ITMI20112432A1 - Kit per il trattamento e la prevenzione dell'alopecia - Google Patents

Description

Descrizione

“KIT PER IL TRATTAMENTO E LA PREVENZIONE DELL’ALOPECIAâ€

La presente invenzione riguarda un kit costituito da due formulazioni da applicarsi in sequenza contenenti ingredienti attivi utili per la prevenzione e il trattamento di alopecia di varia origine.

Stato dell’arte

La calvizie à ̈ una condizione di mancanza, totale o parziale dei capelli. Esistono diverse scale per misurare l’estensione della calvizie; tra queste, le più comuni sono la scala Hamilton e la scala Norwood.

I soggetti appartenenti al livello I della scala Hamilton non soffrono di calvizie. L’alopecia androgenetica o calvizie comune à ̈ un diradamento della parte fronto-occipitale dei capelli, dovuto alla miniaturizzazione del fusto e rappresenta il tipo di alopecia più frequente: colpisce uomini e donne di razza caucasica, con gravità diversa. Il processo patologico fondamentale consiste nell’accelerazione, sotto stimolo androgenico, della fase mitotica del ciclo pilare (anagen I-IV) e nella conseguente riduzione della fase differenziativa, che à ̈ normalmente lunghissima. Essendo quest’ultima necessariamente incompleta, il fusto che ne deriverà sarà più sottile e corto (vellus). In età più avanzata si sovrappongono anche fenomeni atrofici del cuoio capelluto, che diventa sottile e lucido. In questa fase i vellus scompaiono. Un secondo processo patologico consiste nella perdita dell’individualità dei cicli papillari (caratteristica del cuoio capelluto adulto normale) e quindi della loro sincronizzazione. Questo fenomeno à ̈ dovuto alla riduzione della durata della fase di differenziamento. Un terzo fenomeno à ̈ l’aumento della fase di kenogen: quando il fusto del pelo si stacca alla fine del telogen, il follicolo à ̈ già occupato da un altro in anagen avanzato. Può comparire un intervallo tra la caduta del pelo in telogen e il suo rimpiazzo con il nuovo in anagen: durante tale intervallo fisiologico (Kenogen), il follicolo rimane vuoto. La calvizie femminile può costituire, ancora di più che nell’uomo, un grave problema psicologico. La calvizie femminile à ̈ sempre associata ad una malattia. In circa il 40% dei casi, la perdita di capelli di tipo androgenico nelle donne à ̈ causato da un aumento della produzione di ormoni androgeni. In altri casi il problema à ̈ una maggiore sensibilità dei follicoli agli androgeni che comporta capelli più fini e crescita meno abbondante; contemporaneamente, il cuoio capelluto produce più sostanze grasse. E’ molto probabile che si noti per la prima volta tra i trenta e i quarant’anni, rispetto ai venti-trenta anni negli uomini e può proseguire fino in età avanzata. In generale, non si tratta di una vera e propria calvizie, ma di un forte diradamento. È probabile che inizi in coincidenza di un cambiamento ormonale, ad esempio l’inizio o l’arresto nell’assunzione di pillole contraccettive, il periodo post-parto, il periodo post-puberale, i periodi perimenopausali e postmenopausali. Si distinguono diversi tipi di calvizie:

Alopecia cicatriziale

È irreversibile, in quanto comporta la distruzione del follicolo pilosebaceo. Si tratta di un’alopecia causata da cicatrici, causate ad esempio da incidenti o da altre malattie del cuoio capelluto.

Alopecia da farmaci o iatrogena

È dovuta a farmaci ad azione alopecizzante e si risolve spontaneamente alla sospensione del farmaco.

Alopecia da trazione o traumatica

È la conseguenza di trazioni ripetute sui capelli dovute a trattamenti estetici di condizionamento della capigliatura che a lungo termine possono determinare danni irreversibili.

Alopecia da radiazioni

A seguito di trattamenti radianti per la cura di tumori o altre malattie, si può instaurare un’alopecia transitoria immediatamente dopo oppure anche dopo molti anni dall’esposizione alle radiazioni.

Alopecia fronto-parietale maschile

È la tipica stempiatura a forma di M. Corrisponde allo stato uno della scala di Hamilton. Non necessariamente à ̈ il preludio ad una calvizie di tipo androgenetico.

Alopecia post-parto e post infettiva

Si manifesta con la caduta dei capelli in fase telogen maturi, circa 3 mesi dopo il parto. È dovuta alla brusca interruzione degli estrogeni e alla prolattina. Tende a risolversi spontaneamente. L’alopecia post infettiva si manifesta durante o dopo stati morbosi, tipo l’alopecia tifica, sifilide secondaria, epatite virale.

