ITMI20062363A1 - Ceppi di lattobacilli probiotici che persistono nell'intestino e ne modulano i recettori di mucosa - Google Patents
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Description
- 2 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri 7850 M Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
FM/mc “CEPPI DI LATTOBACILLI PROBIOTICI CHE PERSISTONO
NELL’INTESTINO E NE MODULANO I RECETTORI DI MUCOSA”
a nome : AAT - ADVANCED ANALYTICAL TECHNOLOGIES s.r.l. con sede in: Piacenza
* * *
La presente invenzione riguarda ceppi di Lactobacillus capaci di interagire con il sistema immunitario dell’ospite, umano e/o animale, determinando l’espressione dei toll-like receptors TLR2 e TLR4, responsabili dell’induzione della risposta immunitaria a livello mucosale.
L’invenzione riguarda inoltre composizioni probiotiche contenenti i ceppi dell’invenzione.
Background dell’invenzione
Benché siano stati pubblicati numerosi articoli in relazione alla stimolazione del sistema immunitario dell’ospite, umano ed animale, da parte dei batteri probiotici, il meccanismo d’azione rimane sconosciuto. Occorre inoltre precisare che non tutti i ceppi batterici esercitano azioni probiotiche.
Le cellule epiteliali della mucosa dell’intestino non sono più solo considerate una barriera meccanica contro l’invasione dei batteri patogeni, ma è stata dimostrata la loro capacità di recepire una serie di stimoli ambientali e di attivare meccanismi di risposta, al fine di mantenere l’omeostasi intestinale, di sopprimere i patogeni e di reagire all’ingestione dei probiotici.
Per descrivere il caso specifico delle relazioni tra microflora intestinale e mucosa è stata recentemente coniata la definizione di “interazione batterio-ospite”. Le cellule mucosali, immunitarie, e non, sono in grado di - 3 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri riconoscere prodotti microbici, spesso localizzati sulla superficie delle cellule batteriche, quali i lipopolisaccaridi (LPS) dei batteri Gram negativi ed il peptidoglicano e l’acido lipoteicoico (LTA) dei batteri Gram positivi.
Il suddetto riconoscimento ha luogo mediante dei recettori, tra i quali si collocano i cosiddetti Toll-like Receptors (TLRs) nell’ambito dei quali sono stati descritti i TLR4, che riconoscono e legano gli LPS dei batteri Gram negativi, ed i TLR2 che legano gli LTA dei Gram positivi.
I recettori TLRs, dopo essere stati stimolati da molecole batteriche, attivano, mediante appositi cofattori, dei fattori di trascrizione che modulano l’espressione delle citochine e delle chemochine proinfiammatorie e antinfiammatorie che a loro volta regolano l’attività del sistema immunitario.
Il recettore gamma attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARgamma) è un recettore nucleare altamente espresso nel colon che ha un ruolo chiave nella regolazione dell’infiammazione del colon indotta da microorganismi.
Descrizione dell’invenzione
Si è ora trovato, e costituisce un oggetto dell’invenzione, che ceppi di L. crispatus sono in grado di stimolare il sistema immunitario dell’ospite, modulando il recettore PPAR-Ȗ mediante la produzione di acqua ossigenata, secondo un meccanismo mai finora descritto. I ceppi dell’invenzione hanno proprietà di persistenza intestinale, misurata mediante valutazione della loro capacità di aderire alla mucosa intestinale dei topi e di rimanere vitali nelle loro feci.
L’invenzione si riferisce in particolare al ceppo L. crispatus M247, identificato nelle feci e depositato al numero di accesso LMG P-23257 in data - 4 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri 11 Aprile 2006 presso la BCCM/LMG Bacteria Collection, Laboratorium voor Microbiologie, Università di Ghent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgio ai sensi del Trattato di Budapest. Un ceppo comparativo di L. crispatus identificato con la sigla MU5 è stato depositato presso la stessa collezione e in pari data al numero di accesso codice LMG P-23258.
La comparazione dei diversi effetti indotti dai 2 ceppi depositati sul sistema immunitario ha consentito di spiegare il meccanismo che il ceppo M247 utilizza per indurre la risposta immunitaria nell’ospite.
In particolare, gli effetti dei 2 ceppi MU5 e M247 sul sistema immunitario dell’ospite, sono stati paragonati secondo la seguente procedura:
a) Analisi e selezione di lattobacilli che stimolano il sistema immunitario dell’ospite;
b) Analisi e selezione di lattobacilli probiotici aggreganti, capaci di persistere nell’intestino dell’ospite e loro mutanti isogenici spontanei non aggreganti;
c) Analisi e selezione di lattobacilli probiotici che interagiscono con i recettori di mucosa;
d) Analisi e selezione di lattobacilli che inducono l’attivazione dei recettori TLRs;
e) Analisi e selezione di lattobacilli che modulano il recettore PPARgamma;
f) Analisi e selezione di lattobacilli che modulano il recettore PPARgamma mediante la produzione di acqua ossigenata.
