ES2692296T3 - Método para la fabricación de dispositivos microfluídicos tridimensionales monolíticos - Google Patents

Abstract

Método para producir un dispositivo microfluídico tridimensional monolítico (19; 29), que comprende las siguientes etapas: - producir, con un material sacrificial, una plantilla tridimensional (15; 25) de forma estable, que consiste en una parte (A), que se corresponde con la canalización del dispositivo microfluídico, y una o más partes (B, B'), que no se corresponden con dicha canalización; - colocar dicha plantilla tridimensional en un molde (16; 26) suspendiéndola de al menos una de dicha una o más partes (B, B') que no se corresponden con dicha canalización; - recubrir dicha plantilla tridimensional excluyendo dicha una o más partes (B, B') que no se corresponden con dicha canalización, con un precursor, líquido o en disolución, de una matriz sólida, pudiendo solidificar dicho precursor mediante reacción química o transformación física formando una matriz que constituye el cuerpo del dispositivo final; - provocar la solidificación de dicho precursor; - retirar de manera selectiva el material sacrificial mediante un tratamiento térmico y/o mediante disolución con un disolvente del mismo; en el que la matriz se produce con un material poroso obtenido introduciendo en el precursor líquido o en la disolución del precursor de matriz, polvos de un material sacrificial porogénico, que puede ser igual o diferente del usado para formar la plantilla tridimensional.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la fabricacion de dispositivos microflmdicos tridimensionales monoltticos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para la fabricacion de dispositivos microflmdicos monoltticos tridimensionales.

Tecnica anterior

Los dispositivos microflmdicos son artmulos fabricados producidos comunmente a partir de vidrio, silicio o materiales polimericos que contienen una canalizacion que se extiende en dos dimensiones (es decir sustancialmente en un plano dentro del dispositivo) o en tres dimensiones, dentro de la que puede hacerse que fluyan fluidos. Los dispositivos tienen generalmente dimensiones de hasta unos pocos centfmetros, mientras que los canales tienen secciones transversales con lados (o un diametro, en el caso de canales de seccion transversal circular) generalmente de decenas a cientos de micrometros (|im) de tamano; en el significado mas amplio del termino, los dispositivos microflmdicos tambien pueden incluir aquellos sistemas en los que los canales tienen secciones transversales del orden de unos pocos milfmetros; en el resto del texto y en las reivindicaciones, la definicion “dispositivos microflmdicos” se usara en el sentido de este ultimo significado mas amplio.

Los dispositivos microflmdicos tienen una variedad de posibles aplicaciones: por ejemplo, con funcionalizaciones apropiadas de las paredes de canal, pueden actuar como detectores de la presencia de uno o mas analitos en un fluido (funcionando por tanto como elementos activos de analizadores miniaturizados, tambien conocidos en el campo mediante la definicion en ingles “lab on a chip”), particularmente en aplicaciones en el campo biologico y medico, o como microrreactores qmmicos. El uso de estos sistemas en el campo biologico ha aumentado en los ultimos anos, especialmente con respecto a aplicaciones en microscopfa, cultivo, recuento de celulas y manipulacion celular, y experimentos de alto rendimiento. Una ventaja extremadamente importante de estos dispositivos es que su funcionamiento requiere cantidades mmimas de fluidos en comparacion con los sistemas convencionales, y en consecuencia el uso de cantidades mmimas de reactivos (con frecuencia caros), asf como reduce los volumenes de lfquido que debe desecharse, para lo que se requieren normalmente procedimientos especiales.

En una variante particularmente interesante, si estan hechos de materiales biocompatibles, estos artmulos fabricados pueden usarse en la produccion de protesis vascularizadas, y si dichos materiales tambien tienen la caractenstica de ser biodegradables o bioabsorbibles en un lapso de tiempo adecuado, estas protesis pueden funcionar como sitios de regeneracion tisular, que despues se sustituyen por tejido producido de manera natural (los denominados “estructuras basicas”).

Dado el numero y la importancia de las posibles areas de uso, en los ultimos anos se ha llevado a cabo un volumen considerable de trabajo de investigacion y desarrollo en el campo, centrado en la produccion y el perfeccionamiento de dispositivos microflmdicos que tengan las caractensticas deseadas.

Los primeros dispositivos de este tipo se produjeron usando metodos y materiales derivados del campo de los semiconductores y microactuadores (mas conocidos como “micromaquinas” en el sector), con secuencias de deposicion y/o eliminacion de partes de capas depositadas selectiva; ejemplos de estos metodos se describen en las solicitudes de patente EP 1614467 A2, US 2002/0081787 A1, US 2003/0012866 A1, US 2005/0170670 A1, US 2006/0014271 A1, WO 00/42233 A1, WO 2004/042797 A2, WO 2006/113492 A2, WO 2011/064716 A2, en la patente US 6.753.200 B2 y en los artmulos “Synthesis and characterization of photodefinable polycarbonates for use as sacrificial materials in the fabrication of microfluidic devices”, C. White et al., proceedings di SPIE, vol. 4690 (2002), paginas 242-253, y “Microsystems manufacturing via embossing of photodefinable thermally material sacrificials”, C. White et al., SPIE proceedings, vol. 5374 (2004), paginas 361-370. El principal factor limitante en estos metodos es que solo pueden producir estructuras bidimensionales en un sustrato, en el que la canalizacion en la practica se extiende solo en un plano dentro del artmulo fabricado, produciendo por tanto dispositivos relativamente simples, tambien debido a la imposibilidad de superponer o cruzar dos o mas canales; a lo sumo, los documentos citados anteriormente describe la posibilidad de producir dispositivos con canalizacion en mas de un plano paralelo aplicando los metodos de produccion de canalizacion plana sucesivamente varias veces, e interconectando los canales en diferente planos por medio de aberturas perpendiculares a los propios planos. Se han obtenido resultados analogos usando los metodos de prensado descritos en las solicitudes de patente WO 2005/084191 A2 y US 2007/0110962 A1.

La patente US 6.321.791 y la solicitud de patente WO 2009/121037 A2 se refieren a dispositivos en los que los canales, aunque tridimensionales, se obtienen superponiendo varias estructuras canalizadas bidimensionales que se encuentran en planos paralelos entre sf, e interconectando dichas estructuras por medio de aberturas perpendiculares a dichos planos. En estos dispositivos, los diferentes niveles pueden obtenerse mediante superposiciones sucesivas, o construyendolas por separado y uniendolas despues mecanicamente o mediante adhesion. En el primer caso, el proceso para producir una estructura multiplanar es largo y laborioso; en el segundo

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caso, los dispositivos obtenidos no son monolfticos, y puede haber imperfecciones de contacto o adhesion entre las superficies de dos capas adyacentes, lo que conduce a problemas en el uso del dispositivo; por ejemplo, un fluido podna difundir desde un canal a intersticios entre dos capas adyacentes, provocando contaminacion y/o un funcionamiento incorrecto del dispositivo.

Otros documentos proponen un enfoque alternativo a la produccion de dispositivos microflmdicos. Segun esta via, se producen estructuras tridimensionales (tambien denominadas “3D” a continuacion) con un material sacrificial, que puede disolverse como resultado de tratamientos apropiados; la estructura se corresponde (en negativo) con la extension de los canales que deben formarse dentro del dispositivo final; esta estructura se inserta en un molde en el que se vierte entonces un material lfquido, material que puede entonces solidificar (o solidificarse); al final del proceso se retira la estructura 3D inicial mediante ataque qmmico o mediante calentamiento (o ambos), dejando espacios y canales vados en su lugar.