Effluvio in telogen

È una caduta diffusa dei capelli che consegue al passaggio simultaneo di un elevato numero di follicoli dalla fase di crescita (anagen) alla fase di riposo (telogen) ed à ̈ caratterizzata dalla caduta di notevoli quantità di capelli al giorno. È un fenomeno molto comune generalmente benigno e reversibile, assimilabile ad un processo di muta, ben diverso dal più pericoloso defluvio in telogen (in pratica la calvizie androgenetica). Provoca un diradamento diffuso dei capelli. A volte il diradamento à ̈ più marcato nelle regioni frontotemporale e del vertice. Talvolta à ̈ cronico e causato da malattie infettive croniche, disturbi endocrini, abuso cronico di farmaci, malattie psichiche gravi. Possibili cause comuni comprendono: anemia, anestesia generale, brucellosi, colite ulcerosa, convulsioni, dermatomiosite, diabete mellito, diete dimagranti, emodialisi, encefalite, farmaci, febbre, influenza, insufficienza epatica, insufficienza renale, interventi chirurgici, ipertermia, ipertiroidismo, ipoparatiroidismo, ipoprotidemia, ipotiroidismo, lupus eritematoso, malaria, malnutrizione, meningite, nutrizione parenterale, pancreatite, polmonite, post partum, radiazioni UV, sideropenia, sifilide secondaria, stress, tifo, traumi psicofisici, tubercolosi, tumori. Può iniziare dopo 12-15 settimane dall’evento scatenante e durare per 3 mesi, successivamente la caduta termina e i capelli ricrescono, si à ̈ avuta cioà ̈, un’onda di muta. La vera cura efficace à ̈ l’allontanamento della causa scatenante.

Follicolite decalvante

Infiammazione follicolare con pustole piene di pus con conseguente distruzione del follicolo, caduta dei capelli e calvizie cicatriziale, probabilmente dovuta a scompensi immunitari. La terapia immunostimolante e antibiotica non à ̈ risolutiva.

Lichen planus

Il lichen planus à ̈ una malattia infiammatoria con probabile origine autoimmune che può interessare cute, mucose e annessi, caratterizzata da papule e che si evolve in alopecia cicatriziale, con distruzione irreversibile dei follicoli. È tra le cause più frequenti di alopecia cicatriziale dell’adulto. La terapia à ̈ solitamente a base di corticosteroidi anche per via generale.

Lupus eritematoso

Esistono due forme: LES e LED. Nella LES l’alopecia à ̈ solitamente reversibile. La LED, caratterizzata da chiazze arrossate prive di capelli, fittoni di materiale corneo ai follicoli piliferi, atrofia con riduzione dello spessore della cute, desquamazione, dilatazione permanente dei piccoli vasi superficiali cutanei, evolve in alopecia cicatriziale. Viene trattata con corticosteroidi, data l’origine autoimmune.

Mucinosi follicolare

Ha tre forme: la prima, detta mucinosi acuta, Ã ̈ caratterizzata da chiazze eritematose e da papule dello stesso colore della pelle, sul viso, spalle e cuoio capelluto, ove i capelli cadono; si risolve spontaneamente.

La seconda forma o mucinosi cronica à ̈ caratterizzata da lesioni più numerose. Nonostante abbia lungo corso à ̈ benigna ma da esiti di alopecia cicatriziale.

La terza forma detta mucinosi paraneoplastica, Ã ̈ sempre associata ad un linfoma e si presenta con placche multiple generalizzate. Evolve in alopecia cicatriziale.

Pseudoarea di Brocq

È una alopecia cicatriziale che si forma in numerose aree sul vertice, a lenta evoluzione, senza particolari fenomeni infiammatori. Colpisce soprattutto le donne. Si crede sia una particolare espressione di altre malattie (come il LED, follicolite decalvante, lichen planus, etc.).

Sclerodermia

È una dermatosi (malattia della pelle) cronica. La causa à ̈ autoimmune. La cute assume un aspetto cicatriziale, ispessito e di colore simile all’alabastro. Può iniziare alle mani, al torace, al volto per poi interessare anche organi interni. La terapia, basata sui corticosteroidi à ̈ spesso inefficace.

Tigna

È l’attacco dei capelli o dei peli da parte di un micete (Tigna capitis) del cuoio capelluto. È caratterizzata da chiazze eritematose e desquamanti, da capelli spezzati e dall’aspetto polveroso. È contagiosa per trasmissione da animali o uomini e, se opportunamente trattata, si risolve guarisce in poche settimane. Diversamente può portare ad alopecia cicatriziale.

