu di bromotimolo. Questo ha un punto di viraggio nell'alcalino relativamente basso e cioè a pH 7,6.
In confronto con altri indicatori comunemente usati, come il rosso fenolo che vira a pH 8,4, esso consente di rivelare con maggiore precocità e sensibilità l'alcalinizzazione specificamente prodotta dalle Salmonelle per decarbossilazione della lisina presente nel terreno. La variazione di colore che si verifica risalta anche più nettamente perchè, con il blu di bromo timolo, il terreno è solo lievemente colorato in grigio.
Tale caratteristica del terreno permette di riconoscere in modo precoce gli annerimenti prodotti specificamente dalla formazione di SH2 , anche nel caso di Salmonelle scarsamente produttrici di tale metabolita, come la S. typhi.
La produzione di SH2 da parte delle Salmonelle appare anche favorita dall'uso del Proteos peptone Difco.
Si sciolgono le sostanze comprese sotto (a) in 500 mi di H20 distillata scaldando leggermente. Si raffredda e si porta a pH 7,2 con NaOH 1 mmol/1.
Si sciolgono i sali biliari (b) in 200 mi di H20 distillata e si mescolano con la soluzione di (a)-Si sciolgono i fosfati (c) in 100 mi e si aggiungono alla soluzione (a)+(b).
Si aggiungono poi 100 mi di una soluzione al 10% in H20 distillata di Triton X 100.
Si sterilizza per 30 minuti a vapore fluente.
ESEMPIO 2
Si prepara un terreno ES con i seguenti ingredienti:
Sciogliere i componenti (a) in 400 mi di H20 distillata scaldando leggermente.
Raffreddare e portare a pH 6,9 con NaOH 1 mmol/1 .
Sciogliere i sali biliari (b) in 100 mi di H20 distillata e mescolare le due soluzioni.
Sciogliere 1<1 >agar in 500 mi di H20 sterile portando alla ebollizione. Mescolare con la soluzione (a)+(b).
Sterilizzare a vapore fluente per 30 minuti. Raffreddare fino a 55-60<e>C. Aggiungere la Novobiocina sciolta in 10 mi di H20 distillata sterile. Mescolare bene. Distribuire 5 mi per provetta in provette con tappo a vite.
Far solidificare a becco di clarino poco allungato .
USO
Seminare per infissione in profondità con ansa da 5 μΐ da colture in PRA di 12-20 ore.
Incubare a 37-40°C per 10-24 ore. Tenere allentato il tappo per permettere la comunicazione con l'aria ambiente.
La presenza delle Salmonelle viene rivelata da netto viraggio al verde che procede dalla superficie del becco di clarino verso la profondità e per le Salmonelle produttrici di SH2, da annerimento lungo il tragitto d'infissione, che si estende poi rapidamente e intensamente in tutto il terreno.
ESEMPIO 3
Il sistema PRA ES è stato applicato, durante una epidemia di Salmonellosi,in confronto con il metodo classico, cioè arricchimento in terreno al selenito, isolamento su piastra in terreno SS, sottocoltura identificazione biochimica tipizzazione sierologica.
Si è proceduto come segue:
1) Semina nel terreno PRA con le piccole quantità di feci consentite dalla fertilità del terreno (circa 200-250 mg su 5 mi di terreno); eventuali fattori inibenti restano così diluiti.
2) Incubazione a 37-38°C per 20 ore.
3) Passaggio nel terreno solido ES per infissione profonda con ansa da 5 o da 10 μΐ. Incubazione a 37-38°C per 10-18 ore.
I risultati sono stati i seguenti:
Campioni esaminati. 879
Campioni positivi con il metodo classico. 53 Campioni positivi con il sistema PRA+ES. 59
I 6 campioni risultati positivi solo con il sistema PRA+ES erano tutti di portatore quindi con cariche di Salmonelle molto basse. Con tale metodo i tempi necessari per 1'evidenziazione delle Salmonelle sono stati di 30-36 ore contro una media di 72 ore con il metodo classico
Claims (8)
- RIVENDICAZIONI 1. Aggiunta in quantità notevoli di un tensioattivo non ionico ad un terreno con forte concentrazione di sali biliari, mannitolo e sostanze nutritive proteiche, che evita la formazione di precipitati durante la crescita batterica, che può così essere seguita turbidimetricamente, evitando anche alterazioni nei terreni selettivi usati successivamente.
- 2. Eliminazione del selenite di sodio in ottemperanza con le disposizioni anti-inquinamento.
- 3. Tamponamento con fosfati che stabilizza il pH e permette di prolungare l'incubazione, evitando fenomeni di autoinibizione e favorendo 1 'arricchimento.
- 4. Blocco batteriostatico delle diverse specie di Proteus.
- 5. Uso del terreno della rivendicazione 1 come liquido di arricchimento e di trasporto per la semina successiva in terreno solido a selettività molto elevata per le Salmonelle.
- 6. Concentrazione molto elevata dei sali biliari, in presenza di Novobiocina, nel terreno solido di evidenziazione delle Salmonelle, che accresce la capacità inibente nei confronti delle altre Enterobatteriacee senza modificare la elevata fertilità per le Salmonelle.
- 7. Aggiunta di lattosio al terreno di evidenziazione delle Salmonelle per rivelare eventuali massivi inquinamenti da lattosio fermentanti.
- 8. Uso come indicatore del blu di bromo timolo che, virando ad un pH relativamente basso, permette un viraggio rapido nel tempo ed altamente sensibili all'alcalinizzazione prodotta dall'azione della lisina decarbossilasi, specifica delle Salmonelle. Il viraggio è più evidente che con altri indicatori per il contrasto con il terreno solo lievemente colorato.
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