EP3544644A1 - Material für ein knochenimplantat und verfahren zum herstellen eines solchen - Google Patents

Material für ein knochenimplantat und verfahren zum herstellen eines solchen

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Publication number
EP3544644A1
EP3544644A1 EP17811852.7A EP17811852A EP3544644A1 EP 3544644 A1 EP3544644 A1 EP 3544644A1 EP 17811852 A EP17811852 A EP 17811852A EP 3544644 A1 EP3544644 A1 EP 3544644A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
linker
polysaccharide
peek
bone
acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17811852.7A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael GIESSL
Helmut COELFEN
Dietmar Schaffarczyk
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Stimos GmbH
Original Assignee
Stimos GmbH
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Filing date
Publication date
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Application filed by Stimos GmbH filed Critical Stimos GmbH
Publication of EP3544644A1 publication Critical patent/EP3544644A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
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    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/30—Inorganic materials
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a material for a bone chenimplantat comprising a support structure having an upper ⁇ surface that comprises at least one biocompatible material, egg ⁇ ne covalently bound to this surface matrix, and intercalated in the matrix of calcium phosphate.
  • the present invention further relates to a method for producing the material according to the invention, a bone implant to the material of the invention is applied, as well as its Ver ⁇ use as bone implant material.
  • the organic components in the bone are made up of 95% collagen, and from 5% proteoglycans and other haftvermit ⁇ telnden glycoproteins.
  • the mineral portion of bone is composed almost entirely of calcium phosphate in the modifi cation of ⁇ Hydroxylapat it.
  • the hard material properties of hydroxyapatite combine with the elastic properties of the organic components to make the bone a very versatile composite material.
  • cytokines and growth factors released spree- re to recruit white blood cells to Wun ⁇ de.
  • monocytes mononuclear cells such as monocytes recruited.
  • Mononuclear cells differentiate into macrophages and attach themselves to the surface of the implant.
  • macro phages are responsible for the wound by bacteria, cell debris and other impurities ⁇ via phagocytosis rei ⁇ Nigen.
  • the implant material is also perceived by the body as a foreign body. However, since the implant is substantially larger than the macrophages, they can be the material do not phagocytize.
  • the macrophages fuse and form multinucleated giant cells in order to enclose the foreign body.
  • the macrophages also provide for the recruitment of other cells, such as fibroblasts, which deposit fibrous tissue on the surface of the implant.
  • DIE ser consists of bone precursor cells and fibroblasts, wel ⁇ che in a disordered matrix of non-collagenous proteins and collagen are. This matrix is gradually formed by said cells as a first response and is constructive ⁇ turally similar to the woven bone.
  • the soft callus is finally gradually rebuilt by osteoblasts into ordered lamellar bone structure. Osteoblasts secrete type I collagen, calcium phosphate and calcium carbonate with an arbitrary, random orientation.
  • the remodeling phase overlaps with the formation of the hard callus. This is achieved by resorption of disordered bone structures by osteoclasts and subsequent formation of ordered bone structures by osteoblasts.
  • Po ⁇ tentielle bone materials should rosionsbe pretechnik a reliable strength, high resistance, high abrasion resistance, corrosion, therefore, and have a similar bone Stiff ⁇ ness. The latter plays a major role in the context of so-called "stress shielding".
  • the bone ⁇ chen is a dynamic system which off depending on the mechanical stress or is established. Now, a Knochenim- plantatmaterial used, which has a higher compared to bone ⁇ substance stiffness, this takes a large part of the mechanical load, thus the surrounding bone is gradually reduced.
  • a potential implant material should either be as bioinert or bioactive as possible.
  • the implant is therefore biocompatible and builds at best a positive connection with the bone substance (Contact osteogenesis).
  • Contact osteogenesis the bone substance
  • Implants made of Ti ⁇ tan, aluminum, cobalt, chromium and polyetheretherketone (PEEK) are among this type of material.
  • bioactive material promotes rapid implantation of the implant into the surrounding tissue, thus ensuring rapid and long-lasting fixation of the implant in the body.
  • This effect is referred to as so-called "osseointegrate ion". Therefore, bioactive materials often show osteoconductive and osteoinductive properties and are usually highly hydrophilic. Often such material ⁇ lien be absorbed by the body. Hydroxylapatite, tricalcium phosphate and some bioglasses are among the bioactive materials. Bi ⁇ oaktive materials can cause in the body, in the worst case, an immune response.
  • both the low adhesion of the calcium phosphates to the implant is disadvantageous, and also their cohesive cohesion within the individual calcium phosphate layers.
  • these methods should be generated in order to favor the healing of the bone material in the bone mög ⁇ lichst like structure on the surface.
  • the bone itself is a highly hierarchical composite material consisting of a matrix and a mineral phase.
  • gelatin is usually produced by physical and chemical degradation or thermal denaturation of native collagen .
  • gelatin is water-soluble at a physiological pH and melts at a sol-gel transition temperature of 25 to 30 ° C. After cooling arise transparent gels.
  • the prior art is just ⁇ if the non-covalent deposition of gelatin on top ⁇ surfaces of arterial implant materials reported.
  • gelatin was covalently coupled to PEEK and mineralized with calcium phosphate Product Calciump-, so as to form a bone-like layer to very good proliferation of osteoblasts guide ⁇ te.
  • the problem with gelatin-based coatings is that gelatine is an animal product that requires Class III certification.
  • an object of the present OF INVENTION ⁇ dung relates to a material for a bone implant comprising:
  • the matrix has at least one polysaccharide.
  • material for bone implants and “Knochenim ⁇ plantatmaterial” are used interchangeably herein.
  • the OF INVENTION ⁇ dung-date material for bone implants has bioactive egg on properties.
  • bioactive be ⁇ features to enable rapid growth into the surrounding tissue and to ensure fast and langanhal ⁇ tend fixation of the implant in the body the property of the inventive material for bone implants. This property results from the technical features defined in sub-items (a) to (c) above in combination with the characterizing part.
  • polysaccharides are not discussed in connection with the biomim ⁇ mineralization of calcium phosphate - if more than ⁇ only as glycoproteins. But polysaccharides play a role in the biomineralization of calcium carbonate (egg shells - keratan sulfate, coccolith exoskeletons etc.), but even there they are very little studied compared to Protei ⁇ nen because polysaccharides are notoriously difficult to characterize. The inventive approach can therefore be regarded as a departure from most ⁇ th approaches. It is therefore an obvious idea not to think of polysaccharides in building a bone-like bioin ⁇ spir Being coating for an implant.
  • a material layer is to be understood to mean a support structure Minim ⁇ least, which is composed of the biocompatible material and which rix with the Mat- be connected or can be covalently linked.
  • Support structure may, for example, an outermost layer of a completely made of the biocompatible material, wherein ⁇ play shaping, its basic structure of the implant. Or it can be applied to a basic structure made of another material, such as the biocompatible material.
  • biokompati ⁇ bel be understood as the property of a material or substance to be used in vivo and in this case a few to have or to kei ⁇ ne negative impact on the patient or the healing process to be used without sequelae ,
  • a matrix is to be understood here as meaning a structure which has as its main constituent a polysaccharide in which calcium phosphate is incorporated.
  • the polysaccharide can be any polysaccharide which can be used by the person skilled in the art. If the polysaccharide is an animal polysaccharide, a substance can be used whose properties are well known and tested.
  • the Polysac ⁇ CharID is a vegetable polysaccharide, thereby providing a vegetable material may be used, of medically safe is.
  • Synthetic - - Spare ⁇ materials for polysaccharides are understood as beispielswei- se polymers of polyacrylic acid or vinyl and acrylic monomers (possible species see below) under polysaccharides are here also.
  • all of the features mentioned on the polysaccharide - chemical, material or a method, a use or a bone implant - suitably - in any combination also apply to the synthetic substitute (s).
  • the matrix comprises at least one ⁇ polymers of polyacrylic acid and / or a polymer of vinyl and acrylic monomers instead of the polysaccharide.
  • the polysaccharide may be, for example, alginic acid, alginate, hyaluronic acid, hyaluronate, pectin, carrageenan, agarose, Anky ⁇ loose and chitosan. Any other glycosaminoglycan, such as heparin / heparan sulfate, chondroit insulfate / dermatan sulfate or keratan sulfate, would also be possible. Also conceivable are hemicelluloses, such as xylans or mannans after a carboxyfunctionalization, or also xanthan, gellan, fucogalactan or welan gum.
  • the polysaccharide is from ⁇ selected from a group consisting of alginic acid, alginate, hyaluronic acid, hyaluronate, pectin, carrageenan, agarose, Anky ⁇ loose and chitosan. This can be many different substances are used, which can be selected individually, due to their special properties ⁇ .
  • Hyaluronic Acid is a linear polysaccharide composed of disaccharide repeating units. These are composed of D-glucuronic acid and N-acetyl-glucosamine, which are linked via ⁇ -1,4 and ⁇ -1,3 glycosidic bonds (see below).
  • the carboxyl groups of Hy ⁇ aluronsaure are largely present as the sodium salt, it is thus negatively charged and immobilized a variety of Wassermo ⁇ molecules, even at very low concentrations, an aqueous solution is therefore very viscous.
  • Hya is used in many ways in the medical and healthcare industry. Because hyaluronic acid is considered ⁇ widely biocompatible and safe, there are very many applications. This also makes them very inte ⁇ esting as the starting material for the surface coating of bone implants.
  • hyaluronic acid was extracted mainly from chicken combs that are produced as waste in food production. Meanwhile, however, the production is carried out by culturing genetically engineered biotechnologically streptococcus bacteria, thereby reducing the risk for the contamina tion ⁇ deleted with animal pathogens.
  • Alginic acid is a copolymer of the two uronic acids D-mannuronic acid (M) and L-guluronic acid (G). Alginic acid from plants or algae are obtained wes ⁇ half their composition and sequence distribution twitches ⁇ purity strongly depends on the origin of the plant / algae and their species. The G and M are each linked via beta-1,4 glycosi ⁇ sized bonds. The good gelling properties of alginic acid are due to the G blocks, which com- plex the calcium ions. Xieren. Since alginic acid comes from natural sources, it must be ensured that potential contaminants such as heavy metals, endotoxins, proteins, etc. have been removed, otherwise immune reactions can occur. Provided that it has been sufficiently purified, alginic acid, like hyaluronic acid, does not cause an immune or inflammatory reaction in the body, so it has good biocompatibility.
  • alginic acid is not degradable in the human body as there is no alginase. Because of the good biocompatibility alginic acid is used in numerous bi ⁇ o committeeischen applications, for example in wound ⁇ pads and comes when RGD peptide-modified to be used in Be ⁇ costume as bone implant material. If alginic acid is used in combination with hydroxyapatite, the formation of bone tissue can be additionally stimulated.
  • the matrix has a more three-dimensional structure that is similar to the target bone structure, making the Mineralisie ⁇ tion can be facilitated.
  • Chitosan a linear polysaccharide-based biopolymer.
  • Chitosan may also utilize the material's hemostatic efficacy and antimicrobial properties.
  • Chitosan are the following material properties also supplied ⁇ addressed non-allergenic, non-toxic, wound-healing, antibak ⁇ -bacterial, hemostatic, bacteriostatic, fungicidal action (biodegradable) and anti-microbial.
  • the invention is also directed to chitosan as al ⁇ lenberg substance without a combination with the above compounds or compounds ⁇ .
  • the invention is also directed to an inventive use of chitosan as a material - medically and / or non-implantable and / or with and without body contact.
  • the He ⁇ invention further directed to a novel use of the chitosan as a component of a personal care product, into ⁇ particular a tooth brush (toothbrush head), a comb, a hair brush, a nail brush, a nail file, etc.
  • the invention is also directed to an oF iNVENTION ⁇ -making proper use of chitosan as a component of a health product, particularly a sleeping mask, a beauty plaster etc.
  • the invention is further directed to a novel use of the chitosan as a component of a medical device, in particular for wound ⁇ supply (binding, plasters, swabs , Cooling compress etc.).
  • the structure of the coating can be adjusted specifically, since, for example, linear can be combined with branched polysaccharides.
  • branched amylopectin from vegetable starch can be combined with the linear amylose. Chemically, both molecules are identical but not structural.
  • a promising pair for chemically different Po ⁇ lysaccharide the neutral amylose example would be to couple with the negatively charged alginate, which 2+ ions can be cross-linked through addition of Ca additionally. About this crosslinking washing and applying the next alginate (Layer by Layer Assembly, LBL) can then subsequently also further layers of alginate are connected via simple Imoniagnie ⁇ tion of the layer with Ca 2+. An extreme combination would be the negative alginic acid with the positive chitosan. These ionically stabilized "layer by layer assemblies" can be covalently linked by suitable crosslinking chemistry (by means of EDC or the like). In between, all combinations of polysaccharides are continuously available via a common chemical bond via ester bonds.
  • the polysaccharide is a chemically modified polysaccharide.
  • che ⁇ mixed mean modified to artificial, laboratory chemical modification of a sugar of the polysaccharide were made, for example at a free group, for example hydroxyl, aldehyde or acid group on the polysaccharide.
  • a ⁇ set range can be extended.
  • inactive groups can be "converted" into active groups or it can be targeted An undesirable property can be eliminated.
  • HMDA and ADH are both diamide linkers.
  • the material according to the invention for bone chenimplantate to solid materials or bodies are applied, which are used as bone implant USAGE ⁇ dung. These bodies may have any desired or required three-dimensional shape.
  • the whole surface of the invention comprises ma- terials for bone implants in the preceding subsection
  • Suitable Ma ⁇ terialien to which the inventive material can be introduced ⁇ can in this case from terialien known in the prior art ceramic materials, metals, polymers, Kompositma- or combinations thereof. This would, for example, as metals: titanium / stainless steel, as miken Kera ⁇ : Zircon (dioxide) as a polymer: polyetherketone (PEK) and total PEK family, but especially: polyether ether ketone (PEEK), polyether ketone ketone (PEKK) , Polyether ketone ether ketone ketone (PEKEKK); Carbon Fiber Reinforced PEEK (CFR
  • PEEK polyethylene ⁇
  • UHMWPE Ultra-High-Molecular-Weight polyethylene
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • PET polyethylene terephthalate
  • PA polyamides
  • PLA polylactides
  • PPSU polyphenylene sulfone
  • PEEK polyetheretherketone
  • thermoplastic high-performance plastic is a very widespread thermoplastic high-performance plastic.
  • the semi-crystalline plastic is we ⁇ gen its high solvent resistance, the high
  • PEEK has been available in implantable quality on the market. Since then, the market share of PEEK has greatly increased as the ⁇ plantatsmaterial.
  • PEEK is widely used in medical technology as a bone substitute material and implant, for example as a fusion cage for spinal fusion in intervertebral disc injuries. Since PEEK is permeable to X-ray radiation and does not interact with magnetic fields, the patient can easily be observed with an imaging procedure after an operation in order to follow the healing process in the affected area.
  • the good mechanical properties ⁇ properties of PEEK which are very similar to those of cortical bone (cortical bone), qualify PEEK as a well-suited
  • PEEK is one of the materials that almost completely bioinert behave, so do not enter into any specific interaction with the body. PEEK is neither repelled nor well absorbed by the body integrated into the bone, it is therefore ideally to a good contact of the bone with the implant. Partial tissue encapsulation occurs, which reduces mechanical stability and may result in loss of the implant.
  • some methods have been developed to achieve bioactivity of the material, such as coating with calcium phosphate and also adding hydroxylapatite particles to the polymer. Other methods of surface modification of PEEK are possible and are for example as described in the following sections.
  • the polymer substrate may be coated with a functional poly ⁇ mer.
  • a functional poly ⁇ mer Here is introduced compared to the modes ⁇ fication small molecule, a multiple of funktionel ⁇ len groups in dependence of the molecu ⁇ large Klobuk of the introduced polymer.
  • the graft-ing from method when initiated from the surface of the sub ⁇ strats from a polymer chain and increasingly growing.
  • the substrate must be able to act as an initiator for example, be a radical-radical polymerisation ⁇ tion, and must be able to make it through a activator reagent to it.
  • the graft-ing from strategy to reach a higher functionalization because the Polymerket ⁇ th grow gradually and be introduced not listed as a finished polymer.
  • the reverse approach, the grafting-to is based on a finished polymer, which is grafted with a suitable Me ⁇ mechanism to the surface.
  • a disadvantage of this method is that when grafting finished polymers, neighboring potential binding sites are strongly blocked by the macromolecules, this does not happen in the grafting from approach. In contrast, control over the polymer length and molecular weight distribution of the applied polymers can only be achieved with the grafting-to approach.
  • coated substrates also decreased significantly, which increased the hydrophilicity of the surface and thus the acceptance of bone-forming cells (see J. Chem.
  • a surface-induced polymerization can be considered.
  • Oberflä ⁇ chenmodtechnik by means of small molecules can be in egg ⁇ ner variety of organic polymers to introduce linker, thereby further modifications may be carried out at the surface.
  • a UV-indexed polymerization (UV: Ultraviol ⁇ lett) into consideration.
  • radical initiator Rather than apply a radical initiator or other initiators to the surface, it is according to the substrate possible radicals directly on the surface to erzeu ⁇ gene.
  • This can be for example by auxiliary reagents, such as benzophenone (BP), benzoyl benzoic acid, or other photoinitiators reach the Upon UV excitation abstract hydrogen atoms of suitable polymers and thereby generate radicals on the polymer ⁇ surface, which can initiate a chain start.
  • BP benzophenone
  • benzoyl benzoic acid or other photoinitiators reach the Upon UV excitation abstract hydrogen atoms of suitable polymers and thereby generate radicals on the polymer ⁇ surface, which can initiate a chain start.
  • Polymers, such as PET form hydroxyl and peroxide groups on the surface after argon plasma treatment in air. These under excitation with UV light also serve as a radical starter. With polyethylene, this was also done under similar conditions.
  • the photoinitiator BP is known to undergo a photopinacoleactive reaction upon exposure to UV. This results in the formation of a semibenzopinacol radical which can serve as an initiator in polymerizations.
  • photoindu ⁇ ed division radicals can also arise start the polymerization from the excited molecule.
  • the polymer polyetheretherketone (PEEK) having in the polymer backbone BP ⁇ A units, which behave similarly (see also M. Kyomoto; K. Ishihara, Applied Materials & Acs interfaces 2009, 1, 537- 542). In 2009, Kyomoto demonstrated that the surface of untreated PEEK under UV action is capable of initiating free-radical polymerizations of various acrylic acid derivatives.
  • the covalently bonded matrix typically has one
  • the covalently bonded matrix can have a layer thickness of 1 nm to 10 micrometers ([im), preferably from 10 nm to 1 [im, more preferably from 20 nm to 500 nm, more preferably from 30 nm to 300 nm, more be ⁇ vorzugt from 50 nm to 200 nm, and most preferably at from 100 to 150 nm.
  • the covalently bound Matrix prefers the entire surface of the bone implant material of the present invention.
  • a hydroquinone derivative was coupled to the surface and a normal free-radical polymerization was carried out with a thermal radical initiator.
  • the immobilized hydroquinone quenched the growing polymer chain by homolytic cleavage of the OH bond, leading to chain termination.
  • the durable Aryloxylradikal is not too narrow-radical polymerization with the monomers present in the location, but can trap with a growing polymer radical ReKoM ⁇ bine and thus the polymer on the surface.
  • the inventive material includes for bone implants in said matrix intercalated calcium phosphate, calcium orthophosphate preferably in all mineral forms, more preferably selected from the group best ⁇ based amorphous calcium orthophosphate phosphate (ACP), Dicalciumpho- phosphate dihydrate (DCPD; brushite), octacalcium phosphate and hydro- xylapatit, even with partial fluoride, chloride or carbonate substitute nat ion, wherein ACP, it Hydroxylapat and Octacalciumpho ⁇ sphat are particularly preferred.
  • ACP ⁇ based amorphous calcium orthophosphate phosphate
  • DCPD Dicalciumpho- phosphate dihydrate
  • octacalcium phosphate and hydro- xylapatit even with partial fluoride, chloride or carbonate substitute nat ion, wherein ACP, it Hydroxylapat and Octacalciumpho ⁇ sphat are particularly preferred.
  • the polysaccharide is bound via a linker to the biocompatible material, where ⁇ selected at the linker from a group consisting of: a diamine linker or diamine linker in combination with a succinic acid linker, a (UV-grafted) polyacrylic re-linker or a photokoppelbaren Left, in particular ei ⁇ nem Azidoanilin linker.
  • ⁇ selected at the linker from a group consisting of: a diamine linker or diamine linker in combination with a succinic acid linker, a (UV-grafted) polyacrylic re-linker or a photokoppelbaren Left, in particular ei ⁇ nem Azidoanilin linker.
  • Corresponding linkers are known in the art. Here, photorelective or light-induced / light-inducible coupling should be understood as being photocoupled.
