ITMI20080289A1 - Composizioni di gemifloxacina con elevata efficacia su patologie oculari - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:

COMPOSIZIONI DI GEMIFLOXACINA CON ELEVATA EFFICACIA SU PATOLOGIE OCULARI

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda nuove composizioni farmaceutiche per un trattamento mirato delle malattie infettive oculari, in particolare di quelle che coinvolgono la superficie oculare con i suoi annessi, e i distretti interni dell’occhio.

STATO DELLA TECNICA

Le infezioni oftalmiche sono generalmente trattate con composizioni topiche (come colliri o pomate oftalmiche) a base di antimicrobici, che, somministrate direttamente a livello oculare, consentono di raggiungere concentrazioni efficaci del principio attivo nei tessuti interessati con un basso assorbimento sistemico e quindi con una scarsa incidenza di effetti indesiderati a livello sistemico. In particolare, vengono spesso utilizzati antibiotici a largo spettro d’azione, allo scopo di evitare conseguenze compromettenti per la vista che possono derivare da infezioni oftalmiche non trattate in modo rapido ed adeguato. La scelta del principio attivo è effettuata sulla base del quadro clinico del paziente e dei dati epidemiologici descritti in bibliografia in relazione ai ceppi batterici maggiormente rappresentativi dei patogeni oculari.

Studi epidemiologici confermano che circa il 90% delle congiuntiviti e delle cheratiti è causato da Gram+, fra cui i più diffusi sono S. aureus e S. epidermidis (Everett SL e altri, Cornea 1995, (14) 382-387; Starr CE e altri, Invest Ophthalmol Vis Sci 2000, (41), S149) e CNS, stafilococchi coagulasi-negativi (Ly CNe altri, Clin Experiment Ophthalmol, 2006, 34 (1) 44-50). I Gram+ sono anche responsabili per circa il 92-97% delle endoftalmiti (Recchia FM, ,e altri, Arch. Ophthalmol, 2005, 123 (3): 341-346).

Fra i Gram-, particolare importanza ricopre, oltre H. Influenzae, P. aeruginosa (Chalita M.R.e altri, American Journal of Ophthalmology, 2004, 137 (1), 43-51).

Recenti linee guida sulla terapia antibiotica pre- e post-chirurgica sono state emanate dal Medicare National Surgical Infection Prevention Project proprio allo scopo di prevenire il rischio di insorgenza di cheratiti 0 endoftalmiti correlate a interventi chirurgici a livello oculare, come interventi di rimozione della cataratta o di chirurgia refrattiva (Bratzler DW ed altri Clin Infect. Dis. 2004, 38: 1706-1715,).

1 “chinoioni’’ sono sostanze antibatteriche sviluppate a partire dalla struttura di chinoioni classici quali gli acidi nalidissico, piromidico, pipemidico. Le varie modifiche strutturali apportate ai chinoioni di prima generazione hanno dato luogo a diverse generazioni di chinoioni - ad oggi 4 - in cui la generazione successiva è stata di volta in volta sintetizzata per aggiunta di sostituenti in posizioni chiave sul nucleo base della molecola, allo scopo di ampliarne lo spettro d’azione, migliorarne l’efficacia e/o la farmacocinetica, superare le resistenze batteriche. I “fluorochinoloni”, caratterizzati dalla fluorurazione in posizione 7 dell’anello chinoionico, presentano un’attività antibatterica più intensa ed a più ampio spettro rispetto ai chinoioni di precedente generazione. I fluorochinoloni possiedono un’ottima biodisponibilità per via orale e parenterale, la cinetica è ottima con una efficace penetrazione endocellulare ed una buona distribuzione tissutale. La Gemifloxacina è un fluorochinolone di ultima generazione usato nel trattamento delle infezioni respiratorie quali la polmonite acquisita e l'esacerbazione acuta della bronchite cronica. Questo antibiotico mostra infatti una buona attività contro lo Streptococcus pneumoniae e contro i patogeni respiratori Gram - ( Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis) ed i patogeni atipici come Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila e Mycoplasma pneumoniae.

Come altri fluorochinoloni di ultima generazione (moxifloxacina, gatifloxacina), gemifloxacina è dotata di un duplice meccanismo d’azione (inibizione delle topoisomerasi II e IV - rispettivamente “girasi” e “polisomerasi”) che rende difficile l’insorgenza di resistenze da parte dei miscroorganismi, nei quali devono manifestarsi contemporaneamente due mutazioni genetiche perché essi possano contrastare l’effetto dell’antibiotico.

I fluorochinoloni sono antibiotici a largo spettro d’azione che trovano recente applicazione anche in ambito oftalmico. L’uso topico oftalmico di fluorochinoloni è però generalmente associato a tossicità per i tessuti oculari in modo direttamente proporzionale alla concentrazione utilizzata in clinica (in genere 0.3%-0.5%). Tale tossicità si manifesta in termini di opacizzazione corneale, ritardo della cicatrizzazione e della riepitelizzazione corneale, tossicità retinica, ecc.. I fluorochinoloni sono principi attivi abbastanza solubili nei solventi acquosi, cui conferiscono un pH moderatamente acido (4-5): tali valori di acidità, sebbene ripristinabili ai valori fisiologici dal fluido lacrimale, rendono i prodotti poco tollerati a livello oculare. Per questi motivi sarebbe auspicabile aggiungere alle soluzioni di fluorochinoloni sistemi tamponi a pH fisiologico o vicini ad esso, ma sebbene l’aumento di pH migliori la tollerabilità del prodotto, spesso determina al tempo stesso un abbassamento della solubilità del principio attivo, comportando 1) il rischio di una sua parziale precipitazione sulla superficie corneale dopo somministrazione - che riduce la biodisponibilità del farmaco e al contempo disturba la visione a causa della formazione di una patina opalescente sulla superficie della cornea - 2) precipitazione e degradazione del principio attivo nella composizione formulata, che riducono la “shelf life” del prodotto. Si è quindi cercato di incrementare la solubilità dei fluorochinoloni e la stabilità delle formulazioni oftalmiche che li contengono ad es. mediante complessazione del principio attivo con ciclodestrine o con agenti complessati di natura proteica. Queste tecniche comportano tuttavia l’uso di sostanze complessanti addizionali e l'esecuzione di reazioni di complessazione con il farmaco che aumentano in modo non desiderabile la complessità ed il costo delle composizioni oftalmiche risultanti.

