ITMI940068A1 - Procedimento per la preparazione di condroitin solfato - Google Patents
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Description
Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
"Procedimento per la preparazione di condroitin solfato"
Campo dell'invenzione
La presente invenzione riguarda la preparazione di condroitinisolfato di peso molecolare compreso fra 10000 e 30000 Dalton e rapporto solfati/carbossili compreso fra 0,90 e 1,00 mediante un nuovo procedimento di trattamento chimico di condroitin solfati aventi peso molecolare 30.000-50.000 e rapporto solfati/carbossili superiore a 1,00, quali quelli purificati da tessuti di pesce.
Il condroitin solfato è un eteropolisacce.ride (glicosaminoglicano), presente in vari tessuti ed organi animali in miscela con altri glicosaminoglicani (eparina, dermatan solfato etc.).
Nei tessuti animali le catene di condroitin solfato sono generalmente legate alle proteine a costituire i cosiddetti proteoglicani.
Il condroitin solfato è presente nei tessuti animali sia a livello cellulare, come costituente delle membrane plasmatiche, che extracellulare, e si trova in particolare abbondanza nella matrice extracellulare dei tessuti connettivali e cartilagìnei, nella matrice cartilaginea dell'osso in accrescimento e del midollo osseo. E' inoltre presente nel liquido sinoviale, nel plasma e nelle urine.
Il condroitin solfato, come altri gligosamminoglicani, viene ottenuto dai tessuti animali che lo contengono con procedimenti estrattivi e di purificazione. Sono noti i condroitin solfato ottenuto da notocorda di ciclostomi {Anno K., Seno N., Methews M.B., Yamagata T., Suzuki S., Bioch. Biopys. Acta 237, 173.
1971). da setto nasale bovino, da trachea bovina {Volpi N. Carb. Res., 247, 263, 1993). quelli estratti da pelle di squalo (Seno N. e Meyer K., Bioch. Biophys. Acta, 78, 258, 1963) e da cartilagine di squalo (Suzuki S., Saito H., Yamagata T., Anno K., Seno N., Kawai Y e Furuhashi T., J. Biol. Chem. 243, 7. 1968). Dal punto di vista della struttura chimica il condroitin solfato è un polisaccaride costituito da sequenze disaccaridiche composte da residui variamente solfatati di acido uronico [fS-D-glucuronico) e di α-D-N-acetil-galattosammina, uniti con legami β(1->3)-Il condroitin solfato è un polisaccaride a struttura eterogenea, in quanto all'interno delle sue catene polisaccaridiche possono essere localizzate in diversa percentuale unità disaccaridiche diverse per numero e posizione di gruppi solfato.
Fra i condroitin solfati estratti e purificati da diversi organi e tessuti animali sono stati identificati il condroitin solfato A , o condroitin 4-solfato , principalmente costituito dal disaccaride 4-solf ato [ ( 1 — > 4 ) -0- { acido P-D-glucopiranosiluronico)-(l->3)-0-2-N-acetammido-2-deossi-p-D-galattopiranosil-4-solfato)] ; il condroitin solfato C, o condroitin 6-solfato, essenzialmente costituito dal disaccaride 6-solfato [(l->4}-0-{acido (ì-D-glucopiranosiluronico)-{l->3)-0-2-N-acetammido-2-deossi-p-D-galattopiranosil-6-solfato)] (Murata K. e Yokoyama Y.. Anal. Biochem. 149, 26l, 1985)-Sono stati inoltre isolati ed identificati il disaccaride non solfato [{l->4)-0-{acido {S-D-glucopiranosiluronico)-(l->3)-0-2-N-acetammido-2-deossi-fS-D-galattopiranosil]; i disaccaridi disolfato, in cui i due gruppi solfato sono legati in posizione 2 dell'acido β-D-glucuronico e in posizione 6 dell’a-D-N-acetilgalattosammina (disaccaride D o disaccaride 2,6-disolfato), o in posizione 4 e 6 dell'a-D-N-acetil-galattosammina {disaccaride E o diasaccaride 4,6-disolfato); il disaccaride B o disaccaride 2,6-disolfato [(1->4)-0-(acido p-D-glucopiranosiluronico-2-solfato)-(1—>3)-0-2-N-acetammido-2-deossi-fS-D-galattopiranosil-4-solfato]; il disaccaride trisolfato [(1->4)-0-(acido β-D-glucopiranosiluronico-2-solfato)-(l->3)-0-2-N-acetammido-2-deossi-6-D-galattopiranosil-4,6-disolfato] (Kimata K., Okayama M., Oohira A., Suzuki S., Mol. Celi. Biochem.. 1. 211. 1963). In Figura 1 sono riportate le strutture di sette disaccaridi costitutivi di condroitin solfato finora identificati.
La presenza di regioni differenti sia nella struttura che nella quantità di gruppi solfato lungo la catena, la diversa lunghezza delle catene polisaccaridiche e la diversa percentuale di questi diversi disaccaridi influisce sulle caratteristiche chimicofisiche del condroitin solfato (densità di carica o rapporto solfati/carbossili, contenuto di zolfo, peso molecolare), che dipendono fortemente dalla fonte di estrazione e purificazione per quanto riguarda tipo di animale, di tessuto o organo, età del tessuto stesso (Kimata K., Okayama M., Oohira A., Suzuki S., Mol. Celi. Biochem., 1, 211, 1963; (Suzuki S., Saito H., Yamagata T., Seno N., Kaway Y., Furuhashi T., J. Biol. Chem. 243. 7. 1968). Ad esempio, il condroitin solfato purificato da cartilagine di bue è costituito quasi esclusivamente da disaccaridi non solfato o monosolfato in posizione 4 o 6, e i disaccaridi disolfatc sono praticamente assenti, mentre quello purificato da cartilagine di pesce, oltre ai disaccaridi non solfato e monosolfat.o in posizione 4 e 6, presenta percentuali variabili (dal 20 al 30%) di disaccaridi solfato, siano essi solfatati in posizione 2 e 4, 4 e 6, o 2 e 6 (Volpi N., Carb. Res., 247, 263. 1993).
Inoltre, il condroitin solfato purificato da cartilagine bovina ha peso molecolare compreso fra 10.000 e 30-000. mentre qiuello estratto da tessuti di pesce ha peso molecolare compreso fra 30.000 e 50.000.
Nel condroitin solfato purificato da cartilagine bovina il rapporto solfato/carbossili è compreso fra 0,90 e 1,00 con un contenuto in zolfo compreso fra 5,5% e 7.0%, mentre in quello purificato da cartilagine di pesce tale rapporto è compreso fra 1,20 e 1,25 con un contenuto di zolfo compreso fra 6,0 e 7.5,Sili condroitin solfato svolge numerose e fondamentali funzioni in condizioni fisiologiche a livello dei tessuti ed organi in cui è presente, regolando ad esempio forza ed elasticità dei tessuti e intervenendo nell'organizzazione delle strutture citoscheletriche.
