ITMI20011085A1 - Metodo e dispositivo per la rilevazione di batteri negli alimenti - Google Patents

Description

Descrizione di un brevetto d'invenzione a nome:

La presente invenzione riguarda un metodo ed un dispositivo particolarmente adatti per l'analisi batteriologica degli alimenti, in particolare riguarda le fasi di raccolta e di arricchimento del contenuto batterico in campioni alimentari. Con il termine arricchimento si intende promuovere e accelerare lo sviluppo di batteri, presenti anche in bassa concentrazione, tramite idonei terreni colturali .

Il metodo ed il dispositivo qui descritti permettono la ricerca di tutti i batteri aerobi e mesofili che possono contaminare un alimento e, di conseguenza, provocare gravi danni alla salute dell'uomo e della comunità in generale.

L'epidemiologia delle infezioni di origine alimentare è in evoluzione, nel senso che l'eziologia stessa sta cambiando ed il numero di casi di infezione è in aumento.

I motivi possono essere attribuiti, in maggior partè, alla produzione centralizzata e alla distribuzione su larga scala degli alimenti da parte delle industrie alimentari: da una singola fonte contaminata l'agente eziologico si può espandere rapidamente e massivamente in una vasta area territoriale.

Nuovi ceppi patogeni sono emersi e molti di essi, tra cui quelli appartenenti ai generi Salmonella, Shigella, Campylobacter e, inoltre Escherichia coli 0157:H7, hanno, come serbatoi naturali, animali sani da cui possono diffondersi attraverso una varietà di alimenti sempre più ampia.

Negli Stati Uniti sono stati stimati circa 20 milioni di casi di infezione da patogeni in alimenti, con circa 9000 decessi. Molte sono perciò le infezioni ancora non diagnosticate e non riportate.

Allo stato attuale un'analisi microbiologica per un alimento solido viene eseguita secondo un metodo che prevede la triturazione e l'omogeneizzazione dell'alimento, l'inoculo di una certa quantità dell'alimento così preparato in una appropriata quantità di terreno liquido di arricchimento idoneo all'uso batteriologico (terreno di arricchimento primario) e la crescita della coltura in un termostato ad una temperatura compresa fra i valori di temperatura corporea che si riscontrano abitualmente in persone che si trovano in uno stato di salute normale, in pratica fra 35 e 37.5°C, preferibilmente a 37°C, per 8-48 ore, secondo la specie patogena che si vuole ricercare. Esistono dei protocolli più o meno standardizzati relativamente a tipi di terreno di coltura ed ai tempi di incubazione. Si può poi procedere con tecniche varie all'isolamento e all'identificazione del patogeno da ricercare.

In molti casi è necessario operare un secondo arricchimento (arricchimento secondario) in un terreno liquido più selettivo rispetto al primo, prima di procedere all'isolamento e all'identificazione.

I patogeni solitamente ricercati negli alimenti sono: Listeria monocytogenes, Salmone!la spp., Shigella_ spp, Enterobacteriaceae, Staphylococcus_ aureus, Clostridium_ spp.; recentemente nuovi tipi di patogeni sono stati segnalati: Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus spp. fetus, Escherichia coli 0157:H7.

Ad esempio, per la ricerca specifica di Listeria monocytoges si utilizza il terreno di Fraser per l'arricchimento primario ed il terreno di Fraser selettivo per l'arricchimento secondario.

L'operatore deve intervenire, dopo l'arricchimento primario, per effettuare la semina nel terreno di arricchimento secondario e ciò comporta un allungamento dei tempi di analisi.

Dopo la fase di arricchimento primario ed eventualmente secondario, una porzione della brodocoltura viene inoculata su piastre di Petri su ciascuna delle quali è stato steso un terreno specifico per un determinato patogeno da ricercare allo scopo di ottenere colonie batteriche isolate. Le piastre di Petri inoculate vengono incubate ulteriormente per 8-48 ore: si procede quindi all'identificazione della specie batterica con metodi vari (rif. 1, 2, 3, 4).