Este metodo se usa, por ejemplo, en la solicitud de patente US 2003/0087198 A1. Segun este documento, la estructura 3D sacrificial se hace a partir de cera, “extrayendo” filamentos de un bano de cera fundida a traves de una “simiente” solida del mismo material (metodo analogo al metodo de Czochralski para hacer crecer monocristales de silicio puro); los filamentos asf obtenidos pueden elaborarse o interconectarse entonces para obtener las estructuras 3D deseadas. En el texto de la solicitud, se afirma que la seccion transversal de la hebra de cera obtenida (que se corresponded con la seccion transversal de los canales en el dispositivo final) puede controlarse actuando sobre parametros tales como, entre otros, las temperaturas de la masa fundida y del entorno externo, la viscosidad de la cera fundida, el diametro de la “simiente” fna y la tasa de crecimiento de la misma. Este sistema tiene el inconveniente de ser complicado de implementar en la practica, de modo que la produccion de cada estructura sacrificial individual lleva mucho tiempo; por tanto, el metodo de esta solicitud de patente puede ser adecuado para estudios de viabilidad a escala de laboratorio, pero en general no puede usarse en la produccion industrial a gran escala.

La solicitud de patente US 2007/0012891 A1 describe un sistema analogo al anterior, pero en el que la estructura 3D sacrificial se obtiene trabajando a partir del material solido, con equipamiento usado para la produccion de prototipos (se muestra a modo de ejemplo el instrumento Solidscape T66) en sectores tales como joyena, modelado, o en la produccion de modelos mediante mecanica posfusion. Tambien en este caso, el lfmite del metodo consiste en el hecho de que tienen que producirse estructuras sacrificiales de una en una mediante mecanizado de precision, conduciendo a largos tiempos (y por tanto altos costes) de produccion, que son incompatibles con aplicaciones industriales.

El documento US 7.494.557 B1 describe un metodo para producir un dispositivo microflmdico monolttico, comprendiendo el metodo laminar una pila de hojas.

Finalmente, la solicitud de patente WO 2010/009320 A1 describe un metodo que es especialmente adecuado para la produccion de estructuras canalizadas que deben usarse como “estructuras basicas” para su uso en medicina regenerativa. Segun el metodo de este documento, se produce una masa filamentosa de fibras alargadas a partir de un material sacrificial mediante extrusion, o usando diversas tecnicas que se conocen ampliamente en la produccion de fibras polimericas, que se engloban dentro de la definicion general de “hilatura” (metodos citados son hilatura en estado fundido, hilatura en humedo, hilatura en seco, hilatura en humedo por chorro seco y electrohilatura); la masa se recoge entonces con, o sobre, uno o mas soportes de forma alargada, varillas o tubos sustancialmente largos fabricados a su vez de un material sacrificial, de una manera en general analoga a la preparacion de hilo de azucar (el azucar es de hecho el material sacrificial preferido indicado en este documento); el conjunto asf obtenido se usa entonces como estructura sacrificial 3D de la manera descrita con referencia a los documentos anteriores. Este metodo esta limitado por encima de todo porque la estructura de los canales correspondientes a las fibras es completamente aleatoria y por tanto la reproducibilidad de los resultados no puede controlarse satisfactoriamente; en segundo lugar, las fibras obtenidas son muy delgadas y, en algunos casos, pueden no tener caractensticas suficientes en cuanto a la consistencia y estabilidad dimensional, y pueden plegarse y colapsar bajo el peso del material lfquido con el que se sumergen en el molde, antes de que este ultimo solidifique.

Sumario de la invencion

El objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo simple para la produccion de dispositivos microflmdicos tridimensionales monolfticos que supere los problemas de la tecnica anterior, asf como proporcionar los artfculos fabricados obtenidos por medio de dicho metodo.

Estos objetivos se consiguen segun la presente invencion que, en un primer aspecto de la misma, consiste en un metodo para la produccion de un dispositivo microflmdico tridimensional monolftico, tal como se define en reivindicacion 1.

Los terminos usados en la definicion de la invencion facilitados anteriormente, asf como en el resto del texto y en las reivindicaciones, deben entenderse en su sentido ordinario a menos que se especifique lo contrario. Definiciones espedficas de algunos de los terminos usados en la presente descripcion se facilitan a continuacion:

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- en la presente descripcion, con el proposito de brevedad, se hace referencia a un material sacrificial y a un precursor, pero mediante estas definiciones tambien se pretende hacer referencia a mezclas de materiales sacrificiales y materiales precursores;

- la estructura final del dispositivo, obtenida tras la retirada del material sacrificial, se indicara con “matriz”, y el material obtenido mediante la solidificacion del precursor (o una mezcla de precursores) se indicara como “material de la matriz”;

- “plantilla tridimensional de forma estable” significa una estructura que puede mantener su forma cuando se somete unicamente a la fuerza que consiste en su propio peso, en el aire o cuando se sumerge en el precursor lfquido o en la disolucion, pero deformable en consecuencia de la aplicacion de fuerzas mecanicas (por ejemplo traccion, compresion o torsion); para la brevedad, este elemento se denominara, en lo sucesivo, tambien simplemente plantilla.

Breve descripcion de los dibujos

La invencion se ilustrara en detalle a continuacion con referencia a los dibujos, en los que:

- las figuras 1a-f representan, en forma esquematica, la secuencia de etapas del metodo de la invencion dirigidas a la produccion de un primer dispositivo microflmdico;

- las figuras 2a-f, analogas a las figuras 1a-f, representan la secuencia de etapas para producir un segundo dispositivo microflmdico, con canales y micropocillos para cultivos celulares; y

- las figuras 3a-d ilustran imagenes de fluorescencia que muestran celulas vivas en un dispositivo vascularizado segun una realizacion preferida de la invencion y en un dispositivo analogo segun la tecnica anterior.

Descripcion detallada de la invencion

La plantilla usada para producir dispositivos microflmdicos segun la invencion puede producirse de una pieza pero, en particular para la implementacion de geometnas complejas, tambien puede derivar de la union de una pluralidad de partes; en el resto de la descripcion, se hace referencia predominantemente al caso de la plantilla de una sola pieza, pero todas las ensenanzas notificadas en lo sucesivo tambien son aplicables al caso en el que una pluralidad de estructuras 3D estan interconectadas para formar la plantilla final.

La primera etapa del metodo de la invencion consiste en obtener la plantilla, que puede estar hecha de cualquier material sacrificial que pueda disolverse facilmente con un disolvente o licuarse mediante tratamiento termico, sin que el disolvente o el tratamiento termico dane o altere el material de la matriz. El material sacrificial puede seleccionarse, por ejemplo, de ceras o, preferiblemente, polfmeros termoplasticos tales como poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(alcohol vimlico) (PVA), policarbonato (PC) y poliestireno (PS); dado que los polfmeros termoplasticos son los materiales preferidos para implementar la invencion, se hara referencia a los mismos en el resto de la descripcion, pero sigue entendiendose que la invencion tambien puede implementarse con materiales sacrificiales de otro tipo.

La etapa de producir la plantilla puede realizarse usando cualquier metodo conocido para elaborar piezas a partir de materiales termoplasticos. La plantilla se produce preferiblemente usando una tecnica seleccionada de colada, inyeccion en caliente en un molde, prensado en caliente, termoconformacion y corte por laser.

