ITMI20110173A1 - Procedimento ed apparecchiatura per identificare individui a rischio di tumore polmonare e/o per diagnosticare un tumore polmonare, nonché composizione e metodo per ridurre o eliminare il rischio di tumore polmonare - Google Patents

Procedimento ed apparecchiatura per identificare individui a rischio di tumore polmonare e/o per diagnosticare un tumore polmonare, nonché composizione e metodo per ridurre o eliminare il rischio di tumore polmonare Download PDF

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Ugo Pastorino
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Description

DESCRIZIONE
“Procedimento ed apparecchiatura per identificare individui a rischio di tumore polmonare e/o per diagnosticare un tumore polmonare, nonché composizione e metodo per ridurre o eliminare il rischio di tumore polmonare.â€
CAMPO DEL TROVATO
La presente invenzione concerne metodi per individuare ed utilizzare in fasi prediagnostiche e/o diagnostiche opportuni biomarcatori molecolari individuabili in campioni biologici, quali ad esempio sangue intero, siero, plasma, saliva o condensato bronchiale prelevati da un individuo. Più in dettaglio, il trovato concerne procedimenti per identificare individui a rischio di tumore, in particolare tumore polmonare. Il trovato concerne anche procedimenti per determinare presenza e/o aggressività di un tumore, ad esempio polmonare, in un individuo. Il trovato riguarda anche kit diagnostici ed apparecchiature utilizzabili per mettere in opera una o più fasi dei citati metodi. Inoltre, il trovato concerne metodi e composizioni farmaceutiche per trattare un individuo a cui sia stato diagnosticata la presenza di un tumore, ad esempio un tumore polmonare. Il trovato concerne anche metodi e composizioni farmaceutiche per trattare un individuo a cui sia stato identificato un rischio di sviluppare un tumore, ad esempio polmonare, per ridurre e/o eliminare il rischio di sviluppare un tumore.
STATO DELL’ARTE
Come noto, i tumori sono una delle principali cause di decesso nel mondo. In particolare, i tumori polmonari sono i tumori a più elevata incidenza nel mondo (rappresentano circa il 12% di tutti i nuovi casi di cancro) e costituiscono la principale causa di morte per cancro nel mondo sia nell’ uomo che nella donna. In Europa si registrano circa 400.000 nuovi casi/anno (80% uomini, 20% donne). Anche in Italia l’epidemiologia del cancro polmonare e’ simile con un incidenza di 34.000 casi/anno di cui circa 7000 casi nelle donne e 27.000 uomini. Purtroppo, l’incidenza e la mortalità sono molto simili a causa dell’elevata letalità del cancro polmonare: mortalità globale 27.500, di cui 22.000 uomini e 5.500 donne. Questi dati epidemiologici e la scarsa curabilità della malattia sottolineano l’importanza di individuare metodi capaci di individuare con il maggior anticipo possibile soggetti che possano essere a rischio di sviluppare cancro polmonare. Inoltre, risulta di interesse sviluppare metodologie che possano assistere nella corretta diagnosi di tumori, in particolari tumori polmonari, presenti in un individuo soggetto ad esame.
Nonostante queste esigenze, i marcatori tumorali oggi disponibili sono per uso diagnostico ossia identificano i pazienti quando già la malattia si à ̈ sviluppata in modo da poter essere identificabile con metodologie ad immagine (TAC spirale). Tali marcatori sono comunque pochi e non specifici e comprendono essenzialmente marcatori biochimici quali la valutazione della proteina CEA (Antigene Carcino Embrionale) e di alcune Citocheratine quali il TP A, il TPS ed il Cyfra21.1.
E’ anche noto un test di proteomica (profilo di 5 proteine) sul siero proposto attualmente da Vermillion Ine. ed usato per indicare la probabilità (score da 1 a 10) che masse ovariche siano di natura maligna. Tale test viene usato in donne con già un riscontro di masse ovarica di natura non identificata
Con riferimento specifico ai tumori polmonari, benché negli ultimi anni si siano ottenuti importanti miglioramenti nella cura dei pazienti oncologici, vi à ̈ comunque necessità di sviluppare metodi più efficaci che possano portare ad un intervento terapeutico più precoce nella gestione clinica di molti tipi di tumore. Attualmente, la maggior parte dei tumori polmonari viene diagnosticata ad uno stadio tardivo quando i sintomi sono clinicamente evidenti e, ad esempio con riferimento al cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC), solo un terzo dei pazienti con NSCLC presenta una malattia resecabile chirurgicamente, approccio che rimane il più efficace trattamento per questo tipo di tumore. Nonostante i recenti progressi nel trattamento del cancro polmonare dopo resezione e l’uso di trattamenti specifici per determinati bersagli molecolari, il tasso di guarigione del carcinoma polmonare non-a piccole cellule rimane bassa a causa della comparsa di recidive in pazienti farmaco-resistenti o di malattie metastatiche.
D’altro canto, Γ efficacia della TAC spirale per 1’ identificazione del cancro polmonare nei forti fumatori à ̈ in corso di valutazione in diversi studi clinici randomizzati in corso in Europa e negli Stati Uniti. A causa della sua elevata sensibilità rimangono diversi punti critici per un suo utilizzo nella pratica clinica corrente quali la sovra-diagnosi di noduli indolenti, con la conseguente elevata frequenza di trattamenti non necessari, e la verifica dell’effettivo impatto sulla mortalità.
In questo contesto, si sono negli ultimi anni identificati i microRNA (qui di seguito miRNA) quale nuova classe di biomarcatori circolanti che per loro natura sembrano essere molto stabili e altamente tessuto specifici ( Chen X, Celi Res, 2008). I miRNA sono piccole molecole di RNA (lunghezza 19-25 nucleotidi) non codificanti, con funzione regolatoria in grado di modulare l’espressione di più geni target coinvolti in diversi meccanismi molecolari, fra cui anche quelli coinvolti nei processi di trasformazione.
La messa a punto di tecnologie high-throughput ha permesso lo studio dei profili globali di espressione dei miRNA nel cancro (microRNAome) ( Cummins JM et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2006), rivelando che esistono centinaia di miRNA la cui espressione risulta deregolata nei tumori ( Croce CM, Visone R, AJP, 2009; W02009/070653, The Ohio State University Research Foundation). Oltre alla specificità tissutale, i miRNA possiedono elevata stabilità, facilità di rilevamento e associazione con parametri clinico-patologici noti ( Lu J et al., Nature, 2005). Sono anche stati condotti studi per determinare se i miRNA fossero stabili, rilevabili e quantificabili oltre che nei tessuti (sia congelati, che fissati in formalina o in paraffina) anche nei fluidi corporei. I risultati di queste ricerche hanno dimostrato che i miRNA sono presenti anche nel circolo sanguigno (sangue intero, siero e plasma), dove si trovano in una forma stabile protetta da RNAsi endogene. I miRNA circolanti sono risultati rilevabili e quantificabili e gli studi che hanno preso in esame i loro livelli nei fluidi biologici di pazienti oncologici hanno riportato che alcuni di essi presentano livelli deregolati rispetto ad individui sani ( Heneghan HM et al., Ann Surg, 2010; Mìtchell PS et al., Proc Nati Acad Sci USA, 2008; Chen X, Celi Res, 2008). Recentemente sono stati pubblicati alcuni lavori che riportano il profilo di miRNA circolanti nel siero e plasma di pazienti con tumore polmonare (Hu Z, Clin Oncol, 2010; Silva J. Eur Respir J 2010 Shen J, Lab Invest, 2010).
Nonostante la presenza dei sistemi diagnostici ad immagine e nonostante gli studi relativi ai microRNA, resta presente la necessità di individuare metodologie in grado di identificare con un certo grado di anticipazione gli individui a rischio di sviluppare cancro polmonare e possibilmente in grado di predire lo sviluppo delle forme di cancro, in particolare tumore polmonare, più aggressive e letali. È anche sentito il bisogno di migliorare il grado di affidabilità delle tecniche diagnostiche oggi disponibili.
SOMMARIO DEL TROVATO
In questa situazione, scopo della presente invenzione à ̈ quello di superare una o più delle limitazioni delle metodologie e dei prodotti noti.
Pertanto, Ã ̈ uno scopo del trovato mettere a disposizione metodologie per la determinazione precoce di individui che presentino rischio di sviluppare un tumore, in particolare un tumore polmonare.
Un altro scopo del trovato à ̈ quello di mettere a disposizione metodologie che assistano nella diagnosi di tumori, in particolare tumori polmonari, in soggetti umani.
Un ulteriore scopo del trovato à ̈ quello di mettere a disposizione metodologie che possano essere messe in opera agevolmente in laboratorio analizzando campioni biologici prelevati da un individuo.
Un altro scopo del trovato à ̈ quello di mettere a disposizione metodologie che permettano di ottenere risultati attendibili utilizzando campioni di sangue, siero o plasma.
Un ulteriore scopo del trovato à ̈ quello di definire kit diagnostici e/o apparecchiature utilizzabili nelle metodologie sopra esposte per l’individuazione di soggetti umani a rischio di contrarre un tumore e/o per l’assistenza nella diagnosi di tumori presenti in soggetti umani.
È anche uno scopo del trovato mettere a disposizione composizioni farmaceutiche e/o terapie che possano essere utilizzate per trattare un individuo a cui sia stato diagnosticata la presenza di un tumore polmonare.
È infine uno scopo del trovato mettere a disposizione composizioni farmaceutiche e/o terapie per ridurre e/o eliminare il rischio di sviluppare un tumore polmonare.
Uno o più degli scopi specificati sono sostanzialmente raggiunti da un metodo e/o da un kit e/ o da una composizione e/o da un apparecchiatura in accordo con le una o più delle unite rivendicazioni.
Aspetti del trovato sono qui di seguito descritti.
Un primo aspetto concerne un procedimento per identificare individui a rischio di tumore polmonare, detto procedimento comprendendo le fasi di:
misurare, in almeno un campione di fluido biologico previamente prelevato da un soggetto, un valore del livello di espressione di una pluralità di molecole microRNA;
determinare quando detti valori misurati del livello di espressione deviano rispetto ad un prefissato e rispettivo criterio di controllo.
Le molecole microRNA o miRNA vengono pertanto usate per prevedere individui a rischio in una fase in cui il tumore non si à ̈ ancora manifestato.