I metodo ed il dispositivo descritti in questa invenzione sono particolarmente adatti per l'esecuzione delle prime fasi dell'analisi batteriologica degli alimenti, cioè la raccolta e l'arricchimento primario e secondario, in un sistema automatizzato.

In particolare, il metodo dell'invenzione consiste in un processo automatizzato per l'arricchimento batteriologico primario e secondario di un campione di alimenti sottoposto ad analisi batteriologica.

Il suddetto metodo comprende le seguenti fasi: (a)introdurre in un primo contenitore che d'ora in poi verrà definito come contenitore A), una quantità sufficiente di campione alimentare da analizzare adeguatamente preparato (p.e., triturazione e/o omogeneizzazione), detto contenitore essendo assemblato con uno o più contenitori di dimensioni e forme adatte per essere assemblate con il contenitore A e (che d'ora in poi verranno identificati come contenitore/i o provetta/e F), detto contenitore A contenendo una quantità di terreno liquido di coltura appropriato B per promuovere l'arricchimento primario secondo la tecnica nota e, preferibilmente, essendo munito di un sistema di agitazione (p.e. un sistema interno di agitazione continua, preferibilmente, agitazione magnetica); detta/e provetta/e F contenendo una quantità appropriata di terreno di coltura liquido per promuovere l'arricchimento secondario secondo la tecnica nota oppure per fornire una coltura batterica liquida da impiegarsi successivamente per l'isolamento e l'identificazione del patogeno ricercato, e, preferibilmente, essendo tale/i provetta/e F munita/e di un sistema di agitazione {p. e . un sistema interno di agitazione continua, preferibilmente, agitazione magnetica);

(b)nel caso in cui vi sia più di una provetta F assemblata con il contenitore A, essendo il terreno di coltura liquido contenuto in ciascuna provetta F di natura diversa da quello contenuto nella/e altra/e, in modo da poter esplicare una selettività più specifica verso il medesimo patogeno o una selettività verso patogeni diversi;

(c)sottoporre il campione alimentare introdotto nel contenitore A ad un adeguato periodo di incubazione (p.e. da 8 a 24 ore), preferibilmente sotto agitazione, ad una temperatura compresa fra i valori di temperature corporea che si riscontrano abitualmente in persone che si trovano in uno stato di salute normale (p.e. fra 35 e 37,5°C, preferibilmente a 37°C) al fine di eseguire la fase di arricchimento primario;

(d)trasferire meccanicamente una predeterminata porzione della coltura batterica arricchita contenuta nel contenitore A in almeno una provetta F, assemblata con detto contenitore;

(e)sottoporre il campione trasferito nella/e provetta/e F ad un adeguato periodo di incubazione (p.e. da 8 a 24), preferibilmente sotto agitazione, ad una temperatura compresa fra i valori di temperatura corporea che si riscontrano abitualmente in persone in uno stato di salute normale (p.e. fra 35 e 37,5°C, preferibilmente a 37°C) al fine di eseguire la fase di arricchimento secondario oppure di fornire una coltura batterica liquida da impegnarsi per l'isolamento e l'identificazione del patogeno ricercato secondo tecniche note;

(f)se si desidera, continuare l'incubazione della porzione rimasta nel contenitore A per un ulteriore periodo (p.e. per un totale di 48 ore) per completare la fase di arricchimento primario; (g)se si desidera, nel caso in cui sia assemblata con il contenitore A più di una provetta F, trasferire meccanicamente una predeterminata porzione della coltura batterica arricchita risultante dalla fase (f) in almeno una provetta F assemblata con il contenitore A che non sia stata precedentemente utilizzata secondo le fasi (d) ed (e), e sottoporre il campione trasferito in detta/e provetta/e ad incubazione secondo le stesse condizioni di cui alla fase (e) per eseguire la fase di arricchimento secondario o per ottenere una coltura batterica liquida da impiegarsi per l'isolamento e identificazione della coltura risultante.