El metodo de colada consiste en verter en un molde abierto un polfmero, fundido o disuelto en un disolvente adecuado, o un precursor lfquido del mismo; dejar que el polfmero solidifique; y extraer la pieza formada del molde obteniendo una estructura tridimensional que es una replica de la cavidad del molde. En el caso de usar un polfmero, este se vierte generalmente en el molde en estado fundido, es decir se lleva hasta una temperatura mayor que el punto de fusion, se vierte en el molde y se permite que se enfna hasta una temperatura por debajo del punto de fusion; el polfmero es preferiblemente solido a temperatura ambiental, de modo que no son necesarios sistemas de enfriamiento para su solidificacion. En el caso en el que se use un precursor de polfmero, el precursor (por ejemplo, oligomeros del mismo) se vierte en el molde y su reticulacion se efectua mediante metodos conocidos, por ejemplo mediante calentamiento, mediante irradiacion con UV o con iniciadores de reaccion radicalarios. Con el fin de obtener estructuras tridimensionales de la forma deseada, la superficie superior del molde que contiene el polfmero fundido o su precursor puede “rebajarse” para retirar todo el polfmero o precursor en exceso; al final del proceso puede eliminarse cualquier rebaba (pelfculas delgadas de polfmero conectadas a la estructura deseada) mediante metodos mecanicos o mediante ataque qmmico (porque la tasa de ataque qmmico es constante en todas las partes, las mas delgadas se eliminan cuando la estructura principal de la plantilla esta todavfa esencialmente inalterada).

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En el metodo de inyeccion en caliente, el material termoplastico en estado fundido se fuerza a entrar a presion en la cavidad de un molde denominado “modelo”, que esta compuesto de dos o mas partes independientes sostenidas juntas mecanicamente durante la inyeccion, por ejemplo con tornillos, abrazaderas o similares. La posicion y las dimensiones de los canales o de los otros espacios vados en el modelo replican exactamente las del dispositivo microflmdico final o de una de sus partes. Las diversas partes del modelo pueden producirse usando metodos de microfabricacion conocidos, que permiten reproducir detalles del orden de 100 |im e incluso de tamano menor. Las partes individuales que constituyen el modelo tienen generalmente la forma de paralelepfpedos bajos, y se apilan colocando sus superficies mas grandes en contacto. Los canales y otros espacios vados del modelo pueden estar en la forma de rebajes de geometna apropiada en una de las superficies mas grandes de una o mas partes, de tal manera que una segunda parte de la que esta compuesto el modelo, unida a la que presentan los rebajes, define canales u otros espacios vados de forma generica. Las partes del modelo pueden presentar entonces canales en una direccion perpendicular a las superficies mas grandes de la parte; de esta manera se crean pasos de comunicacion entre diferentes niveles del conjunto de canales y espacios vados, o con el exterior del modelo. En el caso de modelos producidos a partir de una pluralidad de partes, los canales perpendiculares a las superficies mas grandes tambien pueden obtenerse dividiendo una o mas de estas partes en dos subpartes, presentando las ultimas dentro del modelo ensamblado a lo largo de dos caras perpendiculares a las superficies mas grandes y teniendo rebajes formados en al menos una de estas caras. Una vez que se ha ensamblado el modelo, el material sacrificial se inyecta en el interior del mismo a presion y en estado fundido; en estas condiciones, el polfmero termoplastico fundido ocupa todos los espacios vados dentro del modelo. Tras la solidificacion de la masa fundida, es posible desmontar el modelo y extraer una estructura 3D (es decir, la plantilla) de geometna equivalente a la red deseada de canales y espacios vados dentro del dispositivo microflmdico final. Alternativamente, tal como se dijo anteriormente, la estructura obtenida de esta manera puede ser equivalente a solo una parte de la plantilla deseada; en este caso, la plantilla completa se obtiene uniendo dos o mas estructuras 3D, por ejemplo haciendo que se adhieren mediante calentamiento.

Un ejemplo de aplicacion del metodo de inyeccion en caliente a la produccion de dos posibles estructuras 3D se muestra en las figuras 1.a, 1.b y 2.a, 2.b. La figura 1.a muestra dos partes 10 y 12 de forma paralelepipedica que estan previstas para combinarse entre sf para formar el modelo tal como se describio anteriormente; sobre una superficie de la parte 10, se forma una red de canales y cavidades interconectadas, indicada en general en los dibujos como elemento 11. La union de la parte 10 (en particular la superficie de la misma en la que esta presente la red de canales 11) con la parte 12 forma el modelo 13, mostrado en la figura 1.b; el modelo tiene dos aberturas 14 (solo uno visible en los dibujos) al nivel del extremo de la red de canales 11. De manera analoga, la figura 2.a muestra las partes 20 y 22 (teniendo la primera una red de canales y cavidades 21 que es mas compleja y articulada que la red 11), que forman el modelo 23 con aberturas 24 de la figura 2.b.

Una plantilla hecha de un material termoplastico tambien puede obtenerse mediante prensado en caliente (un metodo conocido mejor en el sector como “estampado en caliente”, termino que se usara mas adelante). Este metodo consiste en disponer una hoja de un material termoplastico sobre una superficie de una parte de un molde que puede ser completamente plana o tener un grupo de rebajes que se corresponden con la estructura deseada; llevar el polfmero termoplastico hasta una temperatura dentro del intervalo entre la de transicion vftrea (Tg) y la de fusion del propio polfmero, haciendo que se ablande; y apretar la otra parte del molde contra el polfmero ablandado. En el caso de que la primera parte ya tenga rebajes, la segunda, que se presiona sobre la masa fundida, puede ser plana o a su vez tener rebajes. Tras el prensado, se permite que el material termoplastico se enfna hasta por debajo de su Tg, se separan las dos partes del molde, y entonces es posible extraer la plantilla del molde. En este caso, las estructuras obtenidas se extienden principalmente en dos direcciones (correspondientes a los planos que entran en contacto en el molde cerrado), con la posibilidad de tener partes que discurren en la tercera dimension, perpendicular a las dos primeras, derivada de perforaciones que atraviesan y son perpendiculares a las superficies mas grandes de las dos partes del molde. Cualquier “rebaba” de prensado puede eliminarse de manera simple mediante un procedimiento de ataque qmmico o ffsico (metodos conocidos genericamente por el nombre de “ataque”).

La plantilla tambien puede obtenerse por medio del proceso de moldeo por compresion e inyeccion, que combina las ventajas de la fase de inyeccion y de la posterior fase de compresion, eliminando las desventajas debidas a los largos trayectos recorridos por el material termoplastico en el molde. En una primera fase, se inyecta un volumen de polfmero disuelto, correspondiente al volumen de la parte que debe prensarse, en el molde que permanece parcialmente abierto. Gracias al mayor espacio entre las partes del punzon, la inyeccion se realiza a baja presion, reduciendo asf la velocidad y la fuerza de corte del polfmero. Tras la fase de inyeccion, las dos partes del punzon se unen entre sf durante la fase de compresion. Esta fase se subdivide a su vez en un movimiento de velocidad controlada y finalmente, si se alcanza la potencia de compresion deseada, en un mantenimiento de la presion final a una fuerza controlada durante el periodo de enfriamiento.

Otro metodo posible para producir la plantilla es corte por laser. En este caso se proporciona una hoja del material sacrificial polimerico y se corta con el laser para obtener una estructura bidimensional de la forma deseada.

La plantilla de material sacrificial tambien puede producirse mediante otros metodos conocidos, por ejemplo mediante termoconformado, tal como resultara evidente para los expertos en el campo.

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En el caso de plantillas sacrificiales obtenidas mediante estampado en caliente o corte por laser, puede obtenerse una estructura 3D compleja uniendo simplemente (por ejemplo, mediante fusion localizada) dos o mas estructuras primarias, tal como se describe en relacion con la inyeccion en caliente. Alternativamente, es posible deformar estructuras sacrificiales sustancialmente bidimensionales (2D) aprovechando la elasticidad de materiales termoplasticos para conseguir un desarrollo 3D de la estructura; este ultimo metodo tambien puede usarse junto con el de unir una pluralidad de estructuras sustancialmente 2D inicialmente.