  • such light-inducible linkers can, in conjunction with a variety of substances or monomers, such as vinyl or acrylic monomers or polymers (polysaccharides) can be applied or a variety of substances can radically with UV Be polymerized light.
  • Examples include: methacrylic acid, phosphoric acid 2-hydroxyethyl methacrylate ester (as a mixture of monoester and diester, thereof monoester as normal monomer or diester as crosslinker), 2-hydroxyethyl methacrylate (as normal monomer or Co - monomer), ethylene glycol dimethacrylate (as cross-linker, mixture with other monomers), bis [2- (methacryloyloxy) ethyl] phosphate (as cross-linker, mixture with other monomers) and 2- (dimethylamino) ethyl methacrylate.
  • Coupling, for example, with azidoanilines can be applied to all polysaccharides which have carboxyl groups and which are directly functional analogous to hyaluronic acid, such as, for example, alginic acid, pectin, or carboxymethylcellulose.
  • hyaluronic acid such as, for example, alginic acid, pectin, or carboxymethylcellulose.
  • the hydroxyl group present in most polysaccharides in the 6-position can be functionalized analogously to the formation of carboxymethylcellulose to form a carboxyfunction (for example chitosan) and is therefore available for coupling with azidoanilines.
  • Methods for the covalent attachment of polysaccharides to, for example, PEEK are described below.
  • the invention comprises Ma ⁇ TERIAL for bone implants oxidic ceramic materials, titanium, polymeric materials, or composites, or consists of, wherein the polysaccharide is covalently bound matrix is bound with titanium or oxidic ceramic materials through a silane linker.
  • silane linker and entspre ⁇ standard practices for binding of polysaccharides are known in the art.
  • the present invention relates to a material for bone implants to collectively ⁇ :
  • the biocompatible material is PEEK
  • the polysaccharide is alginic acid
  • the calcium phosphate embedded in this matrix is hydroxyapatite, in particular crystalline hydroxylapatite.
  • Another object of the present invention relates to a process for the preparation of an inventive Materi ⁇ as for bone implants, comprising the steps of:
  • step (b) of the process OF INVENTION ⁇ to the invention are not particularly Be ⁇ restrictions and are known in the art.
  • the surface comprises or consists of PEEK
  • Step (b) of the method according to the invention the steps in any order:
  • linker molecule selected from the group consisting of a diamine linker, or a diamine linker and a succinic acid linker or UV gegrafteter polyacrylic acid (PAA), or a photokoppelbaren linker special into ⁇ a Azidoanilin- left to this activated upper ⁇ surface, and
  • any critiquenfol ⁇ ge that either first the coupling of the linker can be made to the activated surface followed by coupling of the product from activated surface and linker to the polysaccharide, or vice versa, so only the coupling the linker to the polysaccharide, and subsequently the coupling of the product from the linker and the polysaccharide at a k ⁇ tivêtêt surface.
  • a method for coupling of linker molecules to a entspre ⁇ accordingly activated PEEK surface or the activated polymer are also subject to no particular restrictions.
  • the covalent coupling of the photo ⁇ couplable linker, in particular the Azidoanilin linker, to the activated surface at a wavelength having a Be ⁇ ranging from 200 nm to 400 nm, preferably with a range of 200 nm to 300 nm, and most preferably with a range of 240 nm to 260 nm.
  • the covalent coupling of the photokop ⁇ pelbaren linker, in particular the Azidoanilin linker, to the activated surface at a wavelength of 254 nm. here ⁇ by a common method can quickly , reliable and easy to apply.
  • the polysaccharide having its carboxylic acid groups ⁇ is coupled overall even before the light-induced coupling to the photo ⁇ couplable linkers, in particular the Azidoanilin linker.
  • the covalent coupling of the carboxy-functionalized polysaccharide takes place by means of a, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) -mediated amine and carboxy group coupling to the photo-couplable Lin- ker, in particular on the azidoaniline linker.
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the coupling can be performed routinely and quickly by a standard method.
  • a method of mineralizing a polysaccharide containing matrix with calcium phosphates according to step (c) of the process according ⁇ invention are not particularly Beschränkun ⁇ gene.
  • amorphous calcium phosphate (ACP) is used, for example, incubating the upper surface with a Solution comprising calcium chloride, dipotassium hydrogen phosphate and a nucleation inhibitor.
  • This Nucle ⁇ tionation inhibitor is preferably a non-collagenous protein or protein analog, particularly preferably poly-aspartic acid and / or fetuin.
  • Hydroxylapat it is used, for example, include incubating the Oberflä ⁇ che with a solution comprising hydrogen phosphate, calcium chloride and dipotassium.
  • Another object of the present invention relates to a bone implant to the inventive Knochenim ⁇ plantatmaterial is applied.
  • Another object of the present invention relates to the use of the material according to the invention for a bone implant as a bone implant material.
  • the present invention was considered all relevant defi ⁇ nition, advantages and preferred embodiments that have been before ⁇ standing listed for the novel material for Knochenimplanta ⁇ te, in an analogous manner.
  • Another object of the present invention relates to the use of the inventive material for a bone ⁇ chenimplantat for example, for the treatment of KnochenC ⁇ .
  • Another object of the present invention relates to the use of the bone implant according to the invention in ⁇ example, for the treatment of bone damage. Also for this aspect of the present invention, all the relevant definitions, advantages and preferred exporting ⁇ insurance forms, which have been listed above for the novel material for bone implants apply analogously. Implants grow in the human body better, and be more stable attached to the body (among other ⁇ rem by increased accumulation of body cells), the better the implant surface corresponds to the natural bone. This is the goal of the present invention. Further, the coating should be covalently TIALLY to the surface of the implants ⁇ .
  • the bone implant materials of the invention have a higher biocompatibility, better healing in the natural bones and an increased mechanical belast ⁇ bility.
  • the surface modification according to the present invention aims, include bone-like structures covalently bonded to the surface of the bone implant materials réellebrin ⁇ gene which alphase an organic polysaccharide and Miner of natural bone. This should be the Assist healing of the implant in the bone.
  • These structures include a matrix of a polysaccharide which is eventually mineralized with calcium phosphate. Mineralization occurs with the help of non-collagenous proteins and their analogues, which act as nucleation inhibitors, so that mineralization is controlled and ectopic mineralization is avoided.
  • Such Nuk ⁇ leationsinhibitoren are for example poly-aspartic acid or fetuin.
  • Mineralization with octacalcium phosphate or hydroxyapatite is accomplished by incubating the polysaccharide matrix in a solution containing calcium ions or phosphate ions. By a slow and controlled addition of a solution of the respective complementary phosphate ions or Calciumi ⁇ ones octacalcium phosphate and / or hydroxyapatite may be intra ⁇ half of the polysaccharide precipitated. By re ⁇ tively disordered structure of the polysaccharide, the re ⁇ sultierende surface modification has woven bone like or kallusieri structure.
  • the bone cells could thus build up further disordered Kollagenstruktu ⁇ ren around the material during the healing of the material or directly connect the material further with the bone.
  • This disordered struc ⁇ ren can then finally in the natural Remodellie- approximately phase of bone healing are transformed into parent bone structural ⁇ tures.
  • the cells can not penetrate to the surface of the direct Implantatma ⁇ terials by the covalent attachment of the polysaccharides in the remodeling and thus always remain in a gewünsch ⁇ th matrix of extracellular proteins.
  • the Implantatmateri ⁇ al is thus masked for the cells to avoid adverse reactions in the healing of implants. Since the modifications only affect the surface of the implant materials, material properties are not changed.
  • the basic chemical reactions can be easily adapted for modification of various materials.
  • metal oxide surfaces can be covalently attached via established silane chemistry. This makes the surface coating of the invention also interesting for oxide Kera ⁇ mikmaterialien.
  • the common Implantatmateri ⁇ alien of titanium over the surface modification according to the invention silanes are accessible via silane chemistry.
  • a method was developed in which the gelatin functionalization of the bone implant plastic PEEK was established.
  • a method has now been developed to bind to the surface of PEEK, a network of Po ⁇ lysacchariden vegetable or bacterial origin, concretely hyaluronic acid, alginic acid derivatives and vollsyntheti ⁇ specific polymers covalently to the problems that a coating has animal-based, such as to bypass the post ⁇ setting of sterility and the lengthy approval process due to the potential endotoxin and Allergenpo- tentials.
  • Some patients opt for certain animal products for personal reasons, be it religious or ethical reasons. vegan, resp. synthetic functionalization could be interesting alternatives for these people ⁇ circle.
  • the applied coating with calcium phosphate, in particular hydroxyapatite be mineralized.
  • the reduced PEEK films can be further reacted to Bernstein Text ⁇ esters.
  • the esterification can be carried out by means of Bern ⁇ steinklad in acetone at room temperature:
  • Purified PEEK films could be reacted in pure diamine (ethylenediamine (EDA) and 1,3-diaminopropane). It comes to ei ⁇ ner forming imines (Schiff base) on the surface of PEEK. The reaction may take 3 h while refluxing the diamine and
  • the modified PEEK films were subjected to Kunststoffwinkelmes ⁇ solution.
  • the modified PEEK films were treated with phosphate buffer prior to measurement, rinsed with MilliQ and dried well.
  • the contact angle measurements can be made 5 seconds (s) after application of the drop.
  • Grewinkelmes ⁇ solutions with ultrapure water (MilliQ) imply while with ethylene diamine modified PEEK with a 6 6 ° markedly increased hydrophilicity compared to unmodified PEEK films (84, 5 °).
  • the contact angle with 7 0 ° has also become smaller, since the surface was also more hydrophilic. The increase in the hydrophilicity indicates a successful reaction during the reaction of PEEK with the diamines.
  • Untreated PEEK films can be coated with a grafting from poly ⁇ merisationsmethode with polyacrylic acid (UV light induced PEEK-modification):
  • the experimental procedure used can be carried out in one step. It can be worked with degassed aqueous solutions of distilled acrylic acid.
  • a UV light source is a OSRAM Vitalux 300 can be used without additional filter ver ⁇ spent.
  • the samples were used, which were polymerized for 30 minutes at 5 wt% acrylic acid fraction. Under these conditions the Beschich ⁇ tung was still thick enough to speak of a homogeneous coating (not shown), and at the same time can be assumed at this layer thickness that the mechanical properties of the bulk material egg ⁇ advertising does not adversely affect the.
  • the polyacrylic acid layers prepared at higher acrylic acid concentrations are not suitable for targeting as a bone graft material because of the thick gel pad of up to 5 millimeters (mm) because a gel pad on the surface greatly degrades mechanical contact with the surrounding tissue.
  • the polyacrylic acid has formed linear structures with the beads.
  • the off ⁇ formation of these lines could be drying method due to his (vacuum furnace) may also the hydrophobicity of the surface PEEK owed.
  • the dif ⁇ founding to the active site acrylic acid molecules have a higher affinity for a growing polyacrylic acid, as for the hydro ⁇ phobe PEEK surface. This could explain the line structures consisting of PAA balls.
  • the average globule -size in under these reaction conditions is 1.7 pm and is therefore again about half as large as at 60 min polymerisation ⁇ tion. Coating results were verified by ATR-IR spectra (not shown).
  • the coatings which have been prepared at 5% by weight of acrylic acid and 30 minutes of UV treatment have proven particularly suitable.
  • the PEEK can be thin ⁇ be coated so that no too much gel pad was deposited under these conditions.
  • the UV-induced graft ing polymer ion is thus very well suited for the coating of PEEK with polyacrylic acid, since significant amounts of PAA on the PEEK surface could be detected.
  • the polyacrylic acid layer can be modified by the coupling of Dia ⁇ minlinkern so that later can be formed with organic acids amide bonds.
  • the coupling of the diamine species to the carboxyl groups can by means of the mo ⁇ ern coupling reagent 4- (4, 6-dimethoxy-l, 3, 5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium Chloride performed (DMT-MM) ⁇ the , Activation and coupling can be performed with DMT-MM at a buffered pH of 9:
  • the fluorescence intensity can be used to determine the concentration of the dye in solution and thus to draw conclusions about the amount of surface amino groups.
  • TMDA tetramethylenediamine
  • alginic acid shown as structural sections of alginic acid with the various poly-G, poly-M and alternating blocks, depending on the source of alginic acid, the ratio of G and M is different
  • Unmodified hyaluronic acid consists of a D-glucuronic acid and an N-acetyl-glucosamine unit. It therefore possesses one free carboxyl function and one acetylated amine function per disaccharide monomer.
  • the deacetylation can be carried out in aqueous hydrazine solution with Hyd ⁇
  • the purple solution was in the sheath ⁇ funnel extracted five times with 25 mL of diethyl ether until the aqueous phase was colorless.
  • the pH of the solution was adjusted to 7-7.5 with 0.2 M NaOH solution.
  • the polymer was precipitated in 1 volume equivalent of ethanol, dissolved in H 2 O and evaporated dialyzed deionized water.
  • the dialysis water was day ⁇ Lich changed two times. After three days of dialysis, the Lö ⁇ solution was freeze-dried and obtain the deacetylated hyaluronic acid as a product.
  • the free amino groups could be used as anchor groups for coupling to the carboxyl groups of the PEEK-PAA surface.
  • the polymer was examined by NMR spectroscopy to determine the degree of deacetylation (not shown).
  • the free carboxyl groups of hyaluronic acid may be suitable for various modification possibilities of the polymer.
  • the literature e.g. reported by amidation, ester formation or Ugi condensation.
  • HMDA hyaluronic acid amidated hexamethyl ⁇ endiamin
  • the coupling of the amine can proceed via the classic EDC / NHS coupling (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide coupling) in an aqueous medium.
  • the reaction is divided into an activation phase in slightly acidic and a coupling phase in slightly basic.
  • the pH value of the reaction had to be continuously monitored and adjusted:
  • ADH adipic dihydrazide
  • a sodium hyaluronate solution containing 3 - was prepared by dissolving 500 mg of sodium hyaluronate in 170 mL H2O. Based on the amount of carboxyl groups in the polymer, a 40-fold molar excess of adipic dihydrazide (ADH, 52.8 mmol, 9.2 g) was added. It was waited until the ADH was completely dissolved (15 min). The pH of the reaction mixture was adjusted to 4 using 1 M HCl solution. Ethanol (50 mL, 50% v / v) was added and stirred for 30 minutes. There were 4 eq. EDC-HC1 (5.3 mmol, 0.9 g) was added. The pH value for 2 h using 1 M HCl supported ⁇ th. To about 4.8 After 2 h the reaction was stopped neutralization of
  • alginic acid can also be functionalized with HMDA.
  • the coupling can for a pre ⁇ writing to Octylaminfunktionalmaschine of alginic acid SUC th:
  • the reaction can be carried out at a constant pH of 9 and the reaction vessel between activation and coupling must not be changed.
  • the coupling at pH 9 is significantly faster compared to the coupling to the NHS ester at pH 7.3, since the amines at pH 9 are largely free amine, which is important for nucleophilic attack on the activated carbonyl center.
  • the NHS clutch can not be performed by ⁇ at such high pH values, as the NHS ester to otherwise fast h is hydrolysed in the aqueous solution:
  • the imine-functionalized PEEK surface can be reacted with native hyaluronic acid and alginic acid under identical reaction conditions.
  • Alginic acid 0.05 mg / mL. It was washed three times with MilliQ of water):
  • Table 2 Overview of the polysaccharide couplings to PEEK substrates.
  • reaction schemes associated with each reaction are as follows: ATR-IR spectra demonstrated successful functionalization (not shown).
  • PEEK-PA film An established synthetic route for hydroxyapatite can be removed and used for the mineralization of PEEK-PA films.
  • the PEEK-PA film can be placed in 0.3 M calcium chloride solution at a buffered pH of 9 and for
  • Simpler variants of mineralization can also be performed.
  • PEEK-PAA samples were incubated for 72 h in diammonium hydrogen phosphate (phosphate pre-structuring, 6 mL vials with 1 M aqueous (NH 4) 2 HPO 4 solution) or calcium nitrate Cal (6 mL vials with 1 M aqueous Ca (NO 3) 2 solution). After this rest period, the samples were added to the other solution (0.6 M (NH 4 ) 2HPC> 4 or 0.6 M Ca (NO 3) 2 solution) and left for one week to allow the counterions ⁇ chen also to diffuse into the gel.
  • diammonium hydrogen phosphate phosphate pre-structuring, 6 mL vials with 1 M aqueous (NH 4) 2 HPO 4 solution) or calcium nitrate Cal (6 mL vials with 1 M aqueous Ca (NO 3) 2 solution).
  • the samples were added to the other solution (0.6 M (NH 4 ) 2HPC> 4 or
  • azido-functionalized hyaluronic acid was attached to a PEEK surface by means of light-induced coupling.
  • the reaction sequence of light-induced coupling of azidoanilines with hyaluronic acid to PEEK could proceed as follows:
  • So Azidoanilin phenomenon were at the carboxy group of polysaccharides, such as alginic or hyaluronic acid, angekop ⁇ pelt (see below).
  • the coupling product of polysaccharide and azidoaniline linker was then ligated to the PEEK surfaces with light.
  • hyaluronic acid for example, would be a split in the hyaluronic acid ⁇ how something enzymatically or by ultrasound, in Be ⁇ costume.
  • the hyaluronic acid is cleaved into fragments of about 15 kilodaltons (kD) and in the ultrasound treatment into fragments of about 300 kD.
  • the substrates containing Hya-US-N3 are slightly darker in color than the substrates with Hya-Enz-N3.
  • the hyaluronic acid ring or spot can be detected in the SEM examination. Fitting for this are signals in the EDX analysis of carbon and oxygen. Depending ⁇ but is not (e) resistant to washing (s) or film deposition on the Hyaluronsaurebe Anlagenung to recognize and detect no calcium or phosphorus in the EDX analysis, which could include a mineralization.
  • the hyaluronic acid coating is a ring (as with all previous ones) Samples with enzymatically split hyaluronic acid) and not completely, but partially covered by the deposited material.
  • the deposits show no preference for hyaluronic acid coating or PEEK, but they appear to be inhomogeneously distributed throughout (not shown).
  • the hyaluronic acid coating is a filled-in spot (as in all previous samples by means of ultrasound cleaved hyaluronic acid) and very tightly covered by the material from ⁇ divorced. There is evidence of preferential mineralization of the hyaluronic acid coating and lower coverage of the uncoated PEEK area (not shown).
  • the deposited materials appear to be rather coarse at RT, while a temperature of 37 ° C appears to promote the formation of fine deposits.
  • a temperature of 37 ° C appears to promote the formation of fine deposits.
  • significant deposits were seen after one day at pH8 (eg IS019 and IS025) and pH9 (eg IS033 and IS039), whereas at RT (IS022, IS036, IS028, IS042) after one day below Conditions nothing until hardly anything was deposited.
  • a longer insertion time should increase the amount of deposited material or, in the case of very slow deposition, allow deposition over ⁇ . Contrary to this expectation, the largest amounts of deposits were observed in the samples with a 24-hour loading time. It may be that length ⁇ rer Open time processing or diffusion processes take place which reduce the visible deposits compared to samples with shorter laying times. Depth analyzes could provide more detailed information on elemental distribution in the mineralized substrate.
  • the polyacrylic acid was investigated with different surface analysis methods such as attenuated total reflection, scanning electron microscopy and confocal laser scanning microscopy to get spectro ⁇ scopic information about the surface and to obtain an accurate picture of the topography (not ge ⁇ shows). It has been modified by the development of Ankupp- Diaminlinkern so later with organic acids ⁇ rule amide bonds can be formed, the polyacrylic acid layer. To quan ⁇ titative statements about the degree of endurenfunktionalisie- tion meet with amino groups, the cleavable fluorescent dye C-coumarin was synthesized with the amino groups accessible indirectly quanti ⁇ fied left on the surface. The quantification was successful for the samples which were directly imin-functionalized with diamines.
  • Hyaluronic acid with adipic dihydrazide and hexamethylenediamine and alginic acid was modified only with the diamine in order to couple amine linkers for subsequent anchorages on the various polyether ether ketone substrates.
  • Hyalur ⁇ oic acid was deacetylated to introduce in this way amine functionalities on the polysaccharide.
  • the modified polysaccharides have been characterized by NMR and ATR-infrared spectroscopy Metho ⁇ (not shown).
  • the numerous modified and unmodified polysaccharides were coupled to the complementary PEEK substrates.
  • the coupled samples were analyzed using ATR-infrared spectroscopy ⁇ , scanning electron microscopy and partly with thermo- mogravimetrie examined (not shown).
  • azidoaniline groups have been coupled to the carboxy groups of polysaccharides, such as alginic or hyaluronic acid, and then attached to a PEEK surface with light.
  • a coating of the polyetheretherketone with azido-functionalized hyaluronic acid was successfully demonstrated. Further ⁇ th strong evidence could be found that a Mineralisie ⁇ tion of the coupled with hyaluronic acid derivatives PEEK surface takes place.