In un 2° aspetto detta fase di determinare comprende le sottofasi di calcolare una pluralità di quozienti o differenze reali determinati effettuando il rapporto o rispettivamente la differenza tra i valori misurati dei livelli di espressione di un prefissato numero di coppie di dette molecole di microRNA, comparare ciascuno di detti quozienti o differenze reali con un rispettivo valore di controllo, determinare i quozienti o differenze reali che si discostano dal rispettivo valore di quoziente o differenza di controllo.
In un 3° aspetto in accordo con il 2° aspetto à ̈ anche prevista una fase di determinazione del numero o della percentuale di quozienti o differenze reali che si discostano dal rispettivo valore di controllo.
In un 4° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti à ̈ prevista una fase di definire come individuo a rischio un individuo per il quale almeno un prefissato numero o una prefissata percentuale di detti quozienti o differenze reali devia rispetto al rispettivo valore di quoziente o differenza di controllo.
In un 5° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti per ciascuno di detti quozienti calcolati à ̈ associato un rispettivo quoziente di controllo rappresentato dal rapporto dei valori di espressione per i medesimi microRNA in un campione di controllo relativo ad un fluido biologico dello stesso tipo. Il quoziente di controllo à ̈ in realtà o un valore noto, o un valore determinato come media di valori misurati su una popolazione sufficiente vasta di individui, o un valore relativo ad un campione di fluido prelevato da un individuo sano.
In un 6° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti il procedimento comprende la fase di correlare la deviazione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale di livelli di espressione (ovvero di quozienti o differenze reali) rispeto ai corrispondenti criteri di controllo alla presenza o assenza di rischio che l’individuo manifesti clinicamente un tumore polmonare in un tempo prefissato.
In un 7° aspeto secondo l’aspeto precedente il tempo prefissato à ̈ compreso tra uno e tre anni, più opzionalmente compreso tra 12 e 28 mesi. In altre parole il metodo in accordo con il trovato à ̈ in grado di anticipare significativamente la determinazione del rischio di contrarre un tumore rispeto a tecniche tradizionali (quali TAC spirale) che devono atendere il manifestarsi della malatia a livello di lacerazioni o noduli di diversi mm.
In un 8° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspeti precedenti il procedimento comprende la fase di correlare la deviazione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale di livelli di espressione rispeto ai corrispondenti criteri di controllo alla presenza o assenza di rischio che l’individuo manifesti clinicamente un tumore polmonare aggressivo in un tempo prefissato.
In un 9° aspeto secondo l’aspeto precedente il tempo prefissato à ̈ compreso tra uno e tre anni, più opzionalmente compreso tra 12 e 28 mesi. In altre parole il metodo in accordo con il trovato à ̈ in grado di anticipare significativamente la determinazione del rischio di contrarre un tumore aggressivo rispeto a tecniche tradizionali (quali TAC spirale) che devono atendere il manifestarsi della malatia a livello di lacerazioni o noduli di diversi mm.
In un 10° aspeto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti calcolare deta pluralità di quozienti o differenze reali comprende utilizzare i valori di espressione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale dei miRNA di cui alla Tabella I e/o di cui alla Tabella II.
In un 11° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspeti 6°, 7° o 10° calcolare deta pluralità di quozienti o differenze reali comprende utilizzare i valori di espressione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale dei miRNA appartenenti alla seguente lista
hsa-mirR-140-5p
hsa-mirR-660
hsa-mirR-320
hsa-mirR-28-3p
hsa-mirR-45 1
hsa-mirR-30c
hsa-mirR-92a
hsa-mirR-197
hsa-mirR-221
hsa-mirR-19b
hsa-mirR-15b
hsa-mirR-30b
hsa-mirR-17
hsa-mirR-45 1
hsa-mirR-106a
In un 12° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti 8°, 9° o 10° calcolare detta pluralità di quozienti o differenze reali comprende utilizzare i valori di espressione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale dei miRNA appartenenti alla seguente lista
hsa-mirR-221
hsa-mirR-45 1
hsa-mirR-197
hsa-mirR-486-5p
hsa-mirR-28-3p
hsa-mirR-221
hsa-mirR-660
hsa-mirR-106a
hsa-mirR-140-5p
hsa-mirR-16
In un 13° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti calcolare detta pluralità di quozienti reali comprende determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti tra i valori dei livelli di espressione, tali quozienti essendo selezionati nel gruppo comprendente quozienti tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella III, opzionalmente in cui vengono determinati almeno il 20%, più opzionalmente almeno il 50% ed ancor più opzionalmente tutti i quozienti di cui alla Tabella III.
In un 14° aspetto secondo l’aspetto precedente, determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella III ed in cui comprende una fase di definire come individuo a rischio di tumore polmonare, opzionalmente in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 30% , opzionalmente almeno il 50%, dei quozienti reali calcolati devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
In un 15° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti 13° o 14° in cui i quozienti sono scelti tra quelli della seguente lista
Qi= hsa-mirR-106a / hsa-mirR-451
Q2= hsa-mirR-140-5p / hsa-mirR-320
Q3= hsa-mirR- 140-5p / hsa-mirR-45 1
Q4= hsa-mirR- 140-5p/ hsa-mirR-660
Q5= hsa-mirR- 140-5p / hsa-mirR-92a
Q6= hsa-mirR- 15b / hsa-mirR-92a
Q7= hsa-mirR- 17 / hsa-mirR-451
Q8= hsa-mirR- 197 / hsa-mirR-451
Q9= hsa-mirR- 19b / hsa-mirR-660
Q10= hsa-mirR-221 / hsa-mirR-660
Qn= hsa-mirR-28-3p / hsa-mirR-660
Q12= hsa-mirR-30b / hsa-mirR-92a
Qn= hsa-mirR-30c / hsa-mirR-451
Q14= hsa-mirR-30c / hsa-mirR-660
In un 16° aspeto secondo uno qualsiasi degli aspeti precedenti calcolare deta pluralità di quozienti reali comprende determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti tra i valori dei livelli di espressione, tali quozienti essendo selezionati nel gruppo comprendente quozienti tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella IV, opzionalmente in cui vengono determinati almeno il 30%, più opzionalmente almeno il 50% ed ancor più opzionalmente tuti i quozienti di cui alla Tabella IV.
In un 17° aspeto secondo l’aspetto precedente determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 30% dei quozienti reali di cui alla Tabella IV ed in cui il procedimento comprende una fase di definire come individuo a rischio di tumore polmonare aggressivo, opzionalmente in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 50% opzionalmente almeno il 75% di deti quozienti reali calcolati devia rispetto al rispetivo valore di quoziente controllo.
In un 18° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspeti 16° o 17° in cui i quozienti sono scelti tra quelli della seguente lista
Qi= hsa-mirR-106a/ hsa-mirR-660
Q2= hsa-mirR-140-5p/ hsa-mirR-486-5p
Q3= hsa-mirR-16/ hsa-mirR-197
Q4= hsa-mirR-197/ hsa-mirR-486-5p
Qs= hsa-mirR-197/ hsa-mirR-660
Q6= hsa-mirR-221/ hsa-mirR-451
Q7= hsa-mirR-221/ hsa-mirR-660
Q8= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-451
Q9= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-486-5p
Qio<=>hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-660
In un 19° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti le fasi di detto procedimento sono condotte in vitro.
In un 20° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti detto fluido biologico à ̈ uno selezionato nel gruppo comprendente: sangue intero, una frazione di sangue, plasma, siero.
In un 21° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti detto tumore polmonare à ̈ uno selezionato nel gruppo comprendente: cancro polmonare a piccole cellule (SCLC), cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC), adenocarcinoma polmonare (ADC), carcinoma bronco-alveolare (BAC), carcinoma polmonare a cellule squamose (SCC), carcinoma a grandi cellule (LC).
In un 22° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti detto campione di fluido biologico à ̈ proveniente da un individuo fumatore che, al momento del prelievo del campione, non evidenzia tumore polmonare se sottoposto a metodiche di diagnosi per immagine, in particolare non evidenzia noduli di dimensioni superiori a 5mm se sottoposto a TAC spirale.
Un 23° aspetto concerne un kit medicale per la determinazione di marcatori biomolecolari presenti in un campione di fluido biologico umano, detto kit comprendendo una piattaforma avente una pluralità di siti ciascuno dei quali à ̈ destinato a ricevere una rispettiva quantità discreta di detto campione di fluido biologico, ciascuno di detti siti comprendendo un reagente capace di legarsi con almeno un rispettivo dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II.
In un 24° aspetto secondo l’aspetto precedente detto reagente include almeno uno selezionato nel gruppo comprendente:
- un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, - un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide complementare a quella di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II,
- sonda molecolare configurata per riconoscere una sequenza di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II.
Un 25° aspetto concerne un’apparecchiatura medicale comprendente:
- un unità definente una sede per ricevere uno o più dei kit di cui all’aspetto 23° o 24°,
- mezzi per determinare il valore del livello di espressione dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II,
- mezzi per calcolare i valori dei quozienti reali tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella III e/o di cui alla Tabella IV.
In un 26° aspetto secondo l’aspetto precedente i mezzi per determinare il valore del livello di espressione comprendono una delle tecniche selezionate nel gruppo:
Quantitative Real-time PCR (PCR quantitativa in tempo reale), Microfluidic cards (chip microfluidici),
Microarrays (microchips),
RT (trascrizione inversa) - PCR quantitativa o semiquantitativa, Northern blot,
Solution Hybridization (ibridizzazione in soluzione),
Sequencing (Sequenziamento totale).
Un 28° aspetto prevede un procedimento in vitro per identificare individui a rischio di tumore e/o per determinare presenza e/o aggressività di un tumore in un individuo, detto procedimento comprendendo le fasi di:
misurare, in almeno un campione di fluido biologico previamente prelevato da un soggetto, un valore del livello di espressione di una pluralità di molecole microRNA;
calcolare una pluralità di quozienti reali determinati effettuando il rapporto tra i valori misurati dei livelli di espressione di un prefissato numero di coppie di dette molecole di microRNA;
comparare ciascuno di detti quozienti reali con un rispettivo valore di controllo.
In un 29° aspetto in accordo con il 28° aspetto il procedimento comprende determinare il numero o la percentuale di quozienti reali che si discostano dal rispettivo valore di controllo, definire come individuo in cui à ̈ presente una forma di tumore, un individuo per il quale almeno un prefissato numero o una prefissata percentuale di detti quozienti reali devia rispetto al rispettivo valore di controllo.
In un 30° aspetto in accordo con il 29° per ciascuno di detti quozienti calcolati à ̈ associato un rispettivo valore di controllo rappresentato dal rapporto dei valori di espressione per i medesimi microRNA in un campione di controllo relativo ad un fluido biologico dello stesso tipo.