I risultati ottenuti, riportati negli Esempi successivi, dimostrano le vantaggiose proprietà dei ceppi dell’invenzione, in particolare di L. crispatus - 5 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri M247, che potranno pertanto essere utilmente utilizzati nei settori della medicina e dell’alimentazione, sia in campo umano che veterinario.
Allo scopo, i ceppi dell’invenzioni potranno essere somministrati in opportune formulazioni probiotiche contenenti un numero efficace di cellule vitali o liofilizzate. Esempi di tali formulazioni comprendono capsule, sospensioni in acqua o altri liquidi, compresse, granulati, polveri, formulazioni topiche per l’applicazioni su mucose e simili.
ESEMPIO 1
Persistenza di L. crispatus M247 e di L. Crispatus MU5 nelle feci e sui tessuti dei topi trattati
Le prove oggetto del brevetto sono state condotte su 3 gruppi di topi, formati da 12-20 topi ciascuno, cui sono stati somministrati quotidianamente, per 14 giorni, 100 µl di sospensione.
La sospensione conteneva soluzione fisiologica, nel caso del gruppo controllo (C), e 100.000.000 di cellule batteriche nel caso del gruppo trattato con L. crispatus M247 (M247) o con L. crispatus MU5 (MU5).
Immediatamente prima dell’inizio (T0) e dopo la fine del periodo di somministrazione (T14) sono stati prelevati dei campioni fecali dei topi C, M247 e MU5.
Gli animali sono stati sacrificati alla fine del periodo di somministrazione e la porzione prossimale del colon è stata rimossa e suddivisa in varie parti, trattate diversamente e conservate per le successive applicazioni, come la determinazione dei lattobacilli totali e l’estrazione dell’RNA.
I campioni fecali ed i campioni di tessuto sono stati usati per - 6 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri determinare, mediante PCR ceppo-specifica, la presenza dei ceppi batterici L. crispatus M247 ed L. crispatus MU5 nei gruppi trattati.
I campioni di tessuto sono stati inoltre usati per recuperare le cellule epiteliali ed estrarne l’RNA messaggero da usare come templato nella RT-PCR.
Tale tecnica è stata impiegata per valutare il livello di trascrizione di interleuchina 6 (IL-6), interleuchina 10 (IL-10) e di recettori Toll-like (TLR2 e TLR4).
I ceppi L. crispatus M247 e L. crispatus MU5 non erano presenti nelle feci dei topi trattati prima dell’inizio della prova.
Dopo 14 giorni di assunzione della sospensione di batteri, il ceppo L. crispatus M247 è stato ritrovato nelle feci di 12 tra i 17 topi del gruppo M247, mentre solo 2 topi su 14 del gruppo MU5 presentavano nelle loro feci il ceppo L. crispatus MU5.
Si può quindi concludere che il ceppo L. crispatus M247 è capace di sopravvivere molto meglio del ceppo L. crispatus MU5 nell’intestino dei topi trattati.
Dopo 14 giorni di assunzione della sospensione di batteri, il ceppo L. crispatus M247 è stato ritrovato in 9 su 17 campioni di tessuto dei topi del gruppo M247, mentre solo 5 topi su 14 del gruppo MU5 presentavano nel loro colon il ceppo L. crispatus MU5.
Anche da questo risultato, si conclude che il ceppo L. crispatus M247 è capace di sopravvivere molto meglio del ceppo L. crispatus MU5 nell’intestino dei topi trattati.
Le tabelle n. 1, 2 e 3 riportano i dati relativi ai suddetti risultati.
- 7 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri
Tabella 1. Numero dei topi nei quali sono stati individuati i ceppi L. crispatus M247 e L. crispatus MU5 rispetto al totale dei topi trattati.
Feci Tessuto
T14 T14
Topi trattati con M247 12/17 9/17
Topi trattati con MU5 2/14 5/14
Tabella 2. Identificazione di L. crispatus M247 e L. crispatus MU5 nelle feci e sui tessuti dei topi trattati.
Nr. di identificazioni per topo<a>L. crispatus M247 L. crispatus MU5
Nr. di topi le cui feci Media log10delle Nr. di topi le cui feci<Media log>10<delle>contenevano il UFC/g di campione contenevano il UFC/g di campione probiotico vivo umido probiotico vivo umido Feci
2 volte<3 7,30 ± 0,44 0 ni>1 volta9 8,22 ± 0,25 2 8,67 ± 0,05 0 volte<5>ni<b 12 ni>Tessuti
1 volta9 7,09 ± 0,21 5 7,24 ± 0,640 volte<8 ni 9 ni>
Nr. totale dei topi<17 14>
<a>2 volte si riferisce all'identificazione di L. crispatus M247 o di L. crispatus MU5 sia al tempo T7 sia al tempo T14, mentre 1 volta indica che i ceppi sono stati identificati solo al tempo T14<b>ni= non identificato
- 8 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri Tabella 3. Quantificazione di L. crispatus M247 and L. crispatus MU5 nelle feci e sui tessuti dei topi trattati (dati espressi come log10UFC).