La determinazione della contaminazione batterica del campione alimentare viene poi completata da una ulteriore fase che consiste nell'isolare e identificare con metodi per sé noti la specie batterica delle colture risultanti nella/e provetta/e F dalle fasi (e), e/o (g) di cui sopra.

Una ulteriore caratteristica del procedimento di questa invenzione è costituita dal fatto che il trasferimento di una porzione della coltura batterica arricchita dal contenitore A alla/e provetta/e F si realizza mediante una differenza di pressione fra il contenitore A e la/e provetta/e F dovuta ad un vuoto calibrato praticato nella/e provetta/e F contenente/i il/i terreno/i di coltura idoneo/i per l'accrescimento secondario, che opera quando l'interno del contenitore A viene messo in comunicazione con l'interno della/e provetta/e F tramite un condotto (o canula) C solidale con il contenitore A e dotato di mezzi adatti a perforare una parete perforabile che separa l'interno del contenitore A dall'interno della/e provetta/e F, tale perforazione avvenendo a seguito di un movimento di translazione della/e suddetta/e provetta/e F rispetto al suddetto contenitore A. Il movimento di translazione può realizzarsi, per esempio, attraverso l'esercizio di una pressione sulla provetta F in direzione assiale verso la cannula C.

L'obbiettivo principale delle indagini microbiologiche nel settore alimentare è la rilevazione, in alcuni casi anche di fronte a bassissime concentrazioni, nel più breve tempo possibile e con un metodo il più standardizzato possibile, di batteri patogeni per l'uomo.

Per ottenere questi obbiettivi devono essere utilizzati idonei terreni colturali e condizioni di incubazione appropriate per la crescita batterica.

Per questo motivo un sistema pronto per l'uso e completo di contenitori vari con idonei terreni colturali, anche di facile e pratico utilizzo, è una valida risoluzione delle esigenze degli operatori del settore alimentare.

Ad oggi non sono conosciuti sistemi automatici utilizzati nella prima fase dell'analisi del campione alimentare, cioè nella fase di raccolta, campionamento e arricchimento primario ed, eventualmente, secondario.

Sono invece conosciuti sistemi per la seconda fase dell'analisi, cioè l'identificazione della specie batterica delle colture ottenute dalla prima fase (rif. 5).

In ogni caso, qualunque tipo di metodologia utilizzata per l'identificazione batterica si avvale della prima fase di arricchimento (rif. 6, 7 , 8 ) .

Per la rilevazione possono essere utilizzate tecniche molto sensibili e specifiche come, ad esempio, il metodo della "polymerase chain reaction" (PCR) (rif. 9, 10).

L'approccio alla fase di arricchimento primario secondo il metodo dell'invenzione viene affrontato e risolto con questo sistema offrendo diversi vantaggi:

minima manualità richiesta all'operatore: si rende necessaria solo la raccolta del campione per l'inoculo nel contenitore A;

- arricchimento primario efficace e standardizzato in automazione per tempi prefissati;

arricchimento secondario in condizione standardizzate e di sicurezza in quanto eseguite in completa automazione senza 1'intervento dell'operatore .

Inoltre, come sopra anticipato per ambedue le fasi di arricchimento, il metodo preferibilmente utilizza anche un principio ben noto e riconosciuto valido in batteriologia per accelerare lo sviluppo batterico: l'agitazione della coltura durante l'incubazione. Infatti, secondo un modo preferito di attuazione dell'invenzione, tutti i contenitori impiegati in questo sistema sono dotati di un sistema di agitazione, per esempio, agitazione magnetica, attraverso ancorette magnetizzate.

L'agitazione della coltura da parte delle ancorette sottoposte ad azione magnetica, ad esempio in uno strumento apposito, accelerano lo sviluppo batterico poiché lo scambio di sostanze nutritive e di ossigeno necessari alla crescita batterica stessa sono molto facilitati.

E' noto infatti che una coltura mantenuta sotto agitazione raggiunge in 4-5 ore la stessa concentrazione batterica di una coltura tenuta in incubazione per circa 18 ore in condizioni statiche .