Tricotillomania

È un disturbo psicotico di persone che coscientemente o no, hanno l’abitudine di attorcigliare e tirare i capelli. Nei casi gravi può portare a fratture del follicolo con emorragie.

Calvizie Iatrogenica (CIA)

Diversi farmaci, soprattutto chemioterapici usati per trattamenti chemioterapici, causano la caduta dei capelli, totale o parziale: Doxorubicina, Epirubicina, Daunorubicina (Antracicline): Ciclofosfamide, Isofosfamide, Vincristina, Etoposide, Taxani, Dactinomicina, Cisplatino, Carboplatino, Bleomicina, Idrossiurea, Irinotecan, Melfalan, Methotrexate.

La CIA à ̈ comunemente reversibile, ma dal punto di vista psicologico vi à ̈ associazione tra perdita di capelli e diminuzione di bellezza e sensualità, interferenze con la propria individualità e personalità, cambiamento dell’immagine corporea e del concetto che la persona ha di sé. Queste implicazioni psicosociali possono talvolta portare al rifiuto del trattamento chemioterapico. Nonostante i recenti progressi le condizioni della CIA rimangono invariate. Indagini condotte negli anni 80-’90 hanno evidenziato che i pazienti considerano la CIA tra i più importanti effetti collaterali della chemioterapia. In una più recente indagine effettuata su 100 pazienti operate di cancro alla mammella in cura con chemioterapia presso un day hospital, la CIA à ̈ stata giudicata al secondo posto come problema dopo gli effetti sulla famiglia e sul partner. Da quanto sopra esposto, risulta evidente l’esigenza di disporre di un trattamento efficace e sicuro per il trattamento delle varie forme di alopecia.

Descrizione dell’invenzione

Secondo la corrente letteratura scientifica, l’azione terapeutica delle cellule staminali può essere riconducibile a due meccanismi: differenziazione delle cellule staminali in cellule residenti e rilascio di fattori trofici rigenerativi da parte delle cellule staminali. I rispettivi contributi di questi due meccanismi rimangono da chiarire, anche se à ̈ stato ipotizzato che non siano le cellule staminali a trasformarsi in cellule mature del tessuto leso, ma che esse trasmettano dei fattori vitali a questo tessuto, che può così tornare a proliferare e a differenziarsi, rigenerandosi (Figura, tratta da A.I. Caplan and J.E. Denni. Mesenchymal Stem Cells as Trophic Mediators. J. Cell Bioch 98:1076-1084; 2006).

La terapia con cellule staminali presenta molti problemi legati non solo ai costi e a complicazioni tecniche ed applicative, ma anche a scrupoli etici e religiosi.

La terapia con cellule staminali à ̈ attuabile solo per via iniettiva o, in alcuni casi, topica, e non per via orale. Il sovranatante delle cellule staminali in coltura contiene fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici ecc. che si ritiene siano responsabili dell’effetto benefico della terapia staminale sulla crescita e/o riparazione dei tessuti.

L’eventuale utilizzo dei fattori vitali isolabili dal sovranatante delle cellule staminali presenta, tuttavia, non solo gli stessi problemi etici dell’uso delle cellule staminali stesse ma anche costi molto elevati.

Si à ̈ sorprendentemente scoperto che nei liquidi biologici e in alcuni tessuti dei mammiferi sono presenti gli stessi fattori attivi rilasciati dalle cellule staminali e pertanto presenti nel sovranatante delle colture delle cellule staminali stesse. Le migliori sorgenti di questi fattori sono il siero, la placenta e il colostro dei mammiferi.

La Tabella riporta il confronto qualiquantitativo fra i fattori presenti nel sovranatante delle colture di cellule staminali e i fattori isolati da queste nuove sorgenti da noi denominati POOL OF MATERNAL FACTORS (P.M.F.).

Tabella

P.M.F. Mesenchymal NÀME (pg/ml) stein ceils (pg/ml) IL 1 ra IL-l receptor antagonist 29.05 0.0

IL-1b Interleuk -1b 0.09 0.0

IL-2 Interleukin-2 32.05 0.0

IL-4 Interleukin-4 0.17 21.12

IL -6 Interleukin-6 1.26 293.01 IL-8 Interleu kin - 8 0.71 359.56

IL-9 Interleuk 9 3.66 0.78

IL- 10 Interleuk - 10 2.83 0.99

IL-12 Interleuk -12 1.73 0.0

IL- 15 Interleukin -15 4.33 0.5

IL- 17 - 17 21.95 0.32 Eotaxin Eotaxin 5.01 0.0

LNF-γ Gamma -interferon 5.97 11.14 MCP-1 Monocyte factor-1 4.12 11.23

PDGF Piatelet derived growth factor 11. 3.08 TNF Tumor necrosis factor 40.00 12.30

