ITMI20110143A1 - Nuova associazione per il trattamento del dolore - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

“Nuova associazione per il trattamento del doloreâ€

La presente invenzione ha per oggetto una nuova associazione per il trattamento del dolore, in particolare l’associazione di betacariofillene e acido docosaesaenoico, come pure le composizioni farmaceutiche, nutraceutiche e /o dietetiche e gli alimenti che la contengono. Contesto tecnico

Il dolore si divide, in base alla sua durata, in acuto e cronico. Il dolore di breve durata, generalmente associato a un danno tissutale o a stimoli dolorosi (per es.: il dolore associato a una piccola ustione, a un taglio, ecc) viene definito “dolore acuto†, ha un valore adattivo in quanto ci avverte della presenza e della localizzazione di una lesione e consente di correggere quei comportamenti che ne sono la causa o che contribuiscono ad essa.

Al contrario, il dolore che persiste oltre al tempo necessario per la risoluzione della malattia acuta, ed à ̈ spesso associato a processi patologici cronici e/o evolutivi, viene definito “dolore cronico†. Nella maggior parte delle patologie croniche, il dolore perde la sua funzione di utilità e conserva solo l’aspetto negativo di interferenza con le normali attività personali, familiari e sociali ed à ̈ certamente in grado di compromettere la qualità della vita dei soggetti che ne soffrono. Inoltre con il persistere del dolore, l’individuo può arrivare a evitare determinate attività per paura di ulteriori lesioni o per paura che il dolore aumenti. A mano a mano che le attività diminuiscono, i muscoli si possono indebolire, il peso corporeo aumentare/diminuire e le condizioni fisiche generali peggiorare.

Il trattamento del dolore, in particolare del dolore cronico, prevede l’uso di svariate sostanze, generalmente di natura sintetica (come i farmaci antiinfiammatori non steroidei, gli oppiodi, ecc), con le quali si induce l’analgesia, cioà ̈ la riduzione della sensazione dolorosa. I trattamenti possono essere necessari per lunghi periodi, a volte anche per tutta la vita. In molti casi quindi i pazienti sostengono per molto tempo terapie ad effetto analgesico che, com’à ̈ noto, contemporaneamente agiscono su molti distretti dell’organismo provocando morbilità importanti e spesso bassissima qualità della vita.

Oltre agli effetti collaterali tossici, un altro grave problema degli analgesici di uso corrente à ̈ rappresentato dall’assuefazione e dalla dipendenza che creano nel soggetto trattato, in particolare nelle terapie croniche.

Nonostante i numerosi sforzi e le immense risorse economiche impiegate al fine di raggiungere la produzione di un prodotto capace di raggiungere un’analgesia scevra di effetti collaterali, ad oggi le numerose sostanze disponibili testimoniano la mancanza di una soluzione reale.

Una valida terapia per il trattamento del dolore, soprattutto di quello cronico, rimane pertanto un grave problema da risolvere.

Scopi dell’invenzione

Scopo della presente invenzione à ̈ di fornire un’associazione di sostanze che eserciti un’azione antidolorifica efficace e che sia poco tossica per l’organismo.

Un altro scopo della presente invenzione à ̈ di fornire un’associazione di sostanze ad effetto analgesico, che non produca assuefazione e che non dia dipendenza.

Un altro scopo della presente invenzione à ̈ di fornire un’associazione di sostanze che contribuisca al miglioramento della qualità della vita di pazienti affetti da dolore di diverso tipo, ad esempio da dolore cronico.

Descrizione dell’invenzione

Secondo uno dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto una associazione comprendente betacariofillene (BCP) e acido docosaesaenoico (DHA).

Il betacariofillene, qui di seguito anche solo “BCP†, (CAS RN 87-44-5) à ̈ un sesquiterpene biciclico naturale presente in molti oli essenziali avente la formula seguente:

È commercialmente disponibile, generalmente in forma di miscela di oli, in cui la percentuale (p/p) di BCP può variare largamente. Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il BCP, quando in miscela liquida con altri oli, à ̈ contenuto in tale miscela in alte percentuali, vantaggiosamente in percentuali di circa 70-90%, ad esempio di circa 80%.