  • a very sensitive surface analysis method is X-ray photoelectron spectroscopy (XPS, narrow X-Ray Photo-electron Spectroscopy).
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • the investigation of the swelling behavior of the polyacrylic acid layers on the polyether ether ketone substrate could be an approach to optimize the coupling conditions so that polysaccharide detection would be possible even with simple analytical methods.
  • Couplings in non-aqueous media would also be conceivable, but are certainly also problematic because of the poor solubility of the polysaccharides. Should also be made to deposit further attempts Hydroxylapat it in the polyacrylic acid, as Hyd ⁇ roxylapat it-coating has been shown to have a positive effect on the acceptance in the organism.

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Abstract

Die Erfindung geht aus von einem Material für ein Knochenimplantat, umfassend: (a) eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst, (b) eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix und (c) in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat. Ein medizinisch unbedenkliches, hochverträgliches und vielseitig einsetzbares Material kann bereitgestellt werden, wenn die Matrix zumindest ein Polysaccharid aufweist (Formel (I)).

Description

MATERIAL FÜR EIN KNOCHE IMPLANTAT UND VERFAHREN ZUM HERSTELLEN EINES SOLCHEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Material für ein Kno- chenimplantat , umfassend eine Trägerstruktur mit einer Ober¬ fläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst, ei¬ ne kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix, sowie in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat . Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Materials, ein Knochenimplantat auf das das erfindungsgemäße Material aufgebracht ist, sowie dessen Ver¬ wendung als Knochenimplantatmaterial.
In den letzten Jahren nahm die Anzahl der Patienten, die an Knochenschäden leiden und/oder ein Knochenimplantat benötigen, tendenziell zu. Dieser Trend betont die Notwendigkeit, hoch¬ wertige, stabile und funktionelle Knochenersatzmaterialien zu erforschen .
Die organischen Komponenten im Knochen bestehen zu 95 % aus Collagen und aus 5 % Proteoglykanen und anderen haftvermit¬ telnden Glykoproteinen . Der mineralische Anteil des Knochens besteht fast ausschließlich aus Calciumphosphat in der Modifi¬ kation von Hydroxylapat it . Die harten Materialeigenschaften von Hydroxylapat it machen den Knochen in Kombination mit den elastischen Eigenschaften der organischen Komponenten zu einem sehr vielseitigen Kompositmaterial.
Die Anforderungen an hochwertige und funktionsgerechte Kno- chenimplantate sind vielfältig und es ist schwierig, alle An¬ forderungen mit einem Material zu erfüllen. Die Funktionalität eines Implantatmaterials ist dabei schwer vorhersehbar, da der natürliche Prozess der Knochenwundheilung und Implantat- Einheilung sehr komplex und zum Teil noch nicht vollständig verstanden ist. Die Wundheilung von harten oder weichen Geweben nach einem operativen Eingriff, wie beispielsweise einer Knochenimplanta¬ tion, umfasst viele zelluläre und extrazelluläre Ereignisse. Der Heilungsprozess an der Kontakt fläche zwischen dem Knochen¬ implantat und dem Knochen umfasst vier Stufen, welche teilwei¬ se ineinander überlappend stattfinden. Darunter fallen Entzün¬ dungsreaktionen, die Bildung eines weichen Kallus, gefolgt von der Bildung eines harten Kallus und schließlich die Remodel- lierungsphase .
Nach einem operativen Eingriff adsorbieren zunächst Proteine und andere Moleküle des Bluts und der Gewebsflüssigkeiten an der Oberfläche des Implantats. Wird vaskularisiertem Gewebe eine Wunde zugefügt, führt dies nicht nur zu Entzündungsreak¬ tionen, sondern auch zur Aktivierung einer Vielzahl weiterer körpereigener Schutzsysteme, wie beispielsweise des extrinsi- schen und intrinsischen Koagulationssystems, des Komplement¬ systems, des fibrinolyt ischen Systems und des Kininsystems . Hiernach folgen zwei sequentiell ablaufende Phasen, die eben¬ falls ineinander übergehend verlaufen können, nämlich die aku¬ te und die chronische Entzündungsreaktion. Das Blut koaguliert zu einem Blutgerinnsel, welches aus Fibrin als Hauptbestand¬ teil aufgebaut ist. Parallel hierzu werden Zytokine und weite- re Wachstumsfaktoren freigesetzt, um weiße Blutzellen zur Wun¬ de zu rekrutieren. Hierbei werden in der akuten Entzündungsan¬ twort Neutrophile und mononukleäre Zellen, wie beispielsweise Monozyten, rekrutiert. Mononukleäre Zellen differenzieren sich zu Makrophagen und lagern sich an der Oberfläche des Implan- tats an. Bei einer normal verlaufenden Wundheilung sind Makro¬ phagen dafür verantwortlich, die Wunde von Bakterien, Zell¬ trümmern und anderen Verunreinigungen via Phagozytose zu rei¬ nigen. Das Implantatmaterial wird dabei vom Körper ebenfalls als Fremdkörper empfunden. Da das Implantat allerdings wesent- lieh größer als die Makrophagen ist, können diese das Material nicht phagozyt ieren . Diese Ereignisse führen schließlich zu der Phase der chronischen Entzündung an der Materi- al/Gewebsgrenze . Dabei fusionieren die Makrophagen und bilden mehrkernige Riesenzellen, um den Fremdkörper zu umschließen. Die Makrophagen sorgen ebenfalls für die Rekrutierung weiterer Zellen, wie beispielsweise Fibroblasten, welche fibröse Gewebe an der Oberfläche des Implantats ablagern.
Nach der Entzündungsphase bildet sich ein weicher Kallus. Die- ser besteht aus Knochenvorläuferzellen und Fibroblasten, wel¬ che sich in einer ungeordneten Matrix aus nicht-kollagenen Proteinen und Kollagen befinden. Diese Matrix wird graduell von besagten Zellen als erste Reaktion gebildet und ist struk¬ turell dem Geflechtknochen ähnlich. Der weiche Kallus wird schließlich graduell von Osteoblasten in geordnete lamellare Knochenstruktur umgebaut. Osteoblasten sekretieren dabei Typ- I-Kollagen, Calciumphosphat und Calciumcarbonat mit einer willkürlichen, zufälligen Orientierung. Die Remodellierungs- phase überlappt mit der Bildung des harten Kallus. Dies ge- schieht durch Resorption der ungeordneten Knochenstrukturen durch Osteoclasten und anschließender Bildung von geordneten Knochenstrukturen durch Osteoblasten.
Damit Stoffe für den Einsatz als Knochenimplantatmaterialien geeignet sind und um eine optimale Heilung der Defektstelle zu ermöglichen, müssen sie einige besondere Eigenschaften aufwei¬ sen. Dazu gehören beispielsweise die Biokompatibilität, die Immunogenität , Osseointegrat ion und Osteogenität . Um eine gute Biokompatibilität zu erreichen, dürfen das Material bzw. seine Abbauprodukte weder toxisch, kanzerogen oder teratogen sein. Es dürfen weder in der Implantatumgebung noch im restlichen Körper Ent zündungs-, Immun- oder andere negative oder ungüns¬ tige Reaktionen ausgelöst werden. Kommt es zu einer Abwehrre¬ aktion des Körpers, wird das Implantat vom Körper durch Binde- gewebe vom restlichen Körper abgekapselt. Durch die Isolierung in der Bindegewebskapsel wird eine Osseointegration des Im¬ plantats in das benachbarte Knochengewebe verhindert, da das Bindegewebe eine Barriere für die Bildung von Gefäßen und dadurch auch für den notwendigen Sauerstoff- und Nähr- stofftransport darstellt. Ein Implantat darf auf keinen Fall eine Immunantwort des Körpers auslösen, es darf also keine Im- munogenität aufweisen. Besonders wichtig für die Eignung als Implantatmaterial ist ebenfalls eine gute Osseointegration, durch die eine stabile Befestigung des Fremdmaterials im Kno- chen erreicht wird, welche später auch den Alltagsbelastungen des Patienten gewachsen sein muss.
Wenn sich einzelne Partikel vom Implantat lösen, dürfen diese ebenfalls keine der vorher genannten Reaktionen auslösen und sollten zudem entweder im Körper abbaubar oder sekretierbar sein, um eine permanente Anhäufung und Anlagerung im Körper oder eine aseptische Endoprothesenlockerung zu vermeiden. Po¬ tentielle Knochenmaterialien sollten daher eine zuverlässige Stärke, hohe Widerstandsfähigkeit, hohe Abriebfestigkeit, Kor- rosionsbeständigkeit , sowie eine dem Knochen ähnliche Steif¬ heit besitzen. Letztgenanntes spielt im Speziellen im Kontext des sogenannten "stress shielding" eine große Rolle. Der Kno¬ chen ist ein dynamisches System, welches je nach mechanischer Beanspruchung ab- oder aufgebaut wird. Wird nun ein Knochenim- plantatmaterial eingesetzt, das eine im Vergleich zur Knochen¬ substanz höhere Steifheit besitzt, übernimmt dieses einen Großteil der mechanischen Belastung, wodurch der umgebende Knochen nach und nach abgebaut wird. Ein weiteres Kriterium ist die sogenannte Biokompatibilität. Ein potentielles Implantatmaterial sollte entweder möglichst bioinert oder bioaktiv sein. Ein bioinertes Material verur¬ sacht keinerlei chemische oder biologische Reaktionen im Kör¬ per. Das Implantat ist deshalb biokompatibel und baut mit der Knochensubstanz bestenfalls eine formschlüssige Verbindung auf (Kontaktosteogenese) . Somit ist nur die Übertragung von Druck¬ belastung zwischen Implantat und Knochen möglich, was jedoch für viele Anwendungen, wie die Substitution von Schädelkno¬ chen, bei Zahnimplantaten und bei Fixierungsstiften bei Kno- chenbrüchen, völlig ausreicht. Implantate hergestellt aus Ti¬ tan, Aluminium, Cobalt, Chrom und Polyetheretherketon (PEEK) zählen zu diesem Materialtyp.
Ein bioaktives Material hingegen fördert ein schnelles Ein- wachsen des Implantats in das umgebende Gewebe und sorgt so für eine schnelle und langanhaltende Fixierung des Implantats im Körper. Dieser Effekt wird als sogenannte "Osseointegrat i- on" bezeichnet. Bioaktive Materialien zeigen deshalb oft oste- okonduktive und osteoindukt ive Eigenschaften und weisen meis- tens eine hohe Hydrophilie auf. Häufig werden solche Materia¬ lien vom Körper resorbiert. Hydroxylapat it , Tricalciumphospat und einige Biogläser zählen zu den bioaktiven Materialien. Bi¬ oaktive Materialien können im Körper im schlechtesten Fall auch eine Immunreaktion auslösen. Diese Fähigkeit eines Bioma- terials, die Zelladhäsion und -migration zu fördern ist ent¬ scheidend für die frühen Phasen der Wundheilung und die späte¬ ren Phasen der Knochenneubildung und hängt stark vom initialen Kontakt zwischen den Zellen und dem Implantatmaterial ab. Deshalb wurden Knochenimplantatmaterialien im Stand der Tech¬ nik durch verschiedene chemische oder physikalische Verfahren mit Hydroxylapat it oder Tricalciumphosphat beschichtet. Diese Calciumphosphate werden meist durch einfache chemische Verfah¬ ren mittels Präzipitation aus wässrigen Lösungen hergestellt. Das Aufbringen auf die Oberfläche des Implantatmaterials er¬ folgt dabei entweder direkt aus der Lösung auf die Oberfläche oder mittels physikalischer Methoden, wie "electrospray depo- sition". Allerdings ist bei der Beschichtung von Materialien mit Apatit beispielsweise sowohl die geringe Adhäsion der Cal- ciumphosphate auf dem Implantat nachteilig, als auch deren Ii- mitierter Zusammenhalt innerhalb der einzelnen Calciumphos- phatlagen. Mit diesen Verfahren sollte eine dem Knochen mög¬ lichst ähnliche Struktur auf der Oberfläche generiert werden, um das Einheilen des Materials in den Knochen zu begünstigen. Hierbei wird allerdings außer Acht gelassen, dass der Knochen selbst ein stark hierarchisch aufgebautes Kompositmaterial ist, welches aus einer Matrix und einer Mineralphase besteht.
Einige Verfahren zur Beschichtung von Implantatmaterialien mit Kollagen wurden auf ihre in-vivo-Funkt ionalität untersucht. Häufig wurden hierbei kollagenbeschichtete Titanimplantate, wie Schrauben oder Nägel, in verschiedenen in-vivo-Systemen analysiert. Dabei wurde beispielsweise von positiven Effekten bezüglich des Einwachsens des Materials in den umgebenden Kno- chen sowie der Knochenneubildung berichtet. Allerdings finden sich im Stand der Technik widersprüchliche Ergebnisse bezüg¬ lich kollagenbeschichteter Titanimplantate. So konnte bei¬ spielsweise keine verbesserte Osseointegrat ion von kollagen¬ beschichteten porösen Titanzylindern, welche in die Diaphyse von Schaftibiae implantiert wurden, festgestellt werden.
Ebenfalls wurde im Stand der Technik von Verfahren zur kova- lenten oder nicht-kovalenten Immobilisierung diverser Proteine der extrazellulären Matrix, wie beispielsweise Fibronectin o- der kurzen Peptiden, auf Oberflächen berichtet. Diese zeigten zum Teil in in-vitro-Test Systemen positive Effekte auf, wie Zelladhäsion und Proliferation.
Häufig wird Kollagen aus Kosten- und Handhabungsgründen durch dessen denaturierte Form Gelatine ersetzt. Die Herstellung der Gelatine geschieht üblicherweise durch physikalischen und che¬ mischen Abbau oder thermische Denaturierung von nativem Kol¬ lagen. Im Gegensatz zu nativem Kollagen ist Gelatine bei einem physiologischen pH-Wert wasserlöslich und schmilzt bei einer Sol-Gel-Übergangstemperatur von 25 bis 30 °C. Nach Abkühlen entstehen durchsichtige Gele. Im Stand der Technik wird eben¬ falls die nicht-kovalente Aufbringung von Gelatine auf Ober¬ flächen von arteriellen Implantatmaterialien berichtet. Ebenso wurde Gelatine kovalent an PEEK angekoppelt und mit Calciump- hosphat mineralisiert , um so eine knochenähnliche Schicht zu bilden, die zu sehr guter Proliferation von Osteoblasten führ¬ te. Das Problem der Beschichtungen auf Basis von Gelatine ist, dass es sich bei Gelatine um ein tierisches Produkt handelt, welches eine Klasse III Zertifizierung nötig macht. Da Gelati- ne industriell aus Rinderknochen oder Schweinehaut gewonnen wird kann es aber religiöse Vorbehalte (Schwein) oder medizi¬ nische Vorbehalte (Rind, BSE) geben, die den Einsatz eines Ge¬ latinebasierten Coatings beschränken können. Auf dieser Grundlage liegt der vorliegenden Erfindung die Auf¬ gabe zugrunde, ein Material für Knochenimplantate bereitzu¬ stellen, welches medizinisch unbedenklich, hochverträglich und vielseitig einsetzbar ist und zudem knochenähnliche Strukturen aufweist. Ferner soll ein entsprechendes Herstellungsverfahren bereitgestellt werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der unab¬ hängigen Ansprüche gelöst. Günstige Ausgestaltungen und Vor¬ teile der Erfindung ergeben sich aus den weiteren Ansprüchen und der Beschreibung.
Insbesondere betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfin¬ dung ein Material für ein Knochenimplantat, umfassend:
(a) eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst,
(b) eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Matrix und
(c) in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat .
Es wird vorgeschlagen, dass die Matrix zumindest ein Polysac- charid aufweist. Die Begriffe "Material für Knochenimplantate" und "Knochenim¬ plantatmaterial" werden hierin synonym gebraucht. Das erfin¬ dungsgemäße Material für Knochenimplantate weist bioaktive Ei- genschaften auf. Der hierin verwendete Begriff "bioaktiv" be¬ zeichnet die Eigenschaft des erfindungsgemäßen Materials für Knochenimplantate, ein schnelles Einwachsen in das umgebende Gewebe zu ermöglichen und so für eine schnelle und langanhal¬ tende Fixierung des Implantats im Körper zu sorgen. Diese Ei- genschaft ergibt sich aus den in den vorstehenden Unterpunkten (a) bis (c) definierten technischen Merkmalen in Kombination mit dem kennzeichnenden Teil.
Wenn in der Fachliteratur Knochenimplantate diskutiert werden, wird immer versucht, die Oberfläche des Implantates möglichst knochenähnlich zu gestalten. Dies kann im einfachsten Fall durch Plasmabeschichtung mit Hydroxyapat it geschehen. Es ist beispielsweise bekannt ein Gelatine/kollagenbasiertes kovalent angebundenes Coating einzusetzen, welches mit Calciumphosphat mineralisiert wird. Das ist die denkbar knochenähnlichste Be- schichtung für Implantate. Damit kann man die Verbindung her¬ stellen, die in der Biomineralisation (Knochen und Dentin in Zähnen) Kollagen bzw. Gelatine als abgebautes Kollagen eine Rolle für die Mineralisation spielt.
Polysaccharide hingegen werden im Zusammenhang mit der Biomi¬ neralisation von Calciumphosphat nicht diskutiert - wenn über¬ haupt nur als Glykoproteine . Polysaccharide spielen aber eine Rolle bei der Biomineralisation von Calciumcarbonat (Eierscha- len - Keratansulfat , Coccolith Exoskelette etc.), aber selbst dort werden sie sehr wenig untersucht im Vergleich zu Protei¬ nen, da Polysaccharide notorisch schwierig zu charakterisieren sind . Der erfindungsgemäße Ansatz kann daher als Abkehr von bekann¬ ten Ansätzen angesehen werden. Es ist daher keinesfalls eine naheliegende Idee, beim Aufbau einer knochenähnlichen bioin¬ spirierten Beschichtung für ein Implantat an Polysaccharide zu denken. Das naheliegende wäre, wie gesagt, Kollagen / Gelatine oder zumindest andere Proteine (hier insbesondere saure Prote¬ ine) zu verwenden. Es hat sich jedoch überraschenderweise ge¬ zeigt, dass Polysaccharide bei dieser Anwendung eine zielfüh¬ rende und vorteilhafte Alternative zu bekannten Substanzen, wie beispielsweise Kollagenen, darstellen.
In diesem Zusammenhang soll unter einer Trägerstruktur mindes¬ tens eine Materialschicht verstanden werden, welche aus dem biokompatiblen Material aufgebaut ist und welche mit der Mat- rix verbindbar ist bzw. kovalent verbunden werden kann. Die
Trägerstruktur kann beispielsweise eine äußerste Schicht eines komplett aus dem biokompatiblen Material gefertigten, bei¬ spielsweise formgebende, Grundstruktur des Implantats sein. Oder sie kann auf eine Grundstruktur, gefertigt aus einem an- deren Material, wie das biokompatible Material, aufgebracht werden. Ferner soll in diesem Zusammenhang unter biokompati¬ bel, die Eigenschaft eines Materials oder Stoffs verstanden werden, in-vivo einsetzbar zu sein und hierbei wenige bis kei¬ ne negativen Einflüsse auf den Patienten oder den Heilungspro- zess zu haben oder ohne Folgeschäden einsetzbar zu sein.
Unter einer Matrix soll hier eine Struktur verstanden werden, die als Hauptbestandteil ein Polysaccharid aufweist, in das Calciumphosphat eingelagert ist. Hierbei kann das Polysaccha- rid jedes dem Fachmann für einsetzbar erachtete Polysaccharid sein. Ist das Polysaccharid ein tierisches Polysaccharid kann ein Stoff eingesetzt werden, dessen Eigenschaften hinlänglich bekannt und erprobt sind. Vorteilhafterweise ist das Polysac¬ charid ein pflanzliches Polysaccharid, wodurch ein veganer Stoff zum Einsatz kommen kann, der medizinisch unbedenklich ist. Generell ist es auch möglich „künstliche" oder nicht in der Natur vorkommende Polysaccharide einzusetzen. Oder es ist möglich Mischungen an Polysacchariden zu verwenden. Diese kön¬ nen gezielt im Labor hergestellt werden. Solche Polysaccharide können durch ihre frei gestaltete Beschichtungschemie sehr flexibel ausgewählt und eingesetzt werden.
Unter Polysaccharide sollen hier auch - synthetische - Ersatz¬ stoffe für Polysaccharide verstanden werden, wie beispielswei- se Polymere aus Polyacrylsäure oder Vinyl- und Acrylmonomeren (mögliche Spezies siehe unten) . Hierbei sollen alle auf das Polysaccharid genannten Merkmale - chemisch, stofflich oder ein Verfahren, eine Verwendung oder ein Knochenimplantat be¬ treffend -in jeglicher Kombination auch auf den/die - syntheti- sehen - Ersatzstoff (e) zutreffen.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist somit vorgesehen, dass die Matrix anstelle des Polysaccharids zumin¬ dest ein Polymere aus Polyacrylsäure und/oder ein Polymer aus Vinyl- und Acrylmonomeren aufweist.