En una variante del metodo invencion, la plantilla puede estar cubierta completa o parcialmente con un material que tiene una funcionalidad deseada (siempre que dicho material pueda resistir los posteriores tratamientos de produccion del dispositivo microflmdico). Por ejemplo, es posible cubrir la superficie de la plantilla con un polvo metalico, sumergiendolo en polvos metalicos calientes, que provocan la fusion localizada del material termoplastico y la incorporacion de una capa de polvo sobre la superficie del mismo tras el enfriamiento. Alternativamente, es posible implantar partfculas sobre superficies de la plantilla segun las tecnicas descritas en los artfculos “Micro- and nanoscale modification of poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels by AFM lithography and nanoparticle incorporation”, A. Podedsta et al, Journal of Nanoscience of Nanotechnology, 5(3), 425-430, 2005, y “Poly(methyl methacrylate)-palladium clusters nanocomposite formation by supersonic cluster beam deposition: a method for microstructured metallization of polymer surfaces”, L. Ravagnan et al., Journal of Physics D: Applied Physics, 42(8), 082002/1-082002/5, 2009. El primero describe la produccion de un “lecho” de nanopartfculas de carbono sobre la superficie interna del molde en el que se vierten entonces los precursores del polfmero estudiado; se incorporan partfculas de carbono en las capas superficiales del polfmero durante la reticulacion del mismo; el segundo describe la aplicacion de un metodo para obtener depositos de nanopartfculas metalicas (paladio en el caso del artfculo) en un polfmero ngido.

La plantilla obtenida segun uno cualquier de los metodos descritos anteriormente tiene dimensiones mayores que la red de canales que se desea dentro del dispositivo microflmdico final. En particular, la plantilla estara compuesta de una parte principal de dimensiones mayores, A, correspondiente a los canales del dispositivo microflmdico final y una o mas partes, B, B', ... que no tienen correspondencia en dichos canales. Este estado se ilustra en las figuras 1.c y 2.c con referencia a las dos plantillas tridimensionales de forma estable, 15 y 25, que se obtienen a traves del uso de los modelos 13 y 23 descritos anteriormente, pero obviamente tambien se requiere el mismo estado segun la invencion para plantillas de otras formas 3D, o tambien obtenidas con cualquiera de los otros metodos mencionados anteriormente (no necesariamente recurriendo al modelo). En las figuras 1.c y 2.c, las partes B y B' (mostradas por separado de las partes A de plantillas 15 y 25 por medio de lmeas discontinuas) son extremos de la plantilla que se usan en el procedimiento de produccion del dispositivo microflmdico para mantener la propia plantilla en la posicion deseada dentro del molde en el que se insertara el precursor de la matriz.

La plantilla asf obtenida se inserta entonces en un molde La plantilla se sostiene lateralmente por medio de las partes B y B'. La figura 1.d muestra la manera de usar la plantilla 15. El molde, 16, tiene una cavidad principal 17 y dos ranuras 18 y 18', cuya profundidad es menor que la de la cavidad; los extremos B y B' de la plantilla 15 estan soportados en estas ranuras, permitiendo que la plantilla se mantenga en la posicion deseada separada del fondo de la cavidad 17. De manera analoga, la figura 2.d muestra un molde 26 que tiene una cavidad 27 y las ranuras 28 y 28' en las que se insertan las partes B y B' de la plantilla 25, manteniendola separada del fondo de la cavidad 27.

En la cavidad (17 o 27) del molde se vierte entonces un precursor, lfquido o en disolucion, de una matriz solida, para cubrir completamente la plantilla contenida en la cavidad, tal como se muestra en las figuras 1.e y 2.e; en la figura 1.e, el precursor se vierte hasta el nivel mostrado mediante la lmea continua, y no llena completamente la cavidad 17, mientras que en la figura 2.e, el precursor llena completamente la cavidad 27.

Para evitar que el precursor lfquido (o la disolucion que lo contiene) tambien llene la parte de las ranuras 18, 18' y 28, 28' no ocupada por las partes B y B' de la plantilla, es posible introducir elementos (no mostrados en las figuras y hechos generalmente del mismo material que el molde) en las ranuras, elementos que tienen una anchura igual a la de dichas ranuras, puestos en contacto con las partes B y B' y en posiciones tales como para cerrar la entrada a las ranuras por encima de las partes B y B'. Alternativamente, puede dejarse que el precursor tambien ocupe las ranuras, y eliminar (por ejemplo, mediante corte) las partes correspondientes del dispositivo microflmdico final. Aunque se muestra el caso de solo dos partes B y B' en los dibujos, que estan soportadas en dos unicas ranuras dentro del molde, ranuras que estan situadas al mismo nivel, segun la invencion la plantilla puede tener una pluralidad de partes de tipo B y B', que resultan a diferentes alturas cuando la plantilla se inserta en la cavidad del molde dando lugar asf a una pluralidad de puntos de entrada, a diversas alturas, de los canales del dispositivo microflmdico final.

El material sacrificial y el precursor tienen que seleccionarse para satisfacer varias condiciones durante las etapas de llevar a cabo el metodo.

El precursor tiene que poder solidificar por medio de reaccion qmmica o transformacion ffsica, y dicha reaccion o transformacion tiene que conllevar el uso de compuestos qmmicos, la adopcion de estados ffsicos, y etapas operativas, de modo que la plantilla permanezca sustancialmente inalterada, o al menos mantenga su continuidad,

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durante el tiempo necesario para la solidificacion del precursor; la definicion “mantener la continuidad” referida a la plantilla indica que, incluso si esta puede estar parcialmente disuelta en su superficie, la disolucion tiene que ser de poca entidad, y de modo que la continuidad de la plantilla no se interrumpa en ningun punto.

Este estado puede alcanzarse de la manera mas simple seleccionando como precursor un compuesto qmmico lfquido en el que el material sacrificial de la plantilla sea insoluble; o, en el caso en el que el precursor se use en disolucion, el material sacrificial tiene que ser insoluble en el disolvente.

Tambien es posible que el material sacrificial sea ligeramente soluble en el precursor (lfquido) o en el disolvente del mismo (si se usa en disolucion). En este caso es necesario que la solubilidad del material sacrificial en el precursor o en el disolvente sea suficientemente baja como para hacer posible que la plantilla siga siendo continua durante todo el tiempo necesario para la solidificacion del precursor, de modo que en ningun punto el material de la matriz pase a bloquear un canal o una cavidad deseada en la red de canales del dispositivo final.

A su vez, el material de la matriz (cuya eleccion depende de la eleccion de precursor) tiene que ser insoluble en el disolvente del material sacrificial, en el caso de que la eliminacion del mismo suceda mediante medios qmmicos, o inalterable a la temperatura de fusion del material sacrificial en el caso de que este se elimine mediante tratamiento termico. En particular, si el metodo seleccionado para la eliminacion del material sacrificial es la fusion, el material de la matriz tiene que tener una temperatura de fusion, y preferiblemente tambien una Tg, mayor que la temperatura de fusion del material sacrificial.

En el caso de que se desee aumentar la incompatibilidad qmmica del material de la plantilla con la de la matriz, para mejorar la capacidad de replicacion de la geometna de dicha plantilla en los canales de la matriz final, tambien es posible - antes de verter el precursor (o una disolucion del mismo) en el molde - para cubrir la plantilla con un agente qmmico adecuado; por ejemplo, si el material de la matriz consiste en hidrogel de polietilenglicol (PEG), la superficie de la plantilla puede cubrirse con una capa delgada de un aceite de silicio.

Ya sea lfquido o este en disolucion, el precursor puede estar compuesto de monomeros u oligomeros de un polfmero, que se hacen polimerizar in situ (por ejemplo, desencadenando la polimerizacion con iniciadores radicalarios, irradiando con lugar de una longitud de onda adecuada, normalmente dentro del rango UV o, de nuevo, termicamente). En general, el material de la matriz puede ser cualquier polfmero reticulado o no reticulado, y mas generalmente cualquier material que pueda solidificar partiendo de un precursor lfquido, siempre que, una vez solido, sea compatible con la eliminacion del material sacrificial.

