ITMI20110995A1 - Metodo per la produzione di dispositivi microfluidici tridimensionali monolitici - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal tìtolo:

"METODO PER LA PRODUZIONE DI DISPOSITIVI MICROFLUIDICI TRIDIMENSIONALI MONOLITICI"

DESCRIZIONE

La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la produzione di dispositivi microfluidici tridimensionali monolitici.

I dispositivi microfluidici sono manufatti, comunemente realizzati in vetro, silìcio o materiali polimerici, contenenti canalizzazioni che si sviluppano in due dimensioni (cioè essenzialmente in un piano all’interno del dispositivo) o in tre dimensioni, al cui interno è possibile far scorrere fluidi. Questi dispositivi hanno generalmente dimensioni fino ad alcuni centimetri, mentre le canalizzazioni hanno sezioni con lati (o diametro, nel caso di canali a sezione circolare), di dimensioni generalmente da decine a centinaia di micrometri (pm); in un’accezione più ampia del termine, possono essere ricompresi tra i dispositivi microfluidici anche quei sistemi in cui le canalizzazioni hanno sezioni di dimensioni dell’ordine di pochi millimetri; nel resto del testo e nelle rivendicazioni, con la definizione "dispositivi microfluidici” si Intenderà quest’ultimo significato più ampio.

I dispositivi microfluidici hanno varie applicazioni possibili: per esempio, con opportune funzionalizzazioni delle pareti dei canali, possono agire come rivelatori della presenza di uno o più analiti in un fluido, (funzionando così da elementi attivi di analizzatori miniaturizzati, noti nel settore anche con la definizione inglese “Labon-a-chip”), in particolare in applicazioni in campo biologico e medicale, oppure come microreattori chimici. L’utilità di questi sistemi in campo biologico ha visto un incremento negli ultimi anni, specialmente per quanto riguarda applicazioni di microscopia, coltura, conteggio e manipolazione cellulare e esperimenti ad alta efficienza (high throughput). Un vantaggio di estrema importanza offerto da questi dispositivi è che il loro funzionamento richiede quantità minime di fluidi rispetto ai sistemi tradizionali e di conseguenza l'impiego di quantità minime di reagenti (spesso costosi) oltre alla riduzione dei volumi di liquidi da smaltire, per i quali di norma sono richieste procedure speciali.

In una variante particolarmente interessante questi manufatti, se realizzati con materiali biocompatibili, possono essere impiegati per la realizzazione di protesi vascolarizzate, e se detti materiali presentano anche la caratteristica di essere biodegradabili o bioriassorbibili in tempi adeguati, queste protesi possono funzionare da siti di ricrescita tissutale, che vengono poi rimpiazzati dal tessuto naturale riprodotto (cosiddetti “scaffold”).

Dati il numero e l’importanza dei possibili campi applicativi, negli ultimi anni è stata svolta nel settore una notevole mole di lavoro di ricerca e sviluppo, volta alla produzione e al perfezionamento di dispositivi microfluidici dotati di caratteristiche desiderate.

I primi dispositivi di questo tipo erano prodotti con tecniche e materiali derivate direttamente dal campo dei semiconduttori e dei microattuatori (meglio noti nel settore come “micromachines"), con sequenze di deposizioni e/o rimozioni selettive di parti di strati deposti; esempi di queste tecniche sono descritti nelle domande di brevetto EP 1614467 A2, WO 00/42233 A1 e WO 2006/113492 A2, e nel brevetto US 6.753.200 B2; il principale limite di queste tecniche è quello di poter produrre solo strutture bidimensionali, in cui le canalizzazioni si sviluppano in pratica solo in un piano all’interno del manufatto, ottenendo così dispositivi relativamente semplici, anche per l’impossibilità di sovrapporre o incrociare due o più canali. Risultati analoghi sono ottenuti con le tecniche di stampaggio descritte nelle domande di brevetto WO 2005/084191 A2 e US 2007/0110962 A1.

II brevetto US 6.321.791 e la domanda di brevetto WO 2009/121037 A2 sono relativi a dispositivi in cui le canalizzazioni sono tridimensionali, ottenute però sovrapponendo più strutture canalizzate bidimensionali che giacciono in piani tra loro paralleli, e mettendole in comunicazione tramite aperture perpendicolari a questi. In questi dispositivi, i vari livelli possono essere ottenuti per sovrapposizioni successive, oppure costruendoli separatamente ed unendoli poi meccanicamente o per adesione. Nel primo caso, il processo produttivo di una struttura a più piani risulta lungo e laborioso; nel secondo caso, i dispositivi ottenuti non sono monolitici, e si possono avere delle imperfezioni di contatto o adesione tra le superfici di due strati adiacenti che portano a problemi nell’impiego del dispositivo; per esempio, un fluido potrebbe diffondere da un canale negli interstizi tra due strati adiacenti, causando inquinamenti e/o malfunzionamenti del dispositivo.

Altri documenti propongono un approccio alternativo alla produzione di dispositivi microfluidici. Secondo questa via, vengono costruite strutture tridimensionali (indicate anche con 3D nel seguito) con un materiale sacrificale, che può essere dissolto in seguito ad opportuni trattamenti; la struttura corrisponde (in negativo) allo sviluppo delle canalizzazioni che si desidera realizzare nel dispositivo finale; questa struttura viene inserita in uno stampo, in cui si versa poi un materiale liquido che può poi solidificare (o essere fatto solidificare); alla fine del processo, la struttura 3D iniziale viene rimossa con un attacco chimico o per riscaldamento (o entrambi), lasciando al suo posto spazi e canali vuoti.

Questo metodo è seguito per esempio nella domanda di brevetto US 2003/0087198 A1. Secondo questo documento, la struttura sacrificale 3D viene realizzata in cera, “tirando” filamenti da un bagno di cera fusa tramite un “seme” solido dello stesso materiale (metodo analogo a quello Czochralski di crescita di monocristalli di silicio puro); i filamenti così ottenuti possono essere poi modellati o collegati tra loro, ad ottenere le strutture 3D desiderate. Nel testo della domanda è detto che la sezione del filo di cera ottenuto (che corrisponderà alla sezione dei canali nel dispositivo finale) può essere controllata agendo su parametri quali, tra gli altri, le temperature del fuso e dell’ambiente esterno, la viscosità della cera fusa, il diametro del “seme” freddo e la velocità di sollevamento dello stesso. Questo sistema ha il difetto di essere complesso da realizzare in pratica, così che la produzione di ogni singola struttura sacrificale richiede tempi lunghi; il metodo di questa domanda di brevetto può quindi risultare adatto a studi di fattibilità su scala di laboratorio, ma è del tutto inapplicabile in una produzione industriale su larga scala.

La domanda di brevetto US 2007/0012891 A1 descrive un sistema analogo a quello precedente, in cui però la struttura sacrificale 3D viene ottenuta per lavorazione “dal pieno”, con un’apparecchiatura del tipo impiegato nella produzione di prototipi (esemplificato lo strumento Solidscape T66) in settori come gioielleria, modellismo o della produzione di master per meccanica da fusione. Anche in questo caso, il limite del metodo è costituito dal fatto che le strutture sacrificali devono essere prodotte una per una con una macchina di precisione, portando a tempi lunghi (e conseguenti elevati costi) di produzione, incompatibili con le applicazioni industriali.

