ITMI20100688A1 - Dispositivo per impianto con proprieta' antibatteriche e superficie multifunzionale - Google Patents

Description

Titolo: “DISPOSITIVO PER IMPIANTO CON PROPRIETA’ ANTIBATTERICHE E SUPERFICIE MULTIFUNZIONALEâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un dispositivo per impianto la cui superficie combina attività antibatterica al fine di prevenire infezioni periprostetiche, e migliorate capacità di osteointegrazione.

Background dell’invenzione

Nella pratica ortopedica, l’infezione periprostetica (PPI) e’ una conseguenza devastante dell’inserimento di impianti. Attualmente l’incidenza di PPI va dall’1 al 5%, con valori anche maggiori per i pazienti di categorie a rischio e per coloro che hanno subito traumi. Inoltre, circa il 73% delle revisioni di intervento vengono eseguite in seguito a infezioni batteriche periimplantari. Il costo sociale ed economico di questi interventi e’ notevolmente elevato. L’eziologia della PPI e’ complessa e dipende dall’abilita’ delle specie batteriche di sfuggire alla risposta del tessuto ospite, di solito mediante la formazione di un biofilm. Infatti, il dispositivo da impianto non appena inserito viene ricoperto da proteine del siero. A questo processo seguono le interazioni con le specie cellulari e, in casi con decorso positivo, la rigenerazione o la riparazione del tessuto. In presenza di specie batteriche, la superficie dell’impianto può subire l’adesione batterica e la formazione di biofilm. In particolare, all’interno del biofilm i batteri sono protetti dal sistema di immunosorveglianza e dall’effetto di antibiotici sistemici. In questo modo la colonizzazione si può propagare, con le dannose conseguenze note nell’ambito dell’infezione periprostetica. Per combattere la PPI sono stati sviluppati una serie di sistemi di rilascio locale di antibiotici, sia da cementi che da strati micrometrici di polimeri biodegradabili depositati sulla superficie dei dispositivi. Tuttavia, a rilascio ultimato, i sistemi porosi di questo tipo possono servire da sito protetto per l’adesione batterica e la formazione di biofilm.

Recentemente, sono stati presentati articoli di letteratura in cui un antibiotico, la vancomicina, veniva legato covalentemente alla superficie di dispositivi da impianto in titanio e svolgeva attività battericida nei confronti di specie batteriche appartenenti al genere degli Stafilococchi (Chemistry & Biology, Vol. 12, 1041–1048, 2005, Vancomycin Covalently Bonded to Titanium Beads Kills Staphylococcus aureus; Journal Orthopedic Research, 25, 858-866, 2007, Vancomycin Covalently Bonded to Titanium Alloy Prevents Bacterial Colonization).

L’immobilizzazione di vancomicina alla superficie di dispositivi da impianto o il suo rilascio locale sono, per queste applicazioni, processi di grande interesse. Vancomicina costituisce un potente farmaco per il trattamento di infezioni da batteri Grampositivi, che sono di gran lunga la più comune causa di infezioni periprostetiche. Il meccanismo d’azione di vancomicina prevede il blocco della sintesi dello strato di peptidoglicani della parete cellulare dei batteri gram-positivi mediante legame al terminale L-Lys-D-Ala-D-Ala del peptidoglicano nascente. In questo modo, vancomicina previene il crosslinking che e’ necessario per la stabilità osmotica. Il concetto di legare vancomicina, di per sé idrosolubile, in modo stabile alla superficie dei dispositivi da impianto supera la visione del semplice sistema di rilascio. In questo caso, infatti, e’ presente un’elevata concentrazione locale di farmaco stabilmente legato all’interfaccia tra dispositivo da impianto e ambiente esterno. Questa barriera farmacologica stabile previene la formazione di colonie batteriche sulla superficie del dispositivo da impianto, impedendo l’instaurarsi della PPI. Come descritto da Chapiro e collaboratori nell’articolo Selfprotective Smart Orthopedic Implants, Expert Rev. Med. Devices, 2007 Jan;4(1):55-64, sistemi di questo tipo possono portare ad una nuova generazione di dispositivi da impianto, che si autoproteggono dai rischi di infezione batterica grazie alle loro proprietà di superficie.

Tuttavia, il processo di legame della vancomicina alla superficie del dispositivo in titanio descritto in questi articoli comprende diversi passaggi di una certa complessità pratica e non facilmente adattabili a produzioni industriali, che lo rende poco adatto a dispositivi di una certa dimensione e di geometria complessa.

Chiaramente, la realizzazione, in termini compatibili con un contesto produttivo, di dispositivi protesici da impianto in grado di sfruttare l’azione farmacologica di vancomicina costituirebbe un notevole passo avanti nel settore, con importanti implicazioni scientifiche, sociali ed economiche. Idealmente, il processo potrebbe accompagnare l’immobilizzazione/rilascio di vancomicina alla realizzazione di altre proprietà superficiali importanti, come l’incremento della velocità di osteointegrazione. Infatti, la rapida rigenerazione di tessuto osseo, con conseguente occupazione della superficie disponibile del dispositivo impiantato, riduce la probabilità di colonizzazione superficiale da parte di cellule batteriche, completando l’effetto protettivo antibatterico dovuto alla vancomicina. Questo concetto permetterebbe la reale realizzazione di dispositivi con superfici multifunzionali, cioà ̈ superfici che esercitano, oltre che l’ovvia funzione di supporto per i componenti tissutali, anche, ad esempio:

- funzione di stimolo per la rigenerazione/riparazione del tessuto

- funzione di protezione antibatterica.

Studi eseguiti dal presente inventore hanno ora evidenziato la possibilità di realizzare praticamente i concetti appena enunciati, come qui di seguito descritto.