E’ noto infine che molte infezioni oculari, in particolare quelle in fase precoce e/o derivanti da lesioni localizzate, si concentrano a livello di specifici distretti oculari.

Alla luce delle attuali conoscenze resta quindi sentita la necessità di nuove composizioni oftalmiche di fluorochinoloni dotate 1) di una capacità di accumulo del principio attivo preferenziale nelle aree in cui è localizzata l’infezione, così da massimizzare l’effetto antibiotico nel sito, consentendo di ridurre la dose di principio attivo somministrata al paziente e di conseguenza la tossicità oculare e sistemica del prodotto, 2) di elevata efficacia e stabilità, con un procedimento di preparazione semplice e a basso costo.

SOMMARIO

Sono state ora identificate nuove composizioni antibiotiche capaci di determinare un accumulo selettivo del principio attivo in specifici distretti oculari, così da concentrare l’effetto in tali zone, riducendo quanto più possibile la dose somministrata e quindi la tossicità del prodotto, migliorandone al contempo la tollerabilità oculare. Tali composizioni sono caratterizzate dal contenere gemifloxacina e un componente polimerico scelto tra: polietilenglicole, polipropilenglicole, polivinilpirrolidone, un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole, miscele di polietileneglicole con acidi grassi polietossilati (qui indicate come “miscele PEG/acidi grassi polietossilati”), cellulose o carbomeri. Le composizioni possono comprendere inoltre eventuali agenti tamponanti, isotonizzanti e conservanti. Le composizioni oftalmiche così ottenute mostrano una sorprendente elevata selettività d’azione verso specifici compartimenti oculari determinata dal polimero utilizzato, che definisce, una particolare distribuzione (penetrazione ed accumulo) del principio attivo nei tessuti oculari superficiali o nei distretti interni dell’occhio. Tali composizioni permettono quindi di effettuare, con elevata efficacia ed ampio margine di sicurezza, una terapia antibiotica mirata, atta a prevenire o curare infezioni batteriche in tali distretti oculari.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1a: Accumulo di gemifloxacina in cornea dopo trattamento con differenti composizioni di gemifloxacina a diversi regimi posologici Figura 1b: Accumulo di gemifloxacina in umor acqueo dopo trattamento con differenti composizioni di gemifloxacina a diversi regimi posologici Figura 1c: Curva spettrofluorimetrica standard di gemifloxacina Figura 2: Riduzione della carica batterica dopo trattamento con differenti composizioni di gemifloxacina a diversi regimi posologici in un modello di cheratite

DESCRIZIONE DETTAGLIATA

Costituiscono oggetto dell’invenzione composizioni farmaceutiche per uso oftalmico comprendenti, in un opportuno solvente, gemifloxacina, un componente polimerico scelto tra: polietilenglicole, polipropilenglicole, polivinilpirrolidone, un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole, miscele di polietileneglicole con acidi grassi polietossilati, cellulose e carbomeri, ed eventuali agenti tamponanti, isotonizzanti e conservanti.

La gemifloxacina viene utilizzata come base o, preferibilmente, in forma di derivato farmaceuticamente accettabile, ad es. mesilato. La sua concentrazione nella composizione dipende dal tipo e dalla gravità della condizione da trattare, oltre che dal sito in cui è localizzata infezione: a titolo indicativo, può essere compresa tra lo 0.01% ed il 0.5% p/v, preferibilmente tra 0.05% e 0.3%, più preferibilmente tra 0.1% e 0.2%, ad es. 0.15%. Il riscontrato aumento di penetrazione ed accumulo del principio attivo a livello dei tessuti superficiali o interni dell’occhio determinato in modo distintivo dai polimeri utilizzati nelle composizioni oggetto dell’invenzione e il conseguente aumento di efficacia in tali distretti consente di somministrare dosi di gemifloxacina significativamente più basse rispetto a quelle generalmente utilizzate nella clinica oftalmica per i fluorochinoloni. A titolo non limitativo, la quantità di gemifloxacina per singola somministrazione è compresa tra 5 e 250 pg, preferibilmente tra 25 e 150 pg, più preferibilmente tra 50 e 100 pg. L’invenzione include quindi composizioni oftalmiche come sopra definite, caratterizzate dall’essere adatte a somministrare tali dosi di principio attivo. Le composizioni possono essere fornite al paziente con confezionamento monodose o multidose. I polimeri indicati possono essere utilizzati nei vari pesi molecolari disponibili commercialmente e in differenti concentrazioni, consentendo così di ottenere composizioni a viscosità differente, opportunamente scelte secondo criteri in sé noti, in relazione alla modalità di somministrazione preferita. In particolare, il polietilene (PEG), può essere presente nella miscela nei suoi diversi gradi di peso molecolare (ad es. da 300 a 10.000). Un esempio preferito è il Macrogol® 400, con poso molecolare compreso nell’Intervallo 380-420. Il polipropilenglicole (PPG) è utilizzabile con peso molecolare compreso fra 600 e 4.000 11 polivinìlpirrolidone (Kollidon®, o povidone o PVP, non reticolato) può essere utilizzato nei suoi diversi intervalli di peso molecolare, in particolare tra 2.000 e 2.000.000. Esempi di PVP commercialmente disponibili sono Kollidon 12 PF, Kollidon 17 PT, Kollidon 25, Kollidon 30 e Kollidon 90 F (peso molecolare medio Mv compreso tra 1.000.000 e 1.500.000 ), quest’ultimo particolarmente preferito ai fini dell’invenzione. Il PVP è presente nelle composizioni in un intervallo di concentrazione preferibilmente compreso tra 1 e 10% p/v, più preferibilmente tra 2 e 5%, ad es. 3.5%.