Das Polysaccharid könnte beispielsweise Alginsäure, Alginat, Hyaluronsäure, Hyaluronat, Pektin, Carrageenan, Agarose, Anky¬ lose und Chitosan sein. Möglich wäre auch jedes andere Glyko- soaminoglycan, wie Heparin/Heparansulfat , Chondroit insul- fat /Dermatansulfat oder Keratansulfat . Denkbar sind auch Hemi- cellulosen, wie Xylane oder Mannane nach einer Carboxyfunkt io- nalisierung, oder auch Xanthan, Gellan, Fucogalactan oder Welan Gum.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Polysaccharid aus¬ gewählt aus einer Gruppe bestehend aus Alginsäure, Alginat, Hyaluronsäure, Hyaluronat, Pektin, Carrageenan, Agarose, Anky¬ lose und Chitosan. Hierdurch können viele verschiedene Stoffe zum Einsatz kommen, die individuell, bedingt durch ihre spezi¬ ellen Eigenschaften, ausgewählt werden können.
Hyaluronsaure (Hya) ist ein lineares Polysaccharid, das aus Disaccharid-Wiederholeinheiten aufgebaut ist. Diese setzen sich aus D-Glucuronsäure und N-Acetyl-Glucosamin zusammen, die über ß-1,4 und ß-1,3 glycosidische Bindungen verknüpft sind (siehe unten) . In physiologischer Umgebung liegen die Carboxylgruppen der Hy¬ aluronsaure zum großen Teil als Natriumsalz vor, sie ist somit negativ geladen und immobilisiert eine Vielzahl von Wassermo¬ lekülen, bereits bei sehr geringen Konzentrationen ist eine wässrige Lösung deshalb sehr viskos. Hya wird in der Medizin- und Gesundheitsindustrie vielseitig eingesetzt. Da Hyaluron¬ saure als weitreichend biokompatibel und sicher gilt, ergeben sich sehr viele Einsatzgebiete. Dies macht sie auch sehr inte¬ ressant als Ausgangsmaterial für die Oberflächenbeschichtung von Knochenimplantaten.
In der Vergangenheit wurde Hyaluronsaure hauptsächlich aus Hühnerkämmen, die bei der Nahrungsmittelproduktion als Abfall anfallen, extrahiert. Inzwischen erfolgt die Produktion jedoch biotechnologisch durch Kultivierung gentechnisch veränderter Streptokokken-Bakterien, wodurch das Risiko für die Kontamina¬ tion mit tierischen Pathogenen entfällt.
Bei der Alginsäure handelt es sich um ein Copolymer aus den beiden Uronsäuren D-Mannuronsäure (M) und L-Guluronsäure (G) . Alginsäure kann aus Pflanzen, bzw. Algen gewonnen werden, wes¬ halb ihre Zusammensetzung und die Sequenzverteilung der Zucke¬ reinheiten stark vom Herkunftsort der Pflanze/Alge und deren Spezies abhängt. Die G und M sind jeweils über ß-1,4 glycosi¬ dische Bindungen verknüpft. Die guten Geliereigenschaften ver- dankt Alginsäure den G-Blöcken, die die Calciumionen komple- xieren. Da die Alginsäure aus natürlichen Quellen stammt, muss sichergestellt werden, dass potentielle Verunreinigungen, wie Schwermetalle, Endotoxine, Proteine, etc. entfernt wurden, sonst können durchaus Immunreaktionen auftreten. Sofern sie ausreichend aufgereinigt wurde, verursacht Alginsäure, wie auch Hyaluronsäure , keine Immun- oder Entzündungsreaktion im Körper, hat also eine gute Biokompatibilität.
Im Gegensatz zu Hyaluronsäure ist Alginsäure im menschlichen Körper nicht abbaubar, da keine Alginase vorhanden ist. Wegen der guten Biokompatibilität wird Alginsäure in zahlreichen bi¬ omedizinischen Anwendungen eingesetzt, beispielsweise in Wund¬ auflagen und kommt, wenn RGD-Peptid-modifiziert , auch in Be¬ tracht als Knochenimplantatmaterial verwendet zu werden. Wird Alginsäure in Kombination mit Hydroxylapatit verwendet, kann die Bildung von Knochengewebe zusätzlich angeregt werden.
Ferner können langkettige Polysaccharide, aber auch verzweigte Polysaccharide, wie beispielsweise Stärke, eingesetzt werden. Somit hat die Matrix eine eher drei-dimensionale Struktur, die der Zielknochenstruktur ähnlich ist, wodurch die Mineralisie¬ rung erleichtert werden kann.
Eine Möglichkeit, der Beschichtung / Oberflächenveredelung zu- sätzlich zur Knochen-identischen Mineralisierung ( sfähigkeit ) keimabweisende Eigenschaften hinzuzufügen, ist der Einsatz von Chitosan, einem linearen Biopolymer auf Polysaccharidbasis: Mit Chitosan kann auch die hämostatische Wirksamkeit und die antimikrobiellen Eigenschaften des Materials genutzt werden. Chitosan werden folgende Materialeigenschaften ebenfalls zuge¬ sprochen nicht-allergen, nicht-toxisch, wundheilend, antibak¬ teriell, blutstillend, bakteriostatisch, fungizide Wirkung, (biologisch abbaubar) und anti-mikrobiell . Insofern ist die Erfindung auch gerichtet auf Chitosan als al¬ leiniger Stoff ohne eine Kombination mit oben genannten Ver¬ bindungen oder Stoffen. Insbesondere ist die Erfindung auch gerichtet auf eine erfindungsgemäße Verwendung des Chitosans als Material - medizinisch und/oder nicht-implantierbar und/oder mit und ohne Körperkontakt. Insbesondere ist die Er¬ findung ferner gerichtet auf eine erfindungsgemäße Verwendung des Chitosans als Bestandteil eines Körperpflegeprodukts, ins¬ besondere einer Zahnbürste (Zahnbürstenkopf) , eines Kamms, ei- ner Haarbürste, einer Nagelbürste, einer Nagelfeile etc. Ins¬ besondere ist die Erfindung zudem gerichtet auf eine erfin¬ dungsgemäße Verwendung des Chitosans als Bestandteil eines Wellnessprodukts, insbesondere einer Schlafbrille, eines Schönheitspflasters etc. Insbesondere ist die Erfindung ferner gerichtet auf eine erfindungsgemäße Verwendung des Chitosans als Bestandteil eines Medizinprodukts, insbesondere zur Wund¬ versorgung (Binde, Pflaster, Tupfer, Kühlkompresse etc.) .
Bindet man über die in den meisten Polysacchariden vorhandene Hydroxylgruppe in 6-er Stellung das Polysaccharid über eine Esterbindung an das Implantat an mit Linkern, wie Bernstein¬ säureanhydrid, oder direkt an polyacrylsäurebeschichtetes PEEK über Esterbindung (gegebenenfalls mit Aktivierungschemie über l-Ethyl-3- ( 3-dimethylaminopropyl ) carbodiimid (EDC) oder ähnli- che) , dann steht das gesamte Repertoire an Polysacchariden für die kovalente Bindung an das Implantat zur Verfügung. Damit ergibt sich die Möglichkeit auch Mischungen von Polysacchari¬ den oder von Polysacchariden mit synthetischen Polymeren zu verwenden. Damit wird eine völlig freie Komposition der Be- Schichtung verfügbar. Diese kann von negativ geladenen Poly¬ sacchariden, wie Hyaluronsäure , über neutrale, wie Amylose, bis zu positiv geladenen, wie Chitosan, reichen. Damit kann das komplette Spektrum an Ladungsdichten von neutral bis zu stark negativ oder positiv abgedeckt werden. Dies hat natür- lieh auch Einfluss auf die Struktur der kovalent an das Im- plantat angebundenen Beschichtung sowie die Mineralisierung des Calciumphosphats . Die Mischung der angebundenen Polymere kann dabei stufenlos variiert werden und somit auch die Eigen¬ schaftsprofile .
Weiterhin kann bei derartigen Mischungen auch die Struktur des Coatings gezielt eingestellt werden, da beispielsweise lineare mit verzweigten Polysacchariden kombiniert werden können. Bei¬ spielsweise kann das verzweigte Amylopektin aus pflanzlicher Stärke mit der linearen Amylose kombiniert werden. Chemisch sind beide Moleküle identisch, aber nicht strukturell.
Ein vielversprechendes Paar für chemisch unterschiedliche Po¬ lysaccharide wäre beispielsweise die neutrale Amylose mit dem negativ geladenen Alginat zu koppeln, welches zusätzlich noch über Zugabe von Ca2+ Ionen quervernetzt werden kann. Über diese Quervernetzung können dann nachträglich auch noch weitere Schichten Alginat angebunden werden über einfache Imprägnie¬ rung der Schicht mit Ca2+, Waschen und Aufbringen der nächsten AlginatSchicht (Layer by Layer Assembly, LBL) . Eine extreme Kombination wäre die negative Alginsäure mit dem positiven Chitosan. Diese ionisch stabilisierten „Layer by Layer As- semblies" können durch geeignete Vernetzungschemie kovalent verbunden werden (mittels EDC o.a.)· Dazwischen sind stufenlos alle Kombinationen von Polysacchariden über eine gemeinsame chemische Anbindung über Esterbindungen verfügbar.
Zudem kann es vorteilhaft sein, wenn das Polysaccharid ein chemisch modifiziertes Polysaccharid ist. Hierbei soll che¬ misch modifiziert bedeuten, dass am Polysaccharid künstliche, laborchemische Veränderung eines Zuckers des Polysaccharids beispielsweise an einer freien Gruppe, z.B. Hydroxyl-, Aldehyd oder Säuregruppe, vorgenommen wurden. Hierüber kann das Ein¬ satzspektrum erweitert werden. Beispielsweise können inaktive Gruppen gezielt in aktive Gruppen „umgewandelt werden" oder es kann eine unerwünschte Eigenschaft eliminiert werden. Hierbei kann beispielsweise eine Behandlung mit Hexamethylendiamin (HMDA) oder Adipinsäuredihydrazid (ADH) erfolgen oder eine Deacetylierung. HMDA und ADH sind beides Diamid Linker. Da ADH eine geringere Basizität als HMDA zeigt, ist die Kupplung be¬ reits im sauren pH-Bereich von 4,8 möglich. Beide Linker ad¬ ressieren also eine Kupplungschemie in verschiedenen pH Berei¬ chen. Je nach der Anforderung für die Anbindung des Polysac¬ charids kann also ein verschiedener Linker nötig sein. Bei ei- ner Deacetylierung kann das Polysaccharid hydrolyseresistent gemacht werden.
Besteht das biokompatible Material lediglich aus einer oder wenigen Schichten kann das erfindungsgemäße Material für Kno- chenimplantate auf feste Materialien oder Körper (Grundstruk¬ tur) aufgebracht werden, welche als Knochenimplantat Verwen¬ dung finden. Diese Körper können jede beliebige gewünschte o- der erforderliche dreidimensionale Gestalt aufweisen. Bevor¬ zugt umfasst die gesamte Oberfläche des erfindungsgemäßen Ma- terials für Knochenimplantate das im vorstehenden Unterpunkt
(a) definierte Material oder besteht aus diesem. Geeignete Ma¬ terialien, auf welche das erfindungsgemäße Material aufge¬ bracht werden kann, können hierbei aus im Stand der Technik bekannten Keramikmaterialien, Metallen, Polymeren, Kompositma- terialien oder Kombinationen davon ausgewählt sein. Dies wären beispielsweise als Metalle: Titan / Stainless Steel, als Kera¬ miken: Zirkon (-dioxid) , als Polymer: Polyetherketon (PEK) und die gesamte PEK-Familie, insbesondere jedoch: Polyetherether- keton (PEEK) , Polyetherketonketon (PEKK) , Polyetherketon- etherketonketon (PEKEKK) ; Carbon-Fiber-Reinforced PEEK (CFR-
PEEK) , PEEK-COMPOSITE, Glasfaserverstärkte Polymere, Polyethy¬ len (PE) , Ultra-High-Molecular-Weight Polyethylen (UHMWPE) , Polyorthoester , Polymethylmethacrylat (PMMA) , Polyethylen- terephthalat (PET) , Polyamide (PA) , Polylactide (PLA) oder Poly- phenylensulfon (PPSU) . In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Material PEEK. Dieses Material ist mechanisch nativem Knochenmaterial sehr ähnlich und so als Knochenimplantatmate¬ rial gut geeignet. Polyetheretherketon (PEEK) mit folgendem Strukturausschnitt
ist ein sehr weit verbreiteter thermoplastischer High- Performance Kunststoff. Der semikristalline Kunststoff ist we¬ gen seiner hohen Lösungsmittelbeständigkeit, dem hohen
Schmelzpunkt von 343 °C und dem hohen Glasübergangspunkt von ca. 143 °C sehr beliebt für Anwendungen bei höheren Temperatu¬ ren .
Seit 1998 ist PEEK in implantierbarer Qualität auf dem Markt verfügbar. Seitdem hat sich der Marktanteil von PEEK als Im¬ plantatsmaterial stark erhöht. PEEK wird in der Medizintechnik vielseitig als Knochenersatzmaterial und Implantat eingesetzt, beispielsweise als Fusion-Cage zur Wirbelsäulenversteifung bei Bandscheibenverletzungen. Da PEEK für Röntgenstrahlung durch- lässig ist und auch nicht mit Magnetfeldern wechselwirkt, lässt sich der Patient nach einer Operation problemlos mit bildgebenden Verfahren beobachten, um den Heilungsprozess im betroffenen Areal zu verfolgen. Die guten mechanischen Eigen¬ schaften von PEEK, die denen der Kortikalis (Cortical Bone) sehr ähnlich sind, qualifizieren PEEK als ein gut geeignetes
Material für den Einsatz als Knochenersatzmaterial und Implan¬ tate .
PEEK zählt zu den Materialien die sich fast komplett bioinert verhalten, also keine spezifische Interaktion mit dem Körper eingehen. PEEK wird vom Körper weder abgestoßen noch gut in den Knochen integriert, es kommt deshalb im Idealfall zu einem guten Kontakt des Knochens mit dem Implantat. Teilweise kommt es zur Gewebeeinkapselung, wodurch die mechanische Stabilität verringert wird und es zum Verlust des Implantats kommen kann. Damit PEEK besser in den Knochen integriert wird, sind einige Methoden entwickelt worden, um eine Bioaktivität des Materials zu erreichen, wie beispielsweise die Beschichtung mit Calci- umphosphat und auch die Zugabe von Hydroxylapatit-Partikeln in das Polymer. Andere Methoden der Oberflächenmodifikation von PEEK sind möglich und sind beispielsweise wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.
Um die Oberflächeneigenschaften eines Knochenimplantates da¬ hingehend zu verbessern, dass es vom Körper besser akzeptiert wird, ist es möglich, sie nach der Herstellung des Implantats zu modifizieren. Oberflächenmodifikationen können physikali¬ scher, wie beispielsweise die Beschichtung mit Hydroxylapatit (HA) und Titan, oder chemischer Natur sein. Um ein KunstStoffSubstrat , wie PEEK, chemisch zu modifizieren gibt es prinzipiell zwei Möglichkeiten. Die eine Methode ist die direkte Reaktion mit kleinen Molekülen oder eine Plasmabe¬ handlung um die Oberflächeneigenschaften zu verändern und um beispielsweise Linkermoleküle einzuführen, an denen man weite- re Reaktionen durchführen kann. Die Konzentration der Linker¬ moleküle pro Fläche ist hierbei natürlich sehr klein, da die Oberfläche einer makroskopischen PEEK-Folie glatt ist und nur das Material direkt an der Oberfläche zugänglich ist. Bei Po¬ lymersubstraten, die in der Festphasensynthese eingesetzt wer- den, verhält sich dies anders. Diese verfügen über ein gutes Quellverhalten in geeigneten Lösungsmitteln, wodurch im kom¬ pletten Volumen des Polymerkörpers Linker eingeführt werden können. Dieses Verhalten ist natürlich bei Kunstoffen, wie PEEK, für Knochenimplantate nicht gewünscht, da sich die Modi- fikation nur auf die Oberfläche beschränken soll, um die Volu- meneigenschaften, wie Härte oder mechanische Stabilität, nicht zu beeinträchtigen.
Um dennoch viele funktionelle Gruppen an der Oberfläche einzu- führen, kann das Polymersubstrat mit einem funktionellen Poly¬ mer beschichtet werden. Dabei wird in Abhängigkeit des Moleku¬ largewichts des eingeführten Polymers, im Vergleich zur Modi¬ fikation mit kleinen Molekülen, ein Vielfaches an funktionel¬ len Gruppen eingeführt.
Zwei Methoden werden hierbei unterschieden. Man spricht von der Graft ing-from Methode wenn von der Oberfläche des Sub¬ strats aus eine Polymerkette initiiert wird und zunehmend wächst. Bei dieser Variante muss das Substrat dazu in der Lage sein z.B. als Initiatorradikal einer radikalischen Polymerisa¬ tion zu fungieren, bzw. muss man es über ein Aktivatorreagenz dazu bringen können. Bei der Graft ing-from Strategie erreicht man eine höhere Funktionalisierungsdichte, da die Polymerket¬ ten sukzessive wachsen und nicht als fertiges Polymer aufge- bracht werden. Der umgekehrte Ansatz, das Grafting-to, geht von einem fertigen Polymer aus, das mit einem geeigneten Me¬ chanismus an die Oberfläche aufgepfropft wird. Ein Nachteil dieser Methode ist, dass beim Aufpfropfen fertiger Polymere, benachbarte potentielle Bindungsstellen durch die Makro- moleküle stark blockiert werden, dies geschieht beim Grafting- from Ansatz nicht. Eine Kontrolle über die Polymer-Länge und Molekulargewichtsverteilung der aufgebrachten Polymere ist wiederrum nur beim grafting-to Ansatz zu erreichen.
Die direkte Modifikation mit kleinen Molekülen bzw. die Reduk¬ tion der Oberflächen-Carbonylgruppen des PEEK ist durch Reduk¬ tion mittels Natriumborhydrid in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 120 °C und Ankuppeln von primären Aminen möglich (siehe unten und C. Henneuse; B. Göret; J. Marchand-Brynaert , Polymer 1998, 39, 835-844 und C. Henneuse-Boxus ; E. Duliere; J. Marchand- Brynaert, European Polymer Journal 2001, 37, 9-18).
Es ist bekannt an die reduzierte PEEK-Oberflache verschiedene Moleküle, unter anderem Gelatine, zu kuppeln, wodurch die
Hydrophilie erhöht und eine höhere Akzeptanz knochenbildender Zellen erreicht werden konnte. Der Kontaktwinkel der
beschichteten Substrate nahm ebenfalls signifikant ab, wodurch die Hydrophilie der Oberfläche und somit die Akzeptanz für knochenbildende Zellen gesteigert werden konnte (siehe J.
Knaus, Master Thesis 2013 Universität Konstanz und H. Cölfen; L. F. Tian; J. Knaus, 2016) .