L’acido docosaesaenoico, qui di seguito anche solo “DHA†à ̈ un acido grasso essenziale a lunga catena appartenente alla famiglia degli Omega-3 avente la formula seguente:

O

H O

È commercialmente disponibile, generalmente in forma di miscela di oli, in cui la percentuale (p/p) di DHA può variare largamente. Secondo una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, il DHA quando in miscela liquida con altri oli, à ̈ contenuto in tale miscela in buone percentuali, vantaggiosamente in percentuali di circa 30-50%, ad esempio di circa 35-45%. Attualmente sono ad esempio commercialmente disponibili miscele al 38%.

L’associazione dell’invenzione comprende BCP e DHA in un qualsiasi rapporto reciproco. Secondo una forma di realizzazione vantaggiosa, l’associazione comprende BCP e DHA in un rapporto di da 3/1 a 1/1, vantaggiosamente di circa 2/1 (p/p), tale rapporto essendo riferito al peso delle due sostanze attive “pure†. L’esperto del ramo può facilmente calcolare la quantità di BCP e DHA commerciali (che, come detto, sono allo stato liquido in miscela con altri oli) da combinare al fine di ottenere il rapporto di sostanze attive desiderato.

Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha per oggetto una associazione comprendente betacariofillene (BCP) e acido docosaesaenoico (DHA) per l’uso nel trattamento del dolore acuto e cronico, in particolare del dolore cronico.

A titolo di esempio, l’associazione può essere utilizzata nel trattamento di artralgie, emicranie, mal di schiena, nevralgie, sciatalgie, fibromi algie, dolori muscolo-scheletrici, coliti, dolori pelvici, nelle affezioni dolorose ormono-dipendenti, nel dolore post-operatorio, nel dolore conseguente ad affezioni tumorali, ecc.

Si à ̈ infatti trovato che l’associazione presenta una migliore efficacia nel trattamento degli stati dolorosi, rispetto al trattamento con il solo BCP.

Inoltre, si à ̈ trovato che la presenza del DHA contribuisce a ridurre fortemente la tossicità del BCP, tale effetto essendo del tutto sorprendente ed inatteso.

Dei saggi sperimentali a dimostrazione dell’efficacia terapeutica dell’associazione e della riduzione della tossicità del BCP indotta dalla presenza del DHA, sono riportati nella Sezione Sperimentale della presente descrizione.

Sono altresì riportati i dati spettroscopici dell’associazione che ne dimostrano la stabilità fisico-chimica.

Per l’uso secondo l’invenzione, l’associazione à ̈ somministrata ai mammiferi e preferibilmente all’uomo, per via orale.

L’associazione può essere somministrata tale e quale, cioà ̈ come miscela delle due sostanze attive, oppure formulata in composizioni farmaceutiche, nutraceutiche e/o dietetiche.

Le composizioni farmaceutiche, nutraceutiche e/o dietetiche possono essere in una qualsiasi forma appropriata e in combinazione con qualsivoglia veicolo e/o additivo e/o eccipiente convenzionalmente impiegato, purché compatibile con le sostanze dell’associazione.

A titolo di esempio, le composizioni possono presentarsi in forma di gocce, sciroppo, granulato, capsule, perle, ecc., e presentate in unità di dosaggio in contenitori monodose o in contenitori multidose.

Le composizioni farmaceutiche, nutraceutiche e/o dietetiche comprendenti l’associazione costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione.

La quantità di associazione da somministrare può variare in funzione dell’età e del peso del soggetto da trattare, come pure della gravità della patologia.