Infine, la domanda di brevetto WO 2010/009320 A1, descrive un metodo adatto in particolare per produrre strutture canalizzate da impiegare come “scaffold” per l’impiego in medicina rigenerativa. Secondo il metodo di questo documento, viene prodotta una massa filamentosa di fibre allungate di un materiale sacrificale, per estrusione o con metodi diversi ben noti nel settore della produzione di fibre da polimeri, che vanno sotto la definizione generale inglese di "spinning” (sono citati i metodi di melt-spinning, wet-spinning, dry-spinning, dry-jet wet-spinning ed electro-spinning); la massa viene poi raccolta con, o su, uno o più supporti aventi forme allungate, essenzialmente lunghi stecchi o tubicini a loro volta realizzati in materiale sacrificale, in modo del tutto analogo alla preparazione dello zucchero filato (lo zucchero è infatti il materiale sacrificale preferito indicato in questo documento); l’insieme così ottenuto viene poi impiegato come una struttura 3D sacrificale nel modo descritto con riferimento ai documenti precedenti. Questa tecnica ha il limite, anzitutto, che la struttura delle canalizzazioni corrispondenti alle fibre sono del tutto casuali, e quindi non si riesce ad avere il controllo della riproducibilità dei risultati; in secondo luogo, le fibre ottenute sono molto sottili e, in alcuni casi, possono non avere caratteristiche sufficienti di consistenza e stabilità geometrica, e possono ripiegarsi e collassare sotto il peso del materiale liquido da cui vengono sommerse nello stampo, prima che questo solidifichi.

Scopo della presente invenzione è quello di fornire un metodo semplice per la produzione di dispositivi microfluidici tridimensionali monolitici che superi i problemi della tecnica nota, così come di fornire i manufatti ottenuti tramite detto metodo.

Questi scopi sono ottenuti secondo la presente invenzione che, in un suo primo aspetto, consiste in un metodo per la produzione di un dispositivo microfluidico tridimensionale monolitico, che comprende le seguenti operazioni:

- produrre una struttura tridimensionale con un materiale sacrificale;

- posizionare detta struttura tridimensionale in un contenitore;

- depositare attorno a detta struttura tridimensionale un precursore, liquido o in soluzione, di una matrice solida, detto precursore in grado di solidificare mediante reazione chimica o trasformazione fisica formando un materiale che costituisce il corpo del dispositivo finale;

- causare la solidificazione di detto precursore;

- rimuovere selettivamente il materiale sacrificale con un trattamento termico e/o per dissoluzione con un solvente dello stesso,

detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che:

- il materiale sacrificale è un materiale termoplastico;

- detti materiali sacrificale e precursore sono scelti in modo tale che il materiale sacrificale sia insolubile nel precursore se questo è liquido o nella soluzione del precursore in un solvente se il precursore è impiegato in soluzione, oppure abbia ridotta solubilità in detti precursore o solvente, tale che detta struttura tridimensionale mantenga la continuità per il tempo necessario alla solidificazione del precursore; e tale che il materiale che costituisce il corpo del dispositivo finale, ottenuto dalla solidificazione del precursore, sia inalterabile nel trattamento termico e/o di dissoluzione chimica necessario alla rimozione della struttura sacrificale.

Nella definizione dell'invenzione sopra riportata, e nel resto del testo e nelle rivendicazioni, per brevità si fa riferimento ad un materiale sacrificale e ad un precursore, ma con queste definizioni si intendono anche miscele di materiali sacrificali e di materiali precursori, purché queste miscele, nel loro impiego, soddisfino le condizioni sopra esposte. Inoltre, nel resto del testo la struttura finale del dispositivo, ottenuta dopo la rimozione del materiale sacrificale, verrà indicata come ‘'matrice”, e il materiale ottenuto dalla solidificazione del precursore (o miscela di precursori) verrà indicato come “materiale della matrice”. Infine, la struttura sacrificale può essere prodotta in singola o in due o più parti, oppure ancora derivare dall’unione delle stesse, come descritto nel seguito.

L’invenzione viene illustrata in dettaglio nel seguito con riferimento alle figure, in cui:

- la Fig. 1 rappresenta in forma schematica la sequenza di operazioni del metodo dell’invenzione, per la produzione di un primo dispositivo microfluidico;

- la Fig. 2, analoga alla Fig. 1, rappresenta la sequenza di operazioni per la produzione di un secondo dispositivo microfluidico, con canalizzazioni e micro pozzetti per colture cellulari.

La prima operazione del metodo dell’invenzione consiste nell’ottenimento della struttura sacrificale tridimensionale realizzata con un materiale termoplastico. Questa operazione può essere realizzata con una qualunque tecnica nota per la formazione di partì tridimensionali in materiali termoplastici. Preferibilmente, la struttura tridimensionale viene prodotta con una tecnica scelta tra il “casting”, l’iniezione a caldo in uno stampo, lo stampaggio a caldo, la modellazione a caldo (thermoforming) e il taglio laser.

Il materiale sacrificale può essere un qualunque materiale termoplastico, in particolare polimetilmetacrilato (PMMA), polivinilalcool (PVA), policarbonato (PC) e polistirene (PS).