Vascalar endothelial growth 41 .00 208.04 VEGF factor

HGF Hepatocyte growth factor 52.3 100.74 FGF Fibroblast growth factor 180.15 18.21 TGF- 64.00 51.32 beta1 transforming growth factor

IGF-1 insulin- growthi factor 1.60 0.0

GM- Gramilocyte/monocyte -colony 183.85 0.0 CSF stimulating factor

LIF leukemia inhibitory factor 15.20 27.32 SCF stem cell factor 10.55 4.54 SDF- 1 stromal derived factor- 1 41.75 28.8 NGF Nerve growth factor 8.33 0.0 BMP-2 Bone morphogenic protein 25.01 2.65

RNÀ 189 ng/ml 48 pg/ml

Presenza di fattori di crescita/citochine in P.M.F. (1 mg /ml) e nel su di Cellule Staminali Mesenchimali (1 milione di cellule).

È evidente (tabella) la maggior concentrazione di quasi tutti i fattori presenti nel P.M.F. rispetto a quella presente nel sovranatante delle cellule staminali.

È inoltre evidente la possibilità di utilizzare concentrazioni terapeutiche anche molto alte di P.M.F., ad esempio dosi da 0,5/1 g per via topica o iniettiva e dosi fino a 20/30 g per via orale, rispetto alle massime concentrazioni terapeutiche utilizzate di cellule staminali che corrispondono a 1/2 milioni/Kg e pertanto a un massimo di 140 milioni per terapia e, dunque, a valori di fattori sempre dell’ordine dei picogrammi.

L’oggetto dell’invenzione à ̈ quindi una composizione (P.M.F.) contenente in altissima concentrazione tutti i fattori attivi presenti nel sovranatante delle cellule staminali ma isolati, con semplici metodiche estrattive, da fonti naturali molto economiche, di facile reperibilità e senza problemi etici.

Inoltre P.M.F., isolato dai liquidi biologici e dai tessuti di mammiferi, contiene anche fattori antibatterici (transferrina, lisozima, lactoperossidasi, lactoferrina) e anticorpi delle classi IgG e IgA (P.M.F. Ab).

L’assenza di anticorpi e di antibatterici del sovranatante delle cellule staminali à ̈ un’ulteriore ragione per l’utilizzo di P.M.F. Ab in molti usi terapeutici, topici e per via orale.

Il siero presenta il massimo picco dei fattori negli ultimi giorni prima del parto, il colostro nelle prime ore dopo il parto e non oltre la 6° ora.

Già dopo 12 ore dal parto i fattori diminuiscono notevolmente, a 24 h molti di loro non sono più dosabili.

Questi fattori sono geneticamente molto conservati nelle varie specie e pertanto à ̈ possibile usare sull’uomo fattori isolati da altre specie di mammiferi come i bovini, gli equini, i cammelli, i mammiferi marini ecc. I fattori sono controllati con metodiche ELISA specifiche per la specie, anche se la cross reazione interspecie à ̈ altissima in quanto i fattori sono filogeneticamente molto conservati e, pertanto, solo qualitativamente sono misurabili anche con ELISA utilizzati per specie diverse (es: uomo-bovino e viceversa).

Una prima fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il siero che, negli ultimi giorni (5-15) prima del parto, à ̈ molto ricco dei fattori attivi oggetto dell’invenzione rispetto a mammiferi non gravidi o ai primi mesi di gravidanza. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione da siero.

Si preleva 1 litro di sangue in 4 giorni per 4 prelievi complessivi per non danneggiare l’animale, preferibilmente bovino o equino.

Il sangue viene sierato a temperatura ambiente per 24 h e quindi centrifugato per spremere il coagulo.

Si recupera il siero (circa il 30/40% del volume totale) a cui si aggiungono, come agenti antisettici, fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%.

Il siero così trattato viene quindi frazionato con i seguenti passaggi. Ultrafiltrazione 300’000 Da

Il campione di siero (congelato a -20°C) ottenuto per coagulazione e centrifugazione da sangue di mammifero viene scongelato a temperatura ambiente e diluito con 2 volumi di acqua demineralizzata. La soluzione ottenuta viene ultrafiltrata su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300’000 Da ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C.

Il retentato e una frazione corrispondente a circa 1:10 del permeato vengono trasferiti in un tubi da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1’000 Da e dializzati contro acqua demineralizzata.