Sommario dell’invenzione

La presente invenzione riguarda il processo per la realizzazione di un dispositivo da impianto nel corpo umano o animale che coniuga l’immobilizzazione di un antibiotico, in particolare vancomicina, in un modo semplice ed efficiente con la stimolazione delle cellule osteogeniche e conseguente incremento della velocità di osteointegrazione. La formazione veloce di tessuto osseo, con relativa occupazione della superficie disponibile del dispositivo impiantato, riduce la probabilità di colonizzazione superficiale da parte di cellule batteriche e costituisce pertanto un effetto sinergico con l’attività antibiotica della vancomicina. Secondo il processo in oggetto, si mettono quindi a disposizione dispositivi con superfici multifunzionali, cioà ̈ superfici che esercitano, oltre all’ovvia funzione di supporto per i componenti tissutali, anche le citate funzioni di stimolo per la rigenerazione/riparazione del tessuto e di protezione antibatterica.

La presente invenzione à ̈ basata sulla sorprendente osservazione che vancomicina, composto idrosolubile, se presente in una soluzione acquosa con la molecola di acido ialuronico in presenza di agenti reticolanti/condensanti, forma con detto acido ialuronico un composto/precipitato. Da tale osservazione, si à ̈ sviluppato un processo che replica questi eventi sulla superficie di dispositivi da impianto. Il processo prevede, in un primo tempo, il legame della molecola di acido ialuronico ad una superficie opportunamente funzionalizzata (con metodi noti in letteratura); in un secondo momento, la superficie ricoperta di acido ialuronico viene incubata in una soluzione acquosa di vancomicina in presenza di agenti reticolanti in opportuna concentrazione. In modo sorprendente, sulla stessa superficie si assiste gradualmente alla formazione di precipitati acido ialuronico/vancomicina, osservabili anche macroscopicamente per via della graduale costituzione di uno strato “opaco†che va a ricoprire in modo omogeneo tutta la superficie, cosa che non avviene se la superficie non e’ stata precedentemente ricoperta con acido ialuronico.

Senza essere legati ad una particolare teoria, si ritiene che questo comportamento sia dovuto, almeno in parte, all’interazione ionica tra le cariche negative presenti nella molecola di acido ialuronico e i gruppi amminici carichi positivamente di vancomicina. Tuttavia, dato che la formazione del detto strato opaco si verifica solamente in presenza di determinati agenti reticolanti, l’interazione potrebbe essere dovuta anche a fattori fisici e chimici differenti, legati in maniera inattesa alla struttura molecolare dell’acido ialuronico.

Per economia di trattazione, nella presente domanda di brevetto tali precipitati o composti di un antibiotico glicopeptidico, in particolare vancomicina, ed acido ialuronico verranno definiti “complessi acido ialuronico/antibiotico glicopeptidico†o specificatamente “complessi acido ialuronico/vancomicina†, senza voler per questo intendere che si forma necessariamente il legame tipico di un complesso.

E’ stato inoltre sorprendentemente osservato che l’utilizzo di differenti pesi molecolari di acido ialuronico (HA) influenza molto la formazione del detto precipitato HA/vancomicina: in questo caso si à ̈ notato che la ricopertura di una superficie con HA a pesi molecolari bassi (compresi tra 5000 Da e 80000 Da) non à ̈ efficace nel “catturare†, nella fase successiva del trattamento, una quantità di molecole di vancomicina equivalente a quella che viene catturata quando la superficie viene ricoperta con acido ialuoronico a più alto peso molecolare. La massima resa nel processo di cattura, inoltre, non aumenta con l’aumentare del peso di acido ialuronico, ma mostra un andamento “a picco†o a campana.

Inoltre l’utilizzo di altri polisaccaridi, tra i quali eparina, condroitin solfato, chitosano, acido alginico, pectine, ha l’effetto di diminuire la quantità di vancomicina funzionale che viene legata sulla superficie (in alcuni casi diminuendone la stabilità, in altri l’attività farmacologica).

Sorprendentemente, il composto/precipitato incorporato nello strato superficiale viene rilasciato se esposto ad ambienti acquosi fisiologici, conservando l’azione farmacologica di vancomicina. Il rilascio totale di vancomicina non à immediato, come ci si attenderebbe dall’elevata solubilità di vancomincina in soluzioni acquose, ma l’effetto permane per diverse settimane, offrendo una copertura antibiotica interfacciale prolungata.

L’acido ialuronico viene depositato sulla superficie del dispositivo da rivestire utilizzando metodiche diverse che comprendono il pre-trattamento della superficie da rivestire con plasma di allilammina o soluzione acquosa di polietilenimmina, con gruppi amminici che permettano il legame covalente con i gruppi carbossilici dell’acido ialuronico.

Secondo un aspetto preferito, à ̈ possibile ricoprire la superficie da trattare con un monostrato di molecole di collagene, preferibilmente in forma fibrillare: i gruppi amminici dei residui amminoacidici della molecola di collagene sono in grado di legare i gruppi carbossilici dell’acido ialuronico. La funzionalizzazione delle superfici con collagene permette inoltre di incrementare la proprietà “osteoinduttiva†della superficie: à ̈ stato infatti visto che tale modifica à ̈ in grado di indirizzare il differenziamento di cellule mesenchimali umane verso la linea osteogenica.

Il processo appena descritto à ̈ versatile e non à ̈ limitato dalla tipologia del dispositivo. Può quindi essere applicato sia su dispositivi metallici, come viti in titanio per la fissazione di fratture, per protesi, sia a dispostivi polimerici, sia biodegradabili che permanenti, sia a dispositivi ceramici, ad esempio idrossiapatite o altre forme di fosfati di calcio, anche in forma di particolato come polveri e granuli come utilizzato per riempitivi di difetti ossei.

Il processo dell’invenzione può essere applicato a corpi formati basati su materiali naturali come spugne o scaffold a base di collagene o polimeri naturali o materiali ceramici. Esso può inoltre essere applicato a sospensioni di materiali organici nanostrutturati, come fibrille di collagene con diametro inferiore al micron.

Nel caso di applicazione a sospensioni di collagene o materiali nanostrutturati in sospensione, l’interazione oggetto di questa invenzione porta alla formazione di un gel. Questo gel a base di collagene e contenente vancomicina ed acido ialuronico può essere utilizzato, tal quale oppure in forma liofilizzata e ricostituita al momento dell’uso, come materiale di riempimento nel sito di fissazione di un dispositivo implantare, potendo esplicare sia la tipica azione di osteointegrazione di collagene e acido ialuronico che l’attività antibatterica dell’antibiotico anche nella regione circostante all’impianto.