La tecnica di casting consiste nel colare un polimero, fuso o disciolto in un opportuno solvente, o un suo precursore liquido in uno stampo aperto, lasciare solidificare il polimero, ed estrarre la parte formata dallo stampo, ottenendo una struttura tridimensionale che è una replica della cavità dello stampo. Nel caso di impiego di un polimero, questo viene generalmente versato fuso nello stampo, cioè viene portato ad una temperatura superiore a quella di fusione, versato nello stampo e lasciato raffreddare ad una temperatura inferiore a quella di fusione; il polimero è preferibilmente solido a temperatura ambiente, per non dover ricorrere a sistemi raffreddanti per la sua solidificazione. Nel caso di impiego di un precursore del polimero, nello stampo si versa il precursore (per esempio, oligomeri dello stesso) e se ne causa la reticolazione con metodi noti, per esempio per riscaldamento, per irraggiamento con UV o con iniziatori di reazione radicalica. Per ottenere strutture tridimensionali di forma voluta, la superficie superiore dello stampo contenente il polimero fuso o il suo precursore può essere “rasata”, per rimuovere tutto il polimero o il relativo precursore in eccesso; alla fine del processo, eventuali bave (sottili pellicole di polimero collegate alla struttura voluta) possono essere rimosse con metodi meccanici o per attacco chimico (poiché la velocità di attacco chimico è costante su tutte le parti, quelle più sottili verranno rimosse quando ancora la struttura principale risulta essenzialmente inalterata). Nella tecnica di iniezione a caldo, il materiale termoplastico allo stato fuso viene forzato ad entrare a pressione nelle cavità di uno stampo, detto “master”, costituito da due o più parti separabili e tenute unite meccanicamente durante l’iniezione per esempio con viti, con morsetti, o simili. La posizione e le dimensioni dei canali o di altri volumi vuoti nel master replicano in modo esatto quelle del dispositivo microfluidico finale, oppure di una loro parte. Le diverse parti del master possono essere prodotte con tecniche note di microfabbricazione, che consentono di riprodurre dettagli di dimensioni dell’ordine dei 100 pm e anche inferiori. Le singole parti che costituiscono il master hanno generalmente la forma di bassi parallelepipedi, e vengono impilate mettendo a contatto le loro superfici maggiori. I canali e altri spazi vuoti del master possono essere in forma di recessi di geometria opportuna su una delle superfici maggiori di una o più parti, di modo che una seconda parte che compone il master, unita a quella che presenta i recessi, definisca un canale o uno spazio chiuso. Le parti del master possono poi presentare canali in direzione perpendicolare alla superficie maggiore della parte; in questo modo si creano passaggi di comunicazione tra livelli differenti dell’insieme di canali e spazi vuoti, o con l’esterno del master. Nel caso di master realizzati in più parti, i canali perpendicolari alle superfici maggiori possono essere ottenuti anche dividendo una o più di queste parti in due sottoparti, e affacciando queste ultime nel master assemblato lungo due facce perpendicolari alle superfici maggiori, e avendo ricavato recessi in almeno una di queste facce. Una volta assemblato il master, al suo interno viene iniettato a pressione il materiale sacrificale allo stato fuso; in queste condizioni, il polimero termoplastico fuso occupa tutti gli spazi vuoti all’interno del master. Dopo la solidificazione del fuso, è possibile smontare il master ed estrarre una struttura 3D, di geometria equivalente al reticolo di canali e spazi vuoti desiderato nel dispositivo microfluidico finale. In alternativa, come detto, la struttura ottenuta in questo modo può essere equivalente solo ad una parte di detto reticolo; in questo caso il reticolo complessivo viene ottenuto unendo due o più strutture 3D, per esempio facendole aderire per riscaldamento. Un esempio di applicazione della tecnica di iniezione a caldo alla realizzazione di due possibili strutture 3D è mostrato nelle figure 1.a, 1.b e 2.a, 2.b. La figura 1.a mostra due parti 10 e 12 a forma di parallelepipedo, destinate ad essere unite tra loro come sopra detto a formare il master; su una superficie della parte 10 è ricavata una rete di canalizzazioni e cavità collegate tra loro, indicata in figura cumulativamente come elemento 11. L’unione della parte 10 (e in particolare della superficie di questa in cui è presente la rete 11) con la parte 12 forma il master, 13, mostrato in figura 1.b; il master presenta due aperture 14 (una sola mostrata in figura) in corrispondenza delle estremità della rete di canalizzazioni 11. Analogamente, la figura 2.a mostra le parti 20 e 22 (la prima con rete di canalizzazioni e cavità 21, più complessa e articolata della rete 11) che formano il master 23 con aperture 24 della figura 2.b.

Una struttura in materiale termoplastico può anche essere ottenuta per stampaggio a caldo (tecnica meglio nota nel settore con la definizione inglese "hot embossing’’, che sarà usata nel seguito). Questa tecnica consiste nel disporre un foglio di un materiale termoplastico su una superficie di una parte di uno stampo, che può essere completamente planare o presentare un insieme di recessi corrispondenti alla struttura desiderata; portare il polimero termoplastico ad una temperatura superiore a quella di transizione vetrosa (Tg), ma inferiore a quella di fusione, dello stesso, per causarne il rammollimento; e comprimere contro il polimero rammollito l’altra parte dello stampo, che presenterà recessi di dimensioni desiderate nella superficie che viene a contatto col polimero. Nel caso in cui la prima parte presenti già recessi, la seconda, che viene compressa sul fuso, può essere liscia o presentare a sua volta recessi. Dopo lo stampaggio, si lascia raffreddare il materiale termoplastico al di sotto della sua Tg, si separano le due parti dello stampo, ed è poi possibile estrarre la struttura di materiale sacrificale dallo stampo. In questo caso le strutture che si ottengono hanno uno sviluppo principalmente in due direzioni (corrispondenti al piano delle superfici che vengono a contatto nello stampo chiuso), con la possibilità di avere parti ad andamento nella terza dimensione, perpendicolare alle prime due, derivate da fori passanti e perpendicolari alle superfici maggiori delle due parti dello stampo. Eventuali "bave” di stampa possono essere eliminate semplicemente con un procedimento di attacco chimico o fisico (metodi noti genericamente con il nome "etching”).

La struttura sacrificale può anche essere ottenuta attraverso il processo di “Injection Compression Molding” che combina i vantaggi della fase di iniezione e del successiva compressione, eliminando gli svantaggi dovuti ai lunghi percorsi seguiti del materiale termoplastico fuso nello stampo. In una prima fase un volume di polimero sciolto, corrispondente al volume della parte da stampare, è iniettato nello stampo che rimane parzialmente aperto. Grazie al maggiore spazio tra le parti dello stampo l'iniezione viene effettuata a bassa pressione, riducendo così la velocità e lo sforzo di taglio del polimero sciolto. Successivamente alla fase di iniezione le due parti dello stampo sono unite assieme durante la fase di compressione. A sua volta questa fase è suddivisa in moto a velocità controllata e infine, se la forza di compressione desiderata viene raggiunta, in tenuta a forza controllata della pressione finale durante il tempo di raffreddamento.

Un’ulteriore tecnica possibile per la produzione della struttura sacrificale è il taglio laser. In questo caso, si predispone un foglio del materiale polimerico sacrificale, e lo si incide col laser fino ad ottenere una struttura bidimensionale avente la forma desiderata.

La struttura tridimensionale in materiale termoplastico sacrificale può essere prodotta anche con altri metodi noti, per esempio per thermoforming, come risulterà evidente agli esperti del settore.

Nel caso di strutture sacrificali ottenute per hot embossing o taglio laser, strutture complesse 3D possono essere ottenute per semplice giunzione (per esempio, per fusione localizzata) di due o più strutture primarie, come descritto in relazione all'iniezione a caldo. Alternativamente, è possibile deformare strutture sacrificali essenzialmente bidimensionali (2D), sfruttando l’elasticità materiale del termoplastico, fino ad ottenere sviluppi 3D della struttura; quest’ultima tecnica può essere impiegata insieme a quella di giunzione di più strutture inizialmente essenzialmente 2D.

Le figure 1.c e 2.c mostrano due esempi di possibili strutture tridimensionali che possono essere impiegate nel metodo dell'invenzione; queste strutture, 15 e 25, sono ottenute tramite l’impiego dei master 13 e 23 descritti in precedenza, ma queste o altre strutture 3D possono essere ottenute con una qualunque delle altre tecniche sopra citate.