Entre los posibles materiales de matriz, el preferido para diversas aplicaciones es polidimetilsiloxano (PDMS) debido a la facilidad de su produccion y uso, porque es transparente, permeable a los gases y flexible.

Otro material adecuado para la produccion de la matriz del dispositivo es poliestireno (PS), usado ampliamente en aplicaciones biomedicas y cultivo de celulas debido al bajo coste de produccion, no toxicidad y transparencia excelente.

En una variante de interes particular, el material de la matriz se produce a partir de una disolucion que contiene especies que polimerizan para formar hidrogeles, produciendo un dispositivo final, cuya matriz contiene dosis altas (normalmente de aproximadamente el 2% al 99% en peso) de agua; un dispositivo microflmdico de este diseno normalmente es especialmente adecuado para la produccion de estructuras basicas para su uso en implantes en el cuerpo humano (o animal).

En particular, estos materiales consisten en polfmeros reticulados insolubles en agua que atrapan ffsicamente cantidades elevadas de agua, incluso hasta el 99% en peso; ejemplos tfpicos de polfmeros que pueden formar hidrogeles son las poliamidoaminas y poli(metacrilato de hidroxietilo) (PHEMa). Tambien es posible usar polfmeros solubles que sean insolubles una vez reticulados; ejemplos de estos polfmeros son poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAAM), polietilenglicol (PEG), policaprolactona (PCL), colageno, agarosa, quitosano y alginato.

Pares de material sacrificial/material de matriz tfpicos en el caso de la eliminacion del primero mediante fusion son PMMA/PDMS y PS/resinas epoxi; cuando la eliminacion del material sacrificial es mediante disolvente, pares tfpicos son PMMA-PDMS (disolventes: acetona, acido acetico), PMMA-PHEMA (disolventes: acetona, acido acetico), PVA- PHEMA (disolvente: agua), PVA-PDMS (disolvente: agua), PVA-PS (disolvente: agua), PVA-PEG (disolvente: agua), PS-colageno (disolvente: acetona), PMMA-quitosano (disolvente: acetona) y PMMA-PCL (disolvente: acetona).

Entonces se permite que el precursor solidifique, y el cuerpo solido obtenido se retira del molde.

Finalmente, el conjunto que consiste en el cuerpo solido asf obtenido, que todavfa contiene la plantilla, se somete a un tratamiento de eliminacion selectiva de la ultima. En el caso de eliminacion mediante tratamiento termico, dicho conjunto se lleva hasta una temperatura mayor que el punto de fusion del material sacrificial, pero menor que la del material del cuerpo del dispositivo (y preferiblemente menor que la Tg del ultimo). Alternativamente, dicho conjunto se inserta en un recipiente (comunmente de dimensiones mayores que el molde en el que se ha formado), en el que

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se introduce un disolvente del material sacrificial, hasta la disolucion total del ultimo. En ambos casos se obtiene un cuerpo solido que contiene una red tridimensional de canales y otros espacios vados, segun el diseno deseado. Las figuras 1.f y 2.f muestran los dos dispositivos microflmdicos obtenidos, 19 y 29, mediante la secuencia de etapas del metodo en el caso de usar las plantillas tridimensionales 15 y 25 respectivamente; los dispositivos mostrados son transparentes para hacer evidente la red tridimensional de canales internos.

En el caso en el que la superficie de la plantilla tridimensional sacrificial se ha cubierto (incluso solo parcialmente) con un material funcional (por ejemplo partfculas metalicas) antes de la inmersion en el precursor lfquido, dicho material funcional sigue estando adherente o parcialmente consolidado en el material de la matriz durante su formacion; tras la disolucion y la eliminacion de la plantilla, el material funcional se transfiere asf a la superficie interna de los canales o de los otros espacios vados del dispositivo. Ejemplos de materiales que pueden transferirse de esta manera a las superficies internas de los canales son protemas y nanopartfculas metalicas.

El metodo de la presente invencion tambien permite la produccion de estructuras basicas vascularizadas que presentan una mejor supervivencia de las celulas contenidas en las mismas. Las estructuras basicas de este tipo tambien pueden usarse para numerosas aplicaciones de cultivo de celulas, por ejemplo para la produccion de productos biofarmaceuticos in vitro y/o para la seleccion de productos farmaceuticos o terapias in vitro, o para la produccion de implantes y protesis para aplicaciones quirurgicas. En el caso de implantes y protesis quirurgicas, estas estructuras basicas constituyen un soporte, permanente o temporal, para la colonizacion mediante las celulas del cuerpo; en el caso de implantes permanentes, la colonizacion de las superficies de la estructura basica permite la integracion y la compatibilidad con los tejidos del cuerpo, mientras que, en el caso de implantes temporales, las estructuras basicas tienen que ofrecer un soporte provisional a las celulas del tejido, y entonces degradarse mediante los fluidos corporales en el plazo de tiempos compatibles con aquellos del nuevo crecimiento de celulas, o metabolizarse mediante las mismas celulas en la fase de crecimiento. Como es sabido, estos sistemas presentan canalizaciones, no necesariamente ordenadas o de geometna regular, que tienen el proposito de posibilitar el transporte de fluidos corporales que portan oxfgeno y elementos nutritivos a las celulas. Un problema de los sistemas vascularizados de la tecnica conocida es que el transporte de fluidos dentro de los materiales de los que estan compuestos dichos sistemas es diffcil. La consecuencia es que, aunque las celulas presentes en las superficies de la estructura basica, incluyendo aquellas de los canales internos, tienen tiempos de supervivencia adecuados, las celulas mas distantes de dichas superficies tienen tiempos de supervivencia que son demasiado cortos y no permiten tasas de reproduccion de celulas y por tanto de regeneracion tisular compatible con los objetivos indicados anteriormente.

La solicitud de patente WO 2010/009320 A1, analizada previamente, aborda el problema y ofrece un medio de formacion de estructuras basicas con vascularizaciones principales de seccion transversal relativamente grande, rodeadas por una red difusa de microcanales dentro de las estructuras basicas; sin embargo, la solucion propuesta por este documento tiene las desventajas descritas anteriormente, que es relativamente compleja de producir y que no puede garantizarse que los filamentos de materiales sacrificiales, destinados a formar los microcanales, no colapsen bajo el peso del precursor lfquido de la matriz de estructura basica.

El metodo de la presente invencion, en una variante, permite superar los problemas de la tecnica anterior.

Segun este metodo, se repiten las etapas de proceso descritas anteriormente, con la unica diferencia de que se introducen materiales porogenicos en el precursor lfquido (o que contiene los precursores) de la matriz de estructura basica.

Estos materiales porogenicos pueden ser polvos de un material sacrificial, que puede ser el mismo o diferente del usado para formar la plantilla. Otros materiales porogenicos que pueden usarse son aquellos que desprenderan gas en disolucion (por ejemplo NaHCOa), o tensioactivos o materiales similares que dan lugar a emulsiones o espumas, con la solidificacion consecuente del precursor en la forma de una espuma.

Ademas de los canales principales obtenidos mediante la eliminacion de la plantilla, la matriz de estructura basica asf producida tiene una estructura de aberturas secundaria compuesta de poros interconectados. Esta estructura secundaria se llena de celulas por medio de inyeccion en la matriz o siembra a traves de los canales. Las celulas colonizan de manera homogenea la estructura basica gracias a la posibilidad de migrar a traves de las interconexiones entre poros. Estas celulas son preferiblemente autologas, es decir, recogidas del mismo individuo en el que debe implantarse la estructura basica o el tejido que vuelve a crecer a partir de la misma, evitando asf problemas de rechazo. Para producir la matriz, se usan preferiblemente materiales que se degradan completamente una vez insertados en el cuerpo del paciente (humano o animal), sin generar efectos inflamatorios. Ejemplos de estos materiales son PCL, colageno y quitosano.