I copolimeri a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole sono commercialmente disponibili in vari gradi di peso molecolare (es. Poloxamer®, Pluronic®, Lutrol®),. Particolarmente preferito è il Lutrol F-127, con peso molecolare compreso tra 9.840 e 14.600. Questi copolimeri sono presenti in quantità preferibilmente compresa tra 2 e 20% p/v, più preferibilmente tra 5 e 15%, ad es. 10%.

La miscela PEG/acidi grassi polietossilati è presente in quantità preferibilmente compresa tra 2 e 20% p/v, più preferibilmente tra 5 e 15%, ad es. 12%. Tale miscela è composta da PEG:acidi grassi polietossilati in proporzioni in peso preferibilmente comprese tra 1:2 e 1:20, più preferibilmente tra 1:3 e 1:7, ad es. 1:5. Un esempio preferito di acidi grassi polietossilati è il Cremophor® RH40 (olio di ricino polietossilato o poliossietilengliceroltriidrossistearato). Il PEG contenuto nella miscela può essere presente nei suoi diversi gradi di peso molecolare, ad es. da 300 a 10.000 . Un esempio preferito è il Macrogol® 400, con peso molecolare compreso nell’intervallo 380-420. È possibile anche utilizzare diversi tipi di cellulose, come: idrossipropilcellulosa (HPC, Klucel®) nell’intervallo di peso molecolare compreso fra 80.000 e 1.150.000, idrossipropilmetilcellulosa (HPMC, Methocel®), nell’intervallo di peso molecolare compreso fra 10.000 e 1.500.000, idrossietilcellulosa (HEC, Natrosol®) nell’intervallo di viscosità apparente (misurata a 20°C e relativa ad una soluzione al 2%) compreso fra 25 e 6.500 mPa x s, carbossimetilcellulosa (CMC, Akuceli®) nell'intervallo di peso molecolare compreso fra 90.000 e 700.000. Le cellulose possono essere utilizzate nell’intervallo di concentrazioni compreso tra 1% e 5%, preferibilmente al 2%.

Altri polimeri utilizzabili sono i carbomeri (acidi poliacrilici, Carbopol®, Carbomer) nell’intervallo di viscosità apparente compreso tra 300 e 115.000 mPa x s, a concentrazioni comprese tra 0,05% e 0,3%, preferibilmente allo 0,1%.

L’agente tamponante può essere scelto tra quelli noti nel settore oftalmico, ad es. tamponi fosfato, fosfato-citrato, Tris, NaOH, istidina, tricina, lisina, glieina, serina eventualmente aggiustati al corretto pH con una componente acida; è presente in concentrazione tale da ottenere/mantenere un pH compreso tra 5 e 8, compatibile con i tessuti oculari.

L’agente isotonizzante può essere scelto tra quelli noti, ad es. cloruro sodico o acido citrico, glicerolo, sorbitolo, mannitolo, glicole etilenico, glicole propilenico, destrosio; è presente in un intervallo di concentrazione ad es. tra 0 e 1% p/v, tale da ottenere l’isotonia della composizione con il liquido lacrimale (270-310 mOsm/Kg).

I suddetti agenti tamponanti ed isotonizzanti, seppur utili e preferiti, non sono indispensabili al fine della presente invenzione.

Le composizioni oggetto dell’invenzione formulate in multidose possono contenere anche conservanti antimicrobici quali ad es.: parabens, sali d’ammonio quaternari, poliesametilenebiguanide (PHMB) ed altri eventualmente compresi fra quelli utilizzabili nelle composizioni per uso oftalmico. Il solvente utilizzato nelle composizioni è preferibilmente acqua o una soluzione acquosa di uno o più componenti compatibili con l’uso topico oftalmico.

Ulteriori principi attivi, in particolare antinfiammatori e/o altri antimicrobici che possano ampliare lo spettro d’azione della gemifloxacina possono egualmente essere presenti nelle composizioni, in associazione con la gemifloxacina. Detti antinfiammatori possono essere scelti fra corticosteroidi, antinfiammatori non steroidei (FANS), inibitori selettivi della COX-2 e molecole che, pur non rientrando in queste categorie, agiscono con un meccanismo d’azione: 1) antinfiammatorio, in quanto interferiscono con i mediatori deH’infiammazione quali ad es.: istamina, eicosanoidi (prostanoidi, leucotrieni), PAF (fattore attivante le piastrine), bradichinina, ossido nitrico, neuropeptidi (neurochinina A, sostanza P, peptide generato dalla calcitonina - CGRP) e citochine (interleuchine, chemochine, interferoni, fattori di crescita - GF, fattori di necrosi tumorale -TNF, fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF) o granulociti (G-CSF); 2) immunosoppressore: metotrexato, mesalazina e derivati (sulfasalazina, balsalazina,...), ciclosporina, azatioprina, Iefiunomide, tacrolimus e analoghi (pimecrolimus, sirolimus, gusperimus, everolimus), mofetil micofenolato, talidomide, lenalidomide.

Fra gli antimicrobici che possono essere compresi nelle composizioni oggetto dell’invenzione riportiamo a titolo d’esempio: betalattamine (penicilline, cefalosporine), macrolidi e polipeptidi naturali e loro frammenti ad azione antibatterica. Questi ultimi comprendono ad es.: lisozima, lattoferrina, melanocortine, trombocidine e altri peptidi antimicrobici che si possono dividere per composizione e per struttura secondaria in tre gruppi principali: 1) peptidi contenenti cisteine: a) peptidi contenenti più ponti disolfuro che adottano una struttura a foglietto b antiparallelo (defensine, tachiplesine); b) peptidi con struttura a loop contenenti un solo ponte disolfuro (bactenecine, brevinine, esculentine); 2) peptidi che contengono un’alta percentuale di aminoacidi specifici (PR-39, apidecina ed i peptidi bovini ricchi in prolina e arginine Bac5 e Bac7); 3) peptidi lineari che si strutturano ad α-elica in ambiente idrofobico e che assumono struttura random in soluzione; questo è il gruppo più numeroso e più a fondo studiato, a cui appartengono la maggior parte dei peptidi antimicrobici "classici" e di cui si conoscono moltissimi esempi (cecropine, melittina, magainine, dermaseptine, temporine, bombinine).