In un 31° aspetto in accordo con il 30° o il 29° aspetto, calcolare detta pluralità di quozienti reali comprende utilizzare i valori di espressione di un prefissato numero dei miRNA:
di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II e/o alla Tabella V e/o alla Tabella VI.
In un 32° aspeto in accordo con uno qualsiasi degli aspeti dal il 29° al 31° calcolare deta pluralità di quozienti reali comprende determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti tra i valori dei livelli di espressione, tali quozienti essendo selezionati nel gruppo comprendente i quozienti di cui alla Tabella III e/o alla Tabella IV e/o alla Tabella VII e/o alla Tabella Vili.
In un 33° aspeto in accordo con il 32° determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella VII ed in cui comprende una fase di definire come individuo in cui à ̈ presente un tumore polmonare un individuo per il quale almeno 30% del prefissato numero di quozienti reali di cui alla Tabella VII che siano stati calcolati devia rispeto al rispetivo valore di controllo.
In un 34° aspeto in accordo con il 33° o il 32° determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella Vili ed in cui comprende una fase di definire come individuo in cui à ̈ presente un tumore polmonare aggressivo un individuo per il quale il 50%, opzionalmente almeno 60%, dei quozienti reali che siano stati calcolati devia rispetto al rispetivo valore di controllo.
In un 35° aspeto in accordo con il 34° o il 33° o il 32° determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella III ed in cui comprende una fase di definire come individuo a rischio di tumore polmonare, opzionalmente in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 30% , opzionalmente almeno il 50%, dei quozienti reali calcolati devia rispeto al rispetivo valore di quoziente controllo.
In un 36° aspetto in accordo con il 35° o il 34° o il 33° o il 32° determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 30% dei quozienti reali di cui alla Tabella IV ed in cui comprende una fase di definire come individuo a rischio di tumore polmonare aggressivo, opzionalmente in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 50%, opzionalmente almeno il 75% di detti quozienti reali calcolati devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
In un 37° aspetto in accordo con uno qualsiasi dei precedenti aspetti dal 28° al 36° detto fluido biologico à ̈ uno selezionato nel gruppo comprendente: sangue intero, una frazione di sangue, plasma, siero, saliva o condensato bronchiale.
In un 38° aspetto in accordo con uno qualsiasi dei precedenti aspetti dal 28° al 37° in cui detto tumore à ̈ un tumore polmonare selezionato nel gruppo comprendente:
cancro polmonare a piccole cellule (SCLC), cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC), adenocarcinoma polmonare (ADC), carcinoma broncoalveolare (BAC), carcinoma polmonare a cellule squamose(SCC), carcinoma a grandi cellule (LC).
In un 39° aspetto in accordo con uno qualsiasi dei precedenti aspetti dal 28° al 38° detto campione di fluido biologico à ̈ proveniente da un individuo fumatore che, al momento del prelievo del campione, evidenzia tumore polmonare se sottoposto a metodiche di diagnosi ad immagine, in particolare evidenzia lesioni di dimensioni superiori a 5mm se sottoposto a TAC spirale.
In un 40° aspetto à ̈ previsto un kit medicale per la determinazione di marcatori biomolecolari presenti in un campione di fluido biologico umano, detto kit comprendendo:
una piattaforma, ad esempio un supporto per ricevere campioni di fluido, avente una pluralità di siti ciascuno dei quali à ̈ destinato a ricevere una rispettiva quantità discreta di detto campione di fluido biologico;
ciascuno di detti siti comprendendo un reagente capace di legarsi con almeno un rispettivo dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II e/o alla Tabella V e/o alla Tabella VI.
In un 41° aspetto in accordo con l’aspetto precedente detto reagente include almeno uno selezionato nel gruppo comprendente:
- un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II e/o alla Tabella V e/o alla Tabella VI;
- un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide complementare a quella di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II e/o alla Tabella V e/o alla Tabella VI; - una sonda molecolare configurata per riconoscere una sequenza di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II e/o alla Tabella V e/o alla Tabella VI.
In un 42° aspetto à ̈ prevista un’ apparecchiatura medicale comprendente:
- un unità definente una sede per ricevere uno o à ̈ più dei kit di cui alla rivendicazione precedente,
- mezzi per determinare il valore del livello di espressione dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II e/o alla Tabella V e/o alla Tabella VI;
- mezzi per calcolare i valori dei quozienti reali tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA, detti quozienti essendo selezionati tra quelli di Tabella III e/o di Tabella IV e/o di Tabella VII e/o di Tabella Vili.
In un 43° aspetto secondo l’aspetto precedente i mezzi per determinare il valore del livello di espressione comprendono uno selezionato nel gruppo:
Quantitative Real-time PCR (PCR quantitativa in tempo reale), Microfluidic cards (chip microfluidici),
Microarrays (microchips),
RT (trascrizione inversa) - PCR quantitativa o semiquantitativa, Northern blot,
Solution Hybridization (ibridizzazione in soluzione), Sequencing (Sequenziamento),
In un 44° aspetto à ̈ previsto un metodo per trattare un individuo a cui sia stato diagnosticata la presenza di un tumore polmonare o a cui sia stato identificato un rischio di sviluppare un tumore polmonare, rispettivamente per la cura di detto tumore polmonare o per ridurre e/o eliminare il rischio di sviluppare un tumore polmonare, detto metodo comprendendo le seguenti fasi:
- misurare un livello di espressione di almeno un miRNA listato nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI presente in un campione di fluido biologico previamente prelevato da detto individuo,
- determinare i miRNA aventi valori misurati del livello di espressione che deviano rispetto ad un prefissato e rispettivo criterio di controllo;
- alterare il livello di espressione dei miRNA i cui livelli di espressione deviano rispetto al rispettivo criterio di controllo.
In un 45° aspetto secondo l’aspetto precedente detta fase di alterazione del livello di espressione dei miRNA comprende amministrare all’individuo un quantitativo efficace di almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI se il livello di espressione misurato di tale o tali miRNA à ̈ inferiore ad un rispettivo livello di espressione di controllo.
In un 46° aspetto secondo l’aspetto 44° o 45° detta fase di alterazione del livello di espressione dei miRNA comprende amministrare all’individuo un quantitativo efficace di almeno una composizione per inibire l’espressione di almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI se il livello di espressione misurato di uno o più di tale o tali miRNA à ̈ superiore al livello di espressione di controllo.
In un 47° aspetto secondo l’aspetto 45° il metodo comprende ripristinare i valori di livello di espressione al livello di espressione di controllo per i miRNA sottoespressi rispetto al rispettivo livello di espressione di controllo.
In un 48° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 44° al 47° il metodo comprende amministrare una quantità terapeuticamente efficace di una composizione comprendente almeno uno dei miRNA di cui alla Tabella I o alla Tabella II o alla Tabella V o alla Tabella VI chimicamente sintetizzato (miRNA mimetici) o ricombinante.
In un 49° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 44° al 48° il metodo comprende ridurre i valori di livello di espressione al livello di espressione di controllo per i miRNA sovraespressi rispetto al rispettivo livello di espressione di controllo.
In un 50° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 44° al 49° il metodo comprende amministrare una quantità terapeuticamente efficace di una composizione comprendente almeno un inibitore di un microRNA di cui alla Tabella I o alla Tabella II o alla Tabella V o alla Tabella VI.
In un 51 ° aspetto secondo il precedente aspetto detto inibitore comprende RNA a doppio filamento.
In un 52° aspetto secondo il precedente aspetto il metodo comprende brevi RNA interferenti (siRNA), acidi nucleici antisenso (anti-miRNA oligonucleotidi (AMOs), molecole di RNA enzimatiche (ribozimi).
In un 53° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 50° al 52° detto inibitore à ̈ indirizzato ad uno specifico prodotto di microRNA e interferisce con l’espressione, ad esempio mediante inibizione della traduzione o induzione della degradazione, di un gene bersaglio del microRNA.
In un 54° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti detta fase di determinare i miRNA aventi valori misurati del livello di espressione che deviano rispetto al rispettivo criterio di controllo comprende:
- calcolare una pluralità di quozienti reali determinati effettuando il rapporto tra i valori misurati dei livelli di espressione di un prefissato numero di coppie di dette molecole di microRNA tali quozienti essendo selezionati nel gruppo comprendente i quozienti di cui alla Tabella III e/o alla Tabella IV e/o alla Tabella VII e/o alla Tabella Vili,
- determinare i quozienti reali che si discostano dal rispettivo valore di controllo, - individuare i miRNA coinvolti nei quozienti reali che si discostano dal rispettivo valore di controllo.
Un 55° aspetto concerne una composizione farmaceutica per trattare un individuo a cui sia stato diagnosticata la presenza di un tumore polmonare o a cui sia stato identificato un rischio di sviluppare un tumore polmonare, rispettivamente per la cura di detto tumore polmonare o per ridurre e/o eliminare il rischio di manifestare un tumore polmonare,
detta composizione comprendendo:
- almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI, e/o
- almeno un inibitore dell’espressione di almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI.
In un 56° aspetto secondo l’aspetto precedente la composizione comprende un quantitativo terapeuticamente efficace di almeno uno di detti miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI.
In un 57° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 55° al 56° detto quantitativo à ̈ capace, per i miRNA sottoespressi rispetto al rispettivo livello di espressione di controllo, di ripristinare i valori di livello di espressione al rispettivo livello di espressione di controllo.
In un 58° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 55° al 57° detto quantitativo terapeuticamente efficace comprende miRNA di cui alla Tabella I o alla Tabella II o alla Tabella V o alla Tabella VI chimicamente sintetizzati o ricombinanti.
In un 59° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 55° al 57° la composizione comprende un quantitativo terapeuticamente efficace di detto inibitore dell’espressione di almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI, detto quantitativo essendo capace, per i miRNA sovraespressi rispetto al rispettivo livello di espressione di controllo, di ridurre i valori di livello di espressione a tale rispettivo livello di espressione di controllo.
In un 60° aspetto secondo l’aspetto precedente, detto inibitore comprende RNA a doppio filamento, opzionalmente brevi RNA interferenti (siRNA), e/o acidi nucleici antisenso, e/o molecole di RNA enzimatiche (ribozimi).
In un 61° aspetto secondo l’aspetto 59° o 60° detto inibitore à ̈ indirizzato ad uno specifico prodotto di microRNA e interferisce con l’espressione (mediante inibizione della traduzione o induzione della degradazione) di un gene bersaglio del microRNA.