In terapia, il condroitin solfato è utilizzato in particolare nel trattamento di vari stati patologici delle giunture cartilaginee, quali processi infiammatori e osteoartrosi ed è inoltre in grado di esplicare un'azione protettiva nei confronti di tessuti cartilaginei e del fluido sinoviale (Pipitene V.R., Drugs Explt., Clin. Res., XVII (1), 3. 1991; Rovetta G., Drugs Explt., Clin. Res., XVII (1), 53. 199D -Come avviene per altri glicosaminoglicani, la struttura e le proprietà chimico-fisiche del condroitin solfato si riflettono sulla sua attività biologica: ad esempio il condroitin solfato ottenuto mediante processi chimici di solfatazione mostra attività biologiche diverse da quelle dei condroitin solfati di bassa densità di carica (Scully M.F., Ellis V., Seno N., Kakkar V.V., Biochem. J. 254, 547, 1988).
Si trovano oggi in commercio preparazioni farmaceutiche contenenti condroitin solfato di origine bovina.
Nonostante le tecnologie di estrazione e di purificaziione estremamente sofisticate oggi disponibili, i prodotti di origine bovina vengono guardati con crescente diffidenza in quanto presentano il rischio più o meno elevato di essere contaminati da materiale virale.
E' questa la ragione per cui negli anni recenti molti paesi hanno preso provvedimenti più o meno drastici per eliminare i rischi connessi all'uso di tali prodotti, dalla messa fuori legge dei prodotti di origine bovina al ritiro dal commercio dei farmaci per cui esiste il sospetto di contaminazione virale.
Pertanto, l'industria farmaceutica sta indirizzando i propri sforzi di ricerca verso la messa a punto di nuove tecnologie che consentano di ottenere da animali diversi i principi attivi finora ricavati da tessuti ed organi bovini.
L'utilizzazione di condroitin solfato proveniente da fonti animali diverse pone una serie di problemi di modificaz;ione strutturale al fine di ottenere un prodotto idoneo per caratteristiche chimico-fisiche e quindi della attività biologica. E' stato infatti dimostrato che alcune attività del condroitin solfato di origine ittica possono essere inferiori rispetto a quello di origine bovina. Ad esempio, il condroitin solfato di origine bovina è molto più attivo nello stimolare la proliferazione cellulare e nel ridurre i processi di differenziamento cellulare in test su cellule leucemiche U-937 rispetto ad un condroitin solfato estratto da cartilagine di squalo, parzialmente depolimerizzato ad un peso molecolare analogo a quello del prodotto di origine bovina, ma con rapporto solfati/carbossili superiore (N. Volpi et al. Leukemia Research, Voi. 17. N. 9. Pag.789. 1993).
Inoltre, è noto che nel trattamento con condroitin solfato sovrasolfatato di patologie degenerative delle articolazioni sono stati riscontrati episodi di trombocitopenia e trombosi venosa (A. GREINACHER et al., BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, 81. 23⁄42, 1992).
Questi dati mettono in evidenza che per ottenere un prodotto dotato di attività biologica completamente equivalente a quello di origine bovina utilizzando condrotin solfato di origine ittica si rende necessario ridurre sia peso molecolare che rapporto solfati/carbossili ai valori presenti nel prodotto di origine bovina.
Tecnica anteriore
Sono noti vari procedimenti di depolimerizzazione: di glicosaminoglicani, che utilizzano vari mezzi, fisici (ad esempio tramite azione di raggi gamma), chimici od enzimatici.
Le depolimerizzazioni di tipo chimico possono a loro volta essere di tipo ossidativo, realizzate ad esempio con acqua ossigenata; di tipo deamminativo, realizzate con acido nitroso o con composti in grado di liberarlo, di tipo solfatante, quali quelle realizzate con acido solforico, depolimerizzazioni acido- o basecatalizzate. Nel caso del condroitin solfato, sono noti vari procedimenti di depolimerizzazione, in particolare in ambiente acido.
Ad esempio. JP 70004734 (estratto Derwent) descrivi: la preparazione di condroitinsolfato a basso peso molecolare per trattamento a 90-100eC in ambiente acquoso con resine a scambio ionico di tipo cationico fortemente acide dotate di gruppi sulfonilici.
JP 70001445 (estratto Derwent) riporta la preparazione di condroitin solfato a peso molecolare compreso fra 4000 e 10000 Dalton, mediante trattamento con acidi diluiti (HC10,1 N), a 30°-60eC.
JP 74030817 (estratto Derwent) descrive l’ottenimento di condroitin solfato a peso molecolare compreso fra 2000 e 20000 per riscaldamento a 50-80°C di soluzioni della sua forma acida, ottenuta per passaggio su resine a scambio ionico.
USP 3405120 riporta l’idrolisi di condroitin solfato commerciale per trattamento con acidi (cloridrico od ossalico) a 35-95°C. per tempi di 10-24 ore, con ottenimento di frazioni a peso molecolare compreso fra 2000 e 6000 Dalton.
BE 857369 è relativo alla preparazione di condroitinsolfato a peso molecolare 3000-6000 per trattamento con una miscela di acido tricloroacetico e cloridrico.
In genere, i procedimenti sopra ricordati forniscono prodotti di peso molecolare notevolmente inferiore a quello dei prodotti di partenza, spesso inferiore ai 10,000 Dalton, e sono effettuati per ottenere prodotti a maggiore biodisponibilità ed attività, o per ridurre la viscosità delle loro soluzioni.
Nessun documento di tecnica nota riporta espressamente nè tantomento suggerisce come modificare il condroitin solfato estratto da materiale ittico per ottenere un prodotto simile a quello di origine bovina attualmente in commercio.
Sommario
Ora la Richiedente ha sorprendentemente trovato un procedimento che consente di depolimerizzare e desolfatare un condroitin solfato di origine ittica simultaneamente, cioè in un unico passaggio chimico, e in modo controllato, fermandosi ai valori desiderati di peso molecolare e rapporto solfati/carbossili, ottenendo un condroitin solfato equivalente a quello di origine bovina sia per caratteristiche chimico-fisiche (peso molecolare 10.000-30.000. rapporto solfati/carbossili 0,90-1,00) che per attività biologica.