Il dispositivo particolarmente adatto per l'esecuzione del metodo secondo questa invenzione è costituito da un contenitore A e da una o piu provette F assemblabili con il contenitore A.

Una descrizione dettagliata del dispositivo particolarmente adatto per l'esecuzione del metodo dell'invenzione può essere seguita facendo riferimento alla Figura 1 dove viene rappresentato il contenitore A per la raccolta del campione da analizzare, di dimensioni e forma specifica (p.e. preferibilmente di forma cilindrica) e di materiale sufficientemente resistente (p.e. materiale plastico) , atto a contenere il terreno liquido per coltura B idoneo per l'arricchimento primario. Secondo una realizzazione preferita, detto contenitore A è dotato di una ancoretta magnetizzata H. Il contenitore A è munito di tappo D a chiusura, preferibilmente a vite, preferibilmente dello stesso materiale del contenitore A; tale tappo è sagomato in modo da accogliere uno o più (generalmente non più di 2) "holder", un dispositivo comunemente impiegato per la raccolta di un campione liquido costituito da un contenitore E munito di un condotto o cannula e che mette in comunicazione l'interno del contenitore E con l'interno del contenitore A attraverso una porzione terminale, preferibilmente, di forma appuntita, munita di un'apertura, che si protende verso l'interno del contenitore E ("ago"). Nella Figura 1 il tappo D (il cui sistema di chiusura, per semplicità, non viene rappresentato) accoglie due "holder" di cui uno è rappresentato in sezione e l'altro in vista.

La porzione della cannula dell' "holder" che si estende all'interno del contenitore A è di lunghezza tale che una parte di essa rimane immersa nel terreno di arricchimento primario B quando questo è introdotto nel contenitore A. Il dispositivo comprende inoltre una o più provette F (Figura 2) di forma e dimensioni specifiche, compatibili con quelle dell'/degli "holder", e atte a contenere una opportuna quantità di terreno liquido idoneo per l'arricchimento secondario. Tale/i provetta/e è/sono munite di una parete o sezione perforabile, preferibilmente costituita da un tappo G di materiale perforabile (p.e. gomma) da uno strumento appuntito, ed è/sono idonea/e a sopportare il vuoto calibrato che viene praticato dopo che è stato introdotto il terreno di arricchimento secondario.

Il contenitore A e la/e provetta/e F sono preferibilmente dotati di un sistema di agitazione che può realizzarsi internamente e in continuo, p.e., attraverso ancorette magnetiche (H, I) di forma e dimensione opportune.

Per esempio, in un contenitore A di forma cilindrica e dimensioni corrispondenti a quelle più avanti riportate può utilizzarsi un ancoretta (H) di plastoferrite a forma quadrata di dimensioni 10 x 10 mm e di spessore di 2 mm. 1/ /Le ancoretta/e I all'interno della/e provetta/e può/possono avere forma quadrata e dimensioni di 3 x 3 mm e spessore di 1 mm.

Quindi, più specificamente, un dispositivo particolarmente adatto alla realizzazione del metodo di questa invenzione nel suo allestimento definito, pronto per l'impiego previsto, consiste in un primo contenitore A per la raccolta e la campionatura degli alimenti solidi o liquidi, contenente un idoneo terreno liquido per colture batteriche, non selettivo, che permette lo sviluppo indifferenziato di tutte le specie batteriche; una o più provette F di forma e dimensioni tali che detta/e provetta/e inserita/e nell'/negli"holder" con la parete perforabile, preferbilmente costituita dal tappo G, rivolta verso la parte terminale della cannula C dell' "holder" E, formano un sistema assemblato con il contenitore A, detta/e provetta/e contenendo specifico/i terreno/i selettivo/i per l'arricchimento batterico secondario ed essendo sottoposte ad un vuoto calibrato idoneo a provocare il trasferimento di una predeterminata quantità del contenuto del contenitore A nella/e provetta/e I a seguito della perforazione della parte perforabile, preferibilmente costituita dal tappo G, ad opera della parte terminale della cannula C dell' "holder" E.