Als Grafting-from Ansatz kann beispielsweise eine oberflächen- induzierte Polymerisation in Betracht kommen. Durch Oberflä¬ chenmodifikation mittels kleiner Moleküle lassen sich bei ei¬ ner Vielzahl organischer Polymere Linker einführen, wodurch weitere Modifikationen an der Oberfläche durchgeführt werden können. Es ist beispielsweise gelungen auf der Oberfläche von PEEK mittels nasschemischer Modifikation OH Gruppen einzufüh¬ ren an die mittels Acrylsäurederivaten wiederum ATRP Initiato¬ ren angekuppelt wurden (siehe B. Yameen; M. Alvarez; 0. Azza- roni; U. Jonas; W. Knoll, Langmuir 2009, 25, 6214-6220) . Ferner kommt eine UV-indizierte Polymerisation (UV: Ultravio¬ lett) in Betracht. Anstatt einen Radikalstarter oder andere Initiatoren auf die Oberfläche aufzubringen ist es je nach Substrat möglich, Radikale direkt auf der Oberfläche zu erzeu¬ gen. Dies lässt sich z.B. durch Hilfsreagenzien, wie Benzo- phenon (BP) , Benzoylbenzoesäure oder andere Photoinitiatoren, erreichen, die bei UV Anregung Wasserstoffatome von geeigneten Polymeren abstrahieren und dadurch Radikale auf der Polymer¬ oberfläche erzeugen, die einen Kettenstart initiieren können. Polymere, wie PET, bilden nach Argonplasma-Behandlung an Luft Hydroxyl- und Peroxidgruppen an der Oberfläche aus. Diese kön- nen unter Anregung mit UV Licht ebenfalls als Radikalstarter dienen. Mit Polyethylen wurde dies unter ähnlichen Bedingungen ebenfalls durchgeführt. Für den Photoinitiator BP ist bekannt, dass er unter UV- Einwirkung eine Photopinakolreakt ion eingeht. Dies resultiert in der Bildung eines Semibenzopinakolradikals , welches als Initiator in Polymerisationen dienen kann. Durch photoindu¬ zierte Spaltung können aus dem angeregten Molekül ebenfalls Radikale entstehen, die Polymerisationen starten. Das Polymer Polyetheretherketon (PEEK) besitzt im Polymerrückgrat BP Ein¬ heiten, die sich ähnlich verhalten (siehe auch M. Kyomoto; K. Ishihara, Acs Applied Materials & Interfaces 2009, 1, 537- 542) . So wurde 2009 von Kyomoto nachgewiesen, dass sich die Oberfläche von unbehandeltem PEEK unter UV Einwirkung dazu eignet, radikalische Polymerisationen verschiedener Acrylsäu- rederivate zu initiieren. Hierbei handelt es sich, um einen gemischten Graft ing-from und Grafting-to Mechanismus, da so¬ wohl wachsende Polymerketten an der Oberfläche gestartet wer- den, als auch wachsende Polymerketten in Lösung an der Ober¬ fläche terminieren. Auf seiner Arbeit aufbauend, führten wei¬ tere Gruppen selbst initiierende Polymerisationen unter UV An¬ regung durch, unter anderem mit Acrylsäure. Der direkte Nach¬ weis der Ketylradikale gelang Kyomoto 2013 durch in-situ ESR Spektroskopie.
Die kovalent gebundene Matrix weist typischerweise eine
Schichtdicke von 100 bis 150 Nanometer (nm) auf, kann aber auch dicker sein oder dünner sein. Insbesondere kann die kova- lent gebundene Matrix eine Schichtdicke von 1 nm bis 10 Mikro¬ meter ([im) , bevorzugt von 10 nm bis 1 [im, mehr bevorzugt von 20 nm bis 500 nm, mehr bevorzugt von 30 nm bis 300 nm, mehr be¬ vorzugt von 50 nm bis 200 nm und am meisten bevorzugt von 100 bis 150 nm aufweisen. Weiter bedeckt die kovalent gebundene Matrix bevorzugt die gesamte Oberfläche des erfindungsgemäßen Materials für Knochenimplantate.
Eine interessante Variante der Grafting-to Methode ist das Einfangen von wachsenden radikalischen Polymerketten durch im¬ mobilisierte Radikalfänger auf der Oberfläche des Substrats (siehe auch P. Yang; J. Y. Xie; J. Yuan; L. Zhang; W. N. Liu; W. T. Yang, Journal of Polymer Science Part a-Polymer Che- mistry 2007, 45, 745-755) . Von Yang et al . wurde gezeigt, dass es möglich ist den Polymerisat ionsinhibitor Hydrochinon zu nutzen um Polymere nach dem Grafting-to Ansatz auf ein Sub¬ strat aufzubringen.
Dabei wurde ein Hydrochinon-Derivat an die Oberfläche gekup- pelt und eine normale radikalische Polymerisation mit einem thermischen Radikalinitiator durchgeführt. Das immobilisierte Hydrochinon quenched die wachsende Polymerkette durch homoly- tische Spaltung der OH Bindung, es kommt zum Kettenabbruch. Das langlebige Aryloxylradikal ist nicht in der Lage eine ra- dikalische Polymerisation mit den vorhandenen Monomeren zu starten, kann aber mit einem wachsenden Polymerradikal rekom¬ binieren und somit das Polymer an der Oberfläche einfangen.
Schließlich umfasst das erfindungsgemäße Material für Knochen- implantate in die genannte Matrix eingelagertes Calciumphos- phat, bevorzugt Calciumorthophosphat in allen mineralischen Formen, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, beste¬ hend aus amorphem Calciumorthophosphat (ACP) , Dicalciumpho- phat-Dihydrat (DCPD; Brushit) , Octacalciumphosphat und Hydro- xylapatit, auch mit partieller Fluorid-, Chlorid- oder Carbo- nat Substitut ion, wobei ACP, Hydroxylapat it und Octacalciumpho¬ sphat besonders bevorzugt sind. Verfahren zum Einlagern der genannten Calciumphosphate in eine entsprechende Matrix sind nachfolgend beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polysaccharid über einen Linker an das biokompatible Material gebunden, wo¬ bei der Linker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: einem Diamin-Linker oder Diamin Linker in Kombination mit ei- nem Bernsteinsäurelinker, einem (UV-gegrafteten) Polyacrylsäu- re-Linker oder einem photokoppelbaren Linker, insbesondere ei¬ nem Azidoanilin-Linker . Entsprechende Linker sind im Stand der Technik bekannt . Hierbei soll unter photokoppelbar eine photoreaktive oder lichtinduzierte/lichtinduzierbare Kupplung verstanden werden. Eine solche lichtinduzierte Kupplung hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, da sie lediglich auf Licht und Wasser beruht, also eine völlig „grüne Chemie" darstellt. Zudem kann die Reaktion schnell, effizient und in einem Reaktionsansatz erfolgen. Zudem entstehen, außer dem gasförmigen Stickstoff, der einfach entweichen kann, keine weiteren Nebenprodukte. Da¬ mit entfällt eine aufwendige Aufreinigung . Ferner ist ein sol¬ cher Ansatz gut skalierbar auf größere Substrate. Ein Vorgehen wäre beispielsweise ein Bepinseln des Implantats mit anschlie¬ ßender Trocknung und im Anschluss eine Bestrahlung jede Ecke des Implantats. Als photokoppelbare Linker kämen beispielswei¬ se Azidoaniline, Aryl-Azide oder Diazirine in Betracht. Solche lichtinduzierbaren Linker können in Verbindung mit vielfältigen Substanzen bzw. Monomeren, wie Vinyl- oder Acryl- monomere, oder Polymeren (Polysaccharide) angewendet werden bzw. eine Vielzahl von Substanzen können radikalisch mit UV Licht polymerisiert werden. Zu nennen wäre hier beispielswei- se : Methacrylsäure, Phosphoric acid 2-hydroxyethyl methacryla- te ester (als Mischung aus Monoester und Diester, davon Mono- ester als normales Monomer oder Diester als Vernetzer) , 2- Hydroxyethyl methacrylate (als normales Monomer oder Co- Monomer) , Ethylene glycol dimethacrylate (als Quervernet zer, Mischung mit anderen Monomeren), Bis [ 2- (methacryloyloxy ) ethyl ] phosphate (als Quervernet zer, Mischung mit anderen Monomeren) und 2- (Dimethylamino) ethyl methacrylate .
Eine Kupplung beispielsweise mit Azidoanilinen kann auf alle Polysacharide angewendet werden, die Carboxylgruppen aufweisen und die direkt analog zur Hyaluronsäure funkt ionalisierbar sind, wie beispielsweise Alginsäure, Pektin, oder Carboxyme- thylcellulose . Dadurch steht vorteilhaft ein weites Spektrum an einsetzbaren Substanzen zur Verfügung. Die bei den meisten Polysacchariden in 6-Position vorhandene Hydroxylgruppe kann dabei analog zur Bildung von Carboxymethylcellulose zu einer Carboxyfunkt ion funkt ionalisiert werden (z.B. Chitosan) und steht damit für die Kupplung mit Azidoanilinen zur Verfügung. Verfahren für die kovalente Bindung von Polysacchariden an beispielsweise PEEK sind nachfolgend beschrieben.
In anderen Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße Ma¬ terial für Knochenimplantate oxidische Keramikmaterialien, Ti- tan, Polymermaterialien oder Kompositmaterialien, oder besteht aus diesen, wobei das Polysaccharid der kovalent gebundenen Matrix bei Titan oder oxidischen Keramikmaterialien über einen Silanlinker gebunden ist. Geeignete Silanlinker und entspre¬ chende Verfahren zur Bindung von Polysacchariden sind im Stand der Technik bekannt .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Material für Knochenimplantate, um¬ fassend :
(a) das biokompatibles Material PEEK ist,
(b) das Polysaccharid Alginsäure ist und
(c) das in diese Matrix eingelagerte Calciumphosphat Hydro- xylapatit, insbesondere kristallines Hydroxylapat it ist. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Materi¬ als für Knochenimplantate, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Trägerstruktur mit einer Oberfläche, umfassend ein biokompatibles Material,
(b) kovalentes Ankoppeln einer Matrix, umfassend zumindest ein Polysaccharid, an diese Oberfläche, und
(c) Mineralisieren der Matrix mit Calciumphosphat . Für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungs¬ formen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für ein Knochenimplantat aufgeführt wurden, in analoger Weise. Verfahren zur kovalenten Ankupplung einer Polysaccharid umfas¬ senden Matrix an eine Oberfläche gemäß Schritt (b) des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens unterliegen keinen besonderen Be¬ schränkungen und sind im Stand der Technik bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere wenn die Oberfläche PEEK umfasst oder aus diesem besteht, umfasst
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Schritte in beliebiger Reihenfolge:
(bl) kovalentes Ankoppeln eines Linkermoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Diamin-Linker oder einem Dia- min Linker und einem Bernsteinsäure-Linker oder UV-gegrafteter Polyacrylsäure (PAA) , oder einem photokoppelbaren Linker, ins¬ besondere einem Azidoanilin-Linker an diese aktivierte Ober¬ fläche, und
(b2) kovalentes Ankoppeln des Polysaccharids mit Carbonsäure¬ gruppen an das Diamin Linkermolekül oder des Hexamethylendia- min modifizierten Polysaccharids an den Bernsteinsäure Linker oder des unmodifizierten Polysaccharids über Esterbindungen an den Polyacrysäure-Linker oder an den photokoppelbaren Linker, insbesondere den Azidoanilin-Linker. Hierbei soll unter der Wendung „in einer beliebigen Reihenfol¬ ge" verstanden werden, dass entweder zuerst die Kupplung des Linkers an die aktivierte Oberfläche mit nachfolgender Kupp- lung des Produkts aus aktivierter Oberfläche und Linker an das Polysaccharid erfolgen kann oder umgekehrt, also erst die Kupplung des Linkers an das Polysacharid und nachfolgend die Kupplung des Produkts aus Linker und Polysaccharid an die ak¬ tivierte Oberfläche.
Verfahren zur Ankupplung von Linkermolekülen an eine entspre¬ chend aktivierte PEEK-Oberfläche oder dem aktivierten Polymer unterliegen ebenfalls keinen besonderen Beschränkungen. Vorteilhafterweise erfolgt das kovalente Ankoppeln des photo¬ koppelbaren Linkers, insbesondere des Azidoanilin-Linkers, an die aktivierte Oberfläche bei einer Wellenlänge mit einem Be¬ reich von 200 nm bis 400 nm, bevorzugt mit einem Bereich von 200 nm bis 300 nm und besonders bevorzugt mit einem Bereich von 240 nm bis 260 nm. Gemäß einer bevorzugten Realisierung des Verfahrens erfolgt das kovalente Ankoppeln des photokop¬ pelbaren Linkers, insbesondere des Azidoanilin-Linkers, an die aktivierte Oberfläche bei einer Wellenlänge von 254 nm. Hier¬ durch kann ein gängiges Verfahren schnell, zuverlässig und einfach angewendet werden.
Bevorzugterweise ist das Polysaccharid mit seinen Carbonsäure¬ gruppen schon vor der lichtinduzierten Kupplung an den photo¬ koppelbaren Linker, insbesondere den Azidoanilin-Linker, ge- koppelt.
Bevorzugt erfolgt das kovalente Ankoppeln des carboxyfunktio- nalisierten Polysaccharids mittels einer, beispielsweise 1- Ethyl-3- ( 3-dimethylaminopropyl ) carbodiimid (EDC) vermittelten Amin- und Carboxygruppenkupplung an den photokoppelbaren Lin- ker, insbesondere an den Azidoanilin-Linker . Somit kann die Kupplung mit einer Standardmethode routinemäßig und schnell durchgeführt werden. Verfahren zum Mineralisieren einer Polysaccharid enthaltenden Matrix mit Calciumphosphaten gemäß Schritt (c) des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens unterliegen keinen besonderen Beschränkun¬ gen. Sie umfassen für den Fall, dass amorphes Calciumphosphat (ACP) verwendet wird, beispielsweise das Inkubieren der Ober- fläche mit einer Lösung, umfassend Calciumchlorid, Dikalium- hydrogenphosphat und einen Nukleat ionsinhibitor . Dieser Nukle¬ at ionsinhibitor ist bevorzugt ein nicht-kollagenes Protein o- der Proteinanalogon, besonders bevorzugt poly-Asparaginsäure und/oder Fetuin. Für den Fall, dass Hydroxylapat it verwendet wird, umfassen Sie beispielsweise das Inkubieren der Oberflä¬ che mit einer Lösung, umfassend Calciumchlorid und Dikalium- hydrogenphosphat .
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Knochenimplantat auf das das erfindungsgemäße Knochenim¬ plantatmaterial aufgebracht ist.
Für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungs- formen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Materials für ein Kno- chenimplantat als Knochenimplantatmaterial. Für diesen Gegen¬ stand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Defi¬ nitionen, Vorteile und bevorzugten Ausführungsformen, die vor¬ stehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplanta¬ te aufgeführt wurden, in analoger Weise. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Materials für ein Kno¬ chenimplantat beispielsweise zur Behandlung von Knochenschä¬ den .
Auch für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausfüh¬ rungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Knochenimplantats bei¬ spielsweise zur Behandlung von Knochenschäden. Auch für diesen Gegenstand der vorliegenden Erfindung gelten alle relevanten Definitionen, Vorteile und bevorzugten Ausfüh¬ rungsformen, die vorstehend für das erfindungsgemäße Material für Knochenimplantate aufgeführt wurden, in analoger Weise. Implantate wachsen in den menschlichen Körper umso besser ein, und werden umso stabiler mit dem Körper verbunden (unter ande¬ rem durch vermehrte Anlagerung von Körperzellen) , je besser die Implantatoberfläche dem natürlichen Knochen entspricht. Dies ist das Ziel der vorliegenden Erfindung. Weiter soll die Beschichtung kovalent an die Oberfläche der Implantate gebun¬ den werden. Die erfindungsgemäßen Knochenimplantatmaterialien weisen eine höhere Biokompatibilität, bessere Einheilung in den natürlichen Knochen und eine erhöhte mechanische Belast¬ barkeit auf.
Die Oberflächenmodifikation gemäß der vorliegenden Erfindung zielt darauf ab, knochenähnliche Strukturen kovalent gebunden auf die Oberfläche von Knochenimplantatmaterialien aufzubrin¬ gen, welche eine organische Polysaccharidmatrix und die Miner- alphase des natürlichen Knochens beinhalten. Dies soll die Einheilung des Implantats in den Knochen unterstützen. Diese Strukturen beinhalten eine Matrix aus einem Polysaccharid, welche schließlich mit Calciumphosphat mineralisiert wird. Die Mineralisation erfolgt hierbei mit Hilfe von nicht-kollagenen Proteinen und deren Analoga, welche als Nukleationsinhibitoren fungieren, so dass die Mineralisation kontrolliert verläuft und eine ektopische Mineralisation vermieden wird. Solche Nuk¬ leationsinhibitoren sind beispielsweise poly-Asparaginsäure oder Fetuin. Die Mineralisation mit Octacalciumphosphat oder Hydroxylapatit erfolgt durch das Inkubieren der Polysaccharid- matrix in einer Lösung, welche Calciumionen oder Phosphationen beinhaltet. Durch eine langsame und kontrollierte Zugabe einer Lösung der jeweils komplementären Phosphationen oder Calciumi¬ onen kann Octacalciumphosphat und/oder Hydroxylapatit inner¬ halb der Polysaccharidmatrix ausgefällt werden. Durch die re¬ lativ ungeordnete Struktur des Polysaccharids besitzt die re¬ sultierende Oberflächenmodifikation geflechtknochenartige oder kallusartige Struktur. Die Knochenzellen könnten so bei der Einheilung des Materials weitere ungeordnete Kollagenstruktu¬ ren um das Material herum aufbauen bzw. das Material direkt weiter mit dem Knochen verknüpfen. Diese ungeordneten Struktu¬ ren können dann schließlich in der natürlichen Remodellie- rungsphase der Knochenwundheilung zu geordneten Knochenstruk¬ turen umgebaut werden. Hierbei können die Zellen durch die kovalente Anbindung der Polysaccharide bei der Remodellierung allerdings nicht bis zur direkten Oberfläche des Implantatma¬ terials vordringen und verbleiben so immer in einer gewünsch¬ ten Matrix aus extrazellulären Proteinen. Das Implantatmateri¬ al wird damit für die Zellen maskiert, um bei der Einheilung von Implantaten unerwünschte Reaktionen zu vermeiden. Da die Modifikationen lediglich die Oberfläche der Implantatmateria¬ lien betrifft, werden Materialeigenschaften nicht verändert.
Die grundlegenden chemischen Reaktionen können leicht für Modifikation verschiedener Materialien adaptiert werden. können Metalloxidoberflächen kovalent über etablierte Silan- chemie angebunden werden. Dies macht die erfindungsgemäße Oberflächenbeschichtung auch interessant für oxidische Kera¬ mikmaterialien. Da weiterhin Metalle beispielsweise durch Plasmabehandlung unschwer an der Oberfläche oxidierbar sind, werden über die Silanchemie auch die gängigen Implantatmateri¬ alien aus Titan der erfindungsgemäßen Oberflächenmodifizierung über Silane zugänglich.
In den vergangenen Jahren wurden viele verschiedene Materia¬ lien für die Verwendung als Knochenimplantate entwickelt. Die biologischen, chemischen, wie auch mechanischen Anforderungen für Implantatmaterialien müssen in einem Material vereint wer¬ den, um den Eigenschaften des Knochens möglichst nah zu kom¬ men. Die Vielfalt an zugelassenen Materialien spiegelt die großen Anstrengungen in diesem Feld wider. Der Kunststoff Po- lyetheretherketon (PEEK) hat beispielsweise sehr gute mechani¬ sche Eigenschaften die vergleichbar mit natürlichem Knochen sind. Die Nachteile liegen mit der hohen Hydrophobie und damit geringer Bioaktivität aber auf der Hand, weshalb es zahlreiche Bestrebungen gibt, diese Problematik anzugehen.
Es wurde eine Methode entwickelt, in welcher die Gelatinefunk- tionalisierung des Knochenimplantatkunststoffs PEEK etabliert wurde. In der vorliegenden Erfindung wurde nun eine Methode entwickelt, um an der Oberfläche von PEEK ein Netzwerk aus Po¬ lysacchariden aus pflanzlichem oder bakteriellem Ursprung, im Konkreten Hyaluronsäure-, Alginsäurederivate und vollsyntheti¬ sche Polymere kovalent zu binden, um die Probleme, welche ein Coating auf tierischer Basis hat, wie beispielsweise der Nach¬ weis von Keimfreiheit und der langwierige Zulassungsprozess aufgrund des potentiellen Endotoxingehalts und des Allergenpo- tentials, zu umgehen. Einige Patienten entscheiden sich aus persönlichen Gründen gegen bestimmte tierische Produkte, sei es aus religiösen oder aus ethischen Gründen. Vegane, bzw. synthetische Funktionalisierungen könnten für diesen Personen¬ kreis interessante Alternativen sein. Um der chemischen Struk¬ tur natürlichen Knochenmaterials möglichst nahe zu kommen kann abschließend die aufgebrachte Beschichtung mit Calciumphos- phat, im speziellen Hydroxylapatit , mineralisiert werden.
Die bisher gegebene Beschreibung vorteilhafter Ausgestaltungen der Erfindung enthält zahlreiche Merkmale, die in einigen ab¬ hängigen Ansprüchen zu mehreren zusammengefasst wiedergegeben sind. Diese Merkmale können jedoch zweckmäßigerweise auch ein¬ zeln betrachtet und zu sinnvollen weiteren Kombinationen zu- sammenfasst werden, insbesondere bei Rückbezügen von Ansprü¬ chen, so dass ein einzelnes Merkmal eines abhängigen Anspruchs mit einem einzelnen, mehreren oder allen Merkmalen eines ande¬ ren abhängigen Anspruchs kombinierbar ist. Außerdem sind diese Merkmale jeweils einzeln und in beliebiger geeigneter Kombina¬ tion sowohl mit dem erfindungsgemäßen Verfahren als auch mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß den unabhängigen An¬ sprüchen kombinierbar. So sind Verfahrensmerkmale auch als Ei¬ genschaft der entsprechenden Vorrichtungseinheit gegenständ¬ lich formuliert zu sehen und funktionale Vorrichtungsmerkmale auch als entsprechende Verfahrensmerkmale.
