ITMI20010583A1 - Sequenza di dna con funzioni promotrici - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione concerne una sequenza promotrice di DNA adatta alla trasformazione di piante, un elemento regolativo interno a questa sequenza anch'esso utilizzabile per la trasformazione delle piante, i costrutti di DNA (geni chimerici) comprendenti l'intera sequenza promotrice, nuovi vettori di trasformazione e le piante geneticamente modificate da esse derivate . Più in particolare l'invenzione concerne un promotore isolato da un gene di beta-tubulina di riso, utile per l'espressione di geni di interesse farmacologico, agricolo e/o industriale, nelle piante.

La trasformazione delle piante con sequenze di DNA che codificano per prodotti ad uso farmacologico, agricolo e/o industriale rappresenta uno dei settori di crescente interesse e sviluppo economico. Di altrettanta importanza risulta la modificazione genetica delle piante al fine di renderle più produttive e resistenti agli stress ambientali o agli attacchi dei patogeni.

A tal fini, le piante vengono modificate mediante l'inserimento di geni prescelti che codificano per la produzione dei prodotti desiderati.

Per l'espressione dei geni, sono necessari almeno due elementi genetici fondamentali: il gene in sè, ovvero la sequenza di DNA che codifica per il prodotto desiderato (sia esso una proteina anti-virale, un insetticida, un prodotto farmacologico, ecc.) e la sequenza di DNA detta "promotore" posta a monte del gene, che ne regola e ne sostiene l'espressione. Senza il promotore nessun gene può essere espresso e di conseguenza la proteina relativa non può essere prodotta.

Un promotore o sequenza promotrice può distinguersi per varie caratteristiche, in particolare per la sua forza e per la sua attività nel corso della crescita e dello sviluppo della pianta. Esistono infatti promotori molto forti cioè in grado di sostenere alti livelli di espressione del gene che controllano e viceversa promotori definiti deboli che determinano un modesto livello di espressione. Esistono inoltre promotori chiamati "costitutivi" che sono in grado di sostenere l'espressione genica in qualsiasi organo o tessuto della pianta così come esistono promotori "inducibili" che vengono cioè attivati da stimoli esterni (es. dalla luce, da ormoni, da un danno meccanico ecc.) o promotori specifici per alcuni particolari organi o tessuti di pianta.

Nonostante i promotori siano in generale alquanto duttili, non tutti i promotori funzionano in tutte le piante potenzialmente oggetto di protocolli di trasformazione genetica. Una distinzione primaria va fatta ad esempio tra i promotori in grado di funzionare in piante dicotiledoni e quelli attivi in piante monocotiledoni, questa diversa funzionalità derivando dalle peculiari caratteristiche del sistema di regolazione dell'espressione genetica che sono specifiche per i due tipi di piante.

Si comprende quindi che nella trasformazione delle piante, l'impiego della sequenza promotrice più opportuna è un fattore critico. L'utilizzo di promotori che sostengono livelli di espressione molto alta, quali per esempio quello derivato dal virus dal mosaico del cavolfiore (35SCaMV) può sbilanciare eccessivamente il metabolismo generale della pianta, interferendo quindi con la produzione di altre proteine necessarie alla pianta. Un altro aspetto degno di nota è l'estraneità delle sequenze promotrici rispetto al genoma della pianta trasformata; questo elemento di eterogeneità è tuttora oggetto di discussione in quanto si ritiene che sia meno rischioso l'impiego di sequenze genetiche promotrici endogene alla pianta oggetto della trasformazione o comunque non distanti filogeneticamente da essa quale ad esempio, l'utilizzo di un promotore isolato da un cereale per la trasformazione di un altro cereale.

Queste indicazioni hanno portato alla scoperta di ulteriori promotori isolati da differenti specie di piante e capaci di fornire differenti livelli e tipologie di espressione. Anche così facendo tuttavia gli approcci transgenici sono tutt'ora basati su un piccolo gruppo di sequenze promotrici poiché la maggior parte di esse sono troppo specifiche o di impiego complicato, o in altri casi, si rivelano inadeguate a causa di problemi imprevisti quali i riarrangiamenti di DNA.