Ultrafiltrazione 5’000 Da

Il restante permeato viene ultrafiltrato su membrana da 5000 Da. Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300’000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5000 ad una Pi di 0,5÷1 bar, in camera fredda a 4°C.

Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1’000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (con questa dialisi si eliminano anche i conservanti). Il composto à ̈ quindi immediatamente liofilizzato.

Una seconda fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ la placenta. Si descrive di seguito, a titolo di esempio, una metodica di estrazione.

Vengono utilizzate preferibilmente placente bovine o equine.

Omogeneizzazione

La placenta (congelata a -20°C) viene scongelata a temperatura ambiente, tagliata in piccoli pezzi, lavata con abbondante soluzione fisiologica (NaCl 0,9%) fredda (4°C) e omogeneizzata tramite cutter Siramm in un buffer di lisi così composto: Tris/HCl 50 mM, EDTA 25 mM, triton X-100 0,001% a pH 7,4. Alla sospensione ottenuta viene aggiunto NaCl fino ad una concentrazione dello 0,9%, e i conservanti (fenossietanolo al 2,5% e diazolidinil-urea all’1%). La sospensione viene posta sotto agitazione (agitatore magnetico) per 2 ore e mantenuta statica overnight in camera fredda a 4°C.

Centrifugazione

La sospensione viene centrifugata a 13’000 rpm con centrifuga Sorvall RC6 e rotore SLA 15000 per 45 minuti a 4°C. Il surnatante della centrifugazione viene recuperato, prefiltrato sotto vuoto su Dicalite e su filtri in cellulosa rigenerata da 0,45 µm e 0,22 µm.

Ultrafiltrazione 300’000 Da

Il prodotto filtrato viene ultrafiltrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 300’000 Da ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C.

Ultrafiltrazione 5’000 Da

Il permeato dell’ultrafiltrazione da 300’000 Da viene concentrato su membrana piana a flusso tangenziale Millipore Pellicon Biomax in polyethersulfone da 5’000 ad una Pi di 0,5 ÷1 bar, in camera fredda a 4°C. Il retentato viene trasferito in un tubo da dialisi Spectrum Spectrapor in cellulosa rigenerata da 1’000 Da e dializzato contro acqua demineralizzata (si eliminano pertanto anche i conservanti) e quindi immediatamente liofilizzato.

Una ulteriore fonte dei fattori dell’invenzione à ̈ il colostro. Si usa preferibilmente colostro bovino per la facilità di approvvigionamento e le quantità disponibili. È particolarmente preferito il colostro da mucche di razza Holstein (Frisona) e Guernsey. È stato provato che tali mucche producono colostro con la maggior concentrazione di fattori attivi. Le mucche sono preferibilmente al secondo o terzo parto. Il colostro à ̈ preferibilmente raccolto fra la 1° e la 6° ora dal parto in quanto, in questo periodo, si assiste alla maggior concentrazione di attivi. Nel colostro a partire dalla sesta ora dal parto i fattori attivi diminuiscono rapidamente (dopo 24 ore ne sono presenti solo il 15%).

Il colostro raccolto à ̈ sottoposto a test per tubercolosi, citotossicità su culture cellulari, controllo di micoplasmi, prioni e di virus umani e bovini.

Il colostro nella cisterna mammaria à ̈ praticamente sterile, ma una volta munto, nonostante ogni precauzione, per l’alta concentrazione di fattori di crescita, la sua carica batterica sale molto rapidamente durante la gelatura e la sgelatura, processi piuttosto lenti data l’alta densità del colostro nelle prime ore.

L’utilizzo di raggi γ permette di ottenere un colostro sterile solo se si utilizzano radiazioni superiori a 10 Kgy che tuttavia distruggono gran parte dei fattori attivi, e d’altronde questo metodo non impedisce la formazione di pirogeni il cui utilizzo à ̈ sconsigliabile per via topica e proibito per via parenterale.

È stata pertanto messa a punto una filiera di raccolta innovativa, per ottenere un composto anallergico sterile, senza conservanti e senza pirogeni.

Al colostro raccolto in taniche sterili (sterilizzate a vuoto a 25 Kgy) si aggiungono agenti antisettici in quantità tali da garantire la sterilità e l’assenza di pirogeni. Si impiegano preferibilmente fenossietanolo alla concentrazione del 2,5% e diazolidinil-urea a una concentrazione dell’1%.

Il colostro così trattato può, per brevi periodi (max 30 gg) non essere conservato congelato prima dei processi di estrazione dei fattori attivi, con evidente risparmio dei costi industriali.

I fattori possono essere estratti con i seguenti passaggi:

Centrifugazione

Il colostro bovino viene diluito 1:10 con acqua demineralizzata, si aggiunge NaCl fino ad ottenere una concentrazione dello 0,9%.