En una variante de produccion de estos dispositivos, las celulas pueden insertarse directamente en el precursor lfquido de un hidrogel antes de o durante la encapsulacion de la plantilla y de posibles porogenos; los hidrogeles que contienen celulas vivas se denominan en el campo mediante la definicion “cargados con celulas”. El material sacrificial (de la plantilla y de cualquier porogeno) se elimina entonces con disolventes compatibles con las celulas,

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en general soluciones salinas. En este caso se obtiene un hidrogel cargado con celulas con canales microflmdicos y posiblemente porosidad.

La invencion se ilustrara adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos.

Se usaron los siguientes materiales cuando se llevaron a cabo las pruebas notificadas en los ejemplos:

- poli(metacrilato de metilo) (PMMA), 445746-1KG (Sigma-Aldrich)

- poli(alcohol vimlico) (Mowiol), Mowiol 4-88 (Sigma-Aldrich)

- poli(alcohol vimlico) (PVA), Mowiflex TC253 (Kuraray)

- polidimetilsiloxano (PDMS), Silgard 184 (Dow Corning)

- metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), codigo 128635 (Sigma-Aldrich)

- dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA), codigo 335681 (Sigma-Aldrich)

- N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED), codigo T22500 (Sigma-Aldrich)

- persulfato de amonio (APS), codigo A3426 (Sigma-Aldrich)

- etanol, codigo 51976 (Sigma-Aldrich)

- aceite de ricino, codigo 259853 (Sigma-Aldrich)

- diacrilato de polietilenglicol MW6000 (PEGDA), codigo 701963 (Sigma-Aldrich)

- dimetilsulfoxido (DMSO), codigo 472301 (Sigma-Aldrich)

- aditivo fotoiniciador Irgacure 2959 (CIBA)

- producto de desmoldeo Nano HS (BPItech)

- pulverizacion de silicona ALS (AMSOIL)

- cloruro de sodio, codigo 71376 (Sigma-Aldrich)

- medio de cultivo DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco), codigo D5546 (Sigma-Aldrich)

-tampon fosfato salino (PBS), codigo P5493 (Sigma-Aldrich)

- acriloil-polietilenglicol-RGDS (APEG-RGDS), sintetizado tal como se describe en el artfculo “Smooth muscle cell growth in photopolimerized hydrogels with cell adhesive and proteolytically degradable domains: the fourth of synthetic ECM analogs for tissue engineering”, B. K. Mann et al, Biomaterials (2001) vol. 22, paginas 3045-51

- kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD®, para celulas de mairnfero, codigo L-3224 (Invitrogen).

EJEMPLO 1

Este ejemplo se refiere a la produccion de un dispositivo a base de elastomero que tiene canales y micropocillos internos de 500 |im para aplicaciones biologicas, usando el metodo con modelo descrito con referencia a la figura 1.

Produccion de la plantilla: en un modelo de aluminio (modelo 13, figura 1.b) pretratado con Nano HS y calentado hasta 140°C, se inyecta PVA fundido a 190°C a traves de la abertura lateral 14, hasta que los espacios internos estan completamente llenos. El modelo se enfna entonces hasta temperatura ambiental, las dos partes componentes se separan y la plantilla de PVA 15 asf formada se retira mecanicamente.

Produccion de la matriz a base de PDMS: el precursor de PDMS lfquido Silgard 184 (13,5 g) y el agente reticulante relevante (1,5 g) (incluido en el paquete de venta de Silgard 184) se introducen, por orden, en un vaso de precipitados de 250 ml, y se mezclan manualmente usando una varilla de vidrio durante aproximadamente 1 minuto. La mezcla se coloca entonces en una camara a presion reducida (10 mbar) durante 60 minutos para eliminar las burbujas presentes en el lfquido, tras lo cual la mezcla se vierte en el molde de PMMA 16 que contiene la plantilla 15; la plantilla se suspende en el molde no en contacto con el suelo de la cavidad 17, por medio de sus dos extremos insertados en las ranuras 18 y 18'. El molde se sella entonces para impedir el escape de lfquido y se

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permite que tenga lugar la reaccion a temperatura ambiental durante 48 horas (alternativamente, es posible un funcionamiento a 60°C durante 6 horas). El molde se abre entonces y se retira el bloque de PDMS solido.

Eliminacion de la plantilla: el bloque de PDMS que contiene la plantilla se sumerge en agua bidestilada mientras se mantiene el conjunto con agitacion magnetica durante 24 horas a 90°C. De esta manera, la plantilla se solubiliza en agua sin dejar trazas en la matriz de PDMS. Al final de este procedimiento, el dispositivo 19 con canalizaciones y micropocillos esta listo para su uso.

EJEMPLO 2

Este ejemplo se refiere a la produccion de un dispositivo a base de elastomero que tiene canales y micropocillos internos de 500 |im para aplicaciones biologicas, y es una variante del ejemplo 1.

Produccion de la plantilla: sobre una parte microfabricada del tipo 10 mostrada en la figura 1.a, situada dentro de un molde y pretratada con Nano HS y calentada hasta 50°C, se vierte una disolucion acuosa de Mowiol (50/50 en peso) calentada hasta 70°C, depositando una pelfcula de aproximadamente 1-3 mm sobre toda la superficie del molde (pieza colada). El molde se enfna entonces hasta temperatura ambiental y se permite que el disolvente se evapore durante 24 horas bajo una corriente de aire. Por medio de un proceso de ataque (usando un trapo empapado en agua y etanol), la capa de Mowiol se lleva a una alineacion perfecta con el lfmite superior de las cavidades que resultan de las microfabricaciones. Tras colocar el molde en una camara de presion reducida (10 mbar) 4 horas, se elimina la plantilla de Mowiol asf moldeada.

Produccion de la matriz a base de PDMS: el precursor de PDMS lfquido Silgard 184 (13,5 g) y el agente reticulante relevante (1,5 g) (incluido en el paquete de venta de Silgard 184) se introducen, por orden, en un vaso de precipitados de 250 ml, y se mezclan manualmente usando una varilla de vidrio durante aproximadamente 1 minuto. La mezcla se coloca entonces en una camara de presion reducida (10 mbar) durante 60 minutos para eliminar las burbujas presentes en el lfquido, tras lo cual la mezcla se vierte en el molde de PMMA 16 que contiene la estructura sacrificial de Mowiol soportada por las dos partes B y B' en las ranuras 18 y 18'. El molde se sella entonces para impedir el escape de lfquido y se permite que tenga lugar la reaccion a temperatura ambiental durante 48 horas (alternativamente, a 60°C durante 6 horas). El molde se abre entonces y se retira el bloque de PDMS solido.

Eliminacion de la plantilla: el bloque de PDMS que contiene la plantilla de Mowiol se sumerge en agua bidestilada manteniendo el conjunto con agitacion magnetica durante 24 horas a 90°C, cambiando la disolucion cada 8 horas. De esta manera, la plantilla se solubiliza en agua no dejando ninguna traza en la matriz de PDMS. Al final de este procedimiento, el dispositivo 19 con canalizaciones y micropocillos esta listo para su uso.

EJEMPLO 3

Este ejemplo se refiere a la produccion de un dispositivo a base de hidrogel que tiene canalizaciones y micropocillos internos de 500 |im para aplicaciones biologicas.

Produccion de la plantilla: procedimiento como en el ejemplo 1, siendo la unica diferencia que el modelo 13 se calienta hasta 120°C, y, en lugar de PVA, se inyecta PmMa fundido en el modelo a 170°C.