Mediante questi processi à ̈ quindi possibile realizzare una copertura di vancomicina in acido ialuroonico sulla superficie dei dispositivi o materiali, realizzando il concetto di barriera farmacologica a lento rilascio all’interfaccia dispositivo/tessuto. Inoltre, la modifica superficiale di dispositivi da impianto con acido ialuronico aumenta la tendenza del materiale all’osteointegrazione, come descritto ad esempio da Morra et al. nell’articolo Covalently-Linked Hyaluronan Promotes Bone Formation around Ti Implants in a Rabbit Model, pubblicato sul Journal of Orthopedic Research, 27:657–663, 2009 e nella domanda di brevetto WO2006/038056 A1.

I metodi appena descritti consentono dunque di realizzare dispositivi da impianto che non solo presentano ottime e migliorate caratteristiche di osteointegrazione, ma forniscono anche le proprietà autoprotettive e battericide di vancomicina, traducendo in pratica il concetto di superficie multifunzionale. Inoltre, il metodo della presente invenzione consente di estendere la multifunzionalità della superficie, esemplificata dalla contemporanea presenza di composizione chimica bioattiva con azione osteogenica (legame di acido ialuronico) e azione farmacologica (rilascio di vancomicina), aggiungendo la possibilità del controllo della topografia superficiale mediante processi di irruvidimento. A questo proposito, à ̈ bene ricordare che nel settore degli impianti dentali il processo di osteointegrazione viene favorito dall’azione della topografia superficiale sulle cellule osteogeniche, come esemplificato dal concetto di “Modulation of osteogenesis via implant surface design†, descritto da Boyan, B.D., Schwartz, Z., , in: , Davies J. E. editor. Bone Engineering, Toronto, em squared, 232-239, 2000. Il successo di questo concetto à ̈ stato tale che oggi non esistono più in commercio impianti dentali con superficie liscia, al contrario tutti presentano irruvidimenti della topografia di superficie. Nella pratica ortopedica, ad esempio nella fissazione di fratture mediante viti in titanio, questo concetto non ha potuto essere sfruttato per il timore di offrire, mediante l’irruvidimento della superficie, siti sfruttabili per l’adesione e la colonizzazione batterica. Il presente trovato permette invece di realizzare uno strato osteogenico superficiale di acido ialuronico conformale (cioà ̈ che non altera la topografia della superficie, adattandosi ad essa), che può inoltre sfruttare l’irruvidimento della topografia superficiale in quanto il rilascio di vancomicina previene la colonizzazione batterica degli anfratti e asperità della superficie.

Descrizione dell’invenzione

La presente invenzione riguarda in particolare un dispositivo per impianto nel corpo umano o animale, in cui almeno una parte della superficie di detto dispositivo à ̈ rivestita da un composto di acido ialuronico con un antibiotico glicopeptidico.

In una forma di realizzazione, l’antibiotico glicopeptidico à ̈ vancomicina.

L’idea à ̈ stata quella di legare uno strato di acido ialuronico alle superfici di interesse (attraverso metodi noti nell’arte), quindi di incubare tali superfici con una soluzione di vancomicina in presenza di agenti condensanti, in particolare N-idrossi succinimide (NHS) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide (EDC), presenti contemporaneamente: dopo qualche ora si forma sulle superfici uno strato “opaco†, indice dell’interazione tra l’acido ialuronico precedentemente legato e la vancomicina. Questo strato opaco non si forma in assenza di acido ialuronico legato alla superficie, funzionalizzata o meno, e non si forma in assenza di NHS/EDC. Da qui innanzi, si parlerà di “complessi di acido ialuronico con vancomicina†, dove il termine “complesso†comprende una qualsiasi forma di interazione di tipo chimico-fisico o semplicemente fisico tra acido ialuronico e vancomicina, includendo interazioni di tipo legame a idrogeno, e/o Van der Waals e/o elettrostatiche, ecc., che si ottiene mediante la precipitazione di vancomicina o coprecipitazione di acido ialuronico e vancomicina in presenza di agenti reticolanti o condensanti ed in particolari condizioni (pH e concentrazioni delle soluzioni).

In una forma di realizzazione, tutta la superficie del dispositivo per impianto à ̈ rivestita di detto complesso di acido ialuronico legato alla superficie con un antibiotico glicopeptidico. In alternativa, parte del dispositivo à ̈ ricoperta da acido ialuronico, e solamente in questa area avviene la formazione dei complessi con vancomicina.

Il dispositivo per impianto secondo l’invenzione può essere realizzato in metallo (ad esempio, acciaio, titanio o loro leghe con altri metalli) o in materiale plastico, quale ad esempio polistirene) compatibile per applicazioni sul corpo umano o animale, o in materiale ceramico, sia in forma di dispositivo che di granulato/polvere.

In una forma di realizzazione, il dispositivo à ̈ costituito da una vite da impianto dentale, preferibilmente in titanio o sue leghe, eventualmente del tipo transmucosale, o da una vite, preferibilmente in titanio o sue leghe, per fissazione spinale o scheletrale, o per fissazione di fratture, o da un disco intervertebrale, preferibilmente in titanio, sue leghe o leghe cromocobalto o nelle leghe metalliche comunemente utilizzate per queste applicazioni. La superficie del dispositivo in titanio può essere liscia (comunemente definita “macchinata†) o preferibilmente irruvidita secondo i metodi noti nell’arte, in particolare mediante sabbiatura, con allumina, ossidi di titanio o altri agenti sabbianti, trattamento di irruvidimento con acidi, o trattamento di irruvidimento elettrochimico.