La figura 1 mostra il dispositivo costituito dal contenitore A, con il tappo D, 1' "holder" E munito di cannula C (senza la/le provetta/e F) e l'ancoretta magnetica H.

La figura 2 mostra una provetta F munita di tappo G e la rispettiva ancoretta magnetica I. La Figura 3 mostra il contenitore A assemblato con il tappo D nel cui "holder" è stata inserita una provetta F con il tappo G rivolto verso l'ago dell'"holder". La figura 4 mostra il dispositivo dove, in seguito a pressione esercitata sulla provetta F, si è verificata la perforazione del tappo da parte dell'ago dell' "holder".

Secondo un esempio specifico ma non limitante della realizzazione dell'invenzione in cui sia la forma, sia le dimensioni dei contenitori, sia il materiale con cui questi sono fabbricati hanno un valore puramente dimostrativo, il contenitore A è preferibilmente di forma cilindrica e di materiale plastico, p.e., polipropilene, sterilizzato, ed è dotato di tappo a vite ad avvitatura esterna, preferibilmente dello stesso materiale del contenitore, tale tappo essendo munito di uno o più "holder" di medesimo materiale plastico. Le dimensioni di un contenitore A, assemblato con due provette F e quindi munito di tappo con due "holder" possono, per esempio, essere le seguenti: raggio del fondo del cilindro circa 4 cm; altezza del cilindro circa 9 cm.

Sempre per un esempio specifico ma non limitante di realizzazione dell'invenzione, le provette F sono di forma preferibilmente cilindrica e di materiale plastico avente adeguate caratteristiche di resistenza meccanica come, ad esempio, il metacrilato, tali provette essendo munite di tappo a tenuta di materiale perforabile mediante ago o altro strumento appuntito (p.e. gomma). Come detto più sopra, le provette F vengono poste sotto vuoto calibrato dopo che è stato introdotto il terreno di arricchimento secondario. Nel caso di assemblaggio con un contenitore del tipo sopra menzionato le provette F possono avere, p.e., le seguenti dimensioni raggio del cilindro circa 0,5 cm; altezza circa 8 cm. Il vuoto calibrato praticato nella/e provetta/e F è determinato in relazione alla quantità di coltura batterica che si vuol trasferire dal contenitore A, tenendo conto delle dimensioni della/e provetta/e F. Per esempio, il vuoto praticato nella/e provetta/e F può essere calibrato in modo tale che nella/e provetta/e F confluisca dal contenitore A una quantità di circa 0.1 mi di coltura batterica che ha completato la fase di arricchimento primario.

Il tappo perforabile può presentare al suo interno un avvallamento o incavo che permette il libero movimento dell'ancoretta magnetica quando la parte terminale della cannula dell' "holder", a seguito della perforazione del tappo stesso, penetra nella provetta F.

Nell'attuazione pratica di questa invenzione il dispositivo pronto per l'impiego nel procedimento sopra descritto, si presenta con il contenitore A assemblato alla(e) provetta(e) F; tutto l'assemblato è sterilizzato e contiene idonei terreni liquidi di coltura per l'arricchimento primario (B) e per l'arricchimento secondario in quantità variabile: p.e., nel contenitore A da 50 a 300 mL, nelle provette F da 2 a 10 mL, quando le loro dimensioni sono quelle più sopra riportate.

In pratica, l'esecuzione del metodo dell'invenzione, secondo un modo preferito dell'attuazione dell'invenzione, prevede la conduzione delle seguenti operazioni e l'impiego un sistema termostatato e capace di indurre l'agitazione magnetica (per ragioni di semplificazione, viene qui di seguito descritto un esempio, peraltro non limitante, in cui viene utilizzata una sola provetta F):

I) Aprire il tappo D e introdurre una quantità sufficiente di campione alimentare da analizzare nel contenitore A (p.e. 25 grammi) che a sua volta contiene il terreno liquido di coltura per l'arricchimento primario;