In una variante di questi metodi, la struttura 3D (o 2D) può essere ricoperta completamente o parzialmente con un materiale avente una funzionalità desiderata (purché sia in grado di resistere ai trattamenti successivi di produzione del dispositivo microfluidico). Per esempio, è possibile ricoprire la superficie di una struttura sacrificale con una polvere metallica, immergendo la struttura in polveri metalliche calde, che causano la fusione localizzata superficiale del materiale termoplastico e l'incorporazione di uno strato di polvere sulla superficie di questo dopo raffreddamento. In alternativa, è possibile impiantare particelle su superfici della struttura sacrificale seguendo le tecniche descritte negli articoli “Micro- and nanoscale modification of poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels by AFM lithography and nanoparticle incorporation”, A. Podestà et al., Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 5(3), 425-430, 2005, e “Poly(methyl methacrylate)-palladium clusters nanocomposite formation by supersonic cluster beam deposition: a method for mi erosi ructured metallization of polymer surfaces”, L. Ravagnan et al., Journal of Physics D: Applied Physics, 42(8), 082002/1-082002/5, 2009. Il primo descrive la produzione di un “letto” di nanoparticelle di carbonio sulla superficie interna di uno stampo in cui vengono poi versati i precursori del polimero studiato; le particelle di carbonio vengono incorporate negli strati superficiali del polimero durante la sua formazione; il secondo descrive l'applicazione di una tecnica per l’ottenimento di depositi di nanoparticelle metalliche (palladio nel caso dell’articolo) in un polimero rigido.

La struttura tridimensionale sacrificale così ottenuta viene poi inserita in un contenitore. La struttura può appoggiare sul fondo del contenitore, oppure può essere sostenuta lateralmente da supporti che possono essere fatti a loro volta di materiale sacrificale. La figure 1.d mostra una possibilità alternativa e preferita di inserimento della struttura sacrificale tridimensionale, 15, nel contenitore; secondo questa variante preferita, il contenitore 16 presenta una cavità principale 17 destinata ad ospitare la struttura 15, e due scanalature, 18 e 18’, di profondità inferiore a quella della cavità 17; le estremità della struttura tridimensionale vengono appoggiate in queste scanalature, consentendo di mantenerla in posizione e staccata dal fondo della cavità 17; analogamente, il contenitore 26 ha una cavità 27 e presenta le scanalature 28 e 28’. Nel contenitore, in corrispondenza dei punti di appoggio o dei supporti, si avranno aperture nella superficie del dispositivo microfluidico finale che consentono di mettere in comunicazione con l’esterno il reticolo di canali e spazi vuoti interno al dispositivo stesso.

Attorno a detta struttura tridimensionale viene poi depositato un precursore, liquido o in soluzione, di una matrice solida; il precursore viene versato nelle cavità 17 e 27, fino a ricoprire completamente le strutture tridimensionali in esse contenute, come mostrato nelle figure 1.e e 2.e.

Il materiale sacrificale e il precursore devono essere scelti in modo tale da soddisfare una serie di condizioni durante le operazioni di realizzazione del metodo.

Il precursore deve essere in grado di solidificare mediante reazione chimica o trasformazione fisica, e dette reazione o trasformazione devono comportare l'impiego di composti chimici, l’adozione di condizioni fisiche, e passaggi operativi, tali che la struttura tridimensionale rimanga essenzialmente inalterata, o almeno mantenga la sua continuità, per il tempo necessario alla solidificazione del precursore; la definizione “mantenere la continuità", riferita alla struttura tridimensionale, indica che, anche se questa può venire parzialmente dissolta in superficie, la dissoluzione deve essere di entità ridotta, e tale che in nessun punto la struttura venga interrotta.

Questa condizione può essere raggiunta nel modo più semplice scegliendo come precursore un composto chimico liquido in cui la struttura tridimensionale sia insolubile; oppure, nel caso in cui il precursore sia usato in soluzione, la struttura tridimensionale deve essere insolubile nel solvente.

È anche possibile che il materiale sacrificale sia lievemente solubile nel precursore (se liquido) o nel suo solvente (se usato in soluzione). In questo caso, è necessario che la solubilità del materiale sacrificale nel precursore o nel solvente sia sufficientemente bassa da fare in modo che la struttura tridimensionale rimanga continua per tutto il tempo necessario alla solidificazione del precursore, così che in nessun punto la matrice vada ad occludere un canale o una cavità previsti nel reticolo di canalizzazioni del dispositivo finale.

A sua volta, il materiale di matrice (le cui caratteristiche dipendono dalla scelta del precursore) deve essere insolubile nel solvente del materiale sacrificale, nel caso la rimozione di questo avvenga per via chimica, oppure inalterabile alla temperatura di fusione del materiale sacrificale nel caso questo venga rimosso per trattamento termico. In particolare, se la tecnica scelta per la rimozione del materiale sacrificale è la fusione di questo, il materiale della matrice deve avere una temperatura di fusione, e preferibilmente anche la Tg, superiore alla temperatura di fusione del materiale sacrificale.

Nel caso si desideri accentuare l'incompatibilità chimica del materiale della struttura sacrificale con quello della matrice, così da migliorare la replicabilità della geometria di detta struttura nelle canalizzazioni della matrice finale, è anche possibile ricoprire la struttura 3D, prima di versare il precursore (o una sua soluzione) nel contenitore, con un agente chimico opportuno; per esempio, se il materiale della matrice è costituito da idrogelo di poli(etilenglicole) (PEG), la superficie della struttura 3D può essere ricoperta con uno strato sottile di un olio di silicone.

Il precursore, sia liquido che in soluzione, può essere costituito da monomeri o oligomeri di un polimero, che vengono fatti polimerizzare in loco (per esempio innescando la polimerizzazione con iniziatori radicalici, tramite irraggiamento con luce di opportuna lunghezza d’onda, normalmente nel campo UV, o ancora termicamente). In generale il materiale della matrice può essere qualsiasi polimero reticolato o non reticolato e più in generale da qualsiasi materiale che sia in grado di solidificare partendo da un precursore liquido, a patto che sia compatibile con la rimozione del materiale sacrificale.

Tra i possibili materiali di matrice, preferito per diverse applicazioni è il polidìmetilsilossano (PDMS) per la facilità di produzione e impiego, perché è trasparente, permeabile ai gas e flessibile.

Un altro materiale adatto alla realizzazione del corpo del dispositivo è il polistirene (PS), molto utilizzato in applicazioni biomediche e per coltura cellulare a causa del basso costo di produzione, dell’atossicità e dell’ottima trasparenza.

In una variante di particolare interesse, il materiale della matrice viene prodotto a partire da una soluzione contenente specie che polimerizzano a formare idrogeli, ottenendo un dispositivo finale la cui matrice contiene dosi elevate (normalmente da circa il 2% fino al 99% in peso) di acqua; un dispositivo microfluidico così realizzato è normalmente particolarmente adatto alla creazione di scaffold per usi in impianti nel corpo umano (o animale).

In particolare, questi materiali consistono in polimeri reticolati insolubili in acqua che intrappolano fisicamente quantità elevate di acqua, fino anche al 99% in peso; esempi tipici di polimeri che possono formare idrogeli sono le poliammidoammine e il poliidrossietilmetacrilato (PHEMA). È anche possibile impiegare polimeri solubili che, una volta reticolati, risultano insolubili; esempi di questi polimeri sono poli-N-isopropilacrilammide (PNIPAAM), polietilenglicole (PEG), policaprolattone (PCL), collagene, agarosio, chitosano e alginato.