Produccion de la matriz a base de hidrogel de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (PHEMA): se introducen HEMA (6,00 g, 46,1 mmol), agua (3 ml), EGDMA (60,0 mg, 0,303 mmol) y TEMED (81,4 mg, 0,701 mmol), por orden, en un matraz de 50 ml, mezclando durante 30 s con un agitador magnetico tras la adicion de cada componente. Se anade entonces una disolucion acuosa del 10% en peso de APS (75,0 |il, 0,0322 mmol), se agita a mano durante 30 s, entonces la mezcla se vierte en el molde de PMMA (16) que contiene la estructura sacrificial. El molde se sella entonces para impedir la evaporacion de los componentes lfquidos y se permite que la mezcla reaccione durante 24 horas a temperatura ambiental. El molde se desmonta entonces, el hidrogel moldeado que contiene la plantilla se retira y se sumerge en una disolucion acuosa de etanol (50% v/v, 30 ml), cambiando la disolucion cada 4 horas tres veces seguidas.

Eliminacion de la estructura sacrificial: el hidrogel del PHEMA que contiene la estructura sacrificial de PMMA se sumerge en acetona, con agitacion magnetica durante 48 horas a 50°C, cambiando la disolucion cada 12 horas. De esta manera, la plantilla de PMMA se solubiliza no dejando ninguna traza en el hidrogel. Posteriormente, el hidrogel se sumerge en una disolucion de etanol durante 4 horas y entonces, durante el mismo tiempo, en una disolucion acuosa de etanol (50% v/v, 30 ml), despues se realiza un lavado en agua bidestilada (50 ml), cambiando la disolucion cada 4 horas tres veces seguidas. Al final de este procedimiento, el dispositivo con canalizacion y micropocillos 19 esta listo para su uso.

EJEMPLO 4

Este ejemplo se refiere a la produccion de un dispositivo a base de hidrogel que tiene canalizaciones y micropocillos internos de 500 |im para aplicaciones biologicas, y es una variante del ejemplo 3.

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Produccion de la estructura sacrificial: el modelo de aluminio de tipo 13 pretratado con Nano HS se deja parcialmente abierto y se calienta hasta 120°C. En el espacio que se deja entre las dos partes (10 y 12) del molde se inyecta PMMA fundido a 170°C. Tras esta fase de inyeccion, las dos partes del molde se unen por medio de una prensa usando una fuerza de compresion de 10.000 kg. Cuando se alcanza la fuerza de compresion deseada, empieza la fase de mantenimiento, con fuerza controlada de la presion final hasta el enfriamiento completo del molde. Al final del proceso descrito, las dos partes que constituyen el molde se separan y la plantilla de PMMA 15 formada se retira mecanicamente.

Produccion de la matriz a base de hidrogel de poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (PHEMA): se introducen HEMA (6,00 g, 46,1 mmol), agua (3 ml), EGDMA (60,0 mg, 0,303 mmol) y TEMED (81,4 mg, 0,701 mmol), por orden, en un matraz de 50 ml, mezclando durante 30 s con un agitador magnetico tras la adicion de cada componente. Entonces se anade una disolucion acuosa del 10% en peso de APS (75,0 |il, 0,0322 mmol), se agita a mano durante 30 s, entonces la mezcla se vierte en el molde de PMMA (16) que contiene la plantilla. El molde se sella para impedir la evaporacion de los componentes lfquidos y se permite que la mezcla reaccione durante 24 horas a temperatura ambiental. El molde se desmonta entonces, el hidrogel moldeado que contiene la estructura sacrificial se retira y se sumerge en una disolucion acuosa de etanol (50% v/v, 30 ml), cambiando la disolucion cada 4 horas tres veces seguidas.

Eliminacion de la plantilla: el hidrogel de PHEMA que contiene la estructura sacrificial de PMMA se sumerge en acetona, con agitacion magnetica durante 48 horas a 50°C, cambiando la disolucion cada 12 horas. De esta manera, la plantilla de PMMA se solubiliza no dejando ninguna traza sobre el hidrogel. Posteriormente, el hidrogel se sumerge en una disolucion de etanol durante 4 horas y entonces en una disolucion acuosa de etanol (50%, v/v, 30 ml) durante el mismo tiempo, despues se realiza un lavado en agua bidestilada (50 ml), cambiando la disolucion cada 4 horas tres veces seguidas. Al final de este procedimiento, el dispositivo 19 con canalizaciones y micropocillos esta listo para su uso.

EJEMPLO 5

Este ejemplo se refiere a la produccion de una estructura basica porosa y vascularizada a base de hidrogel, para aplicaciones en ingeniena tisular.

Produccion de la plantilla de tamano mmimo de 200 |im: en un modelo de aluminio de tipo 23, mostrado en la figura 2.b, pretratado con Nano HS y calentado hasta 120°C, se inyecta PMMA fundido a 170°C a traves de la abertura lateral 24, hasta que los espacios internos estan completamente llenos. El modelo se enfna entonces hasta temperatura ambiental, las dos partes componente se separan y la estructura de PMMA asf moldeada se retira mecanicamente.

Produccion de la matriz a base de hidrogel de polietilenglicol (PEG): se introducen PEGDA 6000 (6,500 mg, 1,08 mmol), una disolucion saturada de cloruro de sodio (7,2 ml), una disolucion de Irgacure 2959 en etanol (450 |il, 100 mg de Irgacure/ml de etanol), polvo de cloruro de sodio con funcion porogenica (3.500 mg, 59,89 mmol), por orden, en un matraz de 50 ml y se mezclan con un agitador magnetico durante 10 minutos. La mezcla se vierte en el molde de PMMA 26 que contiene la plantilla de PMMA (figura 2.e), el molde se sella entonces para impedir la evaporacion de los componentes lfquidos y se permite que la mezcla reaccione durante 10 minutos bajo irradiacion UV (365 nm, bombilla de vapor de mercurio de 120 W, distancia 20 cm) a temperatura ambiental. El molde se desmonta entonces, el hidrogel moldeado que contiene la plantilla se retira y se sumerge en una disolucion acuosa de etanol (50% v/v, 30 ml), cambiando la disolucion cada 4 horas tres veces seguidas.

Eliminacion de la plantilla y porogeno: el hidrogel que contiene la estructura sacrificial de PMMA se sumerge en acetona, con agitacion magnetica durante 48 horas a 50°C, cambiando la disolucion cada 12 horas. De esta manera, la estructura sacrificial de PMMA se solubiliza no dejando ninguna traza sobre el hidrogel.

Posteriormente, el hidrogel se sumerge en una disolucion de etanol durante 4 horas y entonces en una disolucion acuosa de etanol (50%, v/v, 30 ml) durante el mismo tiempo, despues se realiza un lavado en agua bidestilada (50 ml) a 50°C durante 72 horas, cambiando la disolucion cada 12 horas seis veces seguidas. El lavado en agua permite que las partfculas de sal incluidas en la matriz se solubilicen, dejando la estructura porosa en su sitio. Finalmente, el hidrogel se sumerge en primer lugar en una solucion salina (PBS, 30 ml) durante 4 horas y entonces en el medio de cultivo (DMEM 1640, 30 ml) durante 4 horas. Al final de este procedimiento, la estructura basica porosa y vascularizada 29 esta lista para su uso con las celulas.

EJEMPLO 6

Este ejemplo se refiere a la produccion de una estructura basica vascularizada a base de hidrogel de polietilenglicol (PEG) cargado con celulas para aplicaciones de ingeniena tisular.

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Produccion de la plantilla: en un modelo de aluminio de tipo 23, mostrado en la figura 2.b, pretratado con Nano HS y calentado hasta 140°C, se inyecta PVA fundido a 190°C a traves de la abertura lateral 24, hasta que los espacios internos estan completamente llenos. El modelo se enfna entonces hasta temperatura ambiental, las dos partes que constituyen el molde se separan y la plantilla de PVA asf formada se retira mecanicamente. En este caso, la superficie de la plantilla se trata con pulverizacion de silicio ALS para convertirla en hidrofoba.