In un 62° Ã ̈ prevista una composizione farmaceutica secondo uno qualsiasi degli aspetti dal 55° al 61° per la preparazione di un medicamento utilizzabile in uno dei metodi terapeutici di cui ad uno qualsiasi degli aspetti dal 44° al 54°.
In un 63° aspetto secondo l’aspetto precedente il metodo terapeutico à ̈ un metodo per trattare un individuo a cui sia stato diagnosticata la presenza di un tumore polmonare.
In un 64° aspetto secondo l’aspetto 62° il metodo terapeutico à ̈ un metodo per trattare un individuo a cui sia stato identificato un rischio di sviluppare un tumore polmonare per ridurre e/o eliminare il rischio di sviluppare il tumore polmonare.
In accordo con un 65° aspetto secondo uno qualsiasi degli aspetti precedenti à ̈ previsto che, quale variante del trovato ed alternativamente ai quozienti reali (nel procedimento, nel kit medicale e nell’ apparecchiatura) siano determinate differenze reali effettuando la differenza tra i valori misurati dei livelli di espressione di un prefissato numero di coppie di dette molecole di microRNA. In tal caso ciascuna delle differenze viene comparata con un rispettivo valore di controllo per poi determinare le differenze che si discostano dal rispettivo valore di controllo. Tutti gli aspetti precedentemente descritti si applicano egualmente sostituendo ai quozienti reali differenze reali tra le medesime coppie di miRNA di cui alle unite tabelle.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
Qui di seguito vengono descritti alcuni aspetti specifici e pertanto non limitativi del trovato. In particolare sono descritte le fasi della ricerca condotta dagli inventori, sono riportati i risultati ottenuti e vari aspetti esemplificativi del trovato.
Definizioni
La seguente terminologia quando utilizzata nella descrizione, rivendicazioni e disegni della presente domanda di brevetto assume il significato qui di seguito riportato.
Individui: soggetti umani.
MicroRNA o miRNA: piccole molecole di RNA (lunghezza 19-25 nucleotidi) non codificanti. In particolare, si fa riferimento a miRNA presenti in campioni biologici di tessuto umano, ad esempio sangue intero, plasma, siero, saliva o condensato bronchiale.
Quozienti miRNA o “miRNA ratios†: quozienti reali determinati effettuando il rapporto tra i valori misurati dei livelli di espressione di prefissate coppie di molecole di microRNA.
Tumore aggressivo: tumore, ad esempio tumore polmonare, a prognosi infausta ossia in grado di portare a morte il 90% dei pazienti entro 5 anni dalla diagnosi della malattia.
Individuo a rischio di tumore (aggressivo o meno a seconda dei casi studiati): individuo che nell’arco di tempo di riferimento (1-3 anni) successivo al prelievo del campione biologico ha un rischio oltre l’80% di manifestare un tumore, ad esempio un tumore polmonare, rilevabile con tecniche quali TAC spirale.
La ricerca
Gli inventori hanno investigato il profilo di espressione di miRNA nel plasma di individui arruolati in protocolli di screening con TAC spirale. Tale investigazione à ̈ stata condotta al fine di verificare la capacità dei miRNA come nuova classe di biomarcatori molecolari per:
- la predizione del rischio di sviluppare un tumore, in particolare un tumore polmonare, e
- la diagnosi del tumore, in particolare tumore polmonare, e quindi come ausilio prognostico per discriminare pazienti con lesioni polmonari indolenti o aggressive.
Sono stati utilizzati campioni di plasma raccolti in individui fumatori di età maggiore di 50 anni nell’arco di tempo intercorrente tra uno e due anni prima del rilevamento con TAC spirale della presenza di tumore polmonare negli stessi individui. Sono stati anche utilizzati campioni di plasma prelevati al momento della comparsa della malattia (rilevata con TAC spirale). I campioni di plasma sono stati ottenuti da pazienti che hanno sviluppato tumore polmonare con diverse caratteristiche in termini di aggressività clinica (noduli indolenti o tumori avanzati e metastatici), nonché da individui rimasti liberi da malattia per tutto il corso dello screening.
In una prima fase della ricerca, sono stati individuati quali microRNA fossero presenti nel plasma utilizzando le “microfluidic cards†modello TaqMan<®>di Applied Biosystems. Su 378 microRNA analizzati, 100 sono risultati essere presenti stabilmente nel plasma di individui fumatori sani usati come gruppo di controllo. Potendo quindi utilizzare un elevato numero di dati iniziali, c’à ̈ una generale concordanza sulla possibilità di normalizzare i livelli di espressione dei singoli microRNA sulla media dei livelli di espressione dei 100 microRNA per ogni individuo (Mestdagh P et al. Genome Biol, 2009). I dati ottenuti con questo tipo di normalizzazione sono stati confrontati con quelli ottenuti normalizzando su potenziali microRNA housekeeping (per esempio mir-16, mammU6, RNU44 o RNU48).
Gli inventori hanno poi pensato di utilizzare non più i valori dei livelli di espressione dei singoli microRNA, ma i rapporti tra coppie di essi. Il valore di cicli soglia (Ct) ottenuto da qReal-Time PCR con il software SDS 2.2.2<®>(Applied Biosystems) à ̈ stato trasformato nel corrispondente valore di espressione (2<†̃>). Quindi à ̈ stato calcolato il quoziente tra il valore del livello di espressione misurato di ogni coppia di microRNA possibile ottenendo 4950 rapporti totali: i 4950 rapporti totali sono dati dalla formula 100 * 99 / 2 in quanto il rapporto tra due miRNA ed il suo reciproco contengono la stessa informazione. È stato infine analizzato il variare di questi rapporti (chiamati “miRNA ratios†) nel plasma delle diverse classi di pazienti per individuare biomarcatori plasmatici.
I risultati hanno mostrato che i microRNA maggiormente presenti nei rapporti che discriminano tra le classi di pazienti sono gli stessi che risultano dalle analisi effettuate normalizzando sul valore medio dei livelli di espressione dei 100 microRNA per ogni individuo, validando così il metodo basato sui quozienti o “miRNA ratios†per la quantificazione dei microRNA coinvolti.
Più in dettaglio, allo scopo di identificare biomarcatori nel plasma in grado di predire la comparsa del tumore polmonare, gli inventori hanno studiato il profilo di espressione di microRNA circolanti in campioni raccolti fino a due anni prima la diagnosi della malattia e al momento della chirurgia in pazienti di due indipendenti trials clinici, come sopra accennato, per la diagnosi precoce del tumore polmonare in individui ad alto rischio (età >50 anni e fumatori) tramite TAC spirale. Nel primo training set composto da 40 campioni di plasma di 19 pazienti e da 27 campioni di plasma di individui sani di controllo raggruppati in 5 diversi pools, i livelli di espressione dei miRNA sono stati analizzati con TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems) al fine di individuare i “miRNA ratios†significativamente diversi (p<0.05) tra campioni di plasma raccolti pre-malattia, al momento della chirurgia e da individui sani.
La specificità e sensibilità delle firme o “signatures†di microRNA così ottenute sono state confrontate con il set di validazione composto, come sopra descritto, da 32 campioni di plasma di 22 pazienti e da 54 campioni di plasma di individui sani di controllo, raggruppati in 10 diversi pools.
Per la generazione delle firme o “signatures†utilizzate per predire l’aggressività della malattia, gli inventori hanno raggruppato le due coorti (training set e set di validazione) allo scopo di ottenere una numerosità sufficiente per le analisi statistiche. I casi con prognosi sfavorevole sono stati prima paragonati ai rispettivi controlli e le firme o “signatures†così ottenute sono state poi testate per valutare la loro effettiva capacità di discriminare i pazienti a cattiva e a buona prognosi.
Test e prove compiute - materiali ed attrezzature utilizzate
Come già accennato Le firme o “signature†di microRNA identificate nelle diverse analisi sono state validate su due set indipendenti costituiti da individui ad alto rischio (fumatori di età maggiore di 50 anni) arruolati in due diversi trial clinici per l’individuazione precoce del tumore polmonare con TAC spirale a basso dosaggio: un primo set o training set composto da 40 campioni di plasma di 19 pazienti e da 27 campioni di plasma di individui sani di controllo raggruppati in 5 diversi pools ed un secondo set o set di validazione (ossia in un secondo set di individui) composto da 32 campioni di plasma di 22 pazienti e da 54 campioni di plasma di individui sani di controllo, raggruppati in 10 diversi pools. La figura 1 riassume le caratteristiche cliniche patologiche del training set e del set di validazione selezionati per l’analisi dei livelli di espressione dei miRNA nei campioni di plasma.
Per il determinare il profilo di microRNA nei campioni di plasma l’RNA totale à ̈ stato estratto da 200Î1⁄41 di plasma utilizzando il kit mirVanaâ„¢ PARISâ„¢ Kit (Ambion), eluendo in 50Î1⁄41 di buffer di eluizione.
I livelli di espressione sono stati determinati tramite q-Real Time PCR partendo da 3Î1⁄41 di eluito utilizzando prima il Megaplexâ„¢ Pools Protocol su “microfluidic card†, di tipo A (Applied Biosystems), poi il Multiplexâ„¢ Pools Protocol (Applied Biosystems).
Tutti i dati sono stati estrapolati con il software Sequence Detection System (SDS 2.2.2<®>Applied Biosystems) settando la soglia manualmente a 0.2 e la baseline tra 3 e 18 cicli (su un totale di 40).
Oltre ad attrezzature standard per biologia molecolare, si à ̈ fatto uso di Real-time quantitative PCR 7900-HT (Applied Biosystems) e GeneAmp<®>9700 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
Risultati
Gli inventori hanno identificato i miRNA, in particolare quelli di cui alla Tabella I qui unita, come biomarcatori molecolari per la valutazione del rischio di manifestare tumore polmonare entro 1-3 anni dal prelievo campione di fluido biologico. Gli inventori hanno anche identificato che i quozienti tra i valori di espressione dei miRNA risultano essere biomarcatori molecolari ideali da investigare per la valutazione del rischio di contrarre un tumore polmonare entro 1-3 armi da prelievo campione di fluido biologico quale sangue intero, siero, plasma, saliva o condensato bronchiale.
Utilizzando i livelli di espressione dei miRNA elencati in Tabella I, gli inventori hanno individuato specificatamente i quozienti tra valori misurati dei livelli di espressione relativi alle coppie di microRNA elencati in Tabella III. Tali quozienti possono essere utilizzati per la valutazione del rischio di contrarre tumore polmonare entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico dando esiti di predizione estremamente affidabili.