Tipiche coppie materiale sacrificale/materiale corpo dispositivo, in caso di rimozione del primo per fusione, sono PMMA/PDMS e PS/resine epossidiche; nel caso di rimozione del materiale sacrificale con solvente, tipiche coppie sono PMMA-PDMS (solventi: acetone, acido acetico), PMMA-PHEMA (solventi: acetone, acido acetico), PVA-PHEMA (solvente: acqua), PVA-PDMS (solvente: acqua), PVA-PS (solvente: acqua) e PVA-PEG (solvente: acqua), PS-collagene (solvente: acetone), PMMA-chitosano (solvente: acetone) e PMMA-PCL (solvente: acetone).

Il precursore viene poi lasciato solidificare, e il corpo solido ottenuto viene rimosso dal contenitore.

Infine, l’insieme costituito dal corpo solido così ottenuto, contenente ancora il materiale sacrificale, viene sottoposto ad un trattamento di rimozione selettiva di quest’ultimo. Nel caso di rimozione per trattamento termico, detto insieme viene portato ad una temperatura superiore a quella di fusione del materiale sacrificale ma inferiore a quella del materiale del corpo del dispositivo (e preferibilmente inferiore alla Tgdi quest’ultimo). In alternativa, detto insieme viene inserito in un contenitore (comunemente di dimensioni superiori del contenitore in cui si è formato), in cui viene immesso un solvente per il materiale sacrificale, fino alla totale dissoluzione di questo. In entrambi i casi si ottiene un corpo solido che contiene un reticolo tridimensionale di canali e altri volumi vuoti, secondo il disegno desiderato. Le figure 1.f e 2.f mostrano il risultato finale della sequenza di operazioni del metodo, rispettivamente nel caso dell’impiego delle strutture sacrificali tridimensionali 15 e 25. Le figure mostrano i due dispositivi microfluidici, rispettivamente 19 e 29: i dispositivi mostrati sono trasparenti, per mettere in evidenza il reticolo tridimensionale di canali interni.

Nel caso in cui sulla superficie della struttura tridimensionale sacrificale fosse stata ricoperta (anche solo parzialmente) prima di annegarla nel precursore liquido, con un materiale funzionale (per esempio particelle metalliche), quest’ultimo rimarrà aderente o parzialmente conglobato nel materiale della matrice in formazione; in seguito alla dissoluzione e rimozione del materiale sacrificale, il materiale funzionale viene così trasferito alla superficie interna dei canali o degli altri volumi vuoti del dispositivo. Esempi di materiali che possono essere trasferiti per questa via sulle superfici interne dei canali sono le proteine e nanoparticelle metalliche. Il metodo della presente invenzione consente anche la produzione di scaffold vascolarizzati che presentano una migliorata sopravvivenza delle cellule in essi contenute. Scaffold di questo tipo possono essere impiegati per numerose applicazioni di coltura cellulare, per esempio per produrre biofarmaci in vitro e/o per screening di farmaci o di terapie in vitro, oppure per la produzione di impianti e protesi per applicazioni chirurgiche. Nel caso dei impianti e protesi chirurgici, questi scaffold costituiscono un supporto, permanente o temporaneo, per la colonizzazione da parte delle cellule del corpo; nel caso di impianti permanenti la colonizzazione delle superfici dello scaffold consente l’integrazione e la compatibilizzazione dello stesso con i tessuti del corpo, mentre nel caso di impianti temporanei lo scaffold deve offrire un supporto temporaneo alle cellule del tessuto, per poi essere degradato dai fluidi corporei con tempi compatibili con quelli della ricrescita cellulare, o essere metabolizzato dalle stesse cellule in crescita. Come noto, questi sistemi presentano canalizzazioni, non necessariamente ordinate o di geometria regolare, che hanno lo scopo di consentire il trasporto dei fluidi corporei che portano ossigeno ed elementi nutritivi alle cellule. Un problema dei sistemi vascolarizzati della tecnica nota è che il trasporto di fluidi all'interno dei materiali che compongono detti sistemi avviene con difficoltà. La conseguenza è che, mentre le cellule presenti sulle superfici dello scaffold, comprese quelle delle canalizzazioni interne, hanno tempi di sopravvivenza sufficienti, cellule più lontane da dette superfici hanno tempi di sopravvivenza troppo ridotti, che non consentono tassi di riproduzione cellulare e quindi di ricrescita tissutale compatibili con gli scopi sopra indicati.

La domanda di brevetto WO 2010/009320 A1, discussa in precedenza, affronta il problema e offre un modo di formare scaffold con vascolarizzazioni principali di sezione relativamente grossa, circondati da un reticolo di microcanali diffuso all’interno dello scaffold; la soluzione proposta da questo documento ha però gli inconvenienti prima visti, di una relativa complessità produttiva e del fatto che non si può garantire che i filamenti di materiale sacrificale, destinati a formare le microcanalizzazioni, non collassino sotto il peso del liquido precursore della matrice dello scaffold.

Il metodo della presente invenzione, in una sua variante, consente di superare i problemi dell’arte nota.

Secondo questo metodo, si ripetono le fasi di processo descritte in precedenza, con l’unica differenza che si introducono materiali porogeni nel liquido precursore (o contenente i precursori) della matrice dello scaffold.

Questi materiali porogeni possono essere polveri di un materiale sacrificale, che può essere lo stesso o diverso da quello impiegato per formare la struttura sacrificale. Altri materiali porogeni che possono essere impiegati sono quelli che sviluppano gas in soluzione (es., NaHC03), oppure tensioattivi o materiali simili che causano la formazione di schiume o emulsioni, con conseguente solidificazione del precursore in una forma di schiuma.

La matrice di scaffold cosi prodotta presenta, oltre alle canalizzazioni principali ottenute dalla rimozione della struttura sacrificale tridimensionale, una struttura aperta secondaria costituita da pori interconnessi tra loro. Questa struttura secondaria viene riempita di cellule mediante iniezione nella matrice o semina attraverso le canalizzazioni. Le cellule colonizzano lo scaffold in modo omogeneo grazie alla possibilità di migrare attraverso le interconnessioni fra pori. Queste cellule sono preferibilmente autologhe, cioè ricavate dallo stesso individuo in cui si dovrà impiantare lo scaffold o il tessuto ricresciuto da questo, evitando così possibili problemi di rigetto. Per la produzione della matrice si impiegano preferibilmente materiali che degradano completamente una volta inseriti nel corpo del paziente (umano o animale), senza generare effetti infiammatori. Esempi di questi materiali sono il PCL, il collagene e il chitosano.

In una variante di produzione di questi dispositivi, le cellule possono essere inserite direttamente nel precursore liquido di un ìdrogelo prima o durante l’incapsulamento della struttura sacrificale e degli eventuali porogeni; idrogeli contenenti cellule vive sono indicati nel settore con la definizione inglese "cellladen”. Il materiale sacrificale (della struttura tridimensionale che forma le canalizzazioni principali e dell’eventuale porogeno) viene poi rimosso con solventi compatibili con le cellule, in generale soluzioni saline. In questo caso si ottiene un idrogelo caricato con cellule con canalizzazioni microfluidiche ed eventuale porosità.

L’invenzione verrà ulteriormente illustrata tramite i seguenti esempi.