Die oben beschriebenen Eigenschaften, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung, sowie die Art und Weise, wie diese erreicht werden, werden klarer und deutlicher verständlich im Zusammen¬ hang mit der folgenden Beschreibung der Ausführungsbeispiele, die im Zusammenhang in der folgenden Beschreibung genannten Beispiele beschränken die Erfindung nicht auf die darin ange¬ gebene Kombination von Merkmalen, auch nicht in Bezug auf funktionale Merkmale. Außerdem können dazu geeignete Merkmale eines jeden Ausführungsbeispiels auch explizit isoliert be¬ trachtet, aus einem Ausführungsbeispiel entfernt, in ein ande¬ res Ausführungsbeispiel zu dessen Ergänzung eingebracht und/oder mit einem beliebigen der Ansprüche kombiniert werden. Es zeigt:
FIG 1 die Übereinstimmung eines Pulver-
Röntgendiffraktogramms durchgeführt mit der abge¬ kratzten Ablagerung auf Probenplattchen IS019 mit dem Signal von Hydroxylapat it aus der Literatur.
Die im folgenden Text genannten und verwendeten Methoden (ATR- IR Analyse, Rasterelektronenmikroskopie, Konfokale Laser-
Scanning Mikroskopie, Fluoreszenzspektrometrie, NMR-Messungen, Thermogravimetrische Analyse (TGA) , UV-Untersuchungen, Kon¬ taktwinkelmessung, Kernspinresonenz Spektroskopie wurden nach dem Fachmann bekannten Prinzipien und Vorgehensweisen sowie mit bekannten Geräten durchgeführt.
Es ist möglich über eine nasschemische Modifikation der PEEK- Oberfläche, die Reduktion der Carbonylgruppen im PEEK- Grundgerüst durch Behandlung der Folie mit NaBIHU in DMSO bei °C zu erreichen:
Die Reaktion kann ohne Sauerstoffausschluss unter Rühren in einem 500 Milliliter (mL) Kolben durchgeführt werden. 10 PEEK- Plättchen (je 1 cm2 (Quadratzentimeter)) wurden in 20 Millili¬ ter (mL) DMSO gegeben und gerührt. Es wurde auf 120 °C erhitzt und nach 20 min wurden 13mmol (490 mg) NaBIHU zugegeben. Die Re¬ aktionszeit betrug 4 h 30 min. Das PEEK wurde 15 min in 20 mL MeOH, 10 min in 20 ml H20 und 35 min in 20 mL 1 M HCl gewa¬ schen. Nach Abspülen in EtOH wurde das PEEK im Vakuumtrocken¬ ofen für 2 h bei 40°C und 50 mbar getrocknet. Die Reaktion wurde anhand eines ATR-IR-Spektrums verifiziert (ATR-IR: v 3400 cnr m [cm1: Wellenzahl), starke Abschwächung der 1647 cm 1 (w) C=0 Valenzschwingung, nicht gezeigt) .
Die reduzierten PEEK-Folien können weiter zum Bernsteinsäu¬ reester umgesetzt werden. Die Veresterung kann mittels Bern¬ steinsäureanhydrid in Aceton bei Raumtemperatur durchgeführt werden :
10 PEEK-Plättchen (je 1 cm2) wurden in 30 ml Aceton vorgelegt und auf 40 ° C erhitzt. Es wurde 1 Gramm (g) ( 10 mmol) Bern¬ steinsäureanhydrid zugegeben. Die Reaktionszeit betrug 5 h 35 min. Die Plättchen wurden mit je 20 mL Aceton, H2O und Ethanol gewaschen und im Vakuumtrockenofen für 2 h bei 40 ° C und 50 mbar getrocknet. Die Reaktion wurde anhand eines ATR-IR-
Spektrums verifiziert. ATR- IR : v 3400 cirr1 (m) , 2 924 cirr w
2861 cm-1 (m) sp3 CH2 Valenzschwingungen, 1705 (w) COOH Valenz¬ schwingung (nicht gezeigt) .
Gereinigte PEEK-Folien konnten in purem Diamin (Ethylendiamin (EDA) und 1 , 3-Diaminopropan) umgesetzt werden. Es kommt zu ei¬ ner Bildung von Iminen (Schiffschen Base) auf der PEEK- Oberfläche. Die Reaktion kann 3 h unter Reflux des Diamins und
5 PEEK-Plättchen (je 1 cm2) wurden in 10 mL Ethylendiamin, bzw. 1 , 3-Diaminopropan vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren 3 h unter Reflux erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt und die PEEK-Plättchen ausgiebig mit Aceton gewaschen. Die modifizierten Folien wurden im Vakuumtrocken¬ ofen für 2 h bei 4 0 ° C und 50 mbar getrocknet. Die Reaktion wurde anhand eines ATR-IR-Spektrums verifiziert ATR-IR: v 2 925 cirr1 (m) , 2 854 cirr1 (m) sp3 CH2 Valenzschwingungen, 1 62 0 cirr1 (w) C=N Valenzschwingung (nicht gezeigt) .
Es konnte auch ein Bernsteinsäurelinker an die aminfunktiona- lisierten PEEK-Proben eingeführt werden: Die PEEK-Folien wur¬ den in 1 0 mL trockene 1 0 Millimol (mM) Bernsteinsäureanhydrid DMF-Lösung (DMF: Dimethylformamid) gegeben. Nach 1 0 h wurden die Folien sorgfältig mit MilliQ (Reinstwasser) gewaschen. Und mittels ATR-IR-Spektroskopie untersucht (nicht gezeigt) . ATR- IR: v 2 925 cm-1 (m) , 2 854 cm-1 (m) sp3 CH2 Valenzschwingungen, 17 0 6 cm-1 (w) C=0 Valenzschwingung.
Die modifizierten PEEK-Folien wurden einer Kontaktwinkelmes¬ sung unterzogen. Die modifizierten PEEK-Folien wurden vor der Messung mit Phosphatpuffer behandelt, mit MilliQ abgespült und gut getrocknet. Die Kontaktwinkelmessungen können 5 Sekunden (s) nach Aufbringen des Tropfens erfolgen. Kontaktwinkelmes¬ sungen mit Reinstwasser (MilliQ) implizieren beim mit Ethylen- diamin modifizierten PEEK eine mit 6 6 ° deutlich erhöhte Hydro- philie im Vergleich zu unmodifizierten PEEK-Folien ( 84 , 5 ° ) . Bei der mit 1 , 3-Diaminopropan modifizierten Variante ist der Kontaktwinkel mit 7 0 ° auch kleiner geworden, da die Oberfläche ebenfalls hydrophiler wurde. Die Erhöhung der Hydrophilie spricht für einen erfolgreichen Reaktionsverlauf bei der Um- setzung von PEEK mit den Diaminen.
Unbehandelte PEEK-Folien können mit einer Grafting-from Poly¬ merisationsmethode mit Polyacrylsäure beschichtet werden (UV- Licht induzierte PEEK-Modifikation) :
Die verwendete Experimentalvorschrift kann in einem Schritt durchgeführt werden. Es kann mit entgasten wässrigen Lösungen von destillierter Acrylsaure gearbeitet werden. Als UV Licht Quelle kann eine OSRAM Vitalux 300 ohne weiteren Filter ver¬ wendet werden.
4 PEEK-Plättchen (je 1 cm2) wurden in einem Schlenkkolben vor¬ gelegt und mittels 3 Vakuum/ St ickstoffcyclen entgast. Die ent- sprechende Menge entgastes MilliQ Wasser (4 Freeze Pump Thaw Zyklen) wurde zugegeben. Nach Zugabe der entgasten Acrylsaure (30 min Durchleiten von Stickstoff) wurde der Kolben unter Rühren mit der UV-Lampe aus einer Entfernung von 15 cm be¬ strahlt. Die Reaktionszeit betrug zwischen 15 min und 75 min. Die Konzentration der Acrylsaurelosung betrug zwischen 5 wt% und 25 wt%. ATR-IR: v 1705 cirr1 (m) COOH Valenz Schwingung .
Die jeweilig möglichen Bedingungen und Ergebnisse sind in Ta¬ belle 1 Tabelle laufgeführt.
Tabelle 1: Reaktionsansätze des UV-Graftings mit Acrylsaure.
Acrylsaure
Reaktionszeit Gelschicht auf
Eintrag Konzentra-
[min] Oberfläche
tion [wt%]
MG10 20 75 Ja
MG11 10 70 Ja
MGI 3 7,5 70 Ja
MGI 9 5 30 Ja
MG20 5 45 Ja
MG12 5 60 Ja Die mit Polyacrylsäure gegrafteten PEEK-Folien wurden im Ras¬ terelektronenmikroskop (REM) untersucht (nicht gezeigt) .
Bei jedem Ansatz wurde eine im Wesentlichen homogene Schicht aus Polyacrylsäure gebildet. Je höher die Polyacrylsäurekon- zentration und je länger die Reaktionszeit umso mehr Polyac¬ rylsäure wurde auf der Oberfläche im Wesentlichen in Kugelform abgeschieden bzw. umso höher war die Schichtdicke. Hierbei sind die Kügelchen umso kleiner, je geringer die Polyacrylsäu- rekonzentrat ion war (30 (Mikrometer (pm) bei MG10 gegenüber 3 pm bei MG12) .
Zur weiteren Oberflächenfunkt ionalisierung wurden die Proben verwendet, die für 30 Minuten bei 5 wt% Acrylsäureanteil poly- merisiert wurden. Unter diesen Bedingungen war die Beschich¬ tung noch ausreichend dick um von einer homogenen Beschichtung zu sprechen (nicht gezeigt) , und gleichzeitig kann man bei dieser Schichtdicke davon ausgehen, dass die mechanischen Ei¬ genschaften des Bulkmaterials nicht negativ beeinflusst wer- den. Die Polyacrylsäureschichten die bei höheren Acrylsäure- konzentrat ionen hergestellt wurden, sind aufgrund des dicken Gelkissens von bis zu 5 Millimeter (mm) nicht geeignet für die Zielanwendung als Knochenimplantatmaterial, da ein Gelkissen auf der Oberfläche den mechanischen Kontakt zum umliegenden Gewebe stark verschlechtert.
Bei geringer Vergrößerung erkennt man dass die Polyacrylsäure mit den Kügelchen lineare Strukturen ausgebildet hat. Die Aus¬ bildung dieser Linien könnte der Trocknungsmethode geschuldet sein (Vakuumofen) ist möglicherweise aber auch der Hydrophobie der PEEK-Oberfläche geschuldet. Die an die aktive Stelle dif¬ fundierenden Acrylsäuremoleküle haben eine höhere Affinität für eine wachsende Polyacrylsäureschicht , als für die hydro¬ phobe PEEK-Oberfläche . Dies könnte die aus PAA Kugeln beste- henden Linienstrukturen erklären. Die durchschnittliche Kügel- chengröße unter diesen Reaktionsbedingungen beträgt 1,7 pm und ist damit nochmal etwa halb so groß als bei 60 min Polymerisa¬ tion. Die Beschichtungsergebnisse wurden anhand von ATR-IR- Spektren verifiziert (nicht gezeigt) .
Als besonders geeignet haben sich die Beschichtungen, die bei 5 wt% Acrylsäure und 30 min UV-Behandlung hergestellt wurden erwiesen. Das PEEK kann unter diesen Bedingungen dünn be¬ schichtet werden, sodass kein zu großes Gelkissen abgeschieden wurde .
Die UV-induzierte graft ing-Polymerisat ion eignet sich also sehr gut für die Beschichtung von PEEK mit Polyacrylsäure, da deutliche Mengen des PAA auf der PEEK-Oberflache nachgewiesen werden konnten.
Es können auch Polymerisationen in purer Acrylsäure und zum Vergleich in purem Methylacrylat durchgeführt werden, also ei¬ ne Polymerisation im reinen Monomer. Die Resultate wurden an- hand von ATR-IR-Spektren verifiziert (nicht gezeigt) .
Kupplung von 1 , 4-Diaminobutan an die mit PAA beschichtete PEEK-Oberfläche :
Die Polyacrylsäure-Schicht kann durch die Ankupplung von Dia¬ minlinkern modifiziert werden, damit später mit organischen Säuren Amidbindungen ausgebildet werden können. Die Kupplung der Diamin Spezies an die Carboxylgruppen kann mittels des mo¬ dernen Kupplungsreagenzes 4- (4, 6-Dimethoxy-l, 3, 5-triazin-2- yl ) -4-methylmorpholinium Chloride (DMT-MM) durchgeführt wer¬ den. Die Aktivierung und Kupplung kann mit DMT-MM bei einem gepuffertem pH-Wert von 9 erfolgten:
Die Quantifizierung der Aminogruppen auf der Oberfläche der linkerfunktionalisierten PEEK-Folien (Substrat) kann mittels des Fluoreszenzfarbstoff C-Cumarin:
nach dem Fachmann bekannter Weise durchgeführt werden: (Stern = 7-Hydroxicumarin-Fluorophor, Sub = Substrat und siehe S. Shiota; S. Yamamoto; A. Shimomura; A. Ojida; T. Nishino; T. Maruyama, Langmuir 2015, 31, 8824-8829) :
Über die Fluoreszenzintensität kann die Konzentration des Farbstoffes in Lösung bestimmt und damit Rückschlüsse auf die Menge der Oberflächen-Aminogruppen gezogen werden. Bei den funktionalisierten PEEK-Proben (mit Ethylendiamin, 1,3- Diaminopropan 4 und Tetramethylendiamin (TMDA) ) konnte eine höhere H2 Dichte gegenüber einer unfunktionalisierten PEEK- Probe ermittelt werden (Daten nicht gezeigt) . Synthesen der modifizierten Polysaccharide:
Zur Modifikation der PEEK-Folien mit Polysacchariden, können zwei Strategien verfolgt werden: Die Einführung des Linkermo¬ leküls (Diamin) auf der carboxylierten PEEK-Oberflache und die Einführung der Linker am Polymer. Im ersten Fall würde im Po¬ lymer-Kupplungsschritt unmodifiziertes Polysaccharid an freie Aminogruppen am Substrat gekuppelt werden, wohingegen im zwei¬ ten Fall aminfunktionalisierte Polysaccharide an Carboxylgrup- pen am Substrat verankert werden. difizierte Hyaluronsaure:
oder Alginsäure (gezeigt als Strukturausschnitte von Alginsäu- re mit den verschiedenen Poly-G, Poly-M und alternierenden Blöcken. Je nach Herkunft der Alginsäure ist das Verhältnis aus G und M unterschiedlich) :
'OOC OH ooc OH
mit einem Amin funktionalisiert werden, um danach an Car- boxylgruppen auf der PEEK-Oberfläche gekuppelt zu werden. Hierbei kann es nötig sein, vor der Funktionalisierung Deacetylierung durchzuführen.
Deacetylierung von Hyaluronsäure :
Unmodifizierte Hyaluronsäure besteht aus einer D-Glucuronsäure und einer N-Acetyl-Glucosamin-Einheit . Sie besitzt deshalb pro Disaccharid-Monomer eine freie Carboxylfunktion und eine ace- tylierte Aminfunktion . Zwei gängige Methoden um Aminfunktiona- litäten einzuführen, können neben Substitutionsreaktionen an den OH-Gruppen, die Funktionalisierung der Carboxylgruppen mit Diamin-Linkern, oder die Entschützung der N-Acetyl-Gruppe zum freien Amin sein.
Die Deacetylierung kann in wässriger Hydrazinlösung unter Hyd¬
Zu 1 g Natriumhyaluronat wurde 50 mL Hydrazinmonohydrat und 0,5 g Hydrazinsulfat gegeben, sodass eine Lösung, bezogen auf das Polymer, von 2 Gewichtsprozent (wt%) erreicht war. Nach 72 h rühren bei 55°C wurde das Polymerprodukt in kaltem Ethanol ausgefällt, filtriert und im Vakuum getrocknet (24 h) . Der Rückstand wurde in 20 mL 5 % Essigsäure aufgenommen. Zu dieser Lösung wurde wässrige Iodsäurelösung (10 mL, 0,5 M) gegeben, wobei die Temperatur für 1 h in einem Eisbad auf 4°C gehalten wurde. Wässrige Jodwasserstoff Lösung (57 %, 3 mL) wurde dazu¬ gegeben. Nach 15 Minuten wurde die violette Lösung im Scheide¬ trichter fünfmal mit je 25 mL Diethylether extrahiert bis die wässrige Phase farblos war. Der pH Wert der Lösung wurde mit 0,2 M NaOH Lösung auf 7-7,5 eingestellt. Das Polymer wurde in 1 Volumenäquivalent Ethanol ausgefällt, in H2O gelöst und gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Das Dialysewasser wurde tag¬ lich 2-mal gewechselt. Nach dreitägiger Dialyse wurde die Lö¬ sung gefriergetrocknet und die deacetylierte Hyaluronsaure als Produkt erhalten.
Die freien Aminogruppen könnten als Ankergruppen für die Kupp¬ lung an die Carboxylgruppen der PEEK-PAA Oberfläche verwendet werden. Das Polymer wurde NMR-spektroskopisch untersucht um den Deacetylierungsgrad zu bestimmen (nicht gezeigt) .
Modifikation von Hyaluronsäure mittels Hexamethylendiamin und Adipinsäuredihydrazid :
Die freien Carboxylgruppen der Hyaluronsäure können sich für vielfältige Modifikationsmöglichkeiten des Polymers eignen. In der Literatur wurde z.B. von Amidierung, Esterbildung oder Ugi-Kondensation berichtet.
Für die Synthese der amidierten Hyaluronsäure kann Hexamethyl¬ endiamin (HMDA) verwendet werden. Die Kupplung des Amins kann über die klassische EDC/NHS-Kupplung ( l-Ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl ) carbodiimid/ N-Hydroxysuccinimid - Kupplung) im wässrigen Medium verlaufen. Die Reaktion wird in eine Aktivierungsphase im leicht sauren und eine Kupplungspha¬ se im leicht basischen aufgeteilt. Der pH Wert der Reaktion musste kontinuierlich kontrolliert und nachgestellt werden:
Eine wässrige Natriumhyaluronat Lösung mit 3 — wurde herge¬ stellt (500 Milligramm (mg) in 167 mL MilliQ) . Bezogen auf die Menge der Carboxylgruppen im Polymer wurden 30 äq. Hexamethyl¬ endiamin (HMDA, 30äq, 39,6 mmol, 4,6 g) zugegeben. Der pH Wert der Lösung wurde auf 7,5 eingestellt (0,1 M NaOH, bzw. 0,1 M HCl). EDC (4 äq., 5,28 mmol, 0,9 g) und NHS (4 äq., 5,28 mmol, 0, 607 g) wurden in 10 mL Wasser gelöst und dann zu der Reakti¬ onslösung gegeben. Der pH Wert der Mischung wurde mittels Zu- gäbe von 0,1 M NaOH bei 7,5 gehalten. Die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Der pH Wert wurde auf 7 eingestellt und das Po¬ lymer in Ethanol (3 Volumenäquivalente) ausgefällt. Das Poly- mg
mer wurde in MilliQ gelöst (5 —) und 6 Tage gegen VE-Wasser
(Vollentsalztes Wasser) dialysiert. Das VE-Wasser wurde täg- lieh 2 Mal gewechselt. Das gereinigte Produkt wurde 4 Tage ge¬ friergetrocknet. Der Grad der HMDA-Funktionalisierung wurde mittels !H-NMR Spektroskopie bestimmt. 46 % HMDA Funktionali- sierung . Die Reaktion erfolgte unter sehr großem Überschuss an Diamin (30-fach, bezogen auf die Menge der Carboxylgruppen im Poly¬ mer) um die Quervernetzung der Hyaluronsäure zu verhindern. Durch !H-NMR-Spektren konnte die erfolgreiche Kupplung des HMDA Linkers und durch ATR-IR-Spektren die erfolgreiche Funktiona- lisierung der Carboxylgruppen durch Ausbildung von Amidbindun- gen mit den HMDA-Linkern nachgewiesen werden (nicht gezeigt) .