Più in dettaglio, calcolando un numero sufficiente di quozienti reali selezionati tra quelli di Tabella III, ad esempio almeno il 20% di essi, e opzionalmente almeno il 50%, à ̈ possibile studiarne l’andamento rispetto a quozienti di controllo. Un individuo viene definito ad alto rischio di tumore polmonare, che potrà manifestarsi in modo rivelabile da TAC spirale in un periodo compreso tra imo e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 30% dei quozienti reali calcolati devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
Gli inventori hanno anche identificato i miRNA, in particolare quelli di cui alla Tabella II qui unita, come biomarcatori per la valutazione del rischio di contrarre tumore polmonare di tipo aggressivo entro 1-3 anni dal prelievo campione di fluido biologico. Inoltre, anche in questo caso, specificatamente i quozienti tra i valori di espressione dei miRNA sono stati identificati come biomarcatori molecolari ideali da investigare per la valutazione del rischio di contrarre un tumore polmonare aggressivo entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico quale sangue intero, siero, plasma, saliva o condensato bronchiale. Inoltre, utilizzando i livelli di espressione dei miRNA di cui alla Tabella II, gli inventori hanno individuato i quozienti tra valori misurati di livelli di espressione relativi a coppie di microRNA di cui alla Tabella IV per la valutazione del rischio di contrarre un tumore polmonare aggressivo entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico. Più in dettaglio, calcolando un numero sufficiente di quozienti reali selezionati tra i quozienti di cui alla Tabella IV, ad esempio almeno il 30%, e opzionalmente almeno il 50%, à ̈ possibile studiare l’andamento di tali quozienti rispetto a quozienti di controllo. Un individuo viene definito come a rischio di contrarre un tumore polmonare aggressivo in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, se in tale individuo almeno il 50%, opzionalmente almeno il 75%, di detti quozienti reali calcolati devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
L’utilizzazione dei quozienti di miRNA permette pertanto di predire con affidabilità lo sviluppo del tumore polmonare, in particolare della forma più aggressiva, in individui ad alto rischio (più di 50 anni e forti fumatori) fino a due anni prima che la malattia sia ad uno stadio visibile con le migliori tecniche ad immagine oggi a disposizione (TAC a spirale). Si noti per altro che il metodo utilizzante il calcolo dei quozienti o “miRNA ratios†sopra descritti può essere attuato con un semplice prelievo di sangue ed pertanto totalmente non invasivo, consentendo di effettuare le analisi in modo rapido ed economico.
In aggiunta a quanto sopra, gli inventori hanno individuato che i miRNA, ed in particolare quelli elencati in Tabella V, rivestono un ruolo come marcatori biomolecolari per determinazione presenza attuale di un tumore polmonare in un individuo, ossia a fini diagnostici. Gli inventori hanno anche rilevato che in tal caso i quozienti tra valori di livelli di espressione di coppie di miRNA sono validi biomarcatori con funzione diagnostica e prognostica. In dettaglio i miRNA di tabella V sono stati utilizzati per determinare i quozienti di Tabella VII che rappresentano quozienti tra valori misurati di livelli di espressione relativi coppie di microRNA e che vengono utilizzati per determinazione della presenza attuale (diagnosi) di tumore polmonare in un individuo. Più in dettaglio determinando almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella VII à ̈ poi possibile definire che individuo presenta un tumore polmonare se almeno 30% dei quozienti reali (di cui alla Tabella VII) che siano stati effettivamente calcolati devia rispetto al rispettivo valore di controllo.
Infine, gli inventori hanno individuato che i miRNA, ed in particolare quelli elencati in Tabella VI, possono essere utilizzati quali marcatori biomolecolari per determinazione presenza attuale di un tumore polmonare aggressivo in un individuo (prognosi). Gli inventori hanno anche rilevato che in particolare i quozienti tra valori di livelli di espressione di coppie di miRNA sono validi biomarcatori con funzione diagnostica e prognostica anche nel caso di tumore aggressivo. In dettaglio i miRNA di tabella VI sono stati utilizzati per determinare i quozienti di cui alla tabella Vili dove sono elencati quozienti tra i valori misurati dei livelli di espressione relativi a coppie di microRNA di cui alla tabella VI utilizzati per la determinazione della presenza attuale di un tumore polmonare aggressivo in individuo. In dettaglio rilevando almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella Vili si può definire come individuo in cui à ̈ presente un tumore polmonare aggressivo un individuo per il quale almeno 60% dei quozienti reali che siano stati calcolati devia rispetto al rispettivo valore di controllo.
Quindi, l’uso della metodologia descritta può aiutare a risolvere anche il problema della sovra-diagnosi e del sovra-trattamento di pazienti non a rischio.
Più detagliatamente in un contesto di sorveglianza della malatia tramite TAC a spirale l’utilizzo di un test basato su questo metodo potrebbe permetere di selezionare solo un sotogruppo di pazienti ad alto rischio di sviluppare la malattia da tenere successivamente soto più stretto controllo. Inoltre la capacità del test di predire i pazienti che svilupperanno una malatia più aggressiva, frequentemente non diagnosticati dalla TAC, permete di indirizzare diretamente questi individui a programmi farmacologici mirati (inclusa la cessazione del fumo), e/o all’uso di esami diagnostici più specifici basati sulle carateristiche metaboliche-biologiche quali la PET con diversi traccianti o la MR corporea, o ad un diverso tratamento locale come la radioterapia stereotassica, o altri tratamenti ancora.
Infine, l’uso dei “miRNA ratios†à ̈ un metodo facilmente applicabile con un potenziale per l’uso clinico corrente e che permete di evitare l’uso di analisi più estese e complesse.
Esempi
1. Identificazione firma o “signature†basata sui miRNA in grado di identificare individui a rischio di sviluppare tumore polmonare (Figura 4A)
I campioni di plasma raccolti 1-2 anni prima da pazienti a cui à ̈ stato in seguito diagnosticato un tumore tramite TAC spirale sono stati analizzati e confrontati con i pool di controllo, costituiti da individui sani.
Nel training set à ̈ stata così individuata una “signature†di 14 quozienti miRNA o “miRNA ratios†composta da 14 microRNA in grado di discriminare corretamente 18 su 20 campioni pre-malattia di individui che svilupperanno successivamente la malatia (sensibilità del 90%), mentre un solo pool di controlli à ̈ risultato essere positivo per questa “signature†(specificità del 80%). Nel set di validazione la sensibilità à ̈ risultata essere dell’ 80% mentre la specificità del 90% (AUC-ROC=0.85, p<0.001).
I quozienti miRNA di questo primo esempio sono di seguito elencati e sono riportati anche in figura 4A.
Qi= hsa-mirR-106a / hsa-mirR-451
Q2= hsa-mirR-140-5p / hsa-mirR-320
Q3= hsa-mirR-140-5p / hsa-mirR-451
Q4= hsa-mirR- 140-5p/ hsa-mirR-660
Q5= hsa-mirR-140-5p / hsa-mirR-92a
Q6= hsa-mirR-15b / hsa-mirR-92a
Q7= hsa-mirR-17 / hsa-mirR-451
Qg= hsa-mirR-197 / hsa-mirR-451
Q9= hsa-mirR-19b / hsa-mirR-660
Qio= hsa-mirR-221 / hsa-mirR-660
Qn= hsa-mirR-28-3p / hsa-mirR-660
Qi2= hsa-mirR-30b / hsa-mirR-92a
Qi3= hsa-mirR-30c / hs9a-mirR-451
Q14= hsa-mirR-3 Oc / hsa-mirR-660
La capacità predittiva di questa “signature†à ̈ stata validata in prelievi raccolti fino a 28 mesi prima della diagnosi di malattia con TAC spirale e i microRNA più frequentemente deregolati sono risultati: mir-660, mir 140-5p, mir 451 , mir-28-3p, mir-30c e mir-92.
2. Identificazione firma o “signature†basata sui miRNA in grado avere valore diagnostico (figura 4B)
Campioni di plasma raccolti al momento della chirurgia o al momento dell’individuazione della malattia tramite TAC a spirale sono stati confrontati con i pool dei controlli. Nel training set un pannello di 16 “miRNA ratios†, composti da 13 microRNA, classificano correttamente 16 su 19 pazienti con una sensibilità dell’84% e una specificità dell’80%. Nel set di validazione la sensibilità à ̈ del 75% e la specificità del 100% (AUC-ROC=0.88, pO.OOOl). Una più bassa sensibilità nel set di validazione può essere correlata con la presenza di un maggior numero di piccoli noduli indolenti, di cui farebbero parte due pazienti i cui prelievi sono mis-classificati sia dalla “signature†di rischio nei prelievi pre-malattia, che da quella di diagnosi nei prelievi in presenza di malattia.
I quozienti miRNA di questo secondo esempio sono di seguito elencati e sono riportati anche in figura 4B.
Qi= hsa-mirR-106a/ hsa-mirR-140-3p
Q2= hsa-mirR-106a/ hsa-mirR-30c
Q3= hsa-mirR-106a/ hsa-mirR-486-5p
Q4= hsa-mirR-140-3p/ hsa-mirR-17
Q5= hsa-mirR-140-5p/ hsa-mirR-660
Q6= hsa-mirR-15b/ hsa-mirR-660
Q7= hsa-mirR-15b/ hsa-mirR-92a
Qs= hsa-mirR-17/ hsa-mirR-30c
Q9= hsa-mirR-17/ hsa-mirR-451
QI0= hsa-mirR-17/ hsa-mirR-486-5p
Qn= hsa-mirR-19b/ hsa-mirR-451
Qi2= hsa-mirR-19b/ hsa-mirR-660
Qi3= hsa-mirR-19b/ hsa-mirR-92a
Q 14= hsa-mirR-21 / hsa-mirR-92a
Qi5= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-660
Qi6= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-92a
Questa “signature†di diagnosi à ̈ stata poi usata per verificare la presenza di malattia nei campioni di plasma collezionati prima dell’individuazione della malattia tramite TAC a spirale. Nel training set 11 su 20 (55%) dei casi vengono classificati come in presenza di malattia e, cosa molto interessante, di questi 11 ben 10 sono o di casi a cattiva prognosi o appartenenti a pazienti in cui il tumore à ̈ stato identificato negli anni più tardivi dello screening ossia laddove si sono identificati tumori più aggressivi ed a peggior prognosi. Nel set di validazione si sono ottenuti risultati molto simili, poiché in 10 su 15 (66.6%) campioni premalattia presentano la “signature†della presenza di malattia. Sono solo 4 i “miRNA ratios†in comune tra le “signature†di rischio e di diagnosi e parzialmente differenti sono anche i microRNA coinvolti: mir-17, mir-660, mir92a, mir-106a, mir-19b sono i microRNA maggiormente deregolati al momento della diagnosi di tumore al polmone.