La sospensione viene centrifugata in continuo a 8’000 rpm a temperatura di 20-25°C con una centrifuga Alfa Laval scartando il pellet corrispondente alla parte lipidica.

Ultrafiltrazione ceramica da 300’000 Da

Il prodotto ottenuto dalla centrifugazione viene ultrafiltrato su membrana ceramica con cut-off 300’000 Da ad una temperatura di 20-25°C recuperando il permeato.

Ultrafiltrazione su 5000 Da

Il permeato dell’ultrafiltrazione 300’000 Da viene concentrato su membrana a spirale avvolta da 5’000 Da in polyethersulfone ad una temperatura di 20-25°C e dializzato contro acqua demineralizzata fino ad una conducibilità del retentato di circa 600 µs/cm<2>(con questa dialisi si eliminano anche i conservanti).

Liofilizzazione

Il retentato dell’ultrafiltrazione da 5’000 Da viene filtrato sotto vuoto su filtri Millipore in cellulosa rigenerata da 0,2 µm, congelato a -20°C e liofilizzato.

Purificazione di P.M.F. Ab dagli anticorpi

Una soluzione di ammonio solfato satura viene aggiunta ad una soluzione di P.M.F. Ab isolati sia da siero, placenta o colostro sotto agitazione e ad un rapporto finale 1:1 (v/v). La miscela à ̈ mantenuta per due ore a temperatura ambiente o a 4°C per 12 ore, in ambiente sterile e successivamente centrifugata a 18.000 rpm. Il surnatante à ̈ quindi sottoposto a dialisi a 4°C contro acqua, utilizzando membrane con cut-off di 100 kDA. La frazione esterna alle membrane di dialisi, priva della componente immunoglobulinica, viene quindi liofilizzata e conservata a -20°C. La deplezione della componente immunoglobulinica viene verificata mediante analisi SDS-PAGE in condizioni riducenti e non utilizzando blue coomassie come colorante.

In alternativa o di seguito al precedente, la purificazione prevede l’utilizzo di colonne di affinità funzionalizzate con proteina G. La soluzione dei fattori attivi o la frazione preventivamente precipitata con ammonio solfato viene fatta eluire mediante pompa peristaltica ad un flusso di 1 ml/min attraverso una colonna funzionalizzata con proteina G in ambiente sterile. Dopo 20 minuti di perfusione, la soluzione à ̈ dializzata per ultrafiltrazione ad alta pressione per eliminare totalmente i conservanti e quindi liofilizzata. Si ottiene una polvere sterile, priva di pirogeni, priva di immunoglobuline animali, libera da conservanti, anallergica (caseina e lattoalbumina sono i responsabili di oltre il 95% delle allergie verso queste componenti animali) di altissima solubilità e con la massima concentrazione possibile di fattori attivi.

Qualunque sia la sorgente utilizzata si riscontra la presenza degli stessi fattori attivi misurati con l’ELISA.

Si à ̈ trovato che l’alopecia di varia origine, sia maschile che femminile, può essere efficacemente prevenuta e trattata applicando in successione una prima composizione topica che agisce sul bulbo pilifero in fase catagen e una seconda composizione topica che stimola la fase anagen di ricrescita.

L’invenzione ha pertanto per oggetto un kit comprendente due formulazioni di diversa composizione, da somministrare per via topica in sequenza. Una prima formulazione topica comprende come ingredienti attivi olio resina di capsico, Vitamina PP e caffeina oltre ad eccipienti convenzionali. La seconda composizione, da applicare sul cuoio capelluto da 15 a 30 minuti dopo l’applicazione della prima composizione, comprende P.M.F. in forma libera e incapsulata in microsfere, sericina, estratto di Aloe vera, caffeina, melatonina e pantenolo.

Nella prima formulazione, l’olio resina di capsico (peperoncino rosso) à ̈ presente in concentrazioni comprese fra 0,01-0,1%, 1,0%, la Vitamina PP fra 0,1-1,0%, e la caffeina fra 0,1-0,01. La formulazione à ̈ completata da eccipienti convenzionali per formulazioni topiche preferibilmente in forma di gel, lozione o altre forme adatte alla somministrazione sul cuoio capelluto.

Il peperoncino rosso fornisce all’organismo vitamine e sostanze quali capsicina, capsaicina, capsantina, diversi sali e oligoelementi naturali, olio essenziale e lecitine. La capsaicina sviluppa la sua funzione principale influendo sulla circolazione periferica del sangue e sui recettori periferici nervosi. Stimola la circolazione sanguigna del cuoio capelluto. Inoltre sollecita la funzione vasodilatatrice, rende elastici i capillari sanguigni e favorisce l’assorbimento si sostanze funzionali (effetto carrier).