Produccion de la matriz a base de hidrogel de polietilenglicol (PEG): se introducen PEGDA (1.500 mg, 0,250 mmol), APEG-RGDS (164 mg, 0,0450 mmol), una disolucion de PBS (13,5 ml, pH 7,4) con fibroblastos 3T3 en suspension (106 celulas/ml), una disolucion de Irgacure 2959 en DMSO (300 |il, 200 mg de Irgacure/ml de DMSO), por orden, en un matraz de 50 ml, y se mezclan con un agitador magnetico durante 2 min. La mezcla se vierte en el molde de PMMA 26 que contiene la plantilla de PVA (figura 2.e). El molde se sella para impedir la evaporacion de los componentes lfquidos y se permite que la mezcla reaccione durante 3 minutos bajo irradiacion UV (365 nm, bombilla de vapor de mercurio de l20 W, distancia 20 cm) a temperatura ambiental. La alta concentracion de solutos en la mezcla acuosa y el recubrimiento hidrofobo no permite que el PVA se disuelva durante la polimerizacion de la matriz a base de hidrogel. El molde se desmonta entonces y el hidrogel moldeado que contiene la plantilla se retira.

Eliminacion de la plantilla: el hidrogel se sumerge en una solucion salina (PBS, 30 ml) durante 2 horas, y entonces en el medio de cultivo (DMEM 1640, 30 ml) durante 8 horas, permitiendo la solubilizacion completa de la plantilla de PVA. Al final de este procedimiento, la estructura basica porosa y vascularizada 29 con celulas precargadas esta lista para su uso.

EJEMPLO 7

Se repite el ejemplo 2, usando una disolucion de aceite de ricino en etanol (3 ml, 200 mg de aceite de ricino/ml) en lugar de Nano HS para pretratar el molde; los resultados obtenidos son los mismos que los del ejemplo 2.

EJEMPLO 8

Este ejemplo demuestra la capacidad de una estructura basica vascularizada de la invencion para mantener vivas las celulas contenidas en la misma.

Las estructuras basicas producidas en el ejemplo 6 estan conectadas a una bomba de jeringa y se alimentan durante tres dfas con medio de cultivo DMEM para celulas a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Durante la prueba, la estructura basica se mantiene en una incubadora a 37°C y el 5% de CO2, dentro de un recipiente esterilizado. Al final de la prueba, se corta una rodaja de estructura basica de 1 mm de grosor y perpendicular al canal al que se conecto la jeringa, usando un bistun quirurgico; la rodaja se somete a una prueba de fluorescencia que detecta las celulas vivas por medio del metodo LIVE/DEAD usando el kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD®. Los resultados de la prueba se muestran en la parte superior de la figura 3, que muestra la estructura basica al inicio (imagen 3.a) y al final (imagen 3.b) de la misma prueba, tras 72 horas; la lmea discontinua circular indica la posicion del canal microflmdico.

EJEMPLO 9 (COMPARATIVO)

La prueba en el ejemplo 8 se repite con una estructura basica no segun la invencion, producida en particular mediante el mismo metodo que en el ejemplo 6, excepto por la insercion de la plantilla sacrificial, y por tanto sin la canalizacion microflmdica. La parte inferior de la figura 3 muestra la estructura basica al inicio (imagen 3.c) y al final (imagen 3.d) de esta prueba.

Como puede observarse a partir de la comparacion de las imagenes 3.b y 3.d, tras tres dfas de pruebas en el caso de la estructura basica de la invencion, el numero de celulas vivas es mucho mayor que en el caso sin canalizacion; se cree que la capacidad mucho mayor de la estructura basica de la invencion para mantener las celulas contenidas en su matriz vivas se debe a la posibilidad mucho mayor de intercambio de material con el entorno exterior, en particular para llevar nutrientes y oxfgeno a las celulas y para eliminar los productos de desecho generados mediante las propias celulas.

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   REIVINDICACIONES

   1. - Metodo para producir un dispositivo microflmdico tridimensional monolftico (19; 29), que comprende las siguientes etapas:

   - producir, con un material sacrificial, una plantilla tridimensional (15; 25) de forma estable, que consiste en una parte (A), que se corresponde con la canalizacion del dispositivo microflmdico, y una o mas partes (B, B'), que no se corresponden con dicha canalizacion;

   - colocar dicha plantilla tridimensional en un molde (16; 26) suspendiendola de al menos una de dicha una o mas partes (B, B') que no se corresponden con dicha canalizacion;

   - recubrir dicha plantilla tridimensional excluyendo dicha una o mas partes (B, B') que no se corresponden con dicha canalizacion, con un precursor, lfquido o en disolucion, de una matriz solida, pudiendo solidificar dicho precursor mediante reaccion qmmica o transformacion ffsica formando una matriz que constituye el cuerpo del dispositivo final;

   - provocar la solidificacion de dicho precursor;

   - retirar de manera selectiva el material sacrificial mediante un tratamiento termico y/o mediante disolucion con un disolvente del mismo;

   en el que la matriz se produce con un material poroso obtenido introduciendo en el precursor lfquido o en la disolucion del precursor de matriz, polvos de un material sacrificial porogenico, que puede ser igual o diferente del usado para formar la plantilla tridimensional.
2. 2. - Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la plantilla tridimensional esta compuesta por la union de dos o mas partes independientes.
3. 3. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la plantilla tridimensional se obtiene mediante la deformacion de una estructura hecha de un material sacrificial.
4. 4. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, antes de la etapa de recubrir la plantilla tridimensional en el molde con dicho lfquido precursor o en disolucion, la superficie de dicha plantilla se recubre completa o parcialmente con una capa de un material que difiere del material sacrificial y del precursor que, tras la disolucion del material sacrificial, permanece adherido a la superficie interna de la matriz del dispositivo.
5. 5. - Metodo segun la reivindicacion 4, en el que dicho material que difiere del material sacrificial y del precursor es insoluble en el precursor y/o en su disolvente.
6. 6. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material sacrificial es una cera o un polfmero termoplastico seleccionado de poli(metacrilato de metilo) (PMMA), poli(alcohol vimlico) (PVA), policarbonato (PC) y poliestireno (PS).
7. 7. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material que forma el cuerpo del dispositivo final se selecciona de resinas epoxi, polidimetilsiloxano (PDMS), poliuretano (PU), poliamidoaminas (pAa), poli(metacrilato de hidroxietilo) (PHEMA), poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAAM), polietilenglicol (PEG), policaprolactona (PCL), poli(acido lactico) (PLA), poli(acido lactico-co-glicolico) (PLGA), poli(alcohol vimlico) (PVA) hidrogel, colageno, agarosa, quitosano, alginato, fibrinogeno, acido hialuronico, gelatina y dextrano.
8. 8. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material sacrificial se retira mediante disolucion con un disolvente y los pares material sacrificial/material del cuerpo del dispositivo se seleccionan de PMMA-PDMS (disolvente: acetona), PMMA-PHEMA (disolvente: acetona), pVa-PHEmA (disolvente: agua), PVA- PDMS (disolvente: agua) y PVA-PEG (disolvente: agua).
9. 9. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho material porogenico, diferente del de la plantilla tridimensional se selecciona de los materiales que desprenden gas en disolucion, disolventes, aceites, tensioactivos o agentes de espumacion.
10. 10. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para producir soportes vascularizados para aplicaciones de cultivo celular, en el que la matriz del dispositivo esta hecha de un material biocompatible y/o biodegradable.
11. 11. - Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se insertan celulas viables en la matriz.
12. 12.- Metodo segun la reivindicacion 11, en el que dichas celulas se insertan en la matriz cargandolas en el precursor Ifquido o en la disolucion de precursor a partir del/de la que se produce la matriz.