Nel caso ad esempio del promotore dell'alfa-tubulina 1, un limite evidente di utilizzo qualora ne si conservi l'integrità di struttura, risiede nella estrema rigidità di ingegnerizzazione che esso impone alle strategie di clonaggio e ricombinazione del DNA prima della trasformazione. E' infatti documentato che l'elemento promotore di questo gene di riso si compone di una sequenza non codificante a monte del sito di inizio della traduzione combinato però ad un introne presente nella regione codificante per 1'alfa-tubulina 1. E' solo la co-presenza di questi due elementi genetici in un vettore di trasformazione che ne garantisce l'effettiva attività promotrice ma ciò impone dei limiti alla produzione dei costrutti per la trasformazione che devono essere concepiti come proteine chimeriche che veicolino una parte N-terminale di alfa-tubulina 1 di riso, cosa che porta ad ottenere proteine originate dalla giustapposizione dei primi 31 aminoacidi dell 'alfa-tubulina 1 del riso e della proteina di interesse. Questo risultato può rivelarsi non desiderabile nè compatibile con le caratteristiche del prodotto che si desidera far produrre nella pianta, che potrebbe presentare problemi di espressione, di stabilità e persino mostrare proprietà alterate. In alternativa sarebbe possibile usare un costrutto di alfa-tubulina 1 di riso dove l'elemento promotore a monte dell'ATG e l'elemento introne presente nella regione codificante siano affiancati attraverso manipolazione genetica. Una tale configurazione, ancorché produttiva, rappresenta di per sè un riarrangiamento genetico che sarebbe opportuno evitare di produrre non conoscendone le eventuali implicazioni sui generali meccanismi regolativi intracellulari.

Scopo della presente invenzione è quindi di fornire un promotore che possa essere usato in protocolli di trasformazione di una delle più importanti piante alimentari, il riso, e che sia utilizzabile anche negli altri cereali (che costituiscono un altrettanto fondamentale gruppo di piante alimentari) e che nel contempo minimizzi i rischi genetici e ambientali.

È stata ora infatti isolata una sequenza ad attività promotrice dei geni delle beta-tubuline di riso (denominata p ) ed identificato un introne (denominato ) in essa presente, che possono essere impiegati nella costruzione di geni chimerici utili per la trasformazione delle piante.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

La Figura 1 (da 1-1 a 1-4) riporta la sequenza dell'intera regione di 2028 coppie di basi contenente tre diversi elementi : la sequenza a monte del sito di inizio della trascrizione (dal nucleotide 1 al nucleotide 1101); la sequenza di DNA corrispondente alla sequenza leader dell'mRNA (dal nucleotide 1102 al nucleotide 1159 e dal nucleotide 2023 al nucleotide 2028), interrotta dalla presenza dell' (dal nucleotide 1160 al nucleotide 2022). La Figura 2 riporta il disegno dei plasmidi usati nella trasformazione dei calli di riso e contenenti i geni chimerici con GUS. Il è il gene chimerico che contiene come promotore l'intera sequenza ad attività promotrice proTubl6 comprensiva dell ' . Il è il gene chimerico che contiene solo la sequenza a monte del sito di inizio della trascrizione, senza

1' Il è il gene chimerico

dove l'attività promotrice è unicamente sostenuta dall I tre plasmidi contengono tutti il gene UidA di E. Coli come gene reporter per i saggi enzimatici GUS e la sequenza NosT del gene della nopalina sintasi del T-DNA di Agrobacteriium tumefaciens come terminatore della trascrizione.

La Figura 3 rappresenta una stampa in bianco e nero dei dati di trasformazione di embrioni da calli di riso sotto forma di colorazione istochimica, ottenuti dal bombardamento con i costrutti ,

e . Dopo il

bombardamento, i calli sono stati incubati in presenza del substrato cromogenico X-Glc (acido 5-bromo-4-cloro-

. Si evidenzia la colorazione

blue (nella figura indicata dalle porzioni più scure) dovuta all'idrolisi di questo composto. Le frecce bianche nel campione trasformato con

indicano quei calli dove è possibile vedere pochi ma significativi "spots" di colorazione istochimica GUS La Figura 4 riporta in istogramma i dati di un saggio rappresentativo di attività GUS misurata per via fluorometrica. Sono mostrati i dati relativi a tre diverse ripetizioni di ogni campione bombardato rispettivamente con il plasmide di controllo (pAHC25) contenente il gene GUS sotto il controllo del promotore del gene Ubil di mais e il plasmide

La Figura 5 rappresenta la sequenza del gene OsTubl6 impiegato in via preliminare come sonda nello screening per ibridazione molecolare di una libreria genomica di riso al fine di isolare la sequenza promotrice dell'invenzione.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce quindi alla nuova sequenza promotrice preposta al controllo dell'espressione di un isotipo della famiglia dei geni della beta-tubulina, che è in grado di sostenere livelli moderatamente elevati e quindi non dannosi, dei geni che sono posti sotto il suo controllo.

Così, un primo oggetto della presente invenzione è quindi una regione di DNA che definisce un promotore funzionale, capace di sostenere l'espressione in piante di geni posti sotto il suo controllo, avente la sequenza indicata nella Figura 1.