II) Richiudere con il tappo D (nel cui "holder" viene inserita la provetta F contenente l'apposito terreno liquido per l'arricchimento secondario sotto vuoto calibrato, con il tappo rivolto verso l'ago dell' "holder") il contenitore A contenente il terreno e il campione da analizzare;

III) Introdurre il dispositivo nell'apposito strumento che produce condizioni termostaticamente stabili di incubazione alla temperatura più sopra definita, p.e., a 37°C, e sottoporre ad agitazione continua, tramite l'ancoretta magnetizzata posta all'interno del contenitore A, il campione in analisi;

IV) Dopo un appropriato tempo di incubazione (generalmente da 8 a 24 ore) a 37°C, sottoporre il fondo della provetta F ad una pressione (p.e., mediante un pistone) in modo da determinare la perforazione del tappo della provetta F stessa per mezzo dell'ago dell' "holder", e permettere che nella provetta F, nella quale è stato precedentemente praticato un vuoto calibrato, si trasferisca una predeterminata quantità di liquido contenuto in A; nella provetta F, dopo incubazione (generalmente da 8 a 24 ore, con agitazione magnetica) a 37 °C, si realizza l'arricchimento secondario oppure una coltura liquida che può essere utilizzata immediatamente per l'isolamento e l'identificazione del patogeno ricercato secondo tecniche note;

V) Nel caso in cui le provette F siano più di una, l'operazione del punto IV può essere ripetuta sia simultaneamente, sia in successione con le ulteriori provette F.

Un aspetto particolare di questa invenzione è costituito dal fatto che il trasferimento della brodocoltura di arricchimento primario del terreno per arricchimento secondario, definito nei suddetti passaggi IV e V, è determinato dalla perforazione meccanica, da parte dell'ago dell' "holder", a seguito di una pressione sulla/e provetta/e: tutto il processo può essere automatizzato in uno strumento che esegue automaticamente l'operazione senza l'intervento manuale di un operatore.

Questo permette di evitare manipolazioni da parte dell'operatore con possibilità di eventuali, casuali contaminazioni oltre ad un risparmio in termini di tempo e di lavoro.

Come descritto sopra, una volta completata la fase IV ed, eventualmente V, si può prelevare il contenuto della/e provetta/e F e sottoporlo ad isolamento su terreni di coltura agarizzati per la selezione di specifiche specie batteriche responsabili di infezioni alimentari.

Sono noti vari tipi di terreni colturali e di normale utilizzo in questo tipo di analisi (rif.

11, 12).

Le fasi di arricchimento sia primario che secondario risultano essere indispensabili per la fase successiva della caratterizzazione della/e specie batterica/he. Infatti, qualsiasi tecnica o sistema venga utilizzato per l'identificazione è prevista e necessaria la fase di arricchimento favorendo quest'ultima lo sviluppo anche di pochi batteri eventualmente presenti in un alimento. Anche tecniche che sfruttano, per l'identificazione di specie, metodiche molto sensibili come la POR, richiedono la fase preanalitica dell'arricchimento (rif. 13, 14).

Quindi risulta da ciò evidente l'utilità di questa invenzione per la sua applicazione nel settore alimentare dove la necessità di standardizzare il metodo di raccolta e campionamento degli alimenti da analizzare è di esigenza primaria.

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

1. Bird CB et al. Reveal for Salmonella test System. J. AOAC Int. 1999; 82(3): 625-633.

2. Bolton FJ et al. Rapid enzyme - linked immunoassay for detection of Salmonella in food and feed products: performance testing program. J. AOAC