Il procedimento dell'invenzione è in particolare un procedimento per la preparazione di condroitin solfato di origine ittica a peso molecolare 10.000-30.000 e rapporto solfati/carbossili 0,90-1,00, comprendente i seguenti passaggi:
a) depolimerizzazione e desolfatazione in condizioni controllate, per riscaldamento di una soluzione acquosa di condroitin solfato sovrasolfatato di origine ittica ad una temperatura compresa fra 90 e 100 C, a pH 1,5“3. in presenza di un acido forte e di resine a scambio ionico cationiche;
b) arresto della reazione di depolimerizzazione e desolfatazione, mediante alcalinizzazione a pH 6,0-8,0;
c) recupero e purificazione del condroitin solfato a peso molecolare 10.000-30·000 e rapporto solfati/carbossili 0,90-1,00 cosi ottenuto, mediante una tecnica scelta nel gruppo costituito da precipitazioni selettive da solventi, cromatografie su resine a scambio ionico, evaporazione sotto vuoto di soluzioni acquose, da sole o in combinazione fra loro.
Nel presente testo per condroitin solfati di origine ittica si intendono vari tipi di condroitin solfati sovrasolfatati, aventi cioè rapporto solfati/carbossili superiore a 1,00, quali quelli estratti da tessuti di pesci, ad esempio squali, ed altri condroitin solfati sovrasolfatati, quali quelli ottenuti da balene, molluschi e notocorde. I condroitin solfati sopra menzionati hanno peso molecolare generalmente variabile da 30-000 a 50.000 e rapporto solfati/carbossili tipicamente compreso fra 1,00 e 1,30, preferibilmente 1,20-1,25- Possono essere inoltre utilizzati condroitin solfati di origine ittica sovrasolfatati parzialmente depolimerizzati, quali quelli trattati secondo metodi noti di depolimerizzazione che non comportano concomitamte desolfatazione: i condroitin solfati cosi pretrattati possono avere peso molecolare anche inferiore a 30-000 (e superiore a 10.000), pur mantenendo un rapporto solfati/carbossili superiore a 1,00,(fra 1,00 e 1.30) e possono essere convertiti in condroitin solfati equivalenti a quelli di origine bovina regolando opportunamente le condizioni di trattamento a pH acido, in particolare i tempi, in modo da ottenere il grado di desolfatazioone desiderato , pur rimanendo entro i limiti desiderati di peso molecolare.
Descrizione particolareggiata
Il condroitin solfato di origine ittica utilizzabile per il procedimento della presente invenzione può essere estratto e purificato da tessuti animali secondo metodi descritti nella letteratura prima citata. Tuttavia si trova anche disponibile commercialmente.
In condizioni di realizzazione preferite si utilizza il condroitin solfato estratto da cartilagine di pesce, avente peso molecolare compreso fra 30-000 e 50.000 Dalton e rapporto solfati/carbossili compreso fra 1,00 e 1,30. Altre caratteristiche chimico-fisiche del condroitin solfato estratto da cartilagine di pesce sono:
- contenuto di zolfo compreso fra 6,0 e 7,5%:
- contenuto di disaccaride 6-solfato compreso fra 50% e 60% , tipicamente del 55#;
- contenuto di disaccaride 4-solfato compreso fra 15% e 30%, tipicamente del 16#;
- contenuto di disaccaridi disolfato compreso fra 20 e 30%
- contenuto di disaccaride non-solfato compreso fra 2 e 5%, tipicamente 2%;
- contenuto totale di acidi uronici compreso fra 31% e 37%;
- contenuto totale di esosammine compreso fra 31 % e 37%·
Quando si utilizza il condroitin solfato appena descritto si ottiene un condroitin solfato di origine ittica parzialmente depolimerizzato e desolfatato con le seguenti caratteristiche: - peso molecolare compreso fra 10.000 e 30.000 Dalton;
- rapporto solfato/carbossili compreso fra 0,90 e 1,00:
- contenuto di zolfo compreso fra 5,0 e 7.03!;
- contenuto di disaccaride 6-solfato compreso fra 45% e 60% - contenuto di disaccaride 4-solfato compreso fra il 30% e il 45X.
- contenuto di disaccaridi disolfato compreso fra 0 e 3%·,
- contenuto di disaccaride non-solfato compreso fra 8 e 11%; - contenuto totale di acidi uronici compreso fra il 32 e il 37% - contenuto totale di esosammine compreso fra il 31 e il 38%; - [α]D25 compreso fra -14 e -20 (H2O, c=5)·
- assenza di acidi nucleici e di materiale proteico;
- attività terapeutica equivalente a quella del condroitin solfato estratto e purificato da trachea bovina.
In particolare, è possibile ottenere con il presente metodo un condroitin solfato parzialmente depolimerizzato e desolfatato con peso molecolare compreso fra 10.000 e 18.000 Dalton e rapporto solfato/carbossili compreso fra 0,90 e 0,95 e inoltre:
- contenuto di zolfo compreso fra 5,5 e 6,5%
- contenuto di disaccaride 6-solfato del 55%
- contenuto di disaccaride 4-solfato del 35%
- contenuto di disaccaride disolfato compreso fra 0 e 2%;
- contenuto di disaccaride non-solfato compreso fra 8 e 10%, - contenuto totale di acidi uronici compreso fra il 33-35%;
- contenuto totale di esosammine compreso fra il 33 e 35%
- [a]D25= compreso fra -14 e -20 (H20, c=5);
Per la nomenclatura dei disaccaridi si rimanda alle definizioni relative alla struttura del condroitin solfato sopra riportate. Qualora non diversamente specificato, per disaccaride disolfato si intende uno qualunque o una qualunque miscela di disaccaridi aventi 2 gruppi solfato (disaccaridi 2,6 , 2,4 e 4,6 disolfato). Il presente procedimento è particolarmente innovativo, in quanto la tecnica nota relativa alle depolimerizzazioni di condroitin solfato non da alcuna indicazione su come ottenere depolimerizzazione e contemporaneamente desolfatazione, e tantomeno su come controllare le condizioni di reazione in modo da ottenere la riduzione di peso molecolare e di rapporto solfati/carbossili desiderata.
E’ inoltre sorprendente il fatto che il presente procedimento comporti le modifiche di composizione percentuale di disaccaridi riscontrate nel prodotto finale, quali la drastica riduzione dei disaccaridi disolfato, e l'aumento, praticamente un raddoppio, della quantità di disaccaride 4-solfato.
La formazione del disaccaride 4-solfato è principalmente attribuita alla desolfatazione selettiva del gruppo solfato in posizione 6 del disaccaride 4,6-disolfato, che si trova in quantità abbondante nel condroitin solfato estratto da cartilagine di pesce sopra menzionato, dove rappresenta circa il 25-28% dei disaccaridi disolfato, conme pure alla desolfatazione selettiva del gruppo solfato in posizione 2 del disaccaride 2,6-disolfato.