La Vitamina PP aumenta la sintesi di proteine e di cheratina, stimola la sintesi di ceramidi, accelera la differenziazione dei cheratinociti con miglioramento della funzione della barriera dermoepidermica, aumenta l’idratazione e ha effetto inibitorio sulla fotocarcinogenesi. È implicata in tutte le reazioni di ossidoriduzione dell’organismo che avvengono in tutti i tessuti e sono fondamentali nel metabolismo del capello per la riduzione del testosterone a diidrotestosterone (ad opera della 5-alfa reduttasi) e per l’ossidazione del testosterone a androstenedione.

La caffeina stimola la crescita dei capelli e aumenta la durata della vita del capello. Recenti ricerche hanno confermato che la caffeina può neutralizzare gli effetti indesiderati del testosterone, responsabili della morte dei follicoli piliferi nell’alopecia androgenetica.

Nella seconda formulazione, l’estratto di Aloe vera à ̈ presente in concentrazioni comprese fra 0,1 e 1,0%, la melatonina fra 0,01-0,10%, P.M.F. fra 2,0 e 10%, P.M.F. in forma micro incapsulata fra 1 e 5%, la sericina fra 0,5-2%, la caffeina fra 0,1-0,01%, il pantenolo fra 0,10-0,30%.

L’Aloe vera ha attività emolliente, idratante, riepitelizzante e lenitiva. La Melatonina à ̈ sintetizzata dal follicolo pilifero sulle cui cellule sono presenti recettori per la melatonina, a dimostrazione del ruolo della melatonina nella regolazione del ciclo follicolare.

La sericina, per la sua struttura di proteina bioadesiva, ha grande affinità per le proteine idrofobe e, pertanto, per la cheratina dei capelli. Svolge un ruolo protettivo verso agenti esterni e tensioattivi, ha un effetto rinforzante (contro le rotture) elasticizzante e filmogeno.

Le proprietà che fanno del Pantenolo un’importante sostanza funzionale per il trattamento dei capelli e del cuoio capelluti sono:

- Il d-Pantenolo, somministrato localmente, penetra nei capelli e viene convertito in acido pantotenico, il quale à ̈ riconosciuto essere un indispensabile fattore per la salute e la crescita dei capelli

- Penetra profondamente entro lo stele del capello

- Agisce a lungo come controllo del tasso di umidità del capello indipendentemente dalle condizioni ambientali esterne (valore di umidità relativa) - Previene la secchezza del capello e del cuoio capelluto causata da aria secca, vento

- Riduce considerevolmente, anche del 30-40%, la formazione delle doppie punte a seguito di pettinatura

- Riduce l’aggrovigliamento dei capelli in quanto rende la loro superficie (cuticola) più liscia e regolare

- Ripara i danni causati da trattamenti chimici o meccanici della chioma - Impartisce lucentezza e splendore al capello.

P.M.F. viene micro incapsulato secondo tecniche note, ad esempio in microsfere tissutrope e cheratinotrope a lento rilascio, disponibili commercialmente con la denominazione di SPHERULITE®, oppure possono essere preparate secondo WO 2010060886.

ESEMPI DI FORMULAZIONE

1 pre-trattamento tricologico

Olio resina di capsico 0,05%

Vitamina PP 0,20%

Caffeina 0,01%

Eccipienti qb

2 trattamento anticaduta

P.M.F. 10,00%

P.M.F. micro incapsulato 2,5%

Sericina 1,00%

Aloe 1,00%

Pantenolo 0,20%

Melatonina 0,005%

Caffeina 0,01%

Eccipienti qb

UTILIZZO

Dopo aver lavato i capelli con uno shampoo neutro si esegue l’applicazione del primo trattamento, frizionando ripetutamente il cuoio capelluto. Il paziente avverte un senso di lieve bruciore o calore. Questo sintomo dura per circa 15-20 minuti. Immediatamente dopo si applica il secondo trattamento con frizioni prolungate. Si eseguono una o due applicazioni giornaliere a seconda della gravità e dell’eventuale concomitanza con l’assunzione di farmaci, specie chemioterapici.

RISULTATI CLINICI GENERICI

In 30 casi di perdita di capelli ricorrente (telogen), soprattutto in primavera e autunno, si à ̈ ottenuto il blocco della caduta nell’88% dei maschi e del 75% delle femmine.