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento automatizzato per l'arricchimento batteriologico primario e secondario di un campione di alimenti sottoposto ad analisi batteriologica caratterizzato dal fatto che detto procedimento comprende le seguenti fasi: (a) introdurre in un primo contenitore (A) una quantità sufficiente di campione alimentare da analizzare adeguatamente preparato, detto contenitore essendo assemblato con uno o più contenitori (provetta/e F) di dimensioni e forme adatte per essere assemblate con il contenitore A e, detto contenitore A contenendo una quantità di terreno liquido di coltura appropriato B per promuovere l'arricchimento primario secondo la tecnica nota e, preferibilmente, essendo munito di un sistema di agitazione; detta/e provetta/e F contenendo una quantità appropriata di terreno di coltura liquido per promuovere l'arricchimento secondario secondo la tecnica nota oppure per fornire una coltura batterica liquida da impiegarsi successivamente per l'isolamento e l'identificazione del patogeno ricercato, e, preferibilmente, essendo tale/i provetta/e F munita/e di un sistema di agitazione; (b) nel caso in cui vi sia più di una provetta F assemblata con il contenitore A, essendo il terreno di coltura liquido contenuto in ciascuna provetta F di natura diversa da quello contenuto nella/e altra/e, in modo da poter esplicare una selettività più specifica verso il medesimo patogeno o una selettività verso patogeni diversi; (c) sottoporre il campione alimentare introdotto nel contenitore A ad un adeguato periodo di incubazione, preferibilmente sotto agitazione, ad una temperatura compresa fra i valori di temperatura corporea che si riscontrano abitualmente in persone che si trovano in uno stato di salute normale, preferibilmente fra 35 e 37,5°C, più preferibilmente a 37°C, al fine di eseguire la fase di arricchimento primario; (d) trasferire meccanicamente una predeterminata porzione della coltura batterica arricchita contenuta nel contenitore A in almeno una provetta F, assemblata con detto contenitore; (e) sottoporre il campione trasferito nella/e provetta/e F ad un adeguato periodo di incubazione, preferibilmente sotto agitazione, ad una temperatura compresa fra i valori di temperatura corporea che si riscontrano abitualmente in persone che si trovano in uno stato di salute normale, preferibilmente fra 35 e 37 , 5°C, più preferibilmente a 37°C, al fine di eseguire- la fase di arricchimento secondario oppure di fornire una coltura batterica liquida da impegnarsi per l'isolamento e l'identificazione del patogeno ricercato secondo tecniche note; (f) se si desidera, continuare l'incubazione della porzione rimasta nel contenitore A per un ulteriore periodo per completare la fase di arricchimento primario; (g) se si desidera, nel caso in cui sia assemblata con il contenitore A più di una provetta F, trasferire meccanicamente una predeterminata porzione della coltura batterica arricchita risultante dalla fase (f) in almeno una provetta F assemblata con il contenitore A che non sia stata precedentemente utilizzata secondo le fasi (d) ed (e), e sottoporre il campione trasferito in detta/e provetta/e ad incubazione secondo le stesse condizioni di cui alla fase (e) per eseguire la fase di arricchimento secondario o per ottenere una coltura batterica liquida da impiegarsi per l'isolamento e identificazione della coltura risultante.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 che viene completato dalla ulteriore fase di determinazione della contaminazione batterica del campione alimentare consistente nell'isolare e identificare con metodi per sé noti la specie batterica delle colture risultati nella/e provetta/e F dalle fasi (e), e/o (g) del procedimento di cui alla rivendicazione 1.
3. 3. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 1 e 2, dove sia il contenuto del contenitore A, sia il contenuto della/e provetta/e F è sottoposto ad agitazione interna mediante ancorette magnetiche.
4. 4. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3 dove la temperatura di incubazione è compresa fra 35 e 37, 5°C, preferibilmente 37°C.