3. Identificazione di una firma o “signature†basata sui miRNA per rischio di sviluppo di tumore polmonare aggressivo
Sono stati analizzati i profili di microRNA dei campioni pre-malattia con prognosi sfavorevole e individuati 10 “miRNA ratios†in grado di riconoscere 5 su 5 pazienti nel primo set, 4 su 5 nel set di validazione e con una specificità in entrambe del 100%. Si noti che mir-221, mir-660, mir-486-5p, mir-28-3p, mir-197, mir- 106a, mir-451 , mir- 140-5p e mir- 16 sono i microRNA deregolati.
I quozienti miRNA di questo terzo esempio sono di seguito elencati e sono riportati anche in figura 4C.
Qi= hsa-mirR-106a/ hsa-mirR-660
Q2= hsa-mirR-140-5p/ hsa-mirR-486-5p
Q3= hsa-mirR- 16/ hsa-mirR- 197
Q4= hsa-mirR- 197/ hsa-mirR-486-5p
Q5= hsa-mirR- 197/ hsa-mirR-660
Q6= hsa-mirR-221 / hsa-mirR-451
Q7= hsa-mirR-221/ hsa-mirR-660
Q8= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-451
Q9= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-486-5p
Qio= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-660
Questa “signature†à ̈ stata poi testata sui campioni pre-malattia dei pazienti a buona prognosi nel training set e nel set di validazione. Tale “signature†classifica, rispettivamente nei due set, il 33.3% e il 45% dei campioni; la figura 2 rappresenta una curva di sopravvivenza Kaplan-Meier di pazienti con o senza la “signature†di rischio di malattia aggressiva: la curva con “signature†aggressiva à ̈ rappresentata a tratto continuo ed identificata da RAD+ (rischio di malattia aggressiva ) mentre la curva senza “signature†di rischio di malattia aggressiva à ̈ rappresentata a tratto discontinuo ed identificata da RAD- (rischio di malattia aggressiva -) in campioni di plasma collezionati 1-2 anni prima dell’individuazione della malattia tramite TAC a spirale.
Interessante notare che la maggior parte dei campioni individuati appartengono a individui che hanno sviluppato il tumore tra il III e il V anno dello screening, indipendentemente dal grado del tumore. Ciò supporta la precedente osservazione sui campioni di tessuto polmonare tumorale e normale, dove un diverso profilo di microRNA era presente rispettivamente nel tessuto tumorale e normale degli stessi pazienti. Va notato che tra i pazienti con tumore diagnosticato nel secondo anno di screening (tutti tumori stage la e Ib), solo un caso con tumore stage Ib ha avuto la “signature†di rischio aggressivo.
4. Identificazione di una firma o “signature†basata sui miRNA per prognosi di pazienti individuati tramite TAC a spirale (figura 4D)
Si sono analizzati i campioni di pazienti a cattiva prognosi collezionati al momento della diagnosi di malattia, trovando una signature di 10 “miRNA ratios†, tutti contenenti mir-486-5p, che identifica 7 su 8 pazienti a cattiva prognosi nel training set, 2 su 3 del set di validazione e nessun pool di controllo in entrambi i set di dati.
I quozienti miRNA di questo quarto esempio sono di seguito elencati e sono riportati anche in figura 4D.
Qi= hsa-mirR-106a/ hsa-mirR-486-5p
Q2= hsa-mirR-126/ hsa-mirR-486-5p
Q3= hsa-mirR-142-3p/ hsa-mirR-486-5p
Q4= hsa-mirR-148a/ hsa-mirR-486-5p
Qs= hsa-mirR-15b/ hsa-mirR-486-5p
Q6= hsa-mirR-17/ hsa-mirR-486-5p
Q7= hsa-mirR- 197/ hsa-mirR-486-5p
Qs= hsa-mirR-21/ hsa-mirR-486-5p
Q9= hsa-mirR-221/ hsa-mirR-486-5p
Qio= hsa-mirR-28-3p/ hsa-mirR-486-5p
Inoltre solo 2 su 11 e 2 su 13 pazienti a buona prognosi, rispettivamente del primo e del secondo set, risultano essere positivi per questa “signature†; la figura 3 mostra una curva di sopravvivenza Kaplan-Meier di pazienti con o senza la “signature†di presenza di malattia aggressiva (rispettivamente identificate con tratto continuo da PAD+, sigla che sta per presenza di malattia aggressiva , e con tratto discontinuo da PAD-, sigla che sta per presenza di malattia aggressiva -) in campioni di plasma collezionati al momento dell’individuazione della malattia tramite TAC a spirale.
Inoltre, questa “signature†à ̈ stata usata per classificare i campioni pre-malattia in entrambe i dataset. Metà dei pazienti a cattiva prognosi risulta avere anche questa “signature†di aggressività, mentre per quelli a buona prognosi dei 6 positivi per questa “signature†5 sono di tumori individuati dopo il terzo anno di screening.
Si nota che mir-486-5p, confrontato con mir-21, mir-126, mir-15b, mir-148a, mir-142-3p, mir-17, mir-197, mir-221, mir-28-3p e mir-106a, risulta essere sempre sotto espresso nel plasma di pazienti con una prognosi sfavorevole. Dai risultati sopra riportati, gli inventori hanno dedotto che i microRNA presenti nel plasma sono utili per individuare la presenza del tumore polmonare anche 1-2 anni prima della rilevazione con la TAC spirale e di predire inoltre lo sviluppo dei tipi di cancro polmonare più aggressivi, indicando la possibilità di selezionare individui ad alto rischio sulle basi dei profili di microRNA circolanti.
Kits ed apparecchiature per determinazione di marcatori biomolecolari presenti in un campione di fluido biologico umano utilizzabili per determinazione rischio.
Gli inventori hanno anche concepito kit medicali utili per efficacemente e semplicemente mettere in opera i metodi sopra descritti per la determinazione del rischio di contrarre un tumore, ad esempio utilizzando un campione di sangue prelevato da un individuo.
Nella sua forma generale il kit comprende una piattaforma avente una pluralità di siti ciascuno dei quali à ̈ destinato a ricevere una rispettiva quantità discreta di detto campione di fluido biologico (ad esempio sangue intero, siero, plasma, saliva o condensato bronchiale). Ciascun sito comprende un reagente capace di legarsi con almeno un rispettivo dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, in modo da consentirne la rilevabilità con le apparecchiature di seguito descritte. Sotto il profilo strutturale la piattaforma può essere in supporto del tipo micro-fluidic card con i miRNA di interesse e con canalizzazioni per la distribuzione nei rispettivi siti di un prefissato numero di campioni di fluido biologico.
Ad esempio tale include almeno uno selezionato nel gruppo comprendente:
- un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, - un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide complementare a quella di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II,
- sonda molecolare configurata per riconoscere una sequenza di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II.
Il kit medicale descritto può poi essere utilizzato con un apparecchiatura medicale comprendente un unità definente una sede per ricevere uno o più kit e mezzi per determinare il valore del livello di espressione dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II. I mezzi per determinare il valore del livello di espressione comprendono una delle tecniche selezionate nel gruppo:
Quantitative Real-time PCR ( PCR quantitativa in tempo reale) Microfluidic cards ( chip microfluidici)
Microarrays ( microchips)
RT (trascrizione inversa)-PCR quantitativa o semiquantitativa Northern blot
Solution Hybridization ( ibridizzazione in soluzione) Sequencing (Sequenziamento)
L’apparecchiatura può anche presentare mezzi per calcolare i valori dei quozienti reali tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella III e/o di cui alla Tabella IV; tali mezzi possono comprendere un programma ed un’unità di elaborazione in cui il programma contiene istruzioni che quando eseguite dall’elaboratore permettono il calcolo dei citati quozienti, Alternativamente può essere previsto un circuito analogico capace di effettuare i medesimi calcoli.
Kits ed apparecchiature per determinazione di marcatori biomolecolari presenti in un campione di fluido biologico umano utilizzabili per diagnosi tumore.
Gli inventori hanno anche concepito kit medicali utili per efficacemente e semplicemente mettere in opera i metodi sopra descritti per diagnosi di tumore, ad esempio utilizzando un campione di sangue prelevato da un individuo.
Nella sua forma generale il kit comprende una piattaforma avente una pluralità di siti ciascuno dei quali à ̈ destinato a ricevere una rispettiva quantità discreta di detto campione di fluido biologico (ad esempio sangue intero, siero, plasma, saliva o condensato bronchiale). Sotto il profilo strutturale la piattaforma può essere in supporto del tipo micro-fluidic card con i miRNA di interesse e con canalizzazioni per la distribuzione nei rispettivi siti di un prefissato numero di campioni di fluido biologico. Ciascun sito comprende un reagente capace di legarsi con almeno un rispettivo dei microRNA di cui alla Tabella V e/o alla Tabella VI.
Ad esempio il reagente include almeno uno selezionato nel gruppo comprendente:
- un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella V e/o alla Tabella VI; - un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide complementare a quella di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella V e/o alla Tabella VI;
- una sonda molecolare configurata per riconoscere una sequenza di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella V e/o alla Tabella VI.
Il kit medicale descritto può poi essere utilizzato con un apparecchiatura medicale comprendente un unità definente una sede per ricevere uno o à ̈ più dei kit di cui alla rivendicazione precedente, e mezzi per determinare il valore del livello di espressione dei microRNA di cui alla Tabella V e/o alla Tabella VI. I mezzi per determinare il valore del livello di espressione comprendono uno selezionato nel gruppo:
Quantitative Real-time PCR ( PCR quantitativa in tempo reale), Microfluidic cards ( chip microfluidici),
Microarrays ( microchips),
RT (trascrizione inversa)-PCR quantitativa o semiquantitativa, Northern blot,
Solution Hybridization (ibridizzazione in soluzione), Sequencing (Sequenziamento).
L’apparecchiatura prevede anche mezzi per calcolare i valori dei quozienti reali tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA, detti quozienti essendo selezionati tra quelli di Tabella VII e/o di Tabella Vili. Tali mezzi possono comprendere un programma ed un’unità di elaborazione in cui il programma contiene istruzioni che quando eseguite dall’elaboratore permettono il calcolo dei citati quozienti. Alternativamente può essere previsto un circuito analogico capace di effettuare i medesimi calcoli.