In 20 pazienti in chemioterapia (donne con carcinoma mammario) solo il 12% delle pazienti ha perso i capelli, nel 20% i capelli si sono assottigliati, ma non sono caduti, in tutti i casi non si sono registrati effetti avversi.

TRIAL CLINICO (72 PAZIENTI)

CONTROLLI:

• Tricogramma nelle patologie del capillizio

• Biopsia cutanea in alcune forme patologiche del capillizio

PATOLOGIE

• n° 10 pazienti affetti da defluvio acuto capillizio

• n° 10 pazienti affetti da defluvio cronico capillizio

• n° 05 pazienti affetti da alopecia areata

• n° 40 pazienti affetti da alopecia androgenetica

• n° 07 pazienti affetti da alopecia cicatriziale

RISULTATI

Nel defluvio acuto del capillizio la risposta alla terapia dei pazienti trattati, 8 donne e 2 uomini, Ã ̈ stata variabile.

Dopo due mesi di applicazione del prodotto, una volta al giorno, si à ̈ potuta riscontrare una netta diminuzione della caduta in 8 casi (7 donne – 1 uomo) con una modesta ripresa solo in un caso (maschile) nel terzo mese di terapia, nei rimanenti due casi (rispettivamente un uomo e una donna) il quadro à ̈ rimasto invariato.

Nell’80% dei pazienti che hanno avuto una risposta positiva l’arresto della caduta dei capelli si à ̈ verificato già nell’arco della prima settimana di trattamento.

Nel defluvio cronico i risultati sono stati variabili.

Dei 10 casi trattati (9 donne e 1 uomo) 8 pazienti hanno avuto una diminuzione della caduta dopo due mesi di terapia. Due pazienti non hanno risposto alla terapia.

Nell’alopecia areata tutti i soggetti trattati (5 pazienti, 3 donne e 2 uomini) hanno avuto una scarsa o nulla risposta dopo due mesi di terapia.

Nell’alopecia androgenetica sono stati trattati 40 soggetti (30 uomini e 10 donne). In questo gruppo si à ̈ notata, dopo due mesi di terapia, una diminuzione della caduta e un miglioramento dell’aspetto estetico dei capelli, quantificabile con un maggiore diametro del fusto, maggior volume e maggiore lucentezza della chioma in 30 dei casi trattati.

Negli altri 10 casi il quadro à ̈ rimasto invariato.

Nei 7 casi di alopecia cicatriziale (4 donne e 3 uomini), nei quali era presente anche una reazione infiammatoria della cute con forte senso di prurito, la risposta à ̈ stata sorprendente già dopo un mese di terapia.

Si à ̈ riscontrata una diminuzione e anche una scomparsa del prurito, un’attenuazione della forma irritativa cutanea e una stabilizzazione del quadro alopecico.

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un preparato per la prevenzione e il trattamento della caduta dei capelli in forma di kit comprendenti una prima formulazione topica contenente: - Olio resina di capsico; - Pantenolo; - Vitamina PP; - Retinolo; e una seconda formulazione topica contenente - Vitamina H; - estratto di Aloe vera; - Melatonina; - una composizione di fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici presenti nel surnatante di cellule staminali isolati da siero di mammiferi, placenta o colostro in forma libera; - una composizione di fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici presenti nel surnatante di cellule staminali isolati da siero di mammiferi, placenta o colostro in microsfere tissutrope e cheratinotrope a lento rilascio.
2. 2. Un preparato secondo la rivendicazione 1 in cui la prima formulazione ha la seguente composizione quantitativa: - Olio resina di capsico: 0,01-0,1%; - Pantenolo: 0,1-1,0%; - Vitamina PP: 0,1-1,0%; - Retinolo 0,001-0,10%.
3. 3. Un preparato secondo la rivendicazione 1 o 2 in cui la seconda formulazione ha la seguente composizione quantitativa: - Vitamina H: 0,05-0,20%; - estratto di Aloe vera: 0,1-1,0%; - Melatonina: 0,01-0,10%; - una composizione di fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici presenti nel surnatante di cellule staminali isolati da siero di mammiferi, placenta o colostro in forma libera: 2-10%; - una composizione di fattori di crescita, citochine, fattori chemiotattici presenti nel surnatante di cellule staminali isolati da siero di mammiferi, placenta o colostro in microsfere tissutrope e cheratinotrope a lento rilascio: 1-5%.
4. 4. Un preparato secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3 in cui le formulazioni sono in forma di gel.
5. 5. Un metodo di trattamento cosmetico per la prevenzione della caduta e per la ricrescita dei capelli che comprende la somministrazione in sequenza della prima formulazione seguita dalla somministrazione della seconda formulazione del preparato delle rivendicazioni 1-4.