In una forma di realizzazione, il processo di immobilizzazione del complesso di acido ialuronico con l’antibiotico glicopeptidico su un dispositivo implantare secondo l’invenzione prevede l’introduzione di gruppi funzionali amminici sulla superficie del dispositivo. L’acido ialuronico viene legato covalentemente ai gruppi amminici superficiali, utilizzando i metodi noti nell’arte, ed esercita la sua azione di “cattura†di vancomicina con formazione dei complessi in presenza di EDC e NHS nel passaggio successivo. Il peso molecolare medio dell’acido ialuronico può essere compreso tra 4.000 e 4 milioni Da, preferibilmente tra 400.000 e 1 milione Da. Il legame di acido ialuronico alla superficie amminata può avvenire con i metodi noti nell’arte, ad esempio con l’uso di EDC/NHS, o mediante trattamento con periodato dell’acido ialuronico e successiva amminazione riduttiva, o come descritto in WO2006/038056 A1. Lo strato così ottenuto avrà spessore compreso tra 0.1 e 1000 nanometri, preferibilmente tra 1 e 20 nm.

I gruppi amminici possono essere depositati sulla superficie del dispositivo implantare secondo metodiche ampiamente note nel settore. Particolarmente vantaggiosa à ̈ la tecnica che prevede l’introduzione del substrato avente gruppi funzionali amminici sulla superficie del dispositivo implantare mediante deposizione da plasma di molecole che contengono gruppi amminici. Esempi tipici di molecole utilizzate per questo scopo sono l’allilammina, le alchilammine quali esil o eptil ammina e, in generale, le molecole organiche con funzionalità amminica che presentano le necessarie caratteristiche di volatilità in fase plasma. La deposizione dell’ammina da plasma avviene nelle seguenti condizioni: pressione compresa tra 80 e 300 mTorr, potenza di scarica compresa tra 5 e 200 W, tempo di deposizione tra 1 ms e 300 s. La deposizione da plasma può anche avvenire in condizioni di plasma pulsato, con cicli di plasma attivo e non attivo compresi tra 1 e 100 ms, per minimizzare la frammentazione molecolare e conservare la più alta densità possibile di gruppi amminici. Il trattamento di deposizione dell’ammina da plasma può essere preceduto da altri trattamenti con plasma, ad esempio con plasma di aria o ossigeno per pulire la superficie ed incrementare l’adesione con il substrato.

Un’ulteriore metodica per il rivestimento del dispositivo implantare con un substrato contenente gruppi amminici consiste nell’adsorbimento sulla superficie del dispositivo di polietileneimmina (PEI), ad esempio da soluzione acquosa allo 0.2%, per 2 h, a temperatura ambiente. Anche l’uso di silani, ad esempio 3-amminopropiltrietossisilano (APTES), o composti analoghi, rientra nei comuni metodi di funzionalizzazione di superficie.

E’ anche possibile funzionalizzare la superficie del dispositivo implantare con gruppi carbossilici per mezzo di deposizione da plasma di acido acrilico/metacrilico.

E’ inoltre possibile funzionalizzare la superficie con molecole naturali, eventualmente bioattive, che si adsorbono irreversibilmente sulla superficie e presentano gruppi amminici/carbossilici idonei per il successivo legame di acido ialuronico e dei suoi complessi con vancomicina. Esempi tipici che rientrano in questa categoria sono il collagene ed altre molecole proteiche della matrice extracellulare, come laminina, fibronectina, vitronectina. Secondo questa forma di realizzazione, il dispositivo per impianto secondo l’invenzione comprende un primo strato di collagene adsorbito, in forma monomerica o fibrillata, cui viene legato, secondo il processo descritto, preferibilmente mediante EDC/NHS, o mediante amminazione riduttiva, acido ialuronico. A questo punto segue la formazione dei complessi acido ialuronico/vancomicina, mediante esposizione a soluzioni di vancomicina ed agenti reticolanti o condensanti. La funzionalizzazione con collagene viene preferibilmente eseguita con una soluzione di collagene 0,3% in acido acetico 10 mM e un ugual volume di tampone fosfato a 37°C per 8h.

Il procedimento sopra descritto può anche essere eseguito su collagene in sospensione, portando alla formazione nel mezzo acquoso di un precipitato di complesso di collagene fibrillato, acido ialuronico e antibiotico glicopeptidico (quale vancomicina), che può essere separato, lavato e parzialmente essiccato a dare un gel. Questo gel a base di collagene e contenente detto antibiotico glicopeptidico ed acido ialuronico può essere utilizzato, tal quale oppure in forma liofilizzata e ricostituita al momento dell’uso, come materiale di riempimento nel sito di fissazione di detto dispositivo implantare, potendo esplicare sia la tipica azione di osteointegrazione di collagene e acido ialuronico che l’attività antibatterica dell’antibiotico anche nella regione circostante all’impianto.

Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ un kit comprendente un dispositivo per impianto sul corpo umano o animale, in cui almeno una parte della superficie di detto dispositivo à ̈ rivestita da un complesso di acido ialuronico con un antibiotico glicopeptidico, ed un gel di collagene fibrillato con detto complesso di acido ialuronico e detto antibiotico glicopeptidico.

I seguenti esempi descrivono l’invenzione.

Esempio 1. Interazione acido ialuronicovancomicina.

Questo esempio dimostra che esiste una sorprendente interazione tra vancomicina e acido ialuronico.

Si prepara una soluzione allo 0.1% (w/v) di acido ialuronico HW (peso molecolare 800 kDa, Lifecore) in acqua milliQ e una soluzione di vancomicina 0,5% in acqua milliQ. A quest’ultima soluzione si aggiunge gradualmente la soluzione di acido ialuronico e si osserva un graduale aumento della torbidità della soluzione fino alla formazione di particelle in sospensione (sintomo della forte interazione tra HA e vancomicina). Se alla miscela così preparata vengono aggiunti due agenti condensanti, N-idrossisuccinimmide e successivamente etilcarbodiimide, la soluzione diventa istantaneamente limpida. Tuttavia, dopo 15h, la miscela risulta molto torbida, con la presenza di precipitati in sospensione: probabilmente gli agenti condensanti sono in grado di legare i gruppi amminici della vancomicina ai gruppi carbossilici dell’acido ialuronico. Tali precipitati sono stati prelevati, lavati con acqua milliQ e successivamente analizzati all’IR: nella figura 1 sono raffigurati gli spettri relativi alla vancomicina (puntini), all’acido ialuronico (tratto) e al precipitato formatosi attraverso il metodo descritto (continuo). In questo spettro sono presenti sia segnali di vancomicina sia segnali di acido ialuronico, a conferma dell’interazione tra le due molecole.