Composizioni e terapie
Gli inventori hanno poi sviluppato un metodo per trattare un individuo a cui sia stato diagnosticata la presenza di un tumore polmonare o a cui sia stato identificato un rischio di sviluppare un tumore polmonare, rispettivamente per la cura di detto tumore polmonare o per ridurre e/o eliminare il rischio di sviluppare un tumore polmonare.
II metodo comprende le seguenti fasi di misurare un livello di espressione di almeno un miRNA listato nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI presente in un campione di fluido biologico previamente prelevato da detto individuo, e quindi determinare i miRNA aventi valori misurati del livello di espressione che deviano rispetto ad un prefissato e rispettivo criterio di controllo. La valutazione della deviazione rispetto ad un criterio di controllo può utilizzare le metodologie dei quozienti miRNA sopra descritte per i vari casi.
Una volta determinati i miRNA sovraespressi o sottoespressi il metodo prevede di alterare il livello di espressione dei miRNA i cui livelli di espressione deviano rispetto al rispettivo criterio di controllo.
Ad esempio per alterare il livello di espressione dei miRNA à ̈ possibile amministrare all’individuo una composizione farmaceutica avente un quantitativo efficace di almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI se il livello di espressione misurato di tale o tali miRNA à ̈ inferiore ad un rispettivo livello di espressione di controllo.
Alternativamente o in aggiunta a quanto sopra, à ̈ anche possibile amministrare all’individuo una composizione farmaceutica avente un quantitativo efficace di almeno una composizione per inibire l’espressione di almeno uno dei miRNA listati nella Tabella I o nella Tabella II o nella Tabella V o nella Tabella VI se e per quei miRNA il cui livello di espressione misurato à ̈ superiore al livello di espressione di controllo.
In questo modo à ̈ possibile ripristinare i valori di livello di espressione al livello di espressione di controllo per i miRNA sottoespressi rispetto al rispettivo livello di espressione di controllo e/o ridurre il livello di espressione per i miRNA sovraespressi.
Al fine di ripristinare il livello dei mRNA sottoespressi si può amministrare una quantità terapeuticamente efficace di una composizione comprendente almeno uno dei miRNA di cui alla Tabella I o alla Tabella II o alla Tabella V o alla Tabella VI chimicamente sintetizzato ( miRNA mimetici) o ricombinante.
Al fine di ridurre i valori di livello di espressione al livello di espressione di controllo per i miRNA sovraespressi rispetto al rispettivo livello di espressione di controllo, si può amministrare una quantità terapeuticamente efficace di una composizione comprendente almeno un inibitore di un microRNA di cui alla Tabella I o alla Tabella II o alla Tabella V o alla Tabella VI. Tale inibitore comprende ad esempio uno o più dei seguenti: RNA a doppio filamento, opzionalmente brevi RNA interferenti (siRNA), acidi nucleici antisenso (antimiRNA oligonucleotidi (AMOs), molecole di RNA enzimatiche (ribozimi). L’ inibitore à ̈ indirizzato ad uno specifico prodotto di microRNA e interferisce con l’espressione (mediante inibizione della traduzione o induzione della degradazione) di un gene bersaglio del microRNA.
La somministrazione delle composizioni di cui sopra (microRNA sintetici o miRNA mimetici e inibitori di microRNA) può ad esempio avvenire mediante sistemi virali o nanoparticelle contenenti microRNA o inibitore di microRNA coniugati in maniera covalente con lipidi o encapsulati in liposomi.
Le vie di somministrazione possono essere le seguenti, eventualmente anche combinate tra loro:
a) instillazione intranasale
b) inalazione (aerosol)
c) sistemica ( iniezione o infusione)
d) inoculo diretto nel tumore (ove presente e visibile)
e) somministrazione intrapleurica
f) somministrazione endopleurica
A livello di dosaggio si può procedere con dosaggio continuo e prolungato nel tempo. Essendo molecole miRNA “naturalmente†presenti nell’ organismo non si prevedono tossicità rilevanti.
Tabella I: microRNA utilizzati per valutazione rischio di manifestare tumore polmonare (entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico)
hsa-miR-45 1
hsa-miR-320
hsa-miR-660
hsa-miR-92a
hsa-miR-106a
hsa-miR-140-5p
hsa-miR-15b
hsa-miR-17
hsa-miR-197
hsa-miR-19b
hsa-miR-221
hsa-miR-28-3p
hsa-miR-30b
hsa-miR-30c
hsa-miR-145
hsa-miR-16
hsa-miR-133a
Tabella II: microRNA utilizzati per valutazione rischio di manifestare tumore polmonare aggressivo (entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico)
hsa-miR-106a
hsa-miR-660
hsa-miR-140-5p
hsa-miR-486-5p
hsa-miR-16
hsa-miR-197
hsa-miR-22 1
hsa-miR-45 1
hsa-miR-28-3p
Tabella III: quozienti tra valori misurati livelli di espressione coppie di microRNA utilizzati per valutazione rischio di contrarre tumore polmonare (entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico)
Qi= hsa-miR-106a / hsa-miR-660
Q2= hsa-miR- 106a / hsa-miR-45 1
Q3= hsa-miR- 106a / hsa-miR-320
Q4= hsa-miR- 106a / hsa-miR-92a
Q5= hsa-miR- 140-5 p / hsa-miR-320
QÉ= hsa-miR- 140-5p / hsa-miR-45 1
Q7= hsa-miR- 140-5 p/ hsa-miR-660
Qg= hsa-miR- 140-5p / hsa-miR-92a
Q9= hsa-miR-30b / hsa-miR-45 1
Qio= hsa-miR-30b / hsa-miR-660
Qu= hsa-miR-30b / hsa-miR-92a
Q 12= hsa-miR-3 Ob / hsa-miR-3 20
Qn= hsa-miR-28-3p / hsa-miR-320
QM= hsa-miR-28-3p / hsa-miR-45 1
Qi5= hsa-miR-28-3p / hsa-miR-660
Qi6= hsa-miR-28-3p / hsa-miR-92a
Qn= hsa-miR- 15b / hsa-miR-45 1
Qig= hsa-miR-15b / hsa-miR-660
Qi9= hsa-miR-15b / hsa-miR-320
Q2O= hsa-miR- 15b / hsa-miR-92a
Q2]= hsa-miR-17 / hsa-miR-45 1
Q22= hsa-miR- 17 / hsa-miR-660
Q23= hsa-miR- 17 / hsa-miR-320
Q24= hsa-miR- 17 / hsa-miR-92a
Q25= hsa-miR- 197 / hsa-miR-45 1
Q26= hsa-miR- 197 / hsa-miR-92a
Q27= hsa-miR- 197 / hsa-miR-660
Q2g= hsa-miR- 197 / hsa-miR-320
Q29= hsa-miR- 19b / hsa-miR-660
Q3O= hsa-miR-19b / hsa-miR-320
Q3I= hsa-miR-19b / hsa-miR-451
Q32= hsa-miR-19b / hsa-miR-92a
Q33<~>hsa-miR-221 / hsa-miR-660
Q34= hsa-miR-221 / hsa-miR-45 1
Q35= hsa-miR-221 / hsa-miR-320
Q36= hsa-miR-221 / hsa-miR-92a
Q37= hsa-miR-145 / hsa-miR-660
Q3g= hsa-miR-145 / hsa-miR-451
Q39= hsa-miR-145 / hsa-miR-320
Q4O= hsa-miR-145 / hsa-miR-92a
Q4I= hsa-miR-30c / hsa-miR-45 1
Q42= hsa-miR-30c / hsa-miR-660
Q43= hsa-miR-30c / hsa-miR-320
Q44= hsa-miR-30c / hsa-miR-92a
Q45= hsa-miR-133a / hsa-miR-660
Q46= hsa-miR-133a / hsa-miR-451
Q47= hsa-miR-133a / hsa-miR-320
Q4g= hsa-miR-133a / hsa-miR-92a
Q49= hsa-miR-16 / hsa-miR-660
(3⁄4ο= hsa-miR- 16 / hsa-miR-45 1
Q5i= hsa-miR-16 / hsa-miR-320
Q52= hsa-miR-16 / hsa-miR-92a
Tabella IV: quozienti tra valori misurati livelli di espressione coppie di microRNA utilizzati per valutazione rischio di manifestare tumore polmonare aggressivo (entro 1-3 anni da prelievo campione di fluido biologico)
Qi= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-660
(3⁄4= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-451
Q3= hsa-miR-106a/ hsa-miR-486-5p
Q4= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-16
Q5= hsa-miR- 140-5p/ hsa-miR-486-5p
Q6= hsa-miR- 140-5p/ hsa-miR-660
Q7= hsa-miR- 140-5p/ hsa-miR-451
Qs= hsa-miR-140-5p/ hsa-miR-16 Q9= hsa-miR-197/ hsa-miR-451 Qio= hsa-miR-197/ hsa-miR-486-5p Qn= hsa-miR-197/ hsa-miR-660 Qi2= hsa-miR-197/ hsa-miR-16 Qn= hsa-miR-221/ hsa-miR-451 QH= hsa-miR-221/ hsa-miR-660 Qi5= hsa-miR-221/ hsa-miR-486-5p Qi6= hsa-miR-221/ hsa-miR-16 Q17= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-451 Qis= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-486-5p Qi9= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-660 Q2O<=>hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-16 Tabella V: microRNA utilizzati per determinazione presenza attuale tumore polmonare in un individuo
hsa-miR-106a
hsa-miR-140-3p
hsa-miR-486-5p
hsa-miR-17
hsa-miR-660
hsa-miR-15b
hsa-miR-92a
hsa-miR-451
hsa-miR-19b
hsa-miR-28-3p
hsa-miR-133a
hsa-miR-16
hsa-miR-101
Tabella VI: microRNA utilizzati per determinazione presenza attuale di tumore polmonare aggressivo in un individuo
hsa-miR-106a
hsa-miR-142-3p
hsa-miR-148a
hsa-miR-15b
hsa-miR-17
hsa-miR-197
hsa-miR-21
hsa-miR-221
hsa-miR-28-3p
hsa-miR-660
hsa-miR-19b
hsa-miR-486-5p
hsa-miR-126
Tabella VII: quozienti tra valori misurati livelli di espressione coppie di microRNA utilizzati per determinazione presenza attuale di tumore polmonare in un individuo
Qi= hsa-miR-106a/ hsa-miR-140-3p
Q2= hsa-miR- 106a/ hsa-miR- 10 1
Q3= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-486-5p
Q4= hsa-miR- 106a/ hsa-miR- 16
Q5= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-660
Qe= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-92a
Q7= hsa-miR- 106a/ hsa-miR-451
Qs= hsa-miR- 133a/ hsa-miR-451
Q9= hsa-miR-133a/ hsa-miR-92a
Qio= hsa-miR-133a/ hsa-miR- 140-3p
Qn= hsa-miR-133a/ hsa-miR-101
Qi2= hsa-miR-133a/ hsa-miR-486-5p
Qi3= hsa-miR-133a/ hsa-miR-660
Qi4= hsa-miR-133a/ hsa-miR-16
Qi5= hsa-miR- 15b/ hsa-miR-660
Qie= hsa-miR- 15b/ hsa-miR-92a
Qi7= hsa-miR-15b/ hsa-miR-45 1
Qi8= hsa-miR-15b/ hsa-miR- 140-3p
Qi9= hsa-miR-15b/ hsa-miR-101
Q2O= hsa-miR- 15b/ hsa-miR-486-5p
Q2I= hsa-miR- 15b/ hsa-miR- 16
Q22= hsa-miR- 17/ hsa-miR- 101
Q23= hsa-miR- 17/ hsa-miR-451
Q24= hsa-miR- 17/ hsa-miR-486-5p
Q25= hsa-miR- 17/ hsa-miR-660
Q26= hsa-miR- 17/ hsa-miR-92a
Q27= hsa-miR- 17/ hsa-miR- 16
Q2g= hsa-miR-17/ hsa-miR- 140-3p
Q29~ hsa-miR- 19b/ hsa-miR-451
(3⁄4ο= hsa-miR- 19b/ hsa-miR-660
Q3I= hsa-miR-19b/ hsa-miR-92a
Q32= hsa-miR-19b/ hsa-miR-486-5p
Q33— hsa-miR-19b/ hsa-miR-101
Q34= hsa-miR-19b/ hsa-miR-16