Modifikation von Hyaluronsäure mit Adipinsäurediazid:
Zur Synthese des Adipinsäuredihydrazid (ADH) Derivats wurde die Synthesevorschrift abgewandelt. Da ADH eine geringere Ba- sizität als HMDA zeigt, ist die Kupplung bereits im sauren pH- Bereich von 4,8 möglich. Deshalb konnte auf die Zugabe von NHS verzichtet werden:
Eine Natriumhyaluronat lösung mit 3 — wurde hergestellt durch lösen von 500 mg Natriumhyaluronat in 170 mL H2O. Bezogen auf die Menge der Carboxylgruppen im Polymer wurde ein 40-fach mo- larer Überschuss an Adipinsäuredihydrazid (ADH, 52,8 mmol, 9,2 g) zugegeben. Es wurde gewartet bis das ADH vollständig gelöst war (15 min) . Der pH Wert der Reaktionsmischung wurde mittels 1 M HCl Lösung auf 4 eingestellt. Es wurde Ethanol (50 mL, 50 Volumenprozent (Vol%) ) zugegeben und 30 Minuten ge- rührt. Es wurden 4 äq. EDC-HC1 (5,3 mmol, 0,9 g) zugegeben. Der pH Wert wurde für 2 h mittels 1 M HCl auf ca. 4,8 gehal¬ ten. Nach 2 h wurde die Reaktion gestoppt Neutralisation der
Lösung mittels 1 M NaOH (pH = 7) . Die Reaktionslösung wurde in
e vorgewaschene Dialysemembranschläuche gegeben (MWCO = 3500
mol ) und für 9 Tage dialysiert. 1 Tag wurde gegen 100 mM NaCl Lö¬ sung dialysiert und danach abwechselnd einen Tag gegen 25 Vol% Ethanollösung und einen Tag gegen VE Wasser. Der Ethanol/VE Wasser Zyklus wurde 4 Mal wiederholt. Die Polymerlösung wurde schließlich 3 Tage gefriergetrocknet. Der Grad der ADH Funkti- onalisierung wurde mittels !H-NMR Spektroskopie bestimmt. 53 % ADH Funkt ionalisierung .
Die Synthese kann unter großem Überschuss an ADH um hier eben¬ falls die Vernetzung der Hyaluronsäure zu verhindern erfolgen. Bei beiden Synthesen musste das Produkt ausgiebig dialysiert werden, um den großen Überschuss des HMDA bzw. ADH zu entfer¬ nen. Durch !H-NMR-Spektren konnte die erfolgreiche Synthese der ADH-modifizierten Hyaluronsäure und durch ATR-IR-Spektren die erfolgreiche Funkt ionalisierung der Carboxylgruppen durch Aus- bildung von Amidbindungen mit dem ADH nachgewiesen werden (nicht gezeigt) .
HMDA modifizierte Algmsaure:
Analog zur Hyaluronsäure kann auch die Alginsäure mit HMDA funktionalisiert werden. Die Kupplung kann nach einer Vor¬ schrift zur Octylaminfunktionalisierung von Alginsäure erfol ten :
30 mL wässrige Natriumalginat mit 3 wt% (1 g Natriumalginat ) wurde in einem Kolben vorgelegt und der pH Wert mittels 0,1 M HCl auf 3,4 eingestellt. Die Polymerlösung wurde dadurch auf 50 mL verdünnt (2 wt%) . In 4 mL H2O wurden 797,5 mg (4,16 mmol) EDC-HC1 gelöst und zu der Polymerlösung gegeben. Das Verhält- nis der EDC Menge zu den Carboxylfunktionalitäten betrug somit
0,7. Die Konzentration des EDC wurde durch die molare Häufig- e
keit der Natriumalginat Monomere (M = 168,11 ) im Polymer.
mol
Nach 5 min Reaktionszeit wurden 10 äq. Hexamethylendiamin (7,05 g) zugegeben. Die Lösung wurde 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Polymer wurde in Aceton ausgefällt, nach Trock¬ nung in H2O gelöst und gegen H2O dialysiert. Das Wasser wurde 2 Mal täglich gewechselt. Nach 9-tägiger Dialyse wurde die Poly¬ merlösung 4 Tage gefriergetrocknet. Es wurde 938 mg Produkt erhalten. Der Grad der HMDA Funktionalisierung wurde mittels !H-NMR Spektroskopie bestimmt. 31,5 % HMDA Funktionalisierung .
Die Synthese kann unter großem Überschuss von HMDA erfolgten, um die Vernetzung der Alginsäure zu verhindern. Das Produkt kann ausgiebig dialysiert werden, um es vom überschüssigen HMDA zu befreien. Durch !H-NMR-Spektren konnte die erfolgreiche Kupplung des HMDA Linkers und durch ATR-IR-Spektren die er- folgreiche Funkt ionalisierung der Carboxylgruppen durch Aus¬ bildung von Amidbindungen mit den HMDA-Linkern nachgewiesen werden (nicht gezeigt) . Funkt ionalisierung der PEEK-Oberflache mit Polysacchariden: Für die weitere Funkt ionalisierung der PEEK-Oberflache können unterschiedliche Strategien verfolgt werden. Zum einen können verschieden modifizierte Polysaccharide mit Aminfunkt ionalitä- ten versehen und im nächsten Schritt an die Carboxylgruppen auf der PEEK-Oberflache gekuppelt werden. Der andere Ansatz geht von der Modifikation der Carboxylgruppen auf der Oberflä¬ che durch Diamine aus, um im nächsten Schritt unmodifizierte Polysaccharide ankuppeln zu können. Kupplung aminfunkt ionalisierter Polysaccharide:
Um die Polysaccharide auf das Polymersubstrat aufbringen zu können, sollte eine Pept idbindung aufgebaut werden. Es kann einerseits die klassische EDC/NHS Kupplungschemie verwendet werden. Andererseits kann auch mit dem modernen Kupplungsrea- genz DMT-MM gearbeitet werden. Die klassische EDC/NHS Kupplung kann zweistufig durchgeführt werden. Nach 20-minütiger Akti¬ vierung der PEEK-Folie im leicht sauren MES Puffer kann die Kupplung mit den modifizierten Polysacchariden im leicht basi¬ schen Phosphat-Puffer über Nacht durchgeführt werden:
Als alternative Kupplungsreaktion kann die einstufige Kupplung mit dem modernen Kupplungsreagenz 4- (4, 6-Dimethoxy-l, 3, 5- triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium Chloride (DMT-MM) gewählt werden. Der Aktivierungsmechanismus und die anschließende Aus¬ bildung der Pept idbindung können so erfolgen:
Sie hat den Vorteil, dass die Reaktion bei einem konstanten pH Wert von 9 durchgeführt werden kann und das Reaktionsgefäß zwischen Aktivierung und Kupplung nicht gewechselt werden muss. Die Kupplung bei pH 9 ist im Vergleich zur Kupplung an den NHS Ester bei pH 7,3 deutlich schneller, da die Amine bei pH 9 größtenteils als freies Amin vorliegen, was wichtig für den nukleophilen Angriff auf das aktivierte Carbonylzentrum ist. Die NHS Kupplung kann bei so hohen pH-Werten nicht durch¬ geführt werden, da der NHS Ester in der wässrigen Lösung sonst zu schnell h drolysiert wird:
Modifikation der iminfunktionalisierten PEEK-Oberflache :
Die iminfunktionalisierte PEEK-Oberflache kann unter identi- sehen Reaktionsbedingungen mit nativer Hyaluronsäure und Al- ginsäure umgesetzt werden.
Direkte Modifikation der iminierten PEEK-Oberflache mit nativer Hyaluronsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässiger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Direkte Modifikation der iminierten PEEK-Oberflache mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässiger Phosphatpufferlösung bei pH =8 (Aminierte PEEK Folie wurde mit Polysaccharid in PBS Puffer (PBS: Phosphate Buffer Saline) bei pH=8 (67 mM) in 1 mM DMT-MM Lösung über Nacht geschüttelt. Konzentration von Hyaluronsäure : 0,1 mg/mL;
Alginsäure: 0,05 mg/mL. Es wurde dreimal mit MilliQ Wasser gewaschen) :
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten-PEEK- Oberflache :
Die Beschichtung der PEEK-Substrate mit Polyacrylsaure war, wie oben beschrieben wurde, sehr erfolgreich. Die sehr große Menge an Carboxylgruppen die dadurch auf der PEEK-Oberflache eingeführt werden konnte, sollte nun als Angriffspunkt für die weitere Funktionalisierung mit verschiedenen Polysaccharidde- rivaten dienen. So wurden Kupplungsreaktionen mit ADH- Hyaluronsäure, HMDA-Hyaluronsäure, deacetylierter Hyaluronsäu- re und HMDA-Alginsäure durchgeführt. Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit ADH-Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mit¬ tels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Die Reaktion erfolgte unter denselben Bedingungen wie die vor¬ herigen Kupplungen.
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit HMDA-Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mit¬ tels DMT-MM in wässriger Phospha
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit HMDA-Alginsäure . Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit deacetylierter Hyaluronsaure. Die Kupplung er- folgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH
Insgesamt wurden noch bedeutend mehr Kupplungsversuche an das PEEK-Substrat durchgeführt. Der Überblick über die Reaktionen ist in Tabelle 2Tabelle 2 dargestellt. Die mit einem X mar¬ kierten Kupplungen wurden durchgeführt. Alle Reaktionen wurden unter denselben basischen Bedingungen mit Hilfe von DMT-MM als Kupplungsreagenz durchgeführt.
Tabelle 2: Übersicht über die erfolgten Polysaccharidkupplun- gen an PEEK-Substrate .
PEEK-
X X X X
Imin-COOH
PEEK-PAA X X X X
PEEK-PAA-
X X
Amin
Die den einzelnen Reaktionen zugehörigen Reaktionsschemata sind wie folgt: Durch ATR-IR-Spektren wurde die erfolgreiche Funktionalisierung nachgewiesen (nicht gezeigt) .
Direkte Modifikation der iminierten PEEK-Oberflache mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässiger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten PEEK-Oberflache mit ADH-Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten PEEK-Oberflache mit HMDA-Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
HMDA-Hyaluronsäure
DMT-MM, PBS pH = 8
Modifikation der iminierten und carboxylierten (Bernsteinsäu¬ re) PEEK-Oberflache mit HMDA-Alginsäure . Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der iminierten und carboxylierten PEEK-Oberflache mit deacetylierter Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mit¬ tels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit ADH-Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mit¬ tels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit HMDA-Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mit¬ tels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit HMDA-Alginsäure . Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten PEEK- Oberflache mit deacetylierter Hyaluronsaure. Die Kupplung er¬ folgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten und an¬ schließend mit Tetramethylendiamin behandelten PEEK-Oberflache mit nativer Hyaluronsäure . Die Kupplung erfolgte mittels DMT- MM in wässriger Phosphatpufferlö
Modifikation der mit Polyacrylsaure beschichteten und an¬ schließend mit Tetramethylendiamin behandelten PEEK-Oberflache mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung = 8:
Alginsäure
DMT-MM, PBS pH =
Modifikation der iminierten PEEK-Oberflache mit angekuppelter Bernsteinsäure mit nativer Alginsäure. Die Kupplung erfolgte mittels DMT-MM in wässriger Phosphatpufferlösung bei pH =8:
Mineralisierungsversuche mit Hydroxylapat it :
Zudem können drei unterschiedliche Ansätze zur Mineralisierung von Hydroxylapat it in per PEEK-PAA Probe durchgeführt werden. Zum einen können zwei Versuche mit Calciumprästrukturierung unternommen werden und einer mit Phosphat-Prästrukturierung .
Hier wäre die folgemnde Ca-Prästrukturierung möglich:
Eine etablierte Syntheseroute für Hydroxylapat it kann abgewan- delt und für die Mineralisierung von PEEK-PA Folien verwendet werden. Die PEEK-PA Folie kann in 0,3 M Calciumchlorid-Lösung bei einem gepufferten pH-Wert von 9 vorgelegt und für
30 Minuten gerührt werden. Nun wurde eine ebenfalls bei pH = 9 gepufferte Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung mit einer Rate von 3 —— zugegeben. Nach vollständiger Zugabe wurde die Mischung min
über Nacht gerührt .
Es könnte zudem eine Ca-Prästrukturierung und Phosphatpräst- rukturierung durchgeführt werden:
Es können ebenfalls simplere Varianten der Mineralisierung durchgeführt werden. PEEK-PAA Proben wurden 72 h in Diammoni- umhydrogenphosphat (Phosphatprästrukturierung, 6 mL Gläschen mit 1 M wässriger (NH4) 2HP04~Lösung) , respektive Calciumnitrat Cal (6 mL Gläschen mit 1 M wässriger Ca (NO3) 2-Lösung) gegeben. Nach dieser Ruhezeit wurden die Proben in die jeweils andere Lösung (0,6 M (NH4)2HPC>4 bzw. 0,6 M Ca (NO3) 2-Lösung) gegeben und für eine Woche darin belassen, um den Gegenionen zu ermögli¬ chen ebenfalls ins Gel zu diffundieren.
Photoinduzierbare Kupplung
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel wurde Azido- funktionalisierte Hyaluronsäure mittels lichtinduzierter Kupp lung an eine PEEK-Oberfläche angebunden. Die Reaktionssequenz der lichtinduzierten Ankupplung der Azidoaniline mit Hyaluron säure an PEEK könnte wie folgt ablaufen:
Es wurden also Azidoanilingruppen an die Carboxy-Gruppen von Polysacchariden, wie etwa Algin- oder Hyaluronsaure, angekop¬ pelt (siehe unten) . Das Kupplungsprodukt aus Polysaccharid und Azidoanilin-Linker wurde dann mit Licht an die PEEK Oberflä- chen angebunden.
Die Kupplung des Azidoanilin-Linkers an das Polysaccharid er¬ folgt in einem ersten Schritt mittels einer Standard EDC ver¬ mittelten Amin- und Carboxygruppenkupplung an das carboxyfunk- tionalisierte Polymer. Große Polymere, wie hochmolekulare Hya¬ luronsaure, bilden starte Sekundärstrukturen aus (bspw. He- lixstrukturen etc.), die auch eine hohe Viskosität verursa¬ chen. Dadurch ist die Diffusion von Reagenzien zu den funktio¬ nellen Gruppen schlecht und die Zugänglichkeit behindert. Des- halb kann bei Bedarf die Hyaluronsäure vorab bearbeitet wer¬ den. Hierbei käme beispielsweise eine Spaltung der Hyaluron¬ säure, wie etwas enzymatisch oder mittels Ultraschall, in Be¬ tracht. Bei einer enzymat ischen Spaltung, beispielsweise mit Hyaluronidase, wird die Hyaluronsäure in Fragmente mit ca. 15 Kilodalton (kD) und bei der Ultraschallbehandlung in Fragmente mit ca. 300 kD gespalten.
Herstellung einer Azido-funktionalisierten Hyaluronsäure könn¬ te gemäß Eychenne, Romain, et al . "Rhenium Complexes Based on an N20 Tridentate Click Scaffold: From Synthesis, Structural and Theoretical Characterization to a Radiolabelling Study." European Journal of Inorganic Chemistry 2017.1 (2017) : 69-81) erfolgen oder es könnte kommerziell erworbene eingesetzt wer¬ den .
Synthese photoreaktiver Hyaluronsäure (Hya-N3) (siehe Chen, Guoping, et al . "Photoimmobilization of sulfated hyaluronic acid for ant ithrombogenicity . " Bioconjugate chemistry 8.5 (1997) : 730-734. ) : Material: 100 mg (1 Äquivalent) der (gespaltenen) Hyalu¬ ronsaure; 45 mg (1 Äquivalent) 4-Azidoanilin; 58,2 mg (1,15 Äquivalente) EDC-Cl ( l-Ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl ) carbodiimid HCl) - Alle drei Edukte in 110 mL MilliQ-Wasser lösen
- Den pH auf 7 einstellen
- Über Nacht im Dunkeln Rühren
- Aufreinigung mittels Dialyse bis kein UV-Signal im Dialyse¬ wasser mehr bei 255 nm zu detektieren ist
- Gefriertrocknen
Beschichten von Polyetheretherketon (PEEK) mit Azido- funkt ionalisierten Hyaluronsäuren :
- PEEK-Substrat mit Ethylacetat und Aceton jeweils ca. 1 Minute waschen
- Lösung Azido-funkt ionalisierter Hyaluronsäuren (1 mg/mL) (En¬ zymati sch gespaltene Azido-funktionalisierte Hyaluronsaure „Hya-enz-N3" und mittels Ultraschall gespaltene Azido- funkt ionalisierte Hyaluronsaure „Hya-US-N3") in MilliQ-Wasser und in 3 mL Schnappdeckelglas durch Mischen und Schütteln herstellen
- 50 pL der jeweiligen Lösung auf gewaschene PEEK-Substrate mit Pipette auftragen
- Über Nacht an Luft trocknen (Hierbei die betupften PEEK- Folien, beispielsweise mit einer 96-Wellplatte abdecken, um die jeweilige Substratsorte vor Staubablagerungen zu schüt¬ zen. Ein Schnappdeckel als Auflage für die Abdeckung sorgt für die nötige Belüftung. Zusätzlich mit Alufolie zum Schutz vor Licht abdecken.
Beobachtung 1 : Ein Fleck einer tropfenförmigen Materialablage¬ rung ist nach der Trocknung deutlich sichtbar (nicht gezeigt) . - Ausbreiten der PEEK-Plättchen mit angetrockneten Azido- funktionalisierter Hyaluronsäuren auf einem Tuch
- Mit Kurzwellen-UV (254 nm) für 100 min im Abstand von ca. 1 cm bestrahlen
Beobachtung 2: Bei beiden SubstratSorten (Hya-Enz-N3; Hya-US- N3) ist eine runde (tropfenförmige) , bräunliche Ablagerung zu sehen, die dunkler erscheint als die Ablagerung nach dem
Trocknungsvorgang (siehe Beobachtung 1) . Die Substrate mit Hy- a-US-N3 sind hierbei etwas dunkler gefärbt als die Substrate mit Hya-Enz-N3.
- PEEK-Substrate mit Hyaluronsäurederivaten nach Trocknung und Belichtung 24 h auf Rütteltisch in MilliQ und 50 mL Falcon- röhrchen waschen
- Gewaschene PEEK-Substrate 24 h in einem Falcon mit perforier¬ ter Parafilm-Abdeckung im Vakuumofen trocknen
Beobachtung 3: Auf den gewaschenen belichteten Hyaluronsäure- derivat-behandelten PEEK-Foliensubstraten ist der Fleck der Materialablagerung noch deutlich zu erkennen. Bei einer analog gewaschenen unbelichteten Folie (Negativprobe) hingegen ist kein Fleck zu erkennen. Es wurde also erfolgreich Material waschbeständig auf dem PEEK-Substrat angekoppelt. Bei Hya-US- N3 mehr als bei Hya-Enz-N3) (nicht gezeigt) .
Es wurden im Anschluss Materialisierungsversuche mit den wie oben beschrieben hergestellten mit Hyaluronsäurederivaten be¬ schichteten PEEK-Substraten durchgeführt.
Mineralisierungslösung :
40,5 g NaCl; 1, 8475 g CaCl2; 0, 735 g Na2HP04; 8, 875 g HCl
(konz.); 500 mL MilliQ Zubereitung: MilliQ-Wasser vorlegen, dann die Salze darin auf¬ lösen und HCl zugeben (in Spritze abgewogen) . In Laborflasche aufbewahren bis zur Benutzung.
Vorgehen :
• Verdünnung der Mineralisierungslösung herstellen, je nach ge¬ wünschtem pH-Bereich
• pH 7 : Mineralisierungslösung zu MilliQ-Wasser im Verhältnis von 2 : 8
• pH 8 : Mineralisierungslösung zu MilliQ-Wasser im Verhältnis von 1 : 9
• pH 9 : Mineralisierungslösung zu MilliQ-Wasser im Verhältnis von 1:18
• Den pH direkt vor der Anwendung mit 1 M Trizma®-Base (Sigma) einstellen, da dies die Lösung "aktiviert" und die Minerali¬ sierung startet.
• Anschließend sofort 25 mL aktivierte Mineralisierungslösung zu den zu mineralisierenden Substraten in 30 mL Schnappde¬ ckelgläser füllen (1 Substrat pro Glas) . Dabei darauf achten, dass beschichtete Seite nach oben zeigt und das Plättchen nicht auf der Lösung schwimmt, sondern vollständig einge¬ taucht ist.
• Raumtemperatur-Proben dann auf Schütteltisch stellen. Proben bei erhöhten Temperaturen (ca. 37 °C) in entsprechendes Was¬ serbad stellen (erhöht, damit eingetaucht aber nicht komplett unter Wasser) .
• Nach gewünschter Zeit Substrate entnehmen, einzeln in 10 mL MilliQ in 15 mL Falcon auf Rütteltisch 30 Minuten waschen und anschließend über Nacht im Vakuumtrockenofen trocknen.