Esempio 2. Interazione acido ialuronicovancomicina

Questo esempio dimostra il ruolo fondamentale di agenti condensanti nell’interazione tra vancomicina e acido ialuronico.

L’esperimento precedente viene ripetuto utilizzando soluzioni di acido ialuronico e vancomicina a concentrazioni molto più basse (fino a 10 volte inferiori): in questi casi, l’aggiunta di acido ialuronico ad una soluzione di vancomicina non provoca un immediato intorbidamento della miscela, che rimane limpida. Tuttavia, aggiungendo le stesse quantità di agenti condensanti utilizzate nell’esperimento precedente e lasciando in incubazione per circa 15h, la soluzione diventa torbida (anche se in misura minore rispetto ai grossi precipitati formatisi nell’esperimento precedente), a dimostrazione che l’interazione HA-vancomicina viene in qualche modo “stimolata†dalla presenza di agenti condensanti.

Per osservare eventuali differenze tra l’interazione HA-vancomicina che avviene in presenza o in assenza di agenti condensanti, sono state preparate soluzioni ad elevata concentrazione di vancomicina in acqua (1%) e di HA in acqua (0,5%). Tali soluzioni sono state miscelate ed il precipitato che immediatamente si crea à ̈ stato prelevato, lavato ed analizzato mediante IR. Lo spettro relativo a questo precipitato à ̈ stato poi confrontato con quello relativo al precipitato che si forma in presenza di agenti condensanti.

La figura 2 mostra in linea a puntini e continua gli spettri rispettivamente di HA e vancomicina, mentre linea a tratto lungo lo spettro del precipitato HA-vancomicina in presenza di agenti condensanti e in linea a tratto breve lo spettro del precipitato in assenza di agenti condensanti.

Si osservano due segnali importanti presenti nello spettro in line a tratto lungo e non in quello in linea a tratto breve: il primo à ̈ a 1550 cm-1, che potrebbe essere il segnale dell’amide secondaria (bending NH2 e stretching CN); il secondo à ̈ a 840 cm-1 e potrebbe essere il segnale delle ammine alifatiche e del bending OCN. Entrambi questi segnali, presenti solamente nello spettro del precipitato formatosi in presenza di agenti condensanti (ma non appartenenti agli agenti condensanti stessi), potrebbero indicare che in tale precipitato si sono formati dei legami differenti da quelli derivanti da semplice interazione elettrostatica, quali legami covalenti, interazioni specifiche o altro.

La possibilità che esista un’interazione forte tra acido ialuronico e vancomicina ha aperto la strada verso nuovi esperimenti di modifica di superfici. Tali esperimenti consistono nel legare in modo covalente acido ialuronico ad una superficie opportunamente funzionalizzata, poi incubare la suddetta superficie in una soluzione di vancomicina in presenza di agenti condensanti, in modo da far avvenire direttamente sulla superficie la stessa reazione che si osserva in soluzione.

Esempio 3. Interazione HA-vancomicina su una superficie

Questo esempio dimostra che il processo osservato in soluzione avviene anche direttamente sulla superficie di un materiale.

Sono state preparate superfici di polistirene nel modo seguente:

-trattamento al plasma d’aria per 20 secondi -incubazione con soluzione di Polietileneimmina (PEI) 0,5% in acqua per 2h

-lavaggio con acqua milliQ (3 volte)

-incubazione delle superfici di polistirene O.N. con soluzione di acido ialuronico 800 kDa 0,2% (Lifecore) in acqua milliQ, in presenza di 5 mg/cc NHS e 7,5 mg/cc EDC.

-lavaggio con acqua milliQ (2 volte)

-incubazione con soluzione di vancomicina 0,7% in acqua overnight, in presenza di 5 mg/cc NHS e 7,5 mg/cc EDC.

-Lavaggio con acqua milliQ (3 volte) Al termine del trattamento sulle superfici di polistirene così preparate si osserva un sottile strato opaco molto omogeneo, derivante dall’interazione avvenuta tra acido ialuronico legato sulla superficie nel primo passaggio di reazione e la vancomicina aggiunta nel secondo passaggio di reazione. A conferma dell’importanza degli agenti condensanti, superfici di polistirene trattate nel medesimo modo ma in assenza di NHS e EDC durante la seconda incubazione in soluzione di vancomicina, appaiono perfettamente trasparenti.

Esempio 4 - Processo di copertura di una vite da impianto in titanio con acido ialuronico e vancomicina

Alcune viti da impianto in titanio, con lunghezza 13 mm e diametro 4 mm, vengono trattate come segue: campione 1: nessun trattamento (campione Ti) campione 2: funzionalizzazione superficiale mediante PEI, e legame di HA come da esempio 3 (Campione Ti-HA).

campione 3: un campione trattato come al punto 2 e’ stato successivamente sottoposto ad incubazione con soluzione di vancomicina 0,7% in acqua overnight, in presenza di 5 mg/cc NHS e 7,5 mg/cc EDC e successivi lavaggi con acqua MilliQ (campione Ti-HA-VXL)

I campioni così ottenuti sono stati successivamente sottoposti ad analisi XPS (X-ray Photoelectron Spectroscopy) per valutare la composizione chimica della superficie. Unitamente ad essi e’ stato analizzato come riferimento un campione di vancomicina, ottenuto lasciando evaporare una soluzione di vancomicina in acqua MilliQ su un substrato di plastica. Sono stati ottenuti i seguenti risultati, espressi in percentuale di atomi e ricordando che l’analisi XPS non misura la presenza di atomi di idrogeno:

Campione C O N Ti Cl Vancomicina 77.8 15.9 4.6 1.7 Ti 34.8 46.4 0.4 18.4

Ti-HA 69.0 24.4 6.3 0.3

Ti-HA-VXL 69.5 23.2 5.8 0.6 0.9

La molecola di vancomicina à ̈ caratterizzata, ai fini analitici di questa valutazione, dalla presenza dell’eteroelemento Cl (due atomi in un composto che comprende anche O, C ed N con peso molecolare di ca.