Q35= hsa-miR- 19b/ hsa-miR- 140-3p
Q36= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-660
Q37= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-92a
Q38= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-451
Q39= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-140-3p
Q4o= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-486-5p
Q4I= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-101
(3⁄42= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR- 16
Tabella Vili: quozienti tra valori misurati livelli di espressione coppie di microRNA utilizzati per determinazione presenza attuale tumore polmonare aggressivo in individuo
Qi= hsa-miR-106a/ hsa-miR-486-5p
(3⁄4= hsa-miR-106a/ hsa-miR-19b
Q3= hsa-miR-106a/ hsa-miR-660
Q4= hsa-miR-142-3p/ hsa-miR-486-5p
Q5= hsa-miR-142-3p/ hsa-miR-660
QÓ= hsa-miR-142-3p/ hsa-miR-19b
Q7= hsa-miR-148a/ hsa-miR-486-5p
Qs= hsa-miR-148a/ hsa-miR-660
(3⁄4— hsa-miR-148a/ hsa-miR-19b
Qio= hsa-miR-15b/ hsa-miR-486-5p
Qn= hsa-miR-15b/ hsa-miR-19b
Qi2= hsa-miR-15b/ hsa-miR-660
Qi3= hsa-miR-17/ hsa-miR-486-5p
Qi4= hsa-miR-17/ hsa-miR-660
Qi5= hsa-miR-17/ hsa-miR-19b
Qi6= hsa-miR-197/ hsa-miR-486-5p
Qi7= hsa-miR-197/ hsa-miR-660
Qis= hsa-miR-197/ hsa-miR-19b Qi9= hsa-miR-21/ hsa-miR-486-5p Q2O= hsa-miR-21/ hsa-miR-660 Q2I= hsa-miR-21/ hsa-miR-19b Q22= hsa-miR-221/ hsa-miR-486-5p Q23= hsa-miR-221/ hsa-miR-660 Q24= hsa-miR-221/ hsa-miR-19b Q25= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-486-5p Q26= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-660 Q27= hsa-miR-28-3p/ hsa-miR-19b Q2g= hsa-miR-126/ hsa-miR-486-5p Q29= hsa-miR-126/ hsa-miR-660 (3⁄4o= hsa-miR- 126/ hsa-miR- 19b

Claims (16)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per identificare individui a rischio di tumore polmonare, detto procedimento comprendendo le fasi di: misurare, in almeno un campione di fluido biologico previamente prelevato da un soggetto, un valore del livello di espressione di una pluralità di molecole microRNA; determinare quando detti valori misurati del livello di espressione deviano rispetto ad un prefissato e rispettivo criterio di controllo.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detta fase di determinare comprende le seguenti sottofasi: calcolare una pluralità di quozienti reali determinati effettuando il rapporto tra i valori misurati dei livelli di espressione di un prefissato numero di coppie di dette molecole di microRNA; comparare ciascuno di detti quozienti reali con un rispettivo valore di controllo; determinare i quozienti reali che si discostano dal rispettivo valore di quoziente controllo.
  3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione precedente comprendente una fase di determinazione del numero o della percentuale di quozienti reali che si discostano dal rispettivo valore di controllo.
  4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni comprendente una fase di definire come individuo a rischio un individuo per il quale almeno un prefissato numero o una prefissata percentuale di detti quozienti reali devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
  5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 2 o 3 o 4, in cui per ciascuno di detti quozienti calcolati à ̈ associato un rispettivo quoziente di controllo rappresentato dal rapporto dei valori di espressione per i medesimi microRNA in un campione di controllo relativo ad un fluido biologico dello stesso tipo.
  6. 6. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni comprendente la fase di correlare la deviazione di un prefissato numero o una prefissata percentuale di livelli di espressione rispetto ai corrispondenti criteri di controllo alla presenza o assenza di rischio che l’individuo manifesti clinicamente un tumore polmonare in un tempo prefissato, opzionalmente compreso tra uno e tre anni, ancor più opzionalmente entro 28 mesi.
  7. 7. Procedimento secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni comprendente la fase di correlare la deviazione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale di livelli di espressione rispetto ai corrispondenti criteri di controllo alla presenza o assenza di rischio che l’individuo manifesti clinicamente un tumore polmonare aggressivo in un tempo prefissato, opzionalmente compreso tra uno e tre anni, ancor più opzionalmente entro 28 mesi.
  8. 8. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7 in cui calcolare detta pluralità di quozienti reali comprende utilizzare i valori di espressione di un prefissato numero o di una prefissata percentuale dei miRNA di cui alla Tabella I e/o di cui alla Tabella II.
  9. 9. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 8 in cui calcolare detta pluralità di quozienti reali comprende determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti tra i valori dei livelli di espressione, tali quozienti essendo selezionati nel gruppo comprendente quozienti tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella III, opzionalmente in cui vengono determinati almeno il 20%, più opzionalmente almeno il 50% ed ancor più opzionalmente tutti i quozienti di cui alla Tabella III.
  10. 10. Procedimento secondo la precedente rivendicazione in cui determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 20% dei quozienti reali di cui alla Tabella III ed in cui comprende una fase di definire come individuo a rischio di tumore polmonare, opzionalmente in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 30% , opzionalmente almeno il 50%, dei quozienti reali calcolati devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
  11. 11. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 8 in cui calcolare detta pluralità di quozienti reali comprende determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti tra i valori dei livelli di espressione, tali quozienti essendo selezionati nel gruppo comprendente quozienti tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella IV, opzionalmente in cui vengono determinati almeno il 30%, più opzionalmente almeno il 50% ed ancor più opzionalmente tutti i quozienti di cui alla Tabella IV.
  12. 12. Procedimento secondo la precedente rivendicazione in cui determinare un prefissato numero o una prefissata percentuale di quozienti prevede di calcolare almeno il 30% dei quozienti reali di cui alla Tabella IV ed in cui comprende una fase di definire come individuo a rischio di tumore polmonare aggressivo, opzionalmente in un periodo compreso tra uno e tre anni dal prelievo del campione di fluido biologico, un individuo per il quale almeno il 50% opzionalmente almeno il 75% di detti quozienti reali calcolati devia rispetto al rispettivo valore di quoziente controllo.
  13. 13. Procedimento secondo la rivendicazione un qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui le fasi di detto procedimento sono condotte in vitro ed in cui detto fluido biologico à ̈ uno selezionato nel gruppo comprendente: sangue intero, una frazione di sangue, plasma, siero; e/o in cui detto tumore polmonare à ̈ uno selezionato nel gruppo comprendente: cancro polmonare a piccole cellule (SCLC), cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC), adenocarcinoma polmonare (ADC), carcinoma broncoalveolare (BAC), carcinoma polmonare a cellule squamose (SCC), carcinoma a grandi cellule (LC).
  14. 14. Procedimento secondo la rivendicazione un qualsiasi delle precedenti rivendicazioni in cui detto campione di fluido biologico à ̈ proveniente da un individuo fumatore che, al momento del prelievo del campione, non evidenzia tumore polmonare se sottoposto a metodiche di diagnosi per immagine, in particolare non evidenzia noduli di dimensioni superiori a 5mm se sottoposto a TAC spirale.
  15. 15. Kit medicale per la determinazione di marcatori biomolecolari presenti in un campione di fluido biologico umano, detto kit comprendendo un supporto avente una pluralità di siti ciascuno dei quali à ̈ destinato a ricevere una rispettiva quantità discreta di detto campione di fluido biologico, ciascuno di detti siti comprendendo un reagente capace di legarsi con almeno un rispettivo dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, opzionalmente in cui detto reagente include almeno uno selezionato nel gruppo comprendente: - un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, - un polinucleotide comprendente una sequenza nucleotide complementare a quella di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, - sonda molecolare configurata per riconoscere una sequenza di almeno uno dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II.
  16. 16. Apparecchiatura medicale comprendente, - un unità definente una sede per ricevere uno o più dei kit di cui alla rivendicazione precedente, - mezzi per determinare il valore del livello di espressione dei microRNA di cui alla Tabella I e/o alla Tabella II, - mezzi per calcolare i valori dei quozienti reali tra valori di livelli di espressione di coppie di microRNA di cui alla Tabella III e/o di cui alla Tabella IV; opzionalmente in cui i mezzi per determinare il valore del livello di espressione comprendono una delle tecniche selezionate nel gruppo: Quantitative Real-time PCR (PCR quantitativa in tempo reale), Microfluidic cards (chip microfluidici), Microarrays (microchips), RT (trascrizione inversa) - PCR quantitativa o semiquantitativa, Northern blot, Solution Hybridization (ibridizzazione in soluzione), Sequencing (Sequenziamento totale).
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