In generale, in un soggetto umano adulto, l’associazione può essere somministrata in dosaggi giornalieri compresi tra 0,3 e 3,0 g, ad esempio in ragione di 0,5-2,0 g, ad esempio intorno a 0,8-1,5 g al giorno, preferibilmente circa 1,0 g al giorno.

Secondo una forma di realizzazione preferita, l’associazione dell’invenzione costituita da BCP/DHA in rapporto 2/1, à ̈ somministrata in ragione di circa 0,8-1,5 g al giorno, ad esempio di circa 1,0 g al giorno. Dosaggi diversi possono naturalmente essere previsti, se desiderato o necessario.

Tali dosaggi possono essere assunti in un’unica somministrazione o, vantaggiosamente, essere suddivisi in due o più somministrazioni durante la giornata.

L’associazione può altresì essere contenuta in alimenti, come ad esempio prodotti caseari come yogurt e latte, succhi di frutta, ecc.

Se desiderato e anche in funzione della tipologia di dolore da trattare, l’associazione dell’invenzione può essere combinata con ulteriori sostanze attive e somministrata insieme o separatamente a tali ulteriori sostanze attive.

Secondo un altro dei suoi aspetti, l’invenzione ha anche per oggetto un metodo per il trattamento del dolore, in particolare del dolore cronico, che comprende somministrare a un soggetto che lo necessita, una dose efficace della associazione o una composizione farmaceutica, nutraceutica e/o dietetica come sopra definite oppure un alimento che contiene la detta associazione.

Sezione Sperimentale

Esempio 1

Preparazione di una composizione secondo l’invenzione

Si preparano delle capsule comprendenti ciascuna 350 mg di BCP e 150 mg di DHA (pari a 437 mg di BCP all’80% e 390 mg di DHA al 38%).

Tali capsule sono adatte per la somministrazione due volte al giorno, per un dosaggio giornaliero di 1.000 mg di associazione.

Esempio 2

Stabilità dell’associazione

Sono stati ottenuti gli spettri IR dei due composti (BCP e DHA) puri e in due miscele, con uno spettrometro FTIR Nicolet 5700 – Thermo utilizzando una cella ATR (Attenuated Total Reflectance) per liquidi equipaggiata con cristallo di Ge a 45°. Gli spettri (156 scansioni) sono stati registrati ad una risoluzione di 4 cm<-1>utilizzando un detector MCT (Mercurium Cadium Telluride). Nella cella à ̈ stato fatto circolare N2secco, al fine di eliminare la CO2e l’umidità dell’aria.

Lo spettro IR delle due miscele (BCP52%-DHA48% e BCP70%-DHA30%) si à ̈ mostrato essere esattamente sovrapponibile allo spettro ottenuto dalla somma matematica degli spettri IR dei due componenti puri (spettro BCD spettro DHA in rapporto 1:1). I dati di spettroscopia infrarossa hanno consentito di escludere la formazione di un complesso BCP-DHA con una propria identità chimica. I risultati ottenuti consentono di affermare che la struttura e di conseguenza l'attività biologica dei due composti singoli nella miscela à ̈ preservata, poiché non à ̈ compromessa da nessuna interazione forte che coinvolge i gruppi funzionali delle due molecole.

Esempio 3

Saggio di citotossicità dell’associazione

BCP, DHA, BCP DHA

E’ stata testata la tossicità acuta in vitro dei seguenti composti: BCP, DHA, miscela BCP DHA (52%-48%). Le cellule utilizzate sono stati fibroblasti murini NIH3T3 ed astrociti umani U373-MG (derivanti da una linea di astrocitoma umano). La tossicità à ̈ stata valutata con il metodo dell’Uptake del Rosso Neutro seguendo la procedura del National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Le concentrazioni di BCP testate con entrambi i tipi cellulari, sia da solo che coniugato con il DHA, sono state le seguenti: 10<-2>, 10<-4>, 10<-6>, 10<-8>, 10<-10>, 10<-12>M. Le concentrazioni di DHA testate sono state le stesse di quelle presenti nel complesso BCP DHA; sono state indicate con 1, 2, 3, 4, 5, 6 e i valori percentuale corrispondenti sono riportati in Tabella 1.