1450 Da). La presenza di Cl, in percentuale atomica inferiore al 2%, e’ in effetti evidenziata dall’analisi XPS, come riportato in tabella, nella riga relativa all’analisi della Vancomicina. La superficie della vite Ti e di quella Ti-HA sono caratterizzate da valori di composizione in linea con le attese, come discusso dalla letteratura del settore.

La composizione della superficie del campione Ti-HA-VXL si differenzia da quella di Ti-HA per la presenza di Cl, conseguenza dell’introduzione sulla superficie della molecola di Vancomicina.

Esempio 5 – Esempio dell’importanza del peso molecolare di acido ialuronico sul rilascio di vancomicina da superfici modificate con il presente processo

Per osservare la specificità della reazione HA-vancomicina, sono state preparate superfici di polistirene modificate con differenti pesi molecolari di HA e poi con la soluzione di vancomicina in presenza di NHS e EDC. Si sono impiegati HA LW (10 kDa), HA MW (circa 70 kDa), HA HW (880 kDa) e HA HHW (circa 2000 kDa). Le superfici sono state dunque in primo luogo funzionalizzate con polietilenimmina (soluzione 0.5% in acqua per 2h); si à ̈ proceduto poi all’incubazione overnight con le soluzioni di HA a differente peso molecolare in presenza di NHS e EDC. Successivamente sono stati effettuati lavaggi in acqua e poi le superfici sono state incubate overnight con una soluzione di vancomicina 0.8% in acqua in presenza di 5 mg/ml NHS e 7,5 mg/ml di EDC.

L’opacità della superficie si à ̈ osservata con il solo peso HA HW, anche se anche per HA MW e HA HHW i pozzetti non sono apparsi perfettamente trasparenti: c’à ̈ dunque una certa specificità, fosse anche solo dimensionale, nell’interazione tra vancomicina e HA HW.

Al termine dei lavaggi le superfici sono state incubate in PBS per effettuare le analisi di rilascio di vancomicina nel tempo tramite HPLC. Il grafico in figura 3 mostra la quantità di vancomicina rilasciata dalle diverse superfici nel tempo (un mese): si può notare che la superficie modificata con HA HW rilascia una quantità maggiore di antibiotico rispetto a quelle modificate con gli altri pesi molecolari.

Esempio 6 – Influenza del processo di funzionalizzazione sulla quantità di vancomicina rilasciata da superfici modificate con il presente processo

Per verificare se la funzionalizzazione con collagene fibrillare provoca qualche cambiamento nella cinetica di rilascio di vancomicina dalle superfici di polistirene à ̈ stato pianificato il trattamento di due 6-wells di polistirene con HA VXL (VXL = Vancomicina e condensanti EDC-NHS), funzionalizzando però le superfici con PEI (polietilenimmina) oppure con collagene fibrillare. I 6-wells sono stati trattati al plasma come nell’esempio precedente, poi i pozzetti sono stati incubati con una soluzione di PEI 0,5% in acqua per 2h oppure con una soluzione di collagene 0,3% in acido acetico 10 mM e un ugual volume di PBS a 37°C per 8h.

Dopo il passaggio di funzionalizzazione le superfici sono state trattate con una soluzione di HA HW 0,2% in presenza di NHS e EDC overnight, poi lavate con acqua milliQ e incubate con una soluzione di vancomicina 0,75% in acqua in presenza di NHS e EDC overnight. Al termine di tale incubazione, le superfici sono state lavate con acqua milliQ e fatte asciugare.

Il rilascio à ̈ stato effettuato in PBS a 37°C, con misure mediante HPLC della quantità rilasciata a 4h, 24h, 4gg, 12gg e 21 gg. Per tutti i tempi si à ̈ osservato che le superfici modificate con collagene rilasciano una quantità di antibiotico superiore rispetto a quelle funzionalizzate con PEI. Il grafico in figura 4 raffigura la curva cumulativa di rilascio di vancomicina dalle superfici diversamente funzionalizzate: si può notare che, ad ogni punto temporale, le superfici funzionalizzate con collagene fibrillare rilasciano una maggior quantità di vancomicina.

Questo esempio indica che, per motivi sorprendenti e non completamente chiari, il passaggio di funzionalizzazione superficiale, in particolare la specie molecolare utilizzata per la funzionalizzazione superficiale, influenza la quantità totale di vancomicina “catturata†dalla superficie ricoperta con acido ialuronico e/o la quantità di vancomicina che la superficie ricoperta con acido ialuronico à ̈ in grado di rilasciare. Al di là dell’importanza di questa osservazione sotto l’aspetto applicativo, il risultato conferma che il fenomeno osservato non à ̈ un generico effetto dell’azione di EDC-NHS sulla vancomicina in soluzione, ma à ̈ legato in modo sorprendente e non anticipabile alla struttura molecolare della superficie.

Esempio 7 – Verifica delle migliorate proprietà di stimolazione del comportamento osteogenico di cellule mesenchimali

Per analizzare anche la risposta delle cellule mesenchimali al processo di rivestimento e quindi verificare se questo possa avere anche effetti sull’osteogenesi, sono state coltivate cellule mesenchimali sulle seguenti superfici, realizzate in piastre a micropozzetti per colture cellulari:

- plastica per colture cellulari (controllo) - plastica per colture funzionalizzata con PEI e successivo legame covalente di acido ialuronico 800kDa (HA)

- plastica per colture funzionalizzata con PEI e successivo legame covalente di acido ialuronico 800kDa, seguita da formazione di complessi HA-Vancomicina come descritto all’esempio precedente(HA-VXL)

Le cellule mesenchimali da midollo umano sono state acquistate da Lonza Milano srl in forma indifferenziata. Come noto, secondo gli stimoli esterni, queste cellule si possono differenziare lungo alcuni diversi cammini, incluso quello osteogenico. Le cellule sono state coltivate in terreno osteogenico e ne à ̈ stata valutata mediante analisi Real Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) l’espressione di alcuni geni che presiedono la formazione di tessuto osseo. I dati sono riportati nella tabella seguente, dove “=†significa espressione pari a quella del controllo, “+†espressione fino a 5 volte superiore a quella del controllo, “++†espressione superiore a 5 volte a quella del controllo.