Nella sua accezione generale, il procedimento per la preparazione delle composizioni qui descritte comprende il mescolamento, in un opportuno solvente, di gemifloxacina e del componente polimerico. Tale procedimento costituisce un ulteriore aspetto dell’invenzione. A titolo d’esempio non limitativo si riportano i seguenti metodi di preparazione: 1).Si preparano, sotto agitazione a temperatura generalmente compresa tra 2°C e 50°C, due soluzioni separate: la prima contenente il componente polimerico ed una parte degli eventuali agenti tampone ed isotonizzanti o altri eccipienti; la seconda contenente la gemifloxacina ed eventuali altri principi attivi e la rimanente parte di agenti tampone ed isotonizzanti. Le due soluzioni vengono quindi mescolate tra loro sotto agitazione, ottenendo la composizione finale. Tale procedura è preferita nel caso in cui il componente polimerico utilizzato è il polivinilpirrolidone o un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole.

2) Si mescola la gemifloxacina e gli altri eventuali principi attivi a parte con il componente polimerico e la miscela risultante viene aggiunta sotto agitazione ad una soluzione dei rimanenti ingredienti a temperatura generalmente compresa tra 2°C e 50°C. Tale procedura è preferita nel caso in cui il componente polimerico è una miscela PEG/acidi grassi polietossilati.

Le composizioni ottenute vengono quindi sottoposte a tecniche di sterilizzazione opportunamente scelte sulla base del polimero utilizzato, della viscosità del prodotto finito e delle caratteristiche chimico-fisiche del/dei principi attivi utilizzati.

Ai fini della somministrazione, le suddette composizioni vengono realizzate preferibilmente come soluzioni per uso oftalmico (colliri, lavaggi oculari, ecc.). L’invenzione include tuttavia anche la realizzazione e l’impiego di forme oftalmiche alternative, ad es. sistemi semisolidi o solidi quali ad es. gel oculari, inserti medicati, lenti a contatto contenenti in superficie o in massa la gemifloxacina veicolata con i suddetti polimeri. Tali forme alternative sono realizzabili con le composizioni qui descritte, variando opportunamente il peso molecolare/la concentrazione del componente polimerico (e quindi la viscosità della composizione) ed eventualmente aggiungendo componenti addizionali. I metodi per la realizzazione di tali forme alternative sono di per sé noti nel settore. Le presenti composizioni sono dotate di elevata efficacia antibatterica, determinata dalla capacità di penetrazione ed accumulo in specifici compartimenti dell’occhio, in particolare a livello dei tessuti superficiali o dei distretti interni dell’occhio, dipendente dal polimero utilizzato. Esse permettono quindi un trattamento oftalmico antibatterico altamente mirato ed efficace, utile in particolare per quelle condizioni del paziente (malattie e/o sottomissione ad interventi chirurgici) che richiedono il trattamento di specifiche aree oculari. Costituisce quindi ulteriore oggetto dell’invenzione l’uso delle composizioni come sopra definite nella preparazione di un medicamento per il trattamento o la prevenzione delle infezioni oculari, in particolare della superficie oculare e dei distretti interni dell’occhio. L’invenzione include anche l’uso delle composizioni descritte per il trattamento e la prevenzione delle infezioni oculari, in particolare della superficie oculare e dei distretti interni dell’occhio, comprendente la somministrazione, ad un paziente che ne necessita, di una quantità terapeuticamente efficace delle composizioni come sopra definite. Detto uso comprende sia il trattamento curativo che quello di profilassi e di copertura antibiotica postchirurgica. Le composizioni oggetto dell’invenzione possono infatti essere utilizzate anche in caso di interventi di chirurgia a livello oculare (ad esempio chirurgica refrattiva, della cataratta o di vitrectomie), allo scopo di prevenire l’insorgenza di cheratiti o endoftalmiti, rare ma serie complicanze associate alla chirurgia oftalmica. Tra le condizioni della superficie oculare efficacemente trattate ai fini dell’invenzione si possono citare: congiuntivite, blefarite, blefarocongiuntivite, cheratite puntata, cheratocongiuntivite, profilassi chirurgica; le composizioni preferite per questi trattamenti sono, a solo titolo d’esempio, quelle contenenti un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole.

Tra le infezioni che coinvolgono i distretti interni dell’occhio si possono citare: uveite infettiva, cheratite stromale, infezioni conseguenti a trauma profondo, ulcere corneali ed il trattamento post-chirurgico invasivo (es. trapianto corneale); le composizioni preferite per questi trattamenti sono, a solo titolo d’esempio, quelle contenenti una miscela PEG/acidi grassi polietossilati.

Le composizioni dell’invenzione presentano inoltre una particolare efficacia nel trattamento delle cheratiti (infezioni tradizionalmente difficili da risolvere se non con trattamenti antibiotici intensivi a base di farmaci di prima scelta come cefalosporine o aminoglicosidi in formulazioni “fortificate”, cioè ad alta concentrazione in principio attivo, ma correlati ad alta tossicità locale) - rispetto ad una soluzione acquosa di gemifloxacina di pari concentrazione (0.3%), al punto che è addirittura possibile dimezzare il regime posologico (7 somministrazioni al giorno versus le 14 della soluzione, Fig. 2) mantenendo l’efficacia antibatterica. In tutte le suddette condizioni, il trattamento con gemifloxacina è da intendersi diretto a combattere la componente infettiva che le caratterizza.

Lo spettro di attività antibatterica delle composizioni oggetto dell’invenzione è quello di per sé noto per la gemifloxacina. Esso comprende ad es. Streptococcus pneumoniae, patogeni respiratori Gram - (Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis), patogeni atipici come Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, e Mycoplasma pneumoniae ed altre specie quali Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, ecc.