Tabella 1

Concentrazioni BCP testate % (v/v) DHA corrispondente

10-2M3.5% (1)

10<-4>M 3.5x10<-2>% (2)

10<-6>M 3.5x10<-4>% (3)

10<-8>M 3.5x10<-6>% (4)

10<-10>M 3.5x10<-8>% (5)

10<-12>M 3.5x10<-10>% (6)

Materiali

Il Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), la soluzione di tripsina e tutti i prodotti utilizzati per le colture cellulari sono stati forniti da Lonza (Switzerland). La glutaraldeide (25% in acqua) ed il cacodilato di sodio triidrato (98%) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Germany). I fibroblasti tumorali di topo NIH3T3 sono stati forniti dall’American Type Culture Collection (USA).

Colture cellulari

Entrambe le linee cellulari sono state propagate in DMEM supplementato con siero fetale bovino al 10%, L-glutammina-streptomicina all’1% e amminoacidi non essenziali all’1% e incubate a 37°C in atmosfera contenente il 5% di CO2. Una volta a confluenza, le cellule sono state lavate con PBS 0.1M, staccate dal supporto mediante una soluzione di tripsina, centrifugate a 1500 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente e risospese in medium completo (diluizione 1:15).

15000 cellule sospese in medium completo sono state seminate in ciascun pozzetto di una multiwell da 24; il volume di medium di ciascun pozzetto à ̈ stato portato ad 1 ml e le cellule sono state lasciate in incubatore a 37°C ed al 5% CO2per 24 ore. Al termine dell’incubazione sono stati aggiunti a ciascun campione diluizioni dei composti in esame e le multiwell sono state lasciate incubare per altre 24 ore sempre a 37°C ed al 5% CO2. Ogni diluizione di ciascun campione à ̈ stata testata in 8 repliche.

Valutazione della vitalità cellulare

La vitalità cellulare dopo 24 ore di incubazione con i composti in esame à ̈ stata valutata mediante il test dell’Uptake del Rosso Neutro (UNR) utilizzando la procedura riportata di seguito.

Prima di tutto sono state preparate le seguenti soluzioni:

1. Soluzione stock di rosso neutro: 0.33 g di rosso neutro in 100 ml di acqua distillata sterile

2. Medium con rosso neutro: 1.0 ml di soluzione stock 99.0 ml di medium di coltura completo

3. Soluzione di estrazione del rosso neutro: acido acetico glaciale all’1% etanolo al 50% acqua distillata al 49%

Alla fine del periodo di incubazione con i campioni in esame, il terreno di coltura à ̈ stato rimosso da ciascun pozzetto, le cellule sono state lavate gentilmente con 1 ml di PBS preriscaldato a 37°C. La soluzione di lavaggio à ̈ stata poi rimossa e 1.0 ml di medium con rosso neutro à ̈ stato aggiunto a ciascun pozzetto. Le multiwell sono state inserite in incubatore per 3 ore. Alla fine del tempo di incubazione, il medium con rosso neutro à ̈ stato rimosso, ciascun pozzetto à ̈ stato lavato con 1 ml di PBS preriscaldato a 37°C ed à ̈ stato aggiunto 1 ml esatto di soluzione di estrazione a ciascun pozzetto. A questo punto, le piastre sono state messe su uno shaker per 20-45 minuti a temperatura ambiente allo scopo di estrarre il colorante dalle cellule vitali. Durante questa fase, le piastre sono state coperte allo scopo di proteggerle dalla luce. 5 minuti dopo la fine dell’agitazione, la soluzione di estrazione à ̈ stata rimossa da ciascun pozzetto e l’assorbanza à ̈ stata letta a 540 nm in uno spettrofotometro UV/Vis (Lambda 25, Perkin Elmer).