Sono stati ottenuti i seguenti risultati, dopo 10 giorni di coltura:

Gene HA HA-VXL Fosfatasi Alcalina = RunX2 Osteocalcina Bone Sialoproteina + + Proteina morfogenetica + + dell’osso-2 (BMP-2)

I dati confermano che la copertura con HA stimola l’espressione di geni legati alla formazione di tessuto osseo, a conferma dei dati in vivo di letteratura citati sull’effetto del legame covalente di strati superficiali di HA sull’osteointegrazione (Morra et al. Covalently-Linked Hyaluronan Promotes Bone Formation around Ti Implants in a Rabbit Model, pubblicato sul Journal of Orthopedic Research, 27:657–663, 2009). In particolare, sia il fattore di trascrizione RunX2, che controlla la differenziazione cellulare, che in particolare la proteina BMP-2 e la BSP (Bone Sialoprotein) sono decisamente sovraespressi su HA e HA-VXL rispetto al controllo, ed indicano un processo osteogenico molto sostenuto. La presenza dei complessi con vancomicina non altera sostanzialmente i vantaggi di HA (anzi, un altro gene molto importante, fosfatasi alcalina, appare più espresso su HA-VXL rispetto ad HA), confermando che anche questo tipo di superficie à ̈ pro-osteogenico. Questa à ̈ una proprietà molto importante, che accoppiata con il peculiare rilascio di antibiotico, à ̈ alla base della generazione e progettazione di dispositivi multifunzionali.

Esempio 8 – Verifica dell’efficacia antibatterica di viti da impianto ottenute secondo il presente processo

Per dimostrare l’azione antibatterica del presente trovato, vengono realizzati test di alone di inibizione, in colture di Staphylococcus epidermidis. Con i metodi precedentemente descritti vengono realizzati impianti ricoperti con HA e con HA-VXL.

Questi impianti, insieme a quelli di controllo negativo (impianto non trattato), sono stati poi incubati in terreno semisolido agar insieme alla miscela batterica in una capsula Petri a 37°C. I batteri dovrebbero proliferare e, nel caso di una superficie con proprietà antibatteriche (con rilascio di antibiotico), dovrebbe formarsi attorno all’impianto un alone di inibizione, vale a dire una zona senza batteri che circonda l’impianto. I risultati di questo esperimento hanno confermato che il trattamento sviluppato ha proprietà antibatteriche: attorno agli impianti HA VXL, infatti, si osserva l’alone di inibizione, che non si forma attorno agli impianti di controllo. In figura 5 à ̈ rappresentata una foto esplicativa dell’esperimento, con in alto gli impianti di controllo (solo titanio a sinistra, Ti ricoperto con HA a destra) ed in basso quelli trattati (HA-VXL, due repliche), attorno ai quali si osserva in modo evidente l’alone di inibizione.

Gli impianti così trattati sono stati successivamente prelevati ed immersi nuovamente in agar con batteri per vedere se mantengono la loro attività antibatterica: in effetti anche in questa seconda incubazione si forma l’alone di inibizione attorno agli impianti trattati, anche se di diametro leggermente inferiore rispetto a quello formatosi la prima volta. Così à ̈ stato anche per una terza incubazione.

Le superfici degli impianti HA-VXL presentano quindi le superiori proprietà osteogeniche caratteristiche dell’acido ialuronico, come dimostrato dall’esempio 7, cui accoppiano le proprietà antibatteriche rese evidenti dai risultati esemplificati dalla fotografia riportata in figura 5. Questo esempio conferma quindi la natura multifunzionale della superficie realizzata secondo il presente processo, ed il suo vantaggio applicativo sia rispetto al dispositivo tradizionale (vite in titanio) che rispetto al dispositivo con ricopertura con HA descritto nell’arte.

Esempio 9 Esempio di realizzazione di vite per fissazione di frattura in titanio, con superficie irruvidita e copertura con acido-ialuoricovancomicina

Una vite in titanio grado 5 per la fissazione di frattura viene utilizzata per la dimostrazione della preparazione di un dispositivo da impianto con superficie multifunzionale, con le seguenti proprietà:

- superficie irruvidita e conseguente incremento di area superficiale

- superficie bioattiva mediante legame di acido ialuronico previa funzionalizzazione mediante adsorbimento di collagene fibrillato

- superficie antibatterica mediante rilascio di vancomicina presente in complessi con acido ialuronico legato alla superficie

La porzione apicale (testa) della vite viene prodotta mediante mascheratura e la vite viene sottoposta a processo di sabbiatura per 40 secondi in una sabbiatrice Norblast, utilizzando come agente sabbiante ossidi di titanio. La vite à ̈ in seguito sottoposta a processo di trattamento con acidi, secondo i protocolli comunemente adottati da questa azienda nel trattamento di impianti dentali e quindi sottoposto al processo in oggetto come all’esempio 7 e 8.

La superficie irruvidita della vite presenta un’area superficiale, e quindi una superficie di contatto, di più del 70% superiore rispetto a quella di una vite tradizionale.

E’ evidente che sono state descritte solo alcune forme particolari di realizzazione della presente invenzione, cui l’esperto dell’arte sarà in grado di apportare tutte quelle modifiche necessarie per il suo adattamento a particolari applicazioni, senza peraltro discostarsi dall’ambito di protezione della presente invenzione.