Più in particolare, la sequenza di DNA di cui alla Figura 1 è costituita da due porzioni giustapposte. La prima dal nucleotide 1 al nucleotide 1101 rappresenta quella porzione dì DNA strutturalmente definibile come promotore perchè collocata a monte del putativo sito di inizio della trascrizione nella sequenza genomica codificante 1'isotipo 16 di beta tubulina di riso. La seconda porzione - dal nucleotide 1160 al nucleotide 2022 - è costituita da un introne di 862 basi inserito nella regione leader del trascritto dello stesso gene. Questo introne è fondamentale nel sostenere alti livelli di efficienza del promoter ed insieme ad esso concorre a definire l'intera sequenza ad attività promotrice oggetto della presente invenzione .

L'intera sequenza promotrice della presente invenzione, che può essere isolata dal genoma di riso, viene qui di seguito denominata

La sequenza costituita da 862 basi e corrispondente all'introne, viene qui di seguito definita

Il promotore può essere isolato attraverso un primo screening di una libreria genomica di riso mediante ibridazione molecolare utilizzando come sonda la regione codificante il gene OsTubl6 oppure mediante PCR su DNA genomico a partire da "primers" specifici, utilizzando le tecniche note.

La sequenza del gene 0sTubl6 è riportata nella Figura 5.

Le 2028 coppie di basi nucleotidiche riportate in Figura 1 e che corrispondono al sono state successivamente isolate per ibridazione molecolare di una sonda proB7 su placche fagiche (vettore lambdaEMBL3) ricombinanti di una libreria genomica di riso prodotta a partire dal DNA di coleottili della varietà IR36.

La sonda molecolare proB7 (425 basi) corrisponde alla sequenza immediatamente precedente il codone di inizio della traduzione (ATG) dell'isotipo betal6 di tubulina di riso. Essa può essere prodotta per PCR inversa a partire dall'oligonucleotide degenerato T3 (5'-ATTGCCCNCCNTGGATGTG-3 ') disegnato su di una sequenza che è conservata in tutti i geni delle beta tubuline di piante e corrisponde al tetrapeptide N-terminale MREI (metionina, arginina, glutammico ed isoleucina). L'identificazione della banda amplificata di DNA corrispondente all'isotipo 16 di beta tubulina può essere realizzata attraverso il sequenziamento della stessa e il raffronto con regioni corrispondenti del cDNA dello stesso gene. La sonda molecolare proB7 rappresenta un frammento di questa regione amplificata di DNA genomico corrispondente alla posizione 1603 a 2028 della sequenza mostrata in Figura 1.

In particolare e come descritto più in dettaglio negli esempi che seguono, l'ibridazione molecolare che ha condotto all'isolamento di è avvenuta per piastramento e successivo trasferimento su supporto di nylon di 500.000 placche fagiche ricombinanti contenenti frammenti di varie dimensioni di DNA genomico di riso. Le 500.000 placche fagiche sono state dapprima suddivise in due grossi gruppi capaci di ibridare con sonde specifiche per le alfa o le beta tubuline di riso. A tal fine sono stati marcati i frammenti di cDNA corrispondenti a isotipi diversi della famiglia alfa o beta di tubulìna dì riso, tutti disponibili presso il laboratorio. La successiva analisi molecolare del gruppo delle placche fagiche che ibridavano positivamente con le sonde di cDNA della beta tubuline, condotta con l'utilizzo della sonda proB7, ha permesso di individuare 5 cloni fagici che contenevano tutti una porzione della sequenza di beta tubulina corrispondente all'isotipo beta 16. L'analisi preliminare condotta per "Southern blot" di questi 5 cloni fagici ha consentito di individuare quei due che contenevano un più lungo tratto di sequenza di DNA, capace di ibridare con la sonda proB7. Questi due cloni sono stati sequenziati a partire da "primers" disegnati a risalire sulla sequenza immediatamente a monte del sito ATG di inizio della traduzione. La sequenza dei due cloni fagici è risultata essere identica fino alle 2028 basi sequenziate, mostrate in Figura 1.

L'allineamento di questa sequenza genomica con quella del corrispondente cDNA codificante per 1'isotipo 16 di beta-tubulina, ha permesso di individuare la presenza dì un introne di 862 coppie di basi collocato a soli sette residui nucleotidici a monte del sito ATG di inizio della traduzione. L'identità tra le due sequenze di tubulina beta 16, genomica e di cDNA, veniva poi ristabilita a monte dell'introne e per la lunghezza di ulteriori 58 coppie di basi. La presenza di un introne nella sequenza leader dell'mRNA corrispondente all 'isotipo 16 di beta tubulina di riso è stata confermata attraverso opportuni esperimenti di PCR su RNA estratto da coleottili di riso.

La sequenza riportata in Figura 1 si caratterizza quindi per la presenza di tre diversi elementi: una sequenza corrispondente alla sequenza leader dell'RNA messaggero del gene betal6 (dal nucleotide 1101 al nucleotide 1159 e dal nucleotide 2023 al nucleotide 2028), un introne presente nella sequenza leader (dal nucleotide 1160 al nucleotide