Topo nr. Feci Tessuti
Nr. di batteri vivi espressi in log10UFC
M247 MU5 M247 MU5
1 9,4 8,8 7,5 8,0
2 8,4 8,6 6,7 8,0
3 8,1 ni 7,1 7,5 4 8,8 ni 7,3 7,4 5 8,1 ni 7,6 5,2 6 8,5 ni 6,8 ni 7 7,9 ni 7,8 ni 8 7,8 ni 6,9 ni 9 6,9 ni 6,1 ni 10 7,5 ni ni ni 11 8,8 ni ni ni 12 7,3 ni ni ni La presenza del ceppo M247 nelle feci dei topi trattati con tale probiotico è stata inoltre confermata mediante analisi Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) condotta sul DNA estratto direttamente dalle feci murine. Il metodo utilizzato si basa su quanto riportato da Konstantinov et al. (2004). Il DNA batterico è stato estratto dalle feci dei topi controllo e dei topi trattati con i ceppi M247 e MU5 ed amplificato via PCR nested con 2 coppie di primers, come indicato da Konstatinov 2004. Gli amplificati sono stati sottoposti ad analisi elettroforetica in gradiente di acrilammide. I frammenti evidenziati sono stati ritagliati dal gel, eluiti ed amplificati mediante PCR. I prodotti di amplificazione sono stati sequenziati per - 9 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri pervenire all’identificazione tassonomica. Il ceppo M247 è stato individuato nei topi trattati mentre il ceppo MU5 non è stato ritrovato. Questo dato conferma che solo il ceppo aggregante M247 è capace di persistere nell’intestino dei topi e può essere reperito nelle feci degli animali trattati.
ESEMPIO 2
Attivazione del sistema immunitario da parte di L. Crispatus M247 e L. Crispatus MU5
I topi dell’Esempio 1 che hanno ricevuto L. crispatus M247 hanno presentato una significativa riduzione del livello di IL-6 mucosale ed un aumento di IL-10, misurato mediante espressione del corrispondente RNA mesaggero.
Le variazioni dei livelli di mRNA per IL-6 ed IL-10 nel gruppo MU5 sono invece risultate non significative rispetto ai controlli.
I suddetti risultati sono riportati in Figura 1.
Gli istogrammi in bianco si riferiscono ai controlli, mentre quelli grigi a MU5 ed i neri a M247.
ESEMPIO 3
Attivazione dei recettori Toll-like (TLRs)
Il gruppo M247 dell’Esempio 1 ha rivelato livelli di espressione di TLR2 significativamente più alti di quelli degli altri gruppi sia per la mucosa del colon sia per le cellule epiteliali isolate, misurato mediante espressione del corrispondente RNA mesaggero.
Il gruppo MU5 al contrario, non presenta livelli significativi di espressione di TLR2 e TLR4.
I suddetti risultati sono riportati in Figura 2 (A e B) dove gli - 10 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri istogrammi in bianco si riferiscono ai controlli, mentre quelli grigi a MU5 ed i neri a M247.
La Figura 2A riporta i valori riferiti alla mucosa del colon.
La Figura 2B riporta i valori riferiti alle cellule epiteliali isolate.
I recettori della mucosa intestinale svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di varie attività fondamentali per il buon funzionamento dell’intestino. Il riconoscimento delle cellule dei batteri probiotici da parte di questi recettori è quindi molto importante dal punto di vista fisiologico.
La regolazione dei recettori TLRs è molto importante per la protezione delle cellule della mucosa verso i patogeni e per la riparazione di eventuali danni.
La stimolazione eccessiva dei recettori TLRs può essere deleteria dando origine a stati infiammatori cronici.
Il ceppo L. crispatus M247 ha dimostrato la capacità di stimolare il recettore TLR2 rispetto al recettore TLR4.
La stimolazione dell’espressione del recettore TLR2 determina la maturazione delle cellule dendritiche, la protezione dell’intestino contro i batteri patogeni e stimola la funzione di barriera della mucosa intestinale.
La riduzione dell’espressione del recettore TLR4 protegge l’intestino dagli effetti stimolanti sul sistema immunitario dei batteri Gram negativi, potenzialmente patogeni.