5. 5. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 4 dove il trasferimento meccanico di una predeterminata porzione della coltura batterica arricchita dal contenitore A alla/e provetta/e F si realizza mediante una differenza di pressione fra il contenitore A e la/e provetta/e F dovuta ad un vuoto calibrato praticato nella/e provetta/e F contenente/i il/i terreno/i idoneo/i per l'accrescimento secondario, che opera quando l'interno del contenitore A viene messo in comunicazione con l'interno della/e provetta/e tramite un condotto (o cannula) C solidale con il contenitore A dotato di mezzi adatti a perforare una parete perforabile che separa l'interno del contenitore A dall'interno della/e provetta/e F, tale perforazione avvenendo a seguito di un movimento di translazione della/e suddetta/e provetta/e F rispetto al suddetto contenitore A.
6. 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5 in cui il movimento di translazione della/e provetta/e F rispetto al contenitore A è realizzato mediante l'esercizio di una pressione sulla/e provetta/e F in direzione assiale verso la cannula C.
7. 7. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6 dove i patogeni ricercati nel campione alimentare sono ceppi provenienti da uno o più dei seguenti microorganismi: Listeria monocytoqenes , Salmonella spp., Shigella spp, Enterobacteriaceae, Staphylococcus_ aureus, Clostridium_ spp. Campylobacter_ jejuni, Campylobacter fetus spp. fetus, Escherichia coli 0157:H7 .
8. 8. Dispositivo atto alla realizzazione del procedimento di cui alle rivendicazioni da 1 a 7 consistente in: (a) un contenitore A (Fig. 1) per la raccolta del campione alimentare da analizzare, di dimensioni e forma idonee a contenere il terreno di coltura liquido per l'arricchimento primario, munito di un tappo D a chiusura, preferibilmente a vite, tale tappo essendo sagomato in modo da accogliere uno o più "holder" E munito/i di cannula C che mette in comunicazione l'interno dell' "holder" E con l'interno del contenitore A, detta cannula essendo dotata di una porzione terminale atta a perforare una parete perforabile, preferibilmente di forma appuntita, munita di un apertura, che si protende verso l'interno dell' "holder" E. (b) una o più provette F (Fig. 2) di forma e dimensioni compatibile/i con quella/e del/degli "holder", atte a contenere una opportuna quantità di terreno liquido per l'arricchimento secondario, e dì sopportare un vuoto calibrato, tale provette essendo dotate di una parete o sezione perforabile dalla cannula C, preferibilmente costituita da un tappo G di materiale perforabile da uno strumento appuntito .
9. 9. Dispositivo secondo la rivendicazione 8 dove il contenitore A e la/e provetta/e F sono dotate/i di ancorette magnetiche e la porzione terminale della cannula C che si protende all'interno dell' "holder" D ha forma appuntita atta a perforare il tappo G della/e provetta/e F.
10. 10. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni 8 e 9 dove il contenitore A e la /e provetta/e F sono di forma cilindrica e di materiale plastico, preferibilmente, polipropilene o metacrilato e il tappo G perforabile da uno strumento appuntito è preferibilmente di gomma.
11. 11. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 9 a 1C dove il tappo G perforabile da uno strumento appuntito della/e provetta/<'>e F presenta al suo interno un avvallamento o incavo che permette il libero movimento dell'ancoretta magnetica quando la parte terminale della cannula dell' "holder", a seguito della perforazione del tappo G penetra nella/e provetta/e F.
12. 12. Dispositivo secondo una delle rivendicazioni da 7 a 11 (Fig. 3) dove (a) il contenitore A, munito di tappo D, contiene il terreno liquido di coltura idoneo per l'arricchimento primario, e una parte della cannula C dell' "holder" E è immersa nel suddetto terreno liquido di coltura per l'arricchimento primario e (b) la/e provetta/e F è/sono inserita/e nell' "holder" E con la parete o sezione di materiale perforabile, preferibilmente costituita dal tappo G, rivolta verso la parte terminale della cannula C, formando un sistema assemblato con il contenitore A, detta/e provetta/e contenendo specifico/i terreno/i selettivo/i per l'arricchimento batterico secondario ed essendo sottoposte ad un vuoto calibrato idoneo a provocare il trasferimento di una predeterminata quantità del contenuto del contenitore A nella/e provetta/e F a seguito della perforazione del tappo G ad opera della parte terminale della cannula G dell' "holder" E (Fig., 4).
13. 13. Dispositivo secondo la rivendicazione 12 dove la perforazione del tappo G ad opera della porzione terminale della cannula C avviene per opera di una pressione esercitata sul fondo della/e provetta/e F inserita/e nell'/negli "holder" E.