• Anschließend Analyse per Rasterelektronenmikroskopie (REM) für Oberflächenstrukturen, Energie-dispersive Röntgenanalyse (EDX) für Element Zusammensetzung, anschließend Röntgen- Beugung - Röntgendiffraktion (englisch X-ray diffraction, XRD) für Mineralphase (z. T. nicht gezeigt) . Es wurden verschiedene Versuchsansätze durchgeführt (siehe Ta¬ belle 3) . Als Substrat wurde immer PEEK verwendet, als Be- schichtung wurde entweder enzymatisch gespaltene Azido- funkt ionalisierte Hyaluronsaure „Enz" oder mittels Ultraschall gespaltene Azido-funktionalisierte Hyaluronsaure „US" abge¬ bracht, die Inkubation erfolgte entweder bei pH7, pH8 oder pH9 (Verdünnungen siehe oben) , die Kupplung erfolgte bei allen An¬ sätzen mittels UV-Licht. Zudem wurde Mineralisierungsblindpro¬ ben bei allen drei pH-Werten und bei beiden Temperaturen
(RT/37°C) ohne Anwesenheit eines Substrats durchgeführt, die alle keine Mineralisierung zeigten (nicht aufgeführt) .
Tabelle 3: Versuchsansätze der Mineralisierung
P B pH T A E t
IS005 Enz 7 37 dl, 15 : 10 d2, 14 :30 23h, 20min, ld
IS006 Enz 7 37 dl, 15 : 10 d5, 13 :30 118h, 20min, 5d
IS008 Enz 7 RT dl, 15 : 10 d2, 14 :30 23h, 20min, ld
IS009 Enz 7 RT dl, 15 : 10 d5, 13 :30 118h, 20min, 5d
IS019 Enz 8 37 dl, 13 : 45 d2, 14 : 15 24h, 30min, ld
IS020 Enz 8 37 dl, 13 : 45 d5, 12 :40 118h, 55min, 5d
IS022 Enz 8 RT dl, 13 : 45 d2, 14 : 15 24h, 30min, ld
IS023 Enz 8 RT dl, 13 : 45 d5, 12 :40 118h, 55min, 5d
IS033 Enz 9 37 dl, 14 : 05 d2, 13 :20 23h, 15min, ld
IS036 Enz 9 RT dl, 14 : 05 d2, 13 :20 23h, 15min, ld
IS011 US 7 37 dl, 15 : 10 d2, 14 :30 23h, 20min, ld
IS012 US 7 37 dl, 15 : 10 d5, 13 :30 118h, 20min, 5d
IS014 US 7 RT dl, 15 : 10 d2, 14 :30 23h, 20min, ld
IS015 US 7 RT dl, 15 : 10 d5, 13 :30 118h, 20min, 5d
IS025 US 8 37 dl, 13 : 45 d2, 14 : 15 24h, 30min, ld
IS026 US 8 37 dl, 13 : 45 d5, 12 :40 118h, 55min, 5d
IS028 US 8 RT dl, 13 : 45 d2, 14 : 15 24h, 30min, ld
IS029 US 8 RT dl, 13 : 45 d5, 12 :40 118h, 55min, 5d
IS039 US 9 37 dl, 14 : 05 d2, 13 :20 23h, 15min, ld
IS042 US 9 RT dl, 14 : 05 d2, 13 :20 23h, 15min, ld
IS043 US 9 RT dl, 14 : 05 d4, 13 : 00 94h, 55min, 4d Legende: P = Bezeichnung der Probe, B = Beschichtung, pH = pH- Wert, T = Temperatur in [°C] (RT = Raumtemperatur), A = Anfang der Inkubation (d = Tag, XX:YY = Uhrzeit), E = Ende der Inku¬ bation, t = Zeit in Stunden [h] u. Minuten [min], (entspricht X) Tag (en) [d] .
Beobachtungen 4 :
Bei den Proben IS005, 006, 008, 009, 011, 012, 014, 015, 022, 028, 036, 042 und 043 kann bei der REM-Untersuchung der Hyal- uronsäurering bzw. -fleck erkannt werden. Passend hierzu sind Signale in der EDX-Analyse von Kohlenstoff und Sauerstoff. Je¬ doch ist kein(e) waschbeständige (r) Film oder Ablagerung auf der Hyaluronsaurebeschichtung zu erkennen sowie kein Calcium oder Phosphor in der EDX-Analyse zu detektieren, was auf eine Mineralisierung schließen ließe.
Bei den Proben IS019, 020, 023, 025, 026, 029, 033 und 039 hingegen kann ein(e) waschbeständige (r) Film bzw. Ablagerungen in den Bereichen des Hyaluronsäurerings bzw. -flecks gefunden werden. In der EDX-Analyse findet sich neben Kohlenstoff und Sauerstoff auch Calcium und Phosphor, was auf eine Minerali¬ sierung schließen lässt.
Im Anschluss werden die Ergebnisse exemplarisch für die Proben IS019 (enzymatisch gespaltene Hyaluronsäurebeschichtung, pH8, 37°C, 1 Tag Einlegezeit) und IS025 (mittels Ultraschall ge¬ spaltene Hyaluronsäurebeschichtung, pH8, 37°C, 1 Tag Einlege¬ zeit) vorgestellt. In den REM-Analysen sind auf den gesamten Plättchen Ablagerun¬ gen eindeutig sichtbar. Die Ablagerungen sind nicht homogen, sondern unregelmäßig verteilt. Manche Bereiche sind von einer filmartigen Schicht bedeckt, andere Bereiche weisen schwammar¬ tige kugelige Materialansammlungen auf. Bei IS019 ist die Hya- luronsäure-Beschichtung ein Ring (wie bei allen bisherigen Proben mit enzymatisch gespaltener Hyaluronsäure) und nicht vollständig, sondern teilweise bedeckt von dem abgeschiedenen Material. Die Anlagerungen zeigen keine Präferenz auf Hyalur- onsäure-Beschichtung oder PEEK, sondern sie scheinen inhomogen überall gleich verteilt zu sein (nicht gezeigt) . Bei IS025 hingegen ist die Hyaluronsäure-Beschichtung ein ausgefüllter Fleck (wie bei allen bisherigen Proben mit mittels Ultraschall gespaltener Hyaluronsäure) und sehr dicht bedeckt von dem ab¬ geschiedenen Material. Es gibt Anzeichen für eine präferierte Mineralisierung der Hyaluronsäure-Beschichtung und geringere für eine Bedeckung des unbeschichteten PEEK-Bereichs (nicht gezeigt) .
EDX-Analysen der jeweilig schwammartigen kugeligen Ablagerun- gen zeigt eindeutig die Präsenz von Phosphor und Calcium zu¬ sätzlich zu Kohlenstoff und Sauerstoff. Hierbei sind die Pro¬ zentanteile für IS019: Sauerstoff (0) 44,6%, Kohlenstoff (C) 21,8%, Calcium (Ca) 20,5% und Phosphor (P) 13,1% und für
IS025: Sauerstoff (0) 45,2%, Kohlenstoff (C) 40,9%, Calcium (Ca) 9,0% und Phosphor (P) 4,9%. Kohlenstoff wird verursacht durch PEEK, der Hyaluronsäure und dem Kohlenstoff-Klebeband, mit dem die Probe auf dem Probenträger für die Untersuchung geklebt wurde. Calcium, Phosphor und Sauerstoff deuten auf die mögliche Präsenz von Calciumphosphat-Verbindungen hin. Bei ei- nem durchgeführten Mapping ergibt sich folgendes (nicht ge¬ zeigt) : Die Calcium- und Phosphor-Signalverteilung stimmt mit den kugeligen Materialablagerungen überein. Kohlenstoff findet sich vor allem dort, wo das Substrat bzw. die Hyaluronsäurebe- schichtung nicht von dem kugeligen Material bedeckt ist. Sau- erstoff ist relativ regelmäßig verteilt, aber besonders dort, wo das kugelige Material abgelagert wurde (außerdem stärker dort, wo die Hyaluronsäureschicht ist, da diese mehr Sauer¬ stoff enthält als PEEK) . Erste Messungen einer XRD-Analyse der IS0019 Probe deuten auf Calcium-Metaphosphate hin. Signal der Beschichtung ist aller¬ dings nur sehr schlecht auslesbar, da PEEK polykristallin ist und damit sehr starke, scharfe Signale gibt, die alles andere überlagern zudem ist die Hyaluronsäure ebenso kaum sichtbar. Demnach wurden Teile der weißen Ablagerung abgekratzt, um ein¬ zeln gemessen werden zu können also ohne Substrat-Signale. Das Pulver-Röntgendiffraktogramm der abgekratzten Ablagerung ist in FIG. 1 gezeigt (gestrichelter Graph) . Zudem wurde das Sig- nal von Hydroxylapat it (R060180 aus RRUFF Datenbank) in das Diagramm aufgenommen (schwarzer Graph) . Es zeigt sich, dass zwischen dem Signal der Probe IS019 und dem Literatursignal des Hydroxylapat its eine hohe Übereinstimmung besteht. Somit kann davon ausgegangen werden, dass bei der Mineralisierung Hydroxylapat it auf der Hyaluronsäurebeschichtung auf PEEK ent¬ steht .
Man kann folgende Schlüsse aus den Versuchen ziehen:
Bezüglich des Einflusses des pH-Wert scheint der generelle Trend zu sein, dass eine schnellere Ablagerung auf den Subs¬ traten auftritt, je höher der pH-Wert der Mineralisierungslö¬ sung ist. Der optische Eindruck bestätigt dies gegenwärtig bei allen bisher beobachteten Mineralisierungsversuchen von pH7 bis pH9.
Eine höhere Temperatur (hier: 37 °C im Wasserbad) im Vergleich zur Raumtemperatur (ca. 21 °C) scheint das Abscheiden von Mate¬ rial auf den Substraten zu begünstigen. Dies konnte bei allen bisherigen Mineralisierungsversuchen mit bloßem Auge beobach- tet werden.
Außerdem scheinen die abgelagerten Materialien bei RT eher grob zu sein, während eine Temperatur von 37 °C die Bildung feiner Ablagerungen zu fördern scheint. Beispiel: Bei erhöhten Temperaturen waren bei pH8 (bspw. IS019 und IS025) und pH9 (bspw. IS033 und IS039) bereits nach einem Tag deutliche Ablagerungen zu sehen, während bei RT (IS022, IS036, IS028, IS042) nach einem Tag unter diesen Konditionen nichts bis kaum etwas abgelagert wurde.
Eine längere Einlegezeit sollte die Menge des abgeschiedenen Materials erhöhen bzw. bei sehr langsamer Abscheidung über¬ haupt eine Ablagerung ermöglichen. Entgegen dieser Erwartung wurden die größten Ablagerungsmengen bei den Proben mit einer Einlegezeit von 24 h beobachtet. Es kann sein, dass bei länge¬ rer Einlegezeit Umwandlungsvorgänge oder Diffusionsprozesse stattfinden, die die sichtbaren Ablagerungen verringern im Vergleich zu Proben mit kürzeren Einlegezeiten . Tiefenanalysen könnten nähere Informationen der Elementverteilung im minera- lisierten Substrat liefern.
Eine gleichmäßige Beschichtung scheint bisher am besten mit der mittels Ultraschall-gespaltenen Hyaluronsäurelösung mög- lieh zu sein, da diese einen ausgefüllten Material-Fleck auf dem PEEK-Substrat bildet. Bei IS025 und IS026 scheint auf die¬ ser Beschichtung eine präferierte Materialablagerung stattzu¬ finden. Enzymatisch gespaltene Hyaluronsäure scheint nur einen Ring aus Beschichtungsmaterial auf dem Substrat zurückzulassen und weist keine präferierten Materialablagerungsbereiche auf, außer eine leichte bei der Probe IS020.
Zusammenfassung
Es wurde an der Oberflächenfunkt ionalisierung des Knochenim- plantatkunst Stoffs Polyetheretherketon gearbeitet, um einen besseren Einbau in das behandelte Knochenareal zu ermöglichen. Es wurden Polyetheretherketon-Oberflächen erfolgreich mit ver¬ schiedenen Methoden chemisch modifiziert. Dabei wurden die Oberflächeneigenschaften mit Hilfe kleiner Moleküle verändert und Hydroxyl-, Carboxyl- und Iminfunkt ionalitäten auf der Oberfläche erhalten. Die modifizierte Oberfläche wurde mittels ATR-IR-Spektroskopie analysiert und charakterisiert (nicht ge¬ zeigt) . Des Weiteren wurden auf der Polyetheretherketon- Oberfläche mittels UV-induzierter grafting-Polymerisation funktionelle Polymere, wie Polyacrylsäure, aber auch Polyme- thylacrylat (PMA) , abgeschieden. Die Polyacrylsäureschicht wurde mit unterschiedlichen Oberflächen-Analytikmethoden, wie ATR-Infrarotspektroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und Konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie untersucht, um spektro¬ skopische Informationen über die Oberfläche zu bekommen und um ein genaues Bild von deren Topographie zu erhalten (nicht ge¬ zeigt) . Es wurde die Polyacrylsäure-Schicht durch die Ankupp- lung von Diaminlinkern modifiziert, damit später mit organi¬ schen Säuren Amidbindungen ausgebildet werden können. Um quan¬ titative Aussagen über den Grad der Oberflächenfunktionalisie- rung mit Aminogruppen treffen zu können, wurde der spaltbare Fluoreszenzfarbstoff C-Cumarin synthetisiert mit dem sich die zugänglichen Aminogruppen auf der Oberfläche indirekt quanti¬ fizierten ließen. Die Quantifizierung gelang bei den Proben, die direkt mit Diaminen iminfunktionalisiert wurden.
Es wurde Hyaluronsäure mit Adipinsäuredihydrazid und Hexame- thylendiamin und Alginsäure nur mit dem Diamin modifiziert um Amin-Linker für spätere Verankerungen an den verschiedenen Po- lyetheretherketon-Substraten anzukuppeln. Ebenso wurde Hyalur¬ onsäure deacetyliert , um auf diese Weise Aminfunktionalitäten am Polysaccharid einzuführen. Die modifizierten Polysaccharide wurden mittels NMR- und ATR-infrarot-spektroskopischen Metho¬ den charakterisiert (nicht gezeigt) .
Es wurden die zahlreichen modifizierten und nichtmodifizierten Polysaccharide an die komplementären PEEK-Substrate gekuppelt. Die gekuppelten Proben wurden mittels ATR-Infrarot¬ spektroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und teils mit Ther- mogravimetrie untersucht (nicht gezeigt) . In der vorliegenden Erfindung wurden als photokoppelbare oder lichtinduzierbare Linker Azidoanilingruppen an die Carboxy- Gruppen von Polysacchariden, wie beispielsweise Algin- oder Hyaluronsäure, gekoppelt und diese dann mit Licht an eine PEEK- Oberflächen gebunden. Es konnte erfolgreich eine Be- schichtung des Polyetheretherketons mit Azido- funktionalisierter Hyaluronsäure gezeigt werden. Ferner konn¬ ten deutliche Hinweise gefunden werden, dass eine Mineralisie¬ rung der mit Hyaluronsäurederivaten gekoppelten PEEK- Oberfläche erfolgt.
Ausblick
Da die oberflächeninduzierte radikalische Polymerisation sehr erfolgreich war, ergeben sich besonders in diesem Bereich ei- nige Ansätze auf denen man weitere Arbeiten aufbauen könnte.
Da sich die Einführung von Polysaccharidstrukturen auf der Po- lyetheretherketon-Oberfläche nicht als trivial erwies, die Po¬ lymerisation mit Acrylsäure aber sehr gut funktionierte, wäre es ein vielversprechender Ansatz die PEEK-Oberfläche direkt mit Polymeren aus modifizierten Acrylsäurederivaten zu be¬ schichten. Als alternative Monomereinheiten auf Acrylsäure- Basis kämen beispielsweise mit Zuckermolekülen modifizierte Acrylsäurederivate in Betracht, für die bekannt ist, dass sie bei der Zelladhäsion von Osteoblasten eine wichtige Rolle spielen. Ebenso wäre es interessant wenn die Monomereinheiten Oligosaccharide der Hyaluronsäure, oder auch kurze haftvermit¬ telnde RGD-Peptidsequenzen, etc. tragen würden:
R = Zuckermoleküle /
Polysaccharide /
Peptide
Eine sehr empfindliche Oberflächenanalytikmethode ist die Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS, eng. X-Ray Photo- electron Spectroscopy) . Auf diese Weise ließen sich eventuell doch Polysaccharide auf den Oberflächen der hergestellten Sub strate nachweisen. Die Untersuchung des Quellverhaltens der Polyacrylsaurelayer auf dem Polyetheretherketon-Substrat könnte ein Ansatz sein, die Kupplungsbedingungen zu optimieren, sodass auch mit einfa- chen Analytikmethoden Polysaccharidnachweise gelingen würden. Kupplungen in nicht wässrigen Medien wären auch denkbar, sind jedoch wegen der schlechten Löslichkeit der Polysaccharide mit Sicherheit ebenfalls problematisch. Weitere Versuche Hydroxylapat it in der Polyacrylsäureschicht abzuscheiden sollten ebenfalls unternommen werden, da die Hyd¬ roxylapat it-Beschichtung erwiesenermaßen positive Auswirkungen auf die Akzeptanz im Organismus haben.

Claims

Patentansprüche
Material für ein Knochenimplantat, umfassend:
(a) eine Trägerstruktur mit einer Oberfläche, die zumindest ein biokompatibles Material umfasst,
(b) eine kovalent an diese Oberfläche gebundene Mat¬ rix und
(c) in diese Matrix eingelagertes Calciumphosphat , dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix zumindest ein
Polysaccharid aufweist.
2. Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
das Polysaccharid ein pflanzliches Polysaccharid oder tie risches Polysaccharid ist.
3. Material nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ge¬ kennzeichnet, dass
das Polysaccharid ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Alginsäure, Alginat, Hyaluronsäure, Hyaluronat, Pektin,
Carrageenan, Agarose, Amylose, Chitosan, ein Glykosoamino- glycan (Heparin/Heparansulfat , Chondroitinsul- fat/Dermatansulfat , Keratansulfat ) , eine Hemicellulose (Xylane, Mannane nach Carboxyfunktionalisierung) , Xanthan, Gellan, Fucogalactan und Welan Gum.
4. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
das Polysaccharid ein chemisch modifiziertes Polysaccharid ist .
5. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
das biokompatible Material ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem oxidischen Keramikmaterial, einem Poly mermaterial, einem Kompositmaterial und Titan.
6. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
das biokompatible Material Polyetheretherketon (PEEK) ist.
7. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
das Polysaccharid über einen Linker an das biokompatible Material gebunden ist, wobei der Linker ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus einem Diamin-Linker, einem Dia- min und Bernsteinsäure-Linker, einem Polyacrylsäure-Linker und einem photokoppelbaren Linker, insbesondere einem Azidoanilin-Linker .
8. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
(a) das biokompatibles Material PEEK ist,
(b) das Polysaccharid Alginsäure ist und
(c) das in diese Matrix eingelagerte Calciumphosphat Hyd roxylapatit, insbesondere kristallines Hydroxylapatit ist.
9. Material nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
die Matrix die gesamte Oberfläche der Trägerstruktur be¬ deckt .
10. Verfahren zur Herstellung eines Materials für ein Knochenimplantat, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Trägerstruktur mit einer Oberfläche, umfassend ein biokompatibles Material,
(b) kovalentes Ankoppeln einer Matrix, umfassend zu mindest ein Polysaccharid, an diese Oberfläche, und (c) Mineralisieren der Matrix mit Calciumphosphat .
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass
der Schritt (b) die folgenden Schritte in beliebiger Rei¬ henfolge umfasst:
(bl) kovalentes Ankoppeln eines Linkermoleküls, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Diamin-Linker oder ei¬ nem Diamin Linker und einem Bernsteinsäure-Linker oder UV- gegrafteter Polyacrylsäure oder einem photokoppelbaren Lin¬ ker, insbesondere einem Azidoanilin-Linker, an die akti¬ vierte Oberfläche, und
(b2) kovalentes Ankoppeln des Polysaccharids mit Carbon¬ säuregruppen an das Diamin Linkermolekül oder des Hexame- thylendiamin modifizierten Polysaccharids an den Bernstein¬ säure Linker oder des unmodifizierten Polysaccharids über Esterbindungen an den Polyacrysäure-Linker oder an den pho¬ tokoppelbaren Linker, insbesondere den Azidoanilin-Linker.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass
das kovalente Ankoppeln des photokoppelbaren Linkers, ins¬ besondere des Azidoanilin-Linkers, an die aktivierte Ober¬ fläche bei einer Wellenlänge mit einem Bereich von 200 nm bis 400 nm, bevorzugt mit einem Bereich von 200 nm bis 300 nm, besonders bevorzugt mit einem Bereich von 240 nm bis 260 nm und insbesondere bevorzugt bei einer Wellenlängevon 254 nm erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass
das kovalente Ankoppeln des carboxyfunkt ionalisierten Poly¬ saccharids mittels einer Amin- und Carboxygruppenkupplung an den photokoppelbaren Linker, insbesondere an den Azido- anilin-Linker , erfolgt.
14. Knochenimplantat auf das ein Knochenimplantatmaterial nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 9 aufgebracht ist.
15. Verwendung des Materials nach zumindest einem der An¬ sprüche 1 bis 9 als Knochenimplantatmaterial.
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