Nello svolgimento delle prove riportate negli esempi, sono stati impiegati i seguenti materiali:

- polimetilmetacrilato (PMMA), 445746-1 KG (Sigma-Aldrich)

- polivinilalcool (Mowiol), Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich)

- polivinilalcool (PVA), Mowiflex TC253 (Kuraray)

- polidimetilsilossano (PDMS), Sylgard 184 (Dow Corning)

- 2-idrossietilmetacrilato (HEMA), cod. 128635 (Sigma-Aldrich)

- etilenglicole dimetacrilato (EGDMA), cod. 335681 (Sigma-Aldrich)

- Ν,Ν,Ν',Ν’- tetrametiletilendiammina (TEMED), cod. T22500 (Sigma-Aldrich)

- persolfato di ammonio (APS), cod. A3426 (Sigma-Aldrich)

- etanolo, cod. 51976 (Sigma-Aldrich)

- polietilenglicole diacrilato MW6000 (PEGDA), cod. 701963 (Sigma-Aldrich) - additivo fotoiniziatore Irgacure 2959 (CIBA)

- antiaderente per stampi Nano HS (BPItech)

- Silicone spray ALS (AMSOIL)

- cloruro di sodio, cod. 71376 (Sigma-Aldrich)

- terreno di coltura RPMI 1640, cod. R0883 (Sigma-Aldrich)

- tampone salino fosfatico (PBS), cod. P5493 (Sigma-Aldrich)

- acriloil-polietilenglicole-RGDS (APEG-RGDS), sintetizzato come descritto nell’articolo “Smooth muscle celi growth in photopolymerized hydrogels with celi adhesive and proteolytically degradable domains: synthetic ECM analogs for tissue engineering”, B. K. Mann et al, Biomaterials (2001) Voi.

22, pagg. 3045-51 .

ESEMPIO 1

Questo esempio è relativo alla produzione di un dispositivo a base di elastomero con canalizzazioni da 500 pm e micro-pozzetti interni per applicazioni biologiche. Produzione della struttura sacrificale: in un master in alluminio del tipo 13 mostrato in figura 1.b scaldato a 140 °C (precedentemente trattato con Nano HS) si inietta PVA fuso alla temperatura di 190 °C tramite l’apertura laterale 14, fino a riempire completamente gli spazi interni. Successivamente si raffredda il master a temperatura ambiente, si separano le due parti componenti e si rimuove meccanicamente la struttura 15 in PVA così formata.

Produzione della matrice a base di PDMS: in un beaker da 250 mL si introducono, nell’ordine, il precursore liquido per PDMS Sylgard 184 (13,5 g) e il relativo agente reticolante (1,5 g) (incluso nella confezione di vendita del Sylgard 184) e si mescola a mano utilizzando una bacchetta di vetro per 1 minuto circa. Poi si pone la miscela in una camera a pressione ridotta (10 mBar) per 60 minuti per eliminare le bolle presenti nel liquido, dopodiché si versa la miscela nel contenitore 16 realizzato in PMMA contenente la struttura sacrificale 15. Si sigilla quindi il contenitore per evitare la fuoriuscita di liquido e si lascia reagire a temperatura ambiente per 48 ore (alternativamente a 60 °C per 6 ore). Successivamente si apre il contenitore e si rimuove il blocco in PDMS solido.

Rimozione della struttura sacrificale: si immerge il blocco in PDMS contenente la struttura sacrificale in PVA in acqua bi-distillata e sotto agitazione magnetica per 24 ore a 90 °C. In questo modo la struttura sacrificale si solubilizza in acqua senza lasciare tracce sulla matrice in PDMS. A questo punto il dispositivo 19 con canalizzazioni e micro-pozzetti è pronto per l’utilizzo.

ESEMPIO 2

Questo esempio è relativo alla produzione di un dispositivo a base di elastomero con canalizzazioni da 500 pm e micro-pozzetti interni per applicazioni biologiche e risulta una variante dell'esempio 1.

Produzione della struttura sacrificale: su una parte microfabbricata del tipo 10 mostrato in figura 1 .a, scaldata a 50 °C (e trattata in precedenza con Nano HS), si versa una soluzione acquosa di Mowiol (50/50 in peso) alla temperatura di 70 °C depositando un film di circa 1 mm su tutta la superficie dello stampo (casting).

Successivamente si raffredda lo stampo a temperatura ambiente e si lascia evaporare il solvente per 24 ore sotto flusso d'aria. Attraverso il processo di etching (utilizzando un panno imbevuto di acqua ed etanolo) si porta lo strato di Mowiol a filo con il limite superiore delle cavità dovute alle microfabbricazioni. Dopo aver posto lo stampo in una camera a pressione ridotta (10 mbar) per 4 ore si rimuove la struttura in Mowiol così formata.

Produzione della matrice a base di PDMS: in un beaker da 250 mL si introducono, nell’ordine, il precursore liquido per PDMS Sylgard 184 (13,5 g) e il relativo agente reticolante (1,5 g) (incluso nella confezione di vendita del Sylgard 184) e si mescola a mano utilizzando una bacchetta di vetro per 1 minuto circa. Poi si pone la miscela in una camera a pressione ridotta (10 mbar) per 60 minuti per eliminare le bolle presenti nel liquido, dopodiché si versa la miscela nel contenitore 16 in PMMA, contenente la struttura sacrificale in Mowiol. Si sigilla quindi il contenitore per evitare la fuoriuscita di liquido e si lascia reagire a temperatura ambiente per 48 ore (alternativamente a 60 °C per 6 ore). Successivamente si apre il contenitore e si rimuove il blocco in PDMS solido.

Rimozione della struttura sacrificale: si immerge il blocco in PDMS contenente la struttura sacrificale in Mowiol in acqua bi-distillata e sotto agitazione magnetica per 24 ore a 90 °C, cambiando la soluzione ogni 8 ore. In questo modo la struttura sacrificale si solubilìzza in acqua senza lasciare tracce sulla matrice in PDMS. A questo punto il dispositivo 19 con canalizzazioni e micro-pozzetti è pronto per l’utilizzo.

ESEMPIO 3

Questo esempio è relativo alla produzione di un dispositivo a base di idrogelo con canalizzazioni da 500 μιτι e micro-pozzetti interni per applicazioni biologiche.

Produzione della struttura sacrificale: in un master in alluminio del tipo 13 mostrato in figura 1.b, scaldato a 120 °C (precedentemente trattato con Nano HS), si inietta PMMA fuso alla temperatura di 170 °C tramite l’apertura laterale 14, fino a riempire completamente gli spazi interni. Successivamente si raffredda a temperatura ambiente, si separano le due parti componenti lo stampo e si rimuove meccanicamente la struttura in PMMA 15 così formata.

Produzione della matrice a base di idrogelo di poli(2-idrossietilmetacrilato) (PHEMA): in un pallone da 50 mi si introducono nell'ordine, HEMA (6,00 g, 46,1 immoli), acqua (3 mL), EGDMA (60,0 mg, 0,303 mmoli) e TEMED (81,4 mg, 0,701 mmoli), mescolando per 30 secondi con agitatore magnetico dopo l'aggiunta di ciascun componente. Si aggiunge quindi una soluzione acquosa al 10 % in peso di APS (75,0 μΙ_, 0,0322 mmoli), si agita a mano per 30 secondi, poi si versa la miscela nel contenitore in PMMA 16 contenente la struttura sacrificale (figura 1.e) Si sigilla poi il contenitore per evitare l’evaporazione dei componenti liquidi e si lascia reagire per 24 ore a temperatura ambiente. Successivamente si smonta il contenitore, si rimuove l’idrogelo formato contenente la struttura sacrificale e si immerge in una soluzione acquosa di etanolo (50% v/v, 30 mL), cambiando la soluzione ogni 4 ore per 3 volte.