Si ritiene che l’efficacia delle composizioni qui descritte non sia spiegabile esclusivamente con la solubilizzazione del principio attivo conseguente all’interazione farmaco/componente polimerico o con la viscosizzazione della composizione: in tale ipotesi infatti, non si sarebbe osservata una differente capacità di accumulo del principio attivo nei diversi compartimenti oculari considerati fra le diverse composizioni. Si è invece sorprendentemente osservato che il principio attivo penetra e si accumula nei diversi compartimenti oculari in modo caratteristico, in base al polimero utilizzato (Figg. 1a e 1b). Esiste quindi un fattore critico di selettività determinato dal coadiuvante polimerico scelto nei confronti dei diversi compartimenti oculari. Tale selettività, che giustifica l’identificazione di specifiche coppie preferite polimero/compartimento, non elimina la possibilità di utilizzare in alternativa le coppie meno preferite: infatti l’elevata attività della gemifloxacina ottenuta dalle composizioni dell’invenzione rende significativamente utile anche l’impiego di queste ultime, perché il principio attivo formulato con ciascuno dei polimeri scelti in accordo con l’invenzione raggiunge comunque nei diversi distretti oculari, concentrazioni sempre di gran lunga superiori ai propri valori di MIC per i principali ceppi patogeni per l’occhio (Tabella I).

L’elevata efficacia riscontrata per le composizioni oggetto dell’invenzione permette inoltre l’utilizzo di ridotte dosi di principio attivo, con i conseguenti vantaggi di una maggiore tollerabilità oculare, minori rischi di sovradosaggio e di assorbimento sistemico, e minore costo del prodotto. La riscontrata maggiore efficacia delle composizioni oggetto dell’invenzione permette infatti di ridurre la dose di farmaco somministrata pro-dose (concentrazione) e/o la frequenza di somministrazioni nel tempo, rispetto ai trattamenti convenzionali (soluzione acquosa). La presenza del polimero permette inoltre di utilizzare ampiamente soluzioni tampone a pH fisiologico o vicine ad esso, senza il rischio di precipitazione del principio attivo. Tutti questi vantaggi, legati ad un’elevata affinità, efficacia e selettività tissutale, sono stati ottenuti senza la necessità di ricorrere a sostanze aggiuntive quali ciclodestrine, proteine o altri fattori complessanti, che renderebbero più complicata e costosa la preparazione della composizione finale. I seguenti esempi illustrano ulteriormente l’invenzione senza costituirne limitazione.

PARTE SPERIMENTALE

Esempio 1. Soluzione oftalmica a base di Gemifloxacina/Kollidon 1.1 Composizione

1.2 Procedura di preparazione

Si pesa e si scioglie il cloruro sodico in acqua purificata. La soluzione così ottenuta viene divisa in due parti. Una parte viene addizionata di Kollidon 90 ed agitata per almeno 2 ore a temperatura ambiente, fino a dissoluzione. La rimanente parte della soluzione viene addizionata con la gemifloxacina, sotto agitazione (al riparo dalla luce). Le due soluzioni vengono quindi unite sotto agitazione fino ad ottenere una soluzione monofasica (colore giallo pallido, pH 5.4-5.8; osmolarità 270-310 mOsm/Kg). La composizione ottenuta viene sterilizzata per filtrazione con filtro in PVDF (polivinildifluoridene) da 0.22 pm.

Esempio 2. Soluzione oftalmica a base di Gemifloxacina/Lutrol 2.1 Composizione

2.2 Procedura di preparazione

Si pesano e si sciolgono in acqua purificata l’acido citrico, Na2HP04123⁄40 ed il NaCI. La soluzione così ottenuta viene divisa in due parti. Una parte viene addizionata con Lutrol ed agitata per almeno 12 ore a temperatura 2-8°C, fino a dissoluzione. La rimanente parte della soluzione viene addizionata con la gemifloxacina ed agitata (al riparo dalla luce) fino a dissoluzione. Le due soluzioni vengono quindi unité sotto agitazione fino ad ottenere una soluzione monofasica (colore giallo pallido, pH 5.4-5.8; osmolarità 270-310 mOsm/Kg). La composizione ottenuta viene sterilizzata per filtrazione con filtro in PVDF (polivinildifluoridene) da 0.22 pm.

Esempio 3. Soluzione oftalmica a base di Gemifloxacina /Cremophor/PEG

3.1 composizione

3.2 Procedura di preparazione

Si pesano e si sciolgono in acqua purificata l’acido citrico ed il Na2HP0412H20. A parte si mescolano il Cremophor, il PEG e la gemifloxacina, sotto agitazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente (al riparo dalla luce). La miscela semisolida così ottenuta viene aggiunta alla soluzione precedentemente preparata, agitando e scaldando a 37-40°C, fino ad ottenere una soluzione monofasica (colore giallo pallido, pH 5.4-5.6; osmolarità 270-310 mOsm/Kg). La composizione ottenuta viene sterilizzata per filtrazione con filtro in PVDF (polivinildifluoridene) da 0.22 pm.

Esempio 4: Test in-vivo di efficacia e prove di accumulo in cornea ed umor acqueo

4. 1 Metodologia

L’accumulo di gemifloxacina in cornea (tessuto oculare superficiale) in umor acqueo (distretto interno dell’occhio) è stato determinato con metodo spettrofluorimetrico dopo somministrazione in vivo di composizioni di gemifloxacina 0.3% (soluzione acquosa e composizioni contenentiXantano, Kollidon, Cremophor-PEG o Lutrol) nel coniglio albino New Zealand in cui era stato indotto un modello di cheratite stromale batterica ( Survey of Ophthalmology, voi. 50, supl. Nov. 2005, P.S32-S48).

MATERIALI

Animali

Sono stati utilizzati 48 conigli maschi albini New Zealand (Harlan Italia), entro il range di peso di 1 ,8 - 2,2 kg. Gli animali sono stati stabulati con condizioni di umidità (40-60% RH), temperatura (15-21°C) e illuminazione naturale (12 ore di luce e 12 di buio ogni giorno) e sono stati nutriti con cibo standard in forma di pellet (Mucedola - Italia) e con accesso all’acqua ad libitum. Dopo il loro arrivo, gli animali sono stati pesati e sottoposti ad un controllo veterinario e quindi ad un periodo di 7 giorni di acclimatazione prima della data di inizio dello studio. Durante questo periodo, il loro stato di salute è stato monitorato dal veterinario.