Risultati

Di seguito sono riportati i grafici di vitalità cellulare (3T3 ed astrociti) in contatto con diverse concentrazioni di BCP, BCP DHA e DHA.

Come si nota dalle figure allegate alla presente descrizione, la tossicità del BCP à ̈ maggiore nei confronti delle 3T3 (Fig. 1) rispetto a quella degli astrociti (Fig. 2). L’associazione con DHA riduce sensibilmente la sua tossicità sia nei confronti delle 3T3 (Fig. 3) sia degli astrociti (Fig.4).

Il DHA non ha mostrato nessun effetto tossico a nessuna delle concentrazioni testate sia per le 3T3 (Fig.5) sia per gli astrociti (Fig.6).

In base ai dati ottenuti, si può affermare che la riduzione dell’effetto tossico del BCP sia imputabile alla contemporanea presenza in soluzione di DHA.

Esempio 4

Saggio di effetto antidolorifico dell’associazione

Ratti maschi sono stati sottoporti ad una serie di saggi comportamentali per valutare la loro risposta alla formalina e l’effetto dell’associazione BCP+DHA per os.

Come da protocollo sperimentale, ratti maschi sono stati sottoposti ad un primo test della formalina con iniezione di 50 microlitri di formalina diluita nella parte superiore della zampa destra. Questo trattamento induce una serie di comportamenti specifici che sono universalmente utilizzati per quantificare l’intensità del dolore percepito. I comportamenti sono il “Flexing†, cioà ̈ la flessione tonica della zampa che si misura in secondi, e il “Licking†, cioà ̈ il leccamento della parte iniettata che si misura in secondi. L’osservazione viene effettuata per 60 minuti divisi in 12 periodi di 5 minuti ciascuno.

Nel presente protocollo dopo un primo trattamento con formalina al 2,5 % si somministrava all’animale il solo olio (controllo) o l’associazione, due volte al giorno per simulare un trattamento. Dopo una settimana e dopo due settimane, il trattamento con formalina (1%) veniva ripetuto nella stessa zona e veniva ripetuta l’osservazione per 60 min.

Risultati. Negli animali trattati con l’associazione BCP+DHA le durate del Flexing e del Licking sono molto inferiori rispetto al gruppo di controllo a cui à ̈ stato somministrato solo olio privo di sostanza attive. Il peso degli animali non à ̈ stato modificato dall’assunzione delle sostanze così come i comportamenti non di dolore sono tutti nella norma.

Claims (11)

1. RIVENDICAZIONI 1. Associazione comprendente betacariofillene (BCP) e acido docosaesaenoico (DHA).
2. 2. Associazione secondo la rivendicazione 1, in cui il BCP e il DHA sono in rapporto da 3/1 a 1/1.
3. 3. Associazione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui il BCP e il DHA sono in rapporto di circa 2/1.
4. 4. Composizione farmaceutica, nutraceutica e/o dietetica che comprende l’associazione come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3.
5. 5. Composizione secondo la rivendicazione 4, che comprende da 0,5 a 2,0 g, di associazione.
6. 6. Composizione secondo la rivendicazione 5, che comprende da 0,8 a 1,5 g di associazione.
7. 7. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 6, in forma di gocce, sciroppo, granulato, capsule o perle.
8. 8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 4 a 7, che comprende 350 mg di BCP e 150 mg di DHA (pari a 437 mg di BCP all’80% e 390 mg di DHA al 38%).
9. 9. Alimento che comprende l’associazione come definita in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3.
10. 10. Associazione e/o composizione come definite nelle rivendicazioni da 1 a 8, per l’uso nel trattamento del dolore acuto e cronico.
11. 11. Associazione e/o composizione come definite nelle rivendicazioni da 1 a 8, per l’uso nel trattamento di artralgie, emicranie, mal di schiena, nevralgie, sciatalgie, fibromi algie, dolori muscolo-scheletrici, coliti, dolori pelvici e nelle affezioni dolorose ormonodipendenti.