Rimozione della struttura sacrificale: si immerge l’idrogelo di PHEMA contenente la struttura sacrificale in PMMA in acetone e sotto agitazione magnetica per 48 ore a 50 °C, cambiando la soluzione ogni 12 ore. In questo modo la struttura sacrificale in PMMA si solubilizza senza lasciare tracce sull'idrogelo. Successivamente si immerge l’idrogelo in una soluzione di etanolo per 4 ore e poi, per lo stesso tempo, in una soluzione acquosa di etanolo (50% v/v, 30 mL), quindi si eseguono lavaggi in acqua bi-distillata (50 mL) cambiando la soluzione ogni 4 ore per 3 volte. A questo punto il dispositivo con canalizzazioni e micro-pozzetti 19 è pronto per l’utilizzo.

ESEMPIO 4

Questo esempio è relativo alla produzione di un dispositivo a base di idrogelo con canalizzazioni da 500 pm e micro-pozzetti interni per applicazioni biologiche e risulta una variante dell’esempio 3.

Produzione della struttura sacrificale: il master in alluminio del tipo 13 (precedentemente trattato con Nano HS) viene lasciato parzialmente aperto e scaldato a 120 °C. Nello spazio lasciato tra le due parti (10 e 12) dello stampo si inietta PMMA fuso alla temperatura di 170 °C. Successivamente a questa fase di iniezione le due parti dello stampo sono unite assieme con una forza di compressione sviluppata da una pressa di 10000 Kg. Quando la forza di compressione desiderata viene raggiunta, inizia la fase di tenuta a forza controllata della pressione finale fino al completo raffreddamento dello stampo. Al termine del processo descritto si separano le due parti componenti lo stampo e si rimuove meccanicamente la struttura 15 in PMMA così formata.

Produzione della matrice a base di idrogelo di po!i(2-idrossietilmetacrilato) (PHEMA): in un pallone da 50 mi si introducono nell’ordine, HEMA (6,00 g, 46,1 mmoli), acqua (3 mL), EGDMA (60,0 mg, 0,303 mmoli) e TEMED (81 ,4 mg, 0,701 mmoli), mescolando per 30 secondi con agitatore magnetico dopo l'aggiunta di ciascun componente. Si aggiunge quindi una soluzione acquosa al 10 % in peso di APS (75,0 pl_, 0,0322 mmoli), sì agita a mano per 30 secondi, poi si versa la miscela nel contenitore in PMMA 16 contenente la struttura sacrificale (figura 1.e). Si sigilla poi il contenitore per evitare l’evaporazione dei componenti liquidi e si lascia reagire per 24 ore a temperatura ambiente. Successivamente si smonta il contenitore, si rimuove l’idrogelo formato contenente la struttura sacrificale e si immerge in una soluzione acquosa di etanolo (50% v/v, 30 mL), cambiando la soluzione ogni 4 ore per 3 volte.

Rimozione della struttura sacrificale: si immerge l’idrogelo di PHEMA contenente la struttura sacrificale in PMMA in acetone e sotto agitazione magnetica per 48 ore a 50 °C, cambiando la soluzione ogni 12 ore. In questo modo la struttura sacrificale in PMMA si solubilizza senza lasciare tracce sull'idrogelo. Successivamente si immerge l’idrogelo l’idrogelo in una soluzione di etanolo per 4 ore e poi, per lo stesso tempo, in una soluzione acquosa di etanolo (50% v/v, 30 mL), quindi si eseguono lavaggi in acqua bi-distillata (50 mL) cambiando la soluzione ogni 4 ore per 3 volte. A questo punto il dispositivo 19 con canalizzazioni e micro-pozzetti è pronto per l’utilizzo.

ESEMPIO 5

Questo esempio è relativo alla produzione di uno scaffold poroso e vascolarizzato a base di idrogelo per applicazioni di ingegneria tissutale.

Produzione della struttura sacrificale con dimensione minima di 200 micrometri: in un master in alluminio del tipo 23 mostrato in figura 2.b, scaldato a 120 °C (precedentemente trattato con Nano HS), si inietta PMMA fuso alla temperatura di 170 °C tramite l’apertura laterale 24, fino a riempire completamente gli spazi interni. Successivamente si raffredda a temperatura ambiente, si separano le due parti componenti lo stampo e si rimuove meccanicamente la struttura in PMMA così formata.

Produzione della matrice a base di idrogelo di polietilenglicole (PEG): in un pallone da 50 mi si introducono nell’ordine, PEGDA 6000 (6500 mg, 1,08 mmoli), una soluzione satura di cloruro di sodio (7,2 mL), una soluzione di Irgacure 2959 in etanolo (450 pL, 100mg Irgacure/mL etanolo), cloruro di sodio in polvere con funzione di porogeno (3500 mg, 59,89 mmoli) e si mescola mediante agitazione magnetica per 10 minuti. Si versa la miscela nel contenitore in PMMA 26 contenente la struttura sacrificale in PMMA (figura 2.e), si sigilla poi il contenitore per evitare l’evaporazione dei componenti liquidi e si lascia reagire per 10 minuti sotto radiazione UV (365 nm, bulbo a vapori di mercurio 120 W, distanza 20 cm) a temperatura ambiente. Successivamente si smonta il contenitore, si rimuove l’idrogelo formato contenente la struttura sacrificale e si immerge in una soluzione acquosa di etanolo (50% v/v, 30 mL), cambiando la soluzione ogni 4 ore per 3 volte.

Rimozione della struttura sacrificale e del porogeno: si immerge l’idrogelo contenente la struttura sacrificale in PMMA in acetone e sotto agitazione magnetica per 48 ore a 50 °C, cambiando la soluzione ogni 12 ore. In questo modo la struttura sacrificale in PMMA si solubilizza senza lasciare tracce sull’idrogelo.

Successivamente si immerge l’idrogelo in una soluzione di etanolo per 4 ore e poi, per lo stesso tempo, in una soluzione acquosa di etanolo (50% v/v, 30 mL), quindi si eseguono lavaggi in acqua bi-distillata (50 mL) a 50 °C per 72 ore cambiando la soluzione ogni 12 ore per 6 volte. I lavaggi in acqua permettono alle particelle di sale incluse nella matrice di solubilizzarsi lasciando al loro posto la struttura porosa. Infine si immerge l’idrogelo prima in una soluzione salina (PBS, 30 mi) per 4 ore e poi nel terreno di coltura (RPMI 1640, 30 mL) per 4 ore. A questo punto lo scaffoid poroso e vascolarizzato 29 è pronto per l’utilizzo con le cellule.