Claims (31)

1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo implantare per l’impianto in corpo umano o animale, in cui almeno una parte della superficie di detto dispositivo à ̈ rivestita da un complesso di acido ialuronico con un antibiotico glicopeptidico.
2. 2. Dispositivo implantare secondo la rivendicazione 1, in cui detto dispositivo à ̈ in acciaio, titanio o loro leghe con altri metalli o in materiale plastico compatibile per applicazioni sul corpo umano o animale o in materiali ceramici, quale idrossiapatite o altre forme di fosfati di calcio, anche in forma di particolato come polveri e granuli per riempitivi di difetti ossei.
3. 3. Dispositivo implantare secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto dispositivo à ̈ costituito da una vite da impianto dentale, preferibilmente in titanio o sue leghe, eventualmente del tipo transmucosale, o da una vite, preferibilmente in titanio o sue leghe, per fissazione spinale o scheletrale, o da un disco intervertebrale, preferibilmente in titanio, sue leghe o leghe cromo-cobalto o nelle leghe metalliche comunemente utilizzate per queste applicazioni.
4. 4. Dispositivo implantare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto acido ialuronico ha un peso molecolare medio compreso tra 400.000 Da e 1.000.000 Da.
5. 5. Dispositivo implantare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto antibiotico glicopeptidico à ̈ vancomicina.
6. 6. Dispositivo impiantare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detto acido ialuronico à ̈ immobilizzato sulla superficie di detto dispositivo.
7. 7. Dispositivo secondo la rivendicazione 6, in cui la superficie di detto dispositivo à ̈ amminata.
8. 8. Dispositivo secondo la rivendicazione 7, in cui detta superficie amminata di detto dispositivo à ̈ ottenibile per trattamento della superficie con plasma di allilammina, o di un’alchilammina quale esil o eptil ammina o di molecole organiche con funzionalità amminica che presentano caratteristiche di volatilità in fase plasma.
9. 9. Dispositivo secondo la rivendicazione 7, in cui detta superficie amminata di detto dispositivo à ̈ ottenibile per adsorbimento sulla superficie del dispositivo di polietileneimmina.
10. 10. Dispositivo secondo la rivendicazione 6, in cui la superficie di detto dispositivo comprende gruppi carbossilici per deposizione da plasma di acido acrilico/metacrilico.
11. 11. Dispositivo secondo la rivendicazione 6, in cui la superficie di detto dispositivo à ̈ funzionalizzata con collagene o molecole proteiche della matrice extracellulare, preferibilmente scelte tra laminina, fibronectina e vitronectina.
12. 12. Dispositivo secondo la rivendicazione 11, in cui sulla superficie di detto dispositivo à ̈ adsorbito collagene in forma monomerica o fibrillata.
13. 13. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui detto acido ialuronico forma uno strato di spessore compreso tra 0.1 e 1000 nanometri, oppure tra 1 e 20 nm.
14. 14. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, in cui detto complesso di acido ialuronico con un antibiotico glicopeptidico à ̈ ottenibile per trattamento di detti acido ialuronico con una soluzione di detto antibiotico glicopeptidico in presenza di un agente condensante o reticolante.
15. 15. Dispositivo secondo la rivendicazione 14, in cui detto agente condensante o reticolante à ̈ N-idrossi succinimide/ 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide.
16. 16. Gel di collagene comprendente detto complesso di acido ialuronico con un antibiotico glicopeptidico, tal quale o liofilizzato, in cui detto complesso di acido ialuronico con detto antibiotico glicopeptidico à ̈ come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5.
17. 17. Gel secondo la rivendicazione 16, per l’uso come materiale di riempimento attorno ad un impianto protesico osseo.
18. 18. Kit comprendente un dispositivo implantare come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15 ed un gel come definito nella rivendicazione 16 o 17.
19. 19. Procedimento per l’ottenimento di un dispositivo impiantare secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15 o di un gel secondo la rivendicazione 16 o 17, comprendente la fase di formazione di detto complesso di acido ialuronico con detto antibiotico glicopeptidico per contatto di detto acido ialuronico con una soluzione di detto antibiotico glicopeptidico in presenza di un agente condensante o reticolante.
20. 20. Procedimento secondo la rivendicazione 19, in cui detto agente condensante o reticolante à ̈ N-idrossi succinimide/ 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide.
21. 21. Procedimento secondo la rivendicazione 19 o 20, in cui la superficie di detto dispositivo implantare à ̈ preventivamente amminata per deposizione superficiale da plasma di un’ammina scelta tra allilammina, esilammina o eptilammina o per deposizione da soluzione di polietilenimmina o di acido acrilico/metacrilico o per trattamento con silani, quale 3-amminopropiltrietossisilano.
22. 22. Procedimento secondo la rivendicazione 21, in cui detta deposizione dell’ammina da plasma avviene nelle seguenti condizioni: pressione compresa tra 80 e 300 mTorr, potenza di scarica compresa tra 5 e 200 W, tempo di deposizione tra 1 ms e 300 s; oppure in condizioni di plasma pulsato, con cicli di plasma attivo e non attivo compresi tra 1 e 100 ms.
23. 23. Procedimento secondo la rivendicazione 21, in cui detta deposizione di polietilenimmina avviene a partire da una soluzione acquosa allo 0.2%, per 2 h, a temperatura ambiente.
24. 24. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 21 a 23, in cui detto acido ialuronico à ̈ immobilizzato a detta superficie amminata per condensazione con N-idrossi succinimide/ 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide, o mediante trattamento con periodato dell’acido ialuronico e successiva amminazione riduttiva.
25. 25. Procedimento secondo la rivendicazione 19 o 20, in cui la superficie di detto dispositivo à ̈ preventivamente funzionalizzata con collagene.
26. 26. Procedimento secondo la rivendicazione 25, in cui detta funzionalizzazione avviene per trattamento di detta superficie del dispositivo con una soluzione di collagene 0,3% in acido acetico 10 mM e un ugual volume di tampone fosfato a 37°C per 8h in modo da ottenere collagene fibrillato.
27. 27. Procedimento secondo la rivendicazione 25 o 26, in cui detto acido ialuronico à ̈ legato a detto collagene per trattamento in presenza di N-idrossi succinimide/ 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide, o mediante trattamento con periodato dell’acido ialuronico e successiva amminazione riduttiva.
28. 28. Procedimento secondo la rivendicazione 19 o 20, comprendente la formazione di un precipitato di collagene in sospensione acquosa comprendente detto complesso di acido ialuronico con detto antibiotico glicopeptidico, separazione e parziale essiccamento a dare un gel.
29. 29. Procedimento secondo la rivendicazione 28, in cui detto gel subisce un’ulteriore fase di liofilizzazione.
30. 30. Dispositivo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15, per l’uso come antibatterico ed osteoinduttivo in applicazioni implantari.
31. 31. Dispositivo secondo la rivendicazione 30, in cui detto uso prevede un rilascio controllato di detto antibiotico glicopeptidico.