Isolato oculare usato per lo studio

La cheratite è stata indotta utilizzando l'isolato oculare St. aureus 7786. Il ceppo è stato coltivato, la notte prima dell'insulto, su Tryptic Soy Agar (TSA) 5% sangue di montone. Il primo giorno sperimentale alcune colonie sono state risospese in PBS fino ad una densità pari allo standard 0,5 Me Farland (10<8>Unità Formanti Colonie/ml). Tale sospensione è stata quindi diluita in PBS fino ad una concentrazione finale di 10<5>UFC/ml verificata tramite conta in piastra delle UFC. La MIC (Minima Concentrazione Inibente) di Gemifloxacina per tale isolato oculare, pari a 0,016 pg/ml, è stata determinata mediante il metodo E-test (vedi “Prove di efficacia antibatterica in vitro").

METODI

Su animali anestetizzati con ketamina (37,5 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) per via intramuscolare e novesina per via topica (2 gocce per occhio) si è praticata una iniezione intrastromale della sospensione batterica preparata come descritto. A tale scopo 50 pi della sospensione batterica sono stati iniettati per via intrastromale mediante una siringa da insulina con ago da 30-gauge in ciascuna cornea di ogni coniglio. Gli animali sono quindi stati divisi in 6 gruppi di trattamento, secondo il seguente schema:

•Gruppo 1 (non trattato)

•Gruppo 2 (gemifloxacina 0,3% in composizione contenente Xantano) •Gruppo 3 (gemifloxacina 0,3% in composizione contenente Kollidon) •Gruppo 4 (gemifloxacina 0,3% in composizione contenente Cremophor-PEG)

•Gruppo 5 (gemifloxacina 0,3% in composizione contenente Lutrol) •Gruppo 6 (gemifloxacina 0,3% in soluzione acquosa non contenente polimeri).

Lo studio si è svolto in diverse giornate. In tutte le giornate sperimentali il trattamento è iniziato tra le 16 e le 22 ore daH’inoculo, alla comparsa dei segni clinici corrispondenti all’instaurarsi dell’infezione batterica.

Trattamento

I gruppi sopra elencati sono stati trattati secondo il seguente schema posologico:

- Il gruppo di controllo - gruppo 1 , non trattato - non riceveva alcun trattamento.

- I gruppi 2, 3, 4 e 5 - trattati con le composizioni di gemifloxacina contenenti polimeri - sono stati trattati ogni ora (7 gocce in totale per ciascun occhio) secondo lo schema sopra indicato.

- Il gruppo 6 - trattato con la soluzione acquosa di gemifloxacina non contenente polimeri - è stato trattato ogni 30 minuti (14 gocce in totale per ciascun occhio).

50 μΙ di ciascuna composizione sono stati somministrati nel sacco congiuntivaie di entrambi gli occhi del coniglio per mezzo di una pipetta calibrata Micro Gilson. Dopo la somministrazione la palpebra è stata mantenuta chiusa per alcuni secondi per consentire la distribuzione del prodotto su tutta la superficie dell'occhio. Un'ora dopo la fine del trattamento i conigli sono stati sacrificati con appropriati volumi di Tanax e.v.

Prelievo dell’umore acqueo e della cornea

Immediatamente dopo il sacrificio degli animali, l'umore acqueo è stato prelevato mediante l’utilizzo di una siringa ipodermica. I campioni sono stati collocati in tubi precedentemente etichettati e pesati. Dopo il prelievo dei campioni di umore acqueo, la congiuntiva palpebrale è stata tagliata, il bulbo oculare è stato rimosso e la cornea è stata prelevata. Questa ultima è stata quindi lavata con soluzione salina isotonica e collocata in tubi etichettati. Tutti i tubi sono stati quindi conservati a -20°C fino al momento dell’analisi.

Conta batterica

Le cornee scongelate e pesate sono state omogeneizzate in 2 mi di soluzione fisiologica sterile (SF) con 0,1% di peptone a 4°C per 30". Dei 2 mi di omogenato, 1 mi è stato prelevato, diluito con 9 mi di SF e filtrato (essendo stato precedentemente convalidato il rapporto di diluizione 1 :10 necessario per inattivare l’antibiotico). Il filtro è stato quindi adagiato su piastre di agar TSA con il 5% di sangue di montone. Per essere certi di poter contare in modo accurato le colonie, l’altro millilitro di omogenato è stato diluito serialmente in SF più peptone e ogni singola diluizione è stata seminata in duplice su piastre di TSA agar. Dopo incubazione overnight delle piastre a 37°C, la carica batterica totale è stata determinata tramite conta su filtro e su piastra delle UFC. Le cariche batteriche sono state riportate come UFC/gr di tessuto.

Determinazione spettrofluorimetrica dell’accumulo di gemifloxacina in cornea ed umore acqueo

La determinazione della concentrazione in cornea ed in umore acqueo di gemifloxacina somministrata nelle diverse composizioni è stata effettuata utilizzando la metodica spettrofluorimetrica applicata da Ocafìa et al. per la determinazione della moxifloxacina nel siero e nelle urine dell’uomo (Analyst, 2000 Dee; 125 (12) 2322:2325 ). In questa metodica una soluzione micellare 8mM di sodio dodecil solfato (SDS) a pH 4,0 (in acido acetico) è impiegata come medium per determinare la fluorescenza di moxifloxacina (EX = 294 nm e EM = 503). La stessa metodica è stata utilizzata in questo esperimento per determinare la fluorescenza di gemifloxacina. A tale scopo è stata precedentemente determinata la curva standard di fluorescenza per gemifloxacina nello stesso medium in un range di concentrazioni compreso tra 0 e 1000 ng/ml. Le letture spettrofluorimetriche sono quindi state graficate verso le corrispondenti concentrazioni in modo da ottenere la curva standard. 100 pi di ciascun campione di umore acqueo o di omogenato corneale (provenienti dai 2ml utilizzati per la conta batterica) sono quindi stati addizionati a 2ml di buffer micellare; il valore di fluorescenza ottenuto è stato interpolato con la relativa curva standard e calcolato come nanogrammi/ml o nanogrammi/g di tessuto.