ESEMPIO 6

Questo esempio è relativo alla produzione di uno scaffoid vascolarizzato a base di idrogelo di polietilenglicole (PEG) con cellule pre-caricate (cell-laden) per applicazioni di ingegneria tissutale.

Produzione della struttura sacrificale: in un master in alluminio del tipo 23 mostrato in figura 2.b scaldato a 140 °C (precedentemente trattato con Nano HS) si inietta PVA fuso alla temperatura di 190 °C tramite l’apertura laterale 24, fino a riempire completamente gli spazi interni. Successivamente si raffredda lo stampo a temperatura ambiente, si separano le due parti componenti lo stampo e si rimuove meccanicamente la struttura in PVA così formata. In questo caso la superficie della struttura sacrificale viene trattata con Silicon Spray ALS per idrofobicizzare la sua superficie.

Produzione della matrice a base di idrogelo di polietilenglicole (PEG): in un pallone da 50 mi si introducono nell’ordine, PEGDA (1500 mg, 0,250 mmoli), APEG-RGDS (164 mg, 0,0450 mmoli), una soluzione di PBS (13,5 mL, pH 7,4) con fibroblasti 3T3 in sospensione (10<6>cellule/mL), una soluzione di Irgacure 2959 in etanolo (400 μΙ_, 100mg Irgacure/mL etanolo) e si mescola mediante agitazione magnetica per 2 minuti. Si versa la miscela nel contenitore in PMMA 26 contenente la struttura sacrificale in PVA (figura 2.e). Si sigilla poi il contenitore per evitare l’evaporazione dei componenti liquidi e si lascia reagire per 3 minuti sotto radiazione UV (365 nm, bulbo a vapori di mercurio 120 W, distanza 20 cm) a temperatura ambiente. L’elevata concentrazione di soluti nella miscela acquosa e la ricopertura idrofobica non permettono al PVA di sciogliersi durante la polimerizzazione della matrice a base di idrogelo. Successivamente si smonta il contenitore, si rimuove I’idrogelo formato contenente la struttura sacrificale.

Rimozione della struttura sacrificale: si immerge l’idrogelo in una soluzione salina (PBS, 30 mi) per 8 ore cambiando la soluzione ogni 2 ore per 4 volte, successivamente per 8 ore nel terreno di coltura (RPMI 1640, 30 mL), cambiando la soluzione ogni 4 ore per 2 volte, permettendo la completa solubilizzazione della struttura sacrificale in PVA. A questo punto lo scaffold vascolarizzato con cellule pre-caricate, 29, è pronto per l’utilizzo.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la produzione di un dispositivo microfluidico tridimensionale monolitico (19; 29), che comprende le seguenti operazioni: - produrre una struttura tridimensionale (15; 25) con un materiale sacrificale; - posizionare detta struttura tridimensionale in un contenitore (16; 26); - depositare attorno a detta struttura tridimensionale un precursore, liquido o in soluzione, di una matrice solida, detto precursore in grado di solidificare mediante reazione chimica o trasformazione fisica formando un materiale che costituisce il corpo del dispositivo finale; - causare la solidificazione di detto precursore; - rimuovere selettivamente il materiale sacrificale con un trattamento termico e/o per dissoluzione con un solvente dello stesso, detto metodo essendo caratterizzato dal fatto che: - il materiale sacrificale è un materiale termoplastico; - detti materiali sacrificale e precursore sono scelti in modo tale che il materiale sacrificale sia insolubile nel precursore se questo è liquido o nella soluzione del precursore in un solvente se il precursore è impiegato in soluzione, oppure abbia ridotta solubilità in detti precursore o solvente, tale che detta struttura tridimensionale mantenga la continuità per il tempo necessario alla solidificazione del precursore; e tale che il materiale che costituisce il corpo del dispositivo finale, ottenuto dalla solidificazione del precursore, sia inalterabile nel trattamento termico e/o di dissoluzione chimica necessario alla rimozione della struttura sacrificale.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la struttura sacrificale tridimensionale è costituita da due o più parti separate o dall’unione delle stesse.
3. 3. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui la struttura sacrificale tridimensionale è ottenuta per deformazione di una struttura sacrificale essenzialmente bidimensionale.
4. 4. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti, in cui, prima dell’operazione di ricopertura della struttura tridimensionale nello stampo con detto precursore liquido o in soluzione, la superficie di detta struttura sacrificale viene ricoperta completamente o parzialmente con uno strato di un materiale differente dal materiale sacrificale e dal precursore.
5. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4 in cui detto materiale differente dal materiale sacrificale e dal precursore ha una funzionalità chimica, fisica o biologica.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 4 in cui detto materiale differente dal materiale sacrificale e dal precursore è insolubile nel precursore e/o nel suo solvente.
7. 7. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui detto materiale sacrificale termoplastico è scelto tra polimetilmetacrilato (PMMA), polivinilalcool (PVA), policarbonato (PC) e polistirene (PS).
8. 8. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui il materiale che costituisce il corpo del dispositivo finale è scelto tra resine epossidiche, polidimetilsilossano (PDMS), PS, PMMA, Poliuretano (PU), poliammidoammine (PAA), poliidrossietilmetacrilato (PHEMA), poli-N-isopropilacrilammide (PNIPAAM), polietilenglicole (PEG), policaprolattone (PCL), acido polilattico (PLA), acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA), idrogelo di poli(vinilalcool) (PVA,) collagene, agarosio, chitosano, alginato fibrinogeno, acido ialuronico, gelatina e destrano.
9. 9. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui il materiale sacrificale viene rimosso per dissoluzione con un solvente, e le coppie materiale sacrificale/materiale del corpo del dispositivo sono scelte tra PMMA-PDMS (solvente: acetone), PMMA-PHEMA (solvente: acetone), PVA-PHEMA (solvente: acqua), PVA-PDMS (solvente: acqua) e PVA-PEG (solvente: acqua).
10. 10. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti in cui la matrice del supporto è prodotta con un materiale poroso e/o nel precursore liquido o nella soluzione del precursore della matrice si introducono polveri di un materiale sacrificale porogeno, che può essere uguale o diverso da quello impiegato per formare la struttura sacrificale tridimensionale.
11. 11. Metodo secondo la rivendicazione 10 in cui detto materiale porogeno, diverso da quello della struttura sacrificale tridimensionale, è scelto tra materiali che sviluppano gas in soluzione, solventi, olii, tensioattivi o schiumogeni.
12. 12. Metodo secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti per la produzione di supporti vascolarizzati per applicazioni di coltura cellulare in cui la matrice del supporto è prodotta con un materiale biocompatibile.
13. 13. Metodo secondo una delle rivendicazioni da 10 a 12, in cui il materiale della matrice è scelto tra PS, PMMA, PU, PCL, PAA, PHEMA, PNIPAAM, PLA, PLGA, idrogelo di PVA, PEG, collagene, fibrinogeno, acido ialuronico, chitosano, agarosio, alginato, gelatina e destrano.
14. 14. Metodo secondo una delle rivendicazioni 12 o 13, in cui nella matrice sono inserite cellule vive.
15. 15. Metodo secondo la rivendicazione 14, in cui dette cellule sono inserite nel precursore liquido o nella soluzione di precursore con cui viene prodotta la matrice.