ESEMPIO 4
Attivazione del recettore PPARgamma nella mucosa del colon murino
Il recettore PPARgamma è fondamentale per la produzione di citochine - 11 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri e chemochine nell’ambito della risposta infiammatoria mucosale. La capacità dei ceppi probiotici M247 e MU5 di stimolare il recettore PPARgamma è stata perciò misurata mediante l’espressione del corrispondente RNA messaggero. I livelli di espressione dell’RNA messaggero per il recettore PPARgamma sono risultati essere sorprendentemente più alti nelle cellule epiteliali dei topi trattati con M247 rispetto a quelli trattati con MU5 come mostrato in Figura 3.
Tali risultati sono stati confermati anche mediante analisi immunoistochimica mediante colorazione specifica del recettore PPARgamma della mucosa di animali non trattati (controlli) e trattati con i ceppi probiotici.
L’espressione del recettore PPARgamma è risulta molto più elevata nello strato epiteliale della mucosa dei topi trattati con M247 rispetto a quelli trattati con MU5.
ESEMPIO 5
Attivazione del recettore PPARgamma nelle cellule epiteliali murine
Per verificare la risposta delle cellule epiteliali murine al contatto con i ceppi probiotici M247 e MU5, il livello di espressione del recettore PPARgamma è stato valutato in linee cellulari CMT-93 a seguito dell’interazione con i suddetti ceppi batterici.
La Figura 4 riporta la evidente differenza tra l’espressione del recettore PPARgamma nelle cellule messe a contatto con M247 rispetto a quelle trattate con MU5. Anche la tecnica Western blot ha confermato l’ espressione differenziale del recettore nelle cellule messe a contatto con M247, mentre i controlli positivi con ȕ-tubulina non mostrano differenze di espressione tra cellule stimolate a seguito del contatto con M247 o con MU5.
- 12 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri ESEMPIO 6
Meccanismo di attivazione dei recettori della mucosa intestinale del topo da parte dei ceppi probiotici L. crispatus M247 e MU5
Il meccanismo di attivazione di PPARgamma da parte del ceppo M247 è stato inaspettatamente dimostrato dipendere dalla sua capacità di produrre radicali liberi (ROS) che sono importanti attivatori di tale recettore. Il ceppo M247 è infatti risultato un maggior produttore di acqua ossigenata rispetto al ceppo MU5 sia dal punto di vista qualitativo sia quantitativo. Nel primo caso è stato applicato il metodo descritto da Eschenbach et al. 1989 mentre nel secondo caso è stato seguito il metodo di Gilliland, S. E. 1969 modificato secondo le indicazioni di Yap P.S. and Gilliland S.E. 2000.
La quantità di radicali liberi accumulata nelle cellule epiteliali CMT-93 dopo contatto con M247 è risultata significativamente più alta rispetto a quella delle cellule trattate con MU5.
Per dimostrare anche in via indiretta il meccanismo di attivazione del PPAR esposto sopra, si è preceduto ad utilizzare l’agente antiossidante glutatione per trattare le cellule epiteliali messe a contatto con il probiotico M247. La presenza dell’antiossidante elimina completamente l’effetto di attivazione del recettore PPARgamma generato dal probiotico M247 e riduce i suoi livelli di espressione a livello della mucosa murina (Figura 5).
- 13 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.
Bianchetti Giuseppe ed altri REFERENZE CITATE
Konstantinov SR, Awati A, Smidt H, Williams BA, Akkermans AD, de Vos WM (2004) Specific response of a novel and abundant Lactobacillus amylovorus-like phylotype to dietary prebiotics in the guts of weaning piglets. Applied and Environmental Microbiology 70(7): 3821-3830.
Eschenbach DA, Davick PR, Williams BL, Kleibanoff SJ, Young-Smith K, Critchlow CM, Holmes KK (1989) Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis. Journal Clinical Microbiology 27:251-256.
Gilliland SE (1969) Enzymatic determination of residual hydrogen peroxide in milk. Journal Dairy Science 52: 321-324.
Yap PS, Gilliland SE (2000) Comparison of newly isolated strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis for hydrogen peroxide production at 5°C. Journal Dairy Science 83: 628-632.
Claims (3)
- - 14 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l. Bianchetti Giuseppe ed altri RIVENDICAZIONI 1. Ceppi di Lactobacillus crispatus in grado di stimolare il sistema immunitario dell’ospite, modulando il recettore PPAR-Ȗ mediante la produzione di acqua ossigenata.
- 2. Ceppo secondo la rivendicazione 1 depositato al numero di accesso LMG P-23257 in data 11 Aprile 2006, presso la BCCM/LMG Bacteria Collection, Laboratorium voor Microbiologie, Università di Ghent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, Belgio.
- 3. Composizioni probiotiche comprendenti come ingrediente attivo un ceppo delle rivendicazioni 1 o 2. Milano, 6 dicembre 2006
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