RISULTATI

Conta batterica

I dati sperimentali sono stati riportati in grafico e su di essi è stata eseguita l’analisi statistica (One Way Anova e Dunnet Post Test, Fig. 2). Tutti i gruppi di trattamento mostrano una riduzione della carica batterica statisticamente significativa rispetto al gruppo di controllo non trattato. In particolare, le composizioni di gemifloxacina 0.3% contenenti Kollidon, Lutrol o Cremophor-PEG consentono di ottenere con regime posologico di 7 somministrazioni (intervalli di un’ora) una riduzione della carica batterica superiore a due unità logaritmiche, comparabile a quella raggiunta con 14 somministrazioni (intervalli di 30’ ) della soluzione di gemifloxacina 0.3% non addizionata di polimeri. Al contrario, il trattamento con la composizione di gemifloxacina 0.3% contenente Xantano (7 somministrazioni) benché moderatamente efficace verso il gruppo non trattato (riduzione della carica batterica di una unità logaritmica), risulta decisamente meno attivo rispetto al trattamento con gemifloxacina Kollidon, Lutrol o Cremophor-PEG (7 somministrazioni), ed anche rispetto al trattamento con gemifloxacina non addizionata di polimeri con posologia doppia.

Durante l’intera durata del test il principio attivo è rimasto stabile in soluzione e non si è osservata alcuna precipitazione dello stesso.

Determinazione spettrofluorimetrica dell’accumulo di gemifloxacina in cornea ed in umore acqueo

I risultati relativi all'accumulo di gemifloxacina in cornea e in umore acqueo sono riportati in Figg. 1a e 1b. In Fig. 1c è riportata la curva standard.

I dati illustratati in Fig.la evidenziano un accumulo corneale del principio attivo da significativo a molto elevato per tutte le composizioni realizzate in accordo con l’invenzione. In particolare, le composizioni contenenti Lutrol o Cremophor mostrano la più elevata capacità di accumulo di gemifloxacina in cornea: i livelli di principio attivo ottenuti in cornea con tali composizioni sono risultati sostanzialmente uguali a quelli ottenuti somministrando la soluzione acquosa di gemifloxacina non contenente polimeri a pari concentrazione, ma con un regime posologico doppio. Durante l’intera durata del test il principio attivo è rimasto stabile in soluzione e non si è osservata alcuna precipitazione dello stesso.

I dati illustratati in Fig.lb evidenziano un accumulo di gemifloxacina neH’umor acqueo da significativo a molto elevato per tutte le composizioni realizzate in accordo con l’invenzione. In particolare, le composizioni contenenti Cremophor/PEG mostrano la più elevata capacità di accumulo di principio attivo in questo distretto: i livelli di accumulo sono infatti sostanzialmente uguali a quelli ottenuti con la soluzione gemifloxacina a pari concentrazione non contenente il componente polimerico, ma con un regime posologico doppio. Durante l’intera durata del test il principio attivo è rimasto stabile in soluzione e non si è osservata alcuna precipitazione dello stesso.

Esempio 5: Prove di efficacia antibatterica In vitro - Epsilometertest - E-test

5.1 Metodologia

È stata determinata in vitro, con il metodo dell’E-test, l'attività, in termini di MIC50 e MIC90, di gemifloxacina, moxifloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina e ofloxacina versus 85 isolati batterici oculari

MATERIALI

E-test

La metodica dell’E-test (AB Biodisk®) prevede l’impiego di una sottile striscia di plastica inerte e non porosa, caricata con un gradiente di concentrazione crescente dei diversi antibiotici utilizzati su cui è riportata la scala di lettura della MIC in pg/ml. Quando la striscia per ΙΈ-test viene applicata su una superficie di agar seminata con il ceppo batterico si ha un trasferimento del gradiente di antibiotico dalla plastica della striscia sulla matrice della superficie dell'agar. Si forma così direttamente sotto la striscia un gradiente di concentrazioni di antibiotico stabile, continuo ed esponenziale. Dopo incubazione della piastra, periodo in cui si ha la crescita batterica, diventa visibile un alone di inibizione di forma ellittica simmetrica. Il valore di MIC viene letto direttamente sulla scala graduata della striscia in termini di pg/ml e coincide con il valore dove il bordo della ellisse interseca la striscia.

Il test è stato effettuato utilizzando gli E-test per gemifloxacina, moxifloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina e ofloxacina nel gradiente di concentrazione compreso fra 0,002 e 32 pg/ml.

Isolati batterici

Sono stati impiegati 85 isolati batterici oculari suddivisi come segue: 27 St. aureus, 29 St. epidermidis, 16 Stafilococchi coagulase negativi, 8 Ps. aeruginosa e 5 Serratia marcescens. Sono stati inoltre inclusi i seguenti ceppi batterici ATCC: Staphylococcus aureus 25923, Staphylococcus aureus 29213, Staphylococcus aureus 43300, S. epidermidis 35984, Pseudomonas aeruginosa 27853 e Pseudomonas aeruginosa 9027.

METODI

Preparazione dell’inoculo

L'intera procedura è stata effettuata secondo le istruzioni del fornitore (AB Biodisk®). In breve, alcune colonie ben isolate, cresciute ovemight su una piastra di agar, sono state emulsionate in un idoneo mezzo di sospensione (soluzione salina), fino a raggiungere una torbidità pari a 0,5 Me Farland.

Procedura per l’esecuzione dell’E-test

Un tampone sterile è stato imbibito con la sospensione dell’inoculo precedentemente preparata. Il fluido in eccesso è stato rimosso premendo il tampone contro la parete interna della provetta. Dopo aver seminato la piastra di agar con tale tampone, la striscia dell’E-test è stata depositata sulla superficie dell’agar. Le piastre sono state scelte in base al ceppo testato: ad es. per i Gram- e gli Staphylococci meticillino sensibili sono state usate piastre di Mueller Hinton Agar, mentre per gli Staphylococci meticillino resistenti sono state usate piastre di Mueller Hinton Agar più 2% NaCI.