Il trattamento descritto per passaggio a) comporta riduzione di peso molecolare e concomitante desolfatazione.
Tipicamente, la soluzione acquosa del passaggio a) contiene da 5 a 10 g/litro di condroitin solfato di origine ittica e le resine cationiche sono utilizzate in quantità compresa fra 100 e 200 g/litro rispetto alla soluzione acquosa.
Le condizioni di pH desiderate sono ottenute per aggiunta di un acido forte, preferibilmente di un acido minerale forte, ad esempio acido cloridrico o acido solforico.
Le resine cationiche preferibilmente utilizzate nel passaggio a) sono resine scarabiatrici di cationi in forma H* contenenti come gruppi attivi residui di acido solfonico legati ad una matrice costituita da co-polimeri stirene-divinilbenzene. ;Queste resine possono avere diverso grado di reticolazione e di mesh. Ad esempio, si possono utilizzare la resina Dowex 50W.X2 {cross-linkage 2% ; mesh 100-200), la resina Dowex 50W.X4 (crosslinkage 4X; mesh 100-200), la resina Dowex 50W.X8 (cross-linkage 8%,· mesh 50-100). tutte commercializzate dalla BioRad. ;Prima di essere aggiunte alla miscela di reazione, le resine vengono lavate ripetutamente con acqua distillata fino a che le acque di lavaggio hanno pH compreso fra 6,0 e 8,0. ;Dopo l'aggiunta della resina al filtrato, nelle quantità sopra specificate, si acidifica l'ambiente di reazione, preferibilmente con acido cloridrico in forma di soluzione acquosa al 37%-In condizioni ulteriormente preferite si opera a pH 2,5. ad una temperatura di 95°C, per tempi compresi fra 50 e 60 minuti. ;Per avere il grado di depolimerizzazione e di desolfstazione desiderati, temperature e tempi di reazione sono fattori critici. Mentre temperature inferiori a 90°C sono inefficaci, per temperature superiori a 100’C il procedimento è troppo veloce e difficilmente controllabile. ;Il tempo di trattamento secondo le condizioni specificate per il passaggio a) va rigorosamente controllato in modo da ottenere il peso molecolare ed il rapporto solfati/carbossili desiderato. Ad esempio, partendo da un condroitin solfato con peso molecolare 38.000 Dalton e rapporto solfati/carbossili 1,24, come quello utilizzato negli esempi riportati in seguito, i tempi devono essere tenuti rigorosamente entro limiti compresi fra 45 e 60 minuti: per tempi minori si ottiene un condroitin solfato con peso molecolare e densità di carica (rapporto solfati/carbossili) troppo elevati, mentre per tempi maggiori si ottiene un condroitin solfato con peso molecolare e rapporto solfati/carbossili troppo basso. ;L'andamento cinetico della depolimerizzazione e della desolfatazione è illustrato nelle Figure 2 e 3 . indicative di reazioni di primo ordine (tali cinetiche sono state ottenute in condizioni analoghe a quelle descritte per l'Esempio 1, a partire da 5 grammi di condroitin solfato di origine ittica e rapportando tutte le quantità a 5 grammi). ;La reazione chimica di depolimerizzazione e desolfatazione è arrestata alcalinizzando l'ambiente di reazione come descritto per il passaggio b). ;Tipicamente, si aggiunge una soluzione acquosa di una base inorganica, ad esempio un carbonato o bicarbonato alcalino, o un idrossido alcalino quale l'idrossido di sodio. ;L'aggiunta della base può essere convenientemente effettuata dopo aver raffreddato rapidamente la miscela di reazione proveniente dal passaggio a) ad una temperatura compresa fra 2°/+5°C. ;Dopo 1’alcalinizzazione la miscela di reazione è generalmente mantenuta ad una temperatura compresa fra 20°0 e 40°C, per tempi di 20/40 minuti. ;Il precipitato presente dopo alcalinizzazione è convenientemente eliminato per filtrazione, in genere su filtri a membrane, a dare un filtrato limpido, da cui il condroitin solfato è poi recuperato. ;Se necessario, il passaggio di depolimerizzazione e desolfatazione è preceduto da alcuni trattamenti preliminari allo scopo di eliminare il materiale proteico e le sostanze grasse eventualmente presenti nel materiale di origine estrattiva utilizzato come materia prima. ;In tal caso si sottopone il condroitin solfato sovrasolfatato utilizzato come materia prima ai seguenti trattamenti: ;i) eventuale trattamento del condroitin solfato sovrasolfatato di origine ittica con un enzima proteolitico, in ambiente acquoso. ad una temperatura compresa fra 40 ° e 80°C , per tempi generalmente compresi fra 16 e 24 ore, seguito da inattivazione enzimatica per riscaldamento della miscela di reazione da 80° a 100 C, per tempi generalmente compresi dai 10 ai 30 minuti; ii) eventuale filtrazione di una soluzione acquosa di condroitin solfato sovrasolfatato su terre fossili attivate, a temperatura fra i 30° e 40°C ; il filtrato limpido ottenuto viene successivamente passato alla fase di depolimerizzazione e desolfstazione. ;Il passaggio di lisi enzimatica indicato con i) ha lo scopo di degradare le proteine ancora eventualmente presenti nel materiale di partenza. ;Gli enzimi utilizzati possono essere di varia natura, ma preferibilmente vengono utilizzati enzimi di natura vegetale, in particolare papaina grezza , ad esempio Protesse Alcalase. ;In condizioni preferite l'ambiente di reazione è costituito esclusivamente da acqua distillata o comunque deionizzata, ir.cui il condroitin solfato di origine ittica è sospeso in quantità tipicamente compresa fra 5 e 10 g/litro e l'enzima utilizzato in quantità compresa fra 100 e 200 mg per grammo di condroitin solfato. ;Alle temperature impiegate, la lisi proteica richiede in genere tempi compresi fra 16 e ore. Si opera preferibilmente a 60 C. L'inattivazione enzimatica è condotta in condizioni controllate, e ha lo scopo di evitare reazioni secondarie dovute all'eccessivo protrarsi del trattamento enzimatico. Si opera preferibilmente a 100°C, per 20 minuti. ;11 passaggio ii) ha lo scopo di eliminare le sostanze grasse eventualmente presenti nel condroitin solfato estratto da pesce e viene preferibilmente effettuato aggiungendo alla miscela di reazione, dopo raffreddamento a 30°C/+40°C, una terra fossile attivata, ad esempio Dicalite in quantità di 8-15 g di terra fossile per litro di acqua, e filtrando