RISULTATI

Determinazione dei valori di MIC50e MIC90

In Tabella I sono riportati i valori di MIC determinati, espressi per ogni antibiotico e per ciascun gruppo di isolati batterici testati in termini di MIC50 e MICgo

Tabella I

I dati evidenziano una maggiore efficacia antibatterica della gemifloxacina rispetto agli altri fluorochinoloni, su quasi tutti i ceppi testati. Il dato è particolarmente rilevante tenendo conto che tutti i ceppi sottoposti al test derivavano da isolati clinici oculari (ottenuti da congiuntiviti e cheratiti) caratterizzati per la resistenza agli antibiotici con antibiogramma e con caratterizzazione genica per la meticillinoresistenza. Tale efficacia antibatterica del principio attivo è utilmente sfruttata ed incrementata dalla presente invenzione, con particolare riferimento alla possibilità di dirigere l’accumulo dell’attivo sulla superficie oculare o nei distretti interni dell’occhio in base al polimero utilizzato e quindi di trattare delle infezioni di tali zone in modo selettivo.

Claims (25)

1. RIVENDICAZIONI 1. Composizioni farmaceutiche per uso oftalmico comprendenti, in un opportuno solvente, gemifloxacina o un suo derivato farmaceuticamente accettabile, ed un componente polimerico.
2. 2. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 1 in cui detto componente polimerico è scelto tra: polietilenglicole, polipropilenglicole, polivinilpirrolidone, un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole, miscele di polietileneglicole con acidi grassi polietossilati, cellulose e carbomeri.
3. 3. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-2 per uso nel trattamento o nella prevenzione di malattie infettive della superficie oculare e/o dei distretti interni dell’occhio .
4. 4. Composizioni secondo la rivendicazione 3, per uso nel trattamento delle cheratiti.
5. 5. Composizioni secondo la rivendicazione 3, per uso nel trattamento di congiuntivite, blefarite, blefarocongiuntivite, cheratite puntata, cheratocongiuntivite, uveite infettiva, cheratite stromale, infezioni conseguenti a trauma profondo, ulcere corneali, per la profilassi chirurgica e per il trattamento oculare post-chirurgico invasivo.
6. 6. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-5, contenenti gemifloxacina in concentrazione compresa tra 0.01% e 0.5% p/v.
7. 7. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-6, contenenti gemifloxacina in concentrazione compresa tra 0.05% e 0.3% p/v.
8. 8. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-7, contenenti gemifloxacina in concentrazione compresa tra 0.1% e 0.2% p/v.
9. 9. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-8, adatte a fornire una quantità di gemifloxacina per singola somministrazione, compresa tra 5 pg e 250 pg.
10. 10. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-9, adatte a fornire una quantità di gemifloxacina per singola somministrazione, compresa tra 25 pg e 150 pg.
11. 1 1. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-10, adatte a fornire una quantità di gemifloxacina per singola somministrazione, compresa tra 50 pg e 100 pg.
12. 12. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-11 comprendenti antinfiammatori scelti fra: corticosteroidi, antinfiammatori non steroidei (FANS), inibitori selettivi della COX-2, molecole che interferiscono con i mediatori dell'infiammazione, molecole ad azione immunosoppressiva.
13. 13. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-12 comprendenti antimicrobici scelti fra betalattamine (penicilline, cefalosporine), macrolidi, polipeptidi naturali ad azione antibatterica e loro frammenti.
14. 14. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-13 comprendenti uno o più agenti tampone e/o isotonizzanti.
15. 15. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-14 comprendenti uno o più agenti tampone scelti tra: tampone fosfato, fosfato-citrato, Tris, NaOH, istidina, tricina, lisina, glieina, serina, eventualmente aggiustati al corretto pH fisiologico con una componente acida, e/o uno o più agenti isotonizzanti scelti tra cloruro sodico, acido citrico, glicerolo, sorbitolo, mannitolo, glicole etilenico, glicole propilenìco, destrosio.
16. 16. Composizioni secondo le rivendicazioni 1-15 formulate come collirio (soluzione/soluzione viscosizzata), lavaggio oculare, gel o inserto oftalmico medicato.
17. 17. Procedimento per la preparazione delle composizioni descritte nelle rivendicazioni 1-16, comprendente il mescolare, in un opportuno solvente, gemifloxacina o un suo derivato farmaceuticamente accettabile ed un componente polimerico.
18. 18. Procedimento secondo la rivendicazione 17, dove il componente polimerico è scelto tra: polietilenglicole, polipropilenglicole, polivinilpirrolidone, un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole, miscele di polietileneglicole con acidi grassi polietossilati, cellulose e carbonieri.
19. 19. Uso di una composizione comprendente, in un opportuno solvente, gemifloxacina o un suo derivato farmaceuticamente accettabile ed un componente polimerico, nella preparazione di un medicamento per il trattamento delle infezioni oculari.
20. 20. Uso secondo la rivendicazione 19, in cui detto componente polimerico è scelto tra polietilenglicole, polipropilenglicole, polivinilpirrolidone, un copolimero a blocchi di polietileneglicole e polipropileneglicole, miscele di polietileneglicole con acidi grassi polietossilati, cellulose e carbomeri.
21. 21. Uso secondo le rivendicazioni 19-20, dove detta composizione comprende antinfiammatori scelti fra: corticosteroidi, antinfiammatori non steroidei (FANS), inibitori selettivi della COX-2, molecole che interferiscono con i mediatori dell'infiammazione, molecole ad azione immunosoppressiva.
22. 22. Uso secondo le rivendicazioni 19-20, dove detta composizione comprende antimicrobici scelti fra betalattamine (penicilline, cefalosporine), macrolidi, polipeptidi naturali ad azione antibatterica e loro frammenti.
23. 23. Uso secondo le rivendicazioni 19-22, nella preparazione di un medicamento per il trattamento e la prevenzione di infezioni della superficie oculare e/o dei distretti interni dell’occhio.
24. 24. Uso secondo le rivendicazione 23, nella preparazione di un medicamento per il trattamento delle cheratiti.
25. 25. Uso secondo la rivendicazione 23, nella preparazione di un medicamento per il trattamento di congiuntivite, blefarite, blefarocongiuntivite, cheratite puntata, cheratocongiuntivite, uveite infettiva, cheratite stremale, infezioni conseguenti a trauma profondo, ulcere corneali, per la profilassi chirurgica e per il trattamento oculare post-chirurgico invasivo.