la sospensione ottenuta, generalmente su filtro a pressa. ;E' particolarmente conveniente effettuare i passaggi i) e ii) in sequenza e sottoporre il filtrato limpido risultante direttamente al trattamento di depolimerizzazione e desolfatazione secondo il passaggio a) prima descritto. ;Il recupero e la purificazione del prodotto ottenuto dallo stadio b) è preferibilmente effettuato mediante uno o più dei seguenti passaggi, effettuati da soli o in combinazione fra loro: ;d) precipitazione selettiva, per aggiunta di un solvente scelto fra metanolo, etanolo, acetone e loro miscele, ad una soluzione acquosa di condroitin solfato precedentemente salata con un sale sodico, seguita da recupero del precipitato cosi ottenuto; ;e) passaggio su resine a scambio ionico, sia di tipo anionico che di tipo cationico, di soluzioni acquose del condrcitin solfato depolimerizzato, usando come eluentl acqua deionizzuta e soluzioni acquose saline contenenti un sale sodico; ;f) eliminazione dei solventi residui mediante dissoluzione in acqua seguita da evaporazione sotto vuoto o a pressione ambiente e da recupero del condroitin solfato ad elevato grado di purezza. Se necessario, le soluzioni acquose di condroitin solfato utilizzate nei vari passaggi possono essere sottoposte a filtrazioni su filtri a membrana, ad esempio Millipore® in modo da ottenere soluzioni limpide. ;La precipitazione secondo il passaggio d) può essere effettuata direttamente sulla soluzione proveniente dal passaggio b) prima descritto. ;La precipitazione è generalmente effettuata aggiungendo da 1,0 a 1,5 volumi di solvente a soluzioni acquose contenenti da 5 a 10 g/litro di condroitin solfato, precedentemente salate con un sale sodico, preferibilmente cloruro di sodio, in quantità compresa fra 1'1-3% peso/volume rispetto alla suddetta soluzione acquosa. Possono essere utilizzati altri sali sodici, in quantità tale da fornire concentrazioni di ioni sodio analoghe a quelle sopra specificate. ;Il solvente preferibilmente usato per i passaggi di precipitazione è l'acetone. ;La precipitazione così effettuata è selettiva in quanto separa il condroitin solfato da residui aminoacidici, peptidici e di acidi nucleici ancora eventualmente presenti. ;Il condroitin solfato ottenuto mediante precipitazione è convenientemente recuperato per decantazione, seguita da lavaggi ripetuti con etanolo o metanolo e da essicamento in stufa sotto vuoto (ad esempio il normale vuoto di una pompa ad acqua) a 60-70°C. ;Il passaggio e) ha lo scopo di eliminare gli ioni inorganici presenti nel prodotto ed inoltre di convertire il condroitin solfato in sale sodico. ;In condizioni preferite si percola una soluzione acquosa di condroitin solfato depolimerizzato, avente ad esempio concentrazione compresa fra 50 e 200 g/litro, attraverso una resina anionica in forma OH-, ad esempio una resina polistirenica Amberlite IRA 400 (Supelco) e quindi attraverso una resina cationica in forma H+, quale la resina polistirenica Amberlite IR-120 (Supelco). ;L'eluizione è effettuata utilizzando come fase mobile l'acqua distillata e successivamente una soluzione salina contenente dal 10 al 15% di cloruro di sodio. ;il condroitin solfato è convenientemente purificato dai solventi residui secondo quanto descritto per il passaggio f), per trattamento sotto vuoto (ad esempio il normale vuoto di una pompa ad acqua), a temperatura ambiente (in genere da 15° a 30°C circa), quindi recuperato dalle sue soluzioni acquose per evaporazione fino a secchezza. I solventi residui possono «inche essere eliminati per riscaldamento a 50°/70°C a pressione In condizioni ulteriormente preferite, il condroitin solfato sovrasolfatato di origine ittica è sottoposto in successione ai trattamenti dei passaggi i), ii), quindi a) e b); la soluzione acquosa di condroitin solfato proveniente dal passaggio b) è sottoposta ad un passaggio di precipitazione selettiva come descritto in d), il condroitin solfato così ottenuto è trattato come descritto in e); il sale sodico del condroitin solfato cosi ottenuto è sottoposto nuovamente allo stadio di precipitazione selettiva d) ed infine trattato come descritto in f). ;Il condroitin solfato sale sodico ottenuto ha elevata solubilità in acqua e in soluzioni acquose in genere. Esso mostra un comportamento elettroforetico uguale al condroitin solfato di origine bovina, anche in diverse tecniche elettroforetiche, quali quelle in agarosio e in acetato di cellulosa. ;Inoltre è privo di glicosaminoglicani inquinanti, come dermatan solfato, eparina ed eparan solfato, e non è neppure inquinato da proteine ed acidi nucleici. ;Il presente procedimento consente di ottenere un condroitin solfato ad elevato grado di purezza, che non comporta rischio di contaminazione virale nè effetti di trombocitopenia, utilizzabile per tutti gli usi terapeutici per i quali è normalmente impiegato condroitin solfato purificato da trachea bovina, in forma di composizioni farmaceutiche del tutto analoghe a quelle contenenti condroitin solfato di origine bovina già in commercio. ;Quantità terapeuticamente efficaci di condroitin solfato di origine ittica parzialmente depolimerizzato e desolf a :ato possono variare da 6 a 20 mg/Kg/die quando somministrate per via orale e da 0 , 8 a 5 mg/Kg/die quando somministrate per via parenterale . ;Una dose unitaria tipica da somministrare per via orale può contenere da 400 a 1200 mg di principio attivo, e da 50 a 300 mg per la somministrazione parenterale. ;METODI ANALITICI ;Determinazione del peso molecolare: è effettuata mediante cromatografia liquida ad alta pressione ad esclusione molecolare, come riportato da Volpi N. e Bolognani L., J. of Chrom., 630, 390, 1993-Determinazione della densità di carica: il rapporto solfati/carbossili è analizzato mediante degradazione enzimatica specifica e per determinazione potenziometrica. Si determina il condroitin solfato in forma acida in ambiente misto acqua/dimetilformammide (60:40#). Il condroitin solfato sale sodico viene passato su resina scambiatrice di cationi (Amber.Lite IRA-120 in forma H+) per rimuovere gli ioni sodio e formare l'acido condroitinico, che successivamente è titolato in ambiente misto acqua/dimetilformammide (60:40%) con NaOH 0,1 N. I due punti di viraggio costituiscono la titolazione dei gruppi carbossilici e dei gruppi solfato. Dai valori dei milliitri di NaOH 0,1 N usati per titolare i due gruppi si risale alla quantità dei gruppi carbossilici e solfati , di cui si determina il rapporto (Volpi N., Proteoglycans and other anionic (or sulphated) polysaccharides, in press). ;I valori ottenuti con i due metodi risultano essere in ottimo accordo. ;Determinazione del contenuto totale di zolfo: è effettuata mediante analisi quantitativa elementare delle ceneri. ;Assenza di glicosaminoglicani inquinanti: determinata mediante elettroforesi in acetato di cellulosa (Cappelletti R., Del Rosso M., Chiarugi V. P., Anal. Biochem. 99. 311. 1979) ed elettroforesi in agarosio (Cassero C.M.F., Dietrich C.P., i. of Biol. Chem., 252, 2254, 1977; Volpi N., Carb. Res., 247, 263, 1993) ;Determinazione della struttura primaria: le percentuali dei vari disaccaridi sono state determinate mediante degradazione enzimatica specifica con condroitinasi ABC (E.C. 4.2.2.7) (Sigma, Cod. C-2905). come descritto da Yamagata T., Saito H., habuchi 0., Suzuki S.. J. Biol. Chem., 243. 1523. 1968, seguita da separazione dei disaccaridi mediante cromatografia liquida ad alta pressione su colonna a scambio anionico forte, come riportato da Volpi N., Carb. Res., 247, 263, 1993-Comportamento elettroforetico: valutato mediante tecniche in agarosio (Nader H.B. Takahashi H.K., Guimares J.A. et al., Int. J. Biol. Macromol., 3. 144, 1981) e in acetato di cellulosa (Cappelletti R., Del Rosso M. e Chiarugi V.P:, Anal. Biochem., 99, 311. 1979). ;Assenza di materiale proteico e di acidi nucleici: determinato mediante spettrofotometria nell'ultravioletto, a 280 nm pe:r le proteine e a 260 nm per gli acidi nucleici. ;Contenuto di acidi uronici: valutato con il metodo di Bitter T. E., Muir H.M., Anal. Biochem., 4, 330, 1962). ;Contenuto di esosammine: valutato con il metodo di Smith L. R., Gilkerson E., Anal. Biochem., 98. 478, 1979· ;Caratteristiche strutturali: determinate mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare al carbonio, valutando il contenuto percentuale relativo di gruppi 0-solfato.. In particolare, il contenuto di gruppi 0-solfato in posizione 6 al residuo galattosamminico si determina dal rapporto fra l'integrale del picco a 69 ppm, corrispondente al carbonio in posizione 6 sostituito con il gruppo solfato, e la somma degli integrali dei picchi a 62 e 69 ppm, corrispondenti rispettivamente al carbonio in posizione 6 non solfatéito e solfatato. ;Il contenuto di gruppi 0-solfato in posizione 4 al residuo galattosamminico si determina dal rapporto fra l'integrale del picco a 80 ppm, corrispondente al carbonio in posizione 4 sostituito con il gruppo solfato, e la somma degli integrali dei picchi a 77 e 80 ppm , corrispondenti rispettivamente al carbonio in posizione 4 non solfatato e solfatato. ;Il contenuto di gruppi 0-solfato in posizione 2 al residuo dell'acido uronico si determina dal rapporto fra l'integrale del picco a 102 ppm, corrispondente al carbonio anomerico del residuo contenente il gruppo solfato in posizione 2, e la somma degli integrali dei picchi corrispondenti ai carboni anomerici dei vari residui uronici presenti. ;Vengono di seguito riportati alcuni esempi allo scopo di illustrare senza peraltro limitare la presente invenzione. ;Il condroitin solfato di pesce utilizzato negli Esempi 1 e 2 ha un peso molecolare di 38-000 Dalton, rapporto solfati/carbossili di 1,24; un contenuto di zolfo del 7.4&; un contenuto di disaccaride 6-solfato del 55% un contenuto di disaccaride 4-solfato del 16%; un contenuto di disaccaridi disolfato del 26%; un contenuto di disaccaride non-solfato del 2#. ;ESEMPIO 1 ;A 100 g di condroitin solfato da cartilagine di pesce vengono aggiunti 10 litri di acqua deionizzata. La massa viene scaldata a 60 C, addizionata di 10 g di enzima papainico ProteaseR 356 e mantenuta in agitazione per 20 ore a 60°C. Dopo l'idrolisi enzimatica, la massa viene scaldata a 100*0 per 20 minuti, addizionata di 120 g di terre fossili attivate (dicaliteR 478) e filtrate su filtropressa. Agli 8,4 litri di filtrato limpido così ottenuto vengono aggiunti 70 mi di una soluzione acquosa al 37# di acido cloridrico per portare la soluzione a pH 2 , 5 · Si aggiungono 2 kg di resina cationica Dowex 50WX2, in forma H+ e la miscela viene quindi mantenuta a 95°0 per 50 minuti, e successivamente portata a pH 8 con 100 mi di una soluzione acquosa 5 molare di idrossido di sodio. Si mantiene la miscela di reazione ad una temperatura compresa tra 15 C e 35 C per un periodo di tempo di 20 minuti ottenendo un precipitato che viene eliminato per filtrazione. Alla soluzione contenente i condroitin solfato parzialmente depolimerizzato e desolfatato si aggiungono 20g/litro di sodio cloruro e un ugual volume di acetone. Il precipitato viene recuperato per decantazione dopo 24 ore, quindi trattato con ulteriori 2 lavaggi di acetone ed infine essiccato sotto vuoto a 6o"C.
Il prodotto secco (76 g) viene ridisciolto in 500 mi di acqua deionizzata filtrata su membrane Millipore da 0,45 pm e fatto percolare attraverso una resina anionica Amberlite IRA 4C0 in forma OH , della Supelco, e quindi attraverso una resina cationica tipo Amberlite IR-120, in forma H<+ >, della Supelco. Successivamente si eluiscono le resine prima con acqua deionizzata filtrata su filtri da 0,45 pm e poi con soluzione acquosa di sodio cloruro al 12% filtrata su filtri da 0,45pm- La soluzione eluita viene precipitata con un egual volume di acetone.
Il precipitato ottenuto viene recuperato per decantazione, lavato con due porzioni di 20 mi di alcol etilico ed essiccato in stufa sotto vuoto a 60°C per 24 ore. Il prodotto secco viene solubilizzato in acqua deionizzata filtrata su filtri da 0,45 pm ed evaporato sotto vuoto in distillatore per eliminare i solventi residui. La soluzione viene infine essicata ottenendo 60 g di condroitin solfato sale sodico in polvere.
Il prodotto ottenuto ha un profilo elettroforetico in elettroforesi in agarosio conforme. In particolare presenta una banda unica. L'elettroforesi in acetato di cellulosa (Titan III) mostra un profilo anch'esso conforme. Mediante titolazione in ambiente misto acqua/dimetilformammide, è risultato un rapporto solfati/carbossili 0,95 e una percentuale di acidi uronici, valutati mediante determinazione colorimetrica al carbazolo, del 33#· La percentuale di glucosammina, determinata mediante metodo spettrofotometrico risulta essere del 33#· Il contenuto in zolfo, valutato mediante titolazione, risulta eEisere 5.7#· La totale assenza di proteine è stata valutata mediante spettro di assorbimento a 280 no, come riportato. L'assenza totale di acidi nucleici è stata valutata mediante spettro di assorbimento a 260 nm. Il potere rotatorio specifico, determinato a 25°C (c=5% in acqua, è di -20°. Il profilo cromatografico risultante dalla cromatografia liquida ad esclusione molecolare ad alta pressione si presenta conforme e con una distribuzione gaussiana delle frazioni a diverso peso molecolare. Il peso molecolare medio risulta essere di 15860.
L'assenza di glicosaminoglicani contaminati in piccole quantità è stata valutata mediante specifica reazione con liasi batteriche secondo il metodo descritto da Volpi N. (Volpi N., Carb. Res.
247. 263, 1993)· La specifica degradazione con condroitinasi ABC e seguente separazione dei disaccaridi formati mediante cromatografia liquida ad alta pressione a scambio anionico mostra che il condroitin solfato presenta l'8# di disaccaride non solfato, il 55% di disaccaride monosolfato in posizione 6, dal 35% di disaccaride monosolfato in posizione 4 e dal 2% di disaccaride disolfato in posizione 4 e 6. Il rapporto solfati/carbossili è di 0,94 valutato mediante degradazione enzimatica specifica. La struttura primaria del prodotto è stata valutata mediante risonanza magnetica nucleare 13C-NMR): glucuronico a 105 ppm; acido glucuronico-2-0-solfato a 102 ppm: Cg galattosamina-6-0H a 62 ppm e Cg galattosamina-6-0-solfato a 69 ppm; C4 galattosamina-4-0H a 77 PP® e C4 galattosamina-4-0-solfato a 80 ppm.
ESEMPIO 2
A 50 g di condroitin solfato estratto da cartilagine di pesce vengono aggiunti 6 litri di acqua deionizzata. La massa viene scaldata a 60°C, addizionata di 5 g di enzima papainico Protease<R >356 e mantenuta in agitazione per 24 ore a 60°C. Dopo l'idrolisi enzimatica, la massa viene scaldata a 100°C per 20 minuti, addizionata di 100 g di terre fossili attivate (dicalite<R >478) e filtrata su filtropressa. Ai 5.2 litri di filtrato limpido cosi ottenuto vengono aggiunti 50 ®1 di una soluzione acquosa al 37% di acido cloridrico per portare la soluzione a pH 2,5. Si aggiungono 1 Kg di resina cationica Dowex 50W.X2, in forma H<+ >e la miscela viene quindi mantenuta a 95<°c >per 60 minuti, e successivamente portata a pH 8 con 70 mi di una soluzione acquosa 5 molare di idrossido di sodio. Si mantiene la miscela di reazione a temperatura ambiente per un periodo di tempo di 30 minuti ottenendo un precipitato che viene eliminato per filtrazione. Alla soluzione contenente il condroitin solfato parzialmente depolimerizzato e desolfatato si aggiungono 25 g/litro di sodio cloruro e 1,2 volumi di acetone.
Il precipitato viene recuperato per decantazione dopo 24 ore, quindi trattato con ulteriori 2 lavaggi di acetone ed infine essiccato sotto vuoto a 60”C.
Il prodotto secco (32 g) viene ridisciolto in 500 mi di acqua deionizzata filtrata su membrana Millipore da 0,45 ym e fatto percolare attraverso una resina anionica tipo Amberlite IRA--400, in forma OH<- >della Supelco, e quindi attraverso una resina cationica tipo Amberlite IR-120, in forma H<+ >della Supelco.
Successivamene si eluiscono le resine prima con acqua deionizzata filtrata su filtri da 0,45 ym e poi con soluzione acquosa di sodio cloruro al 12% filtrata sul filtri da 0,45 pm. La soluzione eluita viene precipitata con ugual volume di acetone.
Il precipitato ottenuto viene recuperato per decantazione, lavato con tre porzioni di 10 mi di alcool etilico ed essiccato in stufa sotto vuoto a 60°C per 24 ore. Il prodotto secco viene solubilizzato in acqua deionizzata filtrata su filtri da 0,45 um ed evaporato sotto vuoto in distillatore per eliminare i solventi residui. La soluzione viene infine essicata ottenendo 30 g di condroitin solfato sale sodico in polvere.
Il prodotto ottenuto presenta una banda unica in elettroforesi in agarosio e in elettroforesi in acetato di cellulosa (Titan III). Mediante determinazione per titolazione come riportato è risultato un rapporto solfati/carbossili di 0,91 ed una percentuale di acidi uronici, valutati mediane determinazione spettrofotometrica, del 34%. La percentuale di glucosammina, determinata anch'essa mediane metodo spettrofotometrico, risulta essere del 35%· Il contenuto in zolfo risulta essere 5.5%·
Il prodotto non presenta proteine ed acidi nucleici. Potere rotatorio specifico (c=5% in acqua) di -14°. Il profilo cromatografico risultante dalla cromatografia liquida ad esclusione molecolare ad alta pressione si presenta anch'esso conforme e con una distribuzione gaussiana delle frazioni a diverso peso molecolare. Il peso molecolare medio risulta essere di 12430. La specifica degradazione con condroitinasi ABC e seguente separazione dei disaccaridi mediante cromatografia liquida ad alta pressione a scambio anionico mostra che il condroitin solfato presenta il 10% di disaccaride monosolfato, il 55% di disaccaride monosolfato in posizione 6, il 35% di disaccaride monosolfato in posizione 4 e dall'0% di disaccaride disolfato in posizione 4 e 6. Il rapporto solfati/carbossili è di 0,90 valutato mediante degradazione enzimatica specifica. La struttura primaria del prodotto è stata valutata mediante risonanza magnetica nucleare 13C-NMR) edi segnali sono conformi a quelli riportati nell'esempio 1.
Claims (16)
1. Procedimento per la preparazione di condroitin solfato di origine ittica parzialmente depolimerizzato ad un peso molecolare 10.000-30.000 e desolfatato ad un rapporto solfati/carbossili 0,90-1,00, comprendente i seguenti passaggi:
a) depolimerizzazione e desolfatazione in condizioni controllate, per riscaldamento di una soluzione acquosa di condroitin solfato sovrasolfatato di origine ittica ad una temperatura compresa fra 90° e 100’C, a pH 1,5-3. in presenza di un acido forte e di resine a scambio ionico cationiche;
b) arresto della reazione di depolimerizzazione e desolfstazione, mediante alcalinizzazione a pH 6,0-8,0;
c) recupero e purificazione del condroitin solfato a peso molecolare 10.000-30.000 e rapporto solfati/carbossili 0,90-1,00 così ottenuto, mediante una tecnica scelta nel gruppo costituito da precipitazioni selettive da solventi, cromatografie su resine a scambio ionico, evaporazione sooto vuoto di soluzioni acquose, da sole o in combinazione fra loro.
2. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, ir.cui il condroitin solfato sovrasolfatato è un condroitin solfato estratto da tessuti di animali scelti nel gruppo costituito da pesci, balene, molluschi e notocorde.
3. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui il condroitin solfato di origine ittica sovrasolfatato è condroitin solfato avente peso molecolare variabile da 30.000 a 50.000 e rapporto solfati/carbossili compreso fra 1,00 e 1,30.
4 . Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui il condroitin solfato di origine ittica sovrasolfatato è un condroitin solfato estratto da cartilagine di pesce.
5· Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 3. in cui il condroitin solfato di origine ittica parzialmente depolimerizzato ad un peso molecolare 10.000-30.000 e desolfatato ad un rapporto solfati/carbossili 0,90-1,00 ha le seguenti caratteristiche:
- contenuto di zolfo compreso fra 5.0 e 7,0%;
- contenuto di disaccaride 6-solfato compreso fra 45# e 60% - contenuto di disaccaride 4-solfato compreso fra il 30% e il 45%.
- contenuto di disaccaridi disolfato compreso fra 0 e 3%;
- contenuto di disaccaride non-solfato compreso fra 8 e 11%;
- contenuto totale di acidi uronici compreso fra il 32 e il 37%; - contenuto totale di esosammine compreso fra il 31 e il 38%: - compreso fra -14 e -20 (H2O, c=5).
- assenza di acidi nucleici e di materiale proteico;
- attività terapeutica equivalente a quella del condroitin solfato estratto e purificato da trachea bovina.
6. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui l'acido è scelto nel gruppo costituito da acido cloridrico e acido solforico e le resine cationiche sono resine scambiatrici di cationi in forma H+ contenenti come gruppi attivi residui di acido solfonico legati ad una matrice costituita da co-polimeri
7. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui la soluzione acquosa del passaggio a) contiene da 5 a 10 g/litro di condroitin solfato di origine ittica e le resine cationiche sono utilizzate in quantità compresa fra 100 e 200 g/litro rispetto alla soluzione acquosa.
8. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui nel passaggio a) il pH è 2,5 e la temperatura è di 95°C.
9. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui 1 'alcalinizzazione è ottenua per aggiunta di un carbonato o bicarbonato alcalino o di un idrossido alcalino e dopo 1'alcalinizzazione la miscela di reazione è mantenuta ad una temperatura compresa fra 20°C e 40°C, per tempi di 20/40 minuti.
10. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui il condroitin solfato sovrasolfatato di origine ittica, prima di essere sottoposto al passaggio di depolimerizzazione e desolfatazione, è sottoposto ai seguenti trattamenti:
i) eventuale trattamento con un enzima proteolitico, in ambiente acquoso, ad una temperatura compresa fra 40° e 80°C, seguito da inattivazione enzimatica per riscaldamento della miscela di reazione da 80° a 100°C;
ii) eventuale filtrazione di una soluzione acquosa di condroitin solfato sovrasolfatato su terre fossili attivate, dopo raffreddamento a temperatura fra i 30<° >e 40°C, con ottenimento di un filtrato limpido.
11. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 10, in cui l’enzima proteolitico è la papaina.
12. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 10, in cui
nel passaggio i) l'ambiente acquoso è costituito da acqua distillata o deionizzata, in cui il condroitin solfato di origine ittica è sospeso in quantità compresa fra 5 e 10 g/litro, la temperatura è di 60°C, l'enzima è in quantità compresa fra 100 e 200 mg per grammo di condroitin solfato, l'inattivazione enzimatica è condotta a 100°C.
13. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 1, in cui il recupero e la purificazione del condroitin solfato ottenuto dallo stadio b) è effettuato mediante uno a più dei seguenti passaggi, effettuati da soli o in combinazione fra loro:
d) precipitazione selettiva, per aggiunta di un solvente scelto fra metanolo, etanolo, acetone e loro miscele, ad una soluzione acquosa di condroitin solfato precedentemente salata con un sale sodico, seguita da recupero del precipitato così ottenuto;
e) passaggio su resine a scambio ionico, sia di tipo anionico che di tipo cationico, di soluzioni acquose del condroitin solfato depolimerizzato, usando come eluenti acqua deionizzata e soluzioni acquose saline contenenti un sale sodico;
f) eliminazione dei solventi residui mediante dissoluzione in acqua seguita da evaporazione sotto vuoto o a pressione ambiente della soluizone cosi ottenuta e da recupero del condroitin solfato ad elevato grado di purezza.
14. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 13, in cui la precipitazione è effettuata aggiungendo da 1,0 a 1,5 volumi di solvente a soluzioni acquose contenenti da 5 a 10 g/litro di condroitin solfato; il sale sodico è cloruro di sodio, in quantità compresa fra 11-3% peso/volume rispetto alla suddetta soluzione acquosa;
il passaggio e) è effettuato percolando una soluzione acquosa di condroitin solfato depolimerizzato, avente ad esempio concentrazione compresa fra 50 e 200 g/litro, attraverso una resina anionica in forma OH<- >e quindi attraverso una resina cationica in forma H<+>, l'eluizione è effettuata utilizzando come fase mobile l’acqua distillata e successivamente una soluzione salina contenente dal 10 al 15% di cloruro di sodio;
il passaggio f) è effettuato a temperatura ambiente quando si opera sotto vuoto, oppure a 50<°>/70<°>C quando l'evaporazione è condotta a pressione ambiente.
15· Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 14, in cui il solvente usato per la precipitazione è l'acetone.
16. Procedimento come rivendicato nella rivendicazione 13, prima di essere sottoposto ai passaggi a) e b), il condroitin solfato di origine ittica è sottoposto in successione ai trattamenti dei passaggi i), ii); la soluzione acquosa di condroitin solfato proveniente dal passaggio b) è sottoposta ad un passaggio di precipitazione selettiva come descritto in d), il condroitin solfato così ottenuto è trattato come descritto in e); il sale sodico del condroitin solfato cosi ottenuto è sottoposto nuovamente allo stadio di precipitazione selettiva d) ed infine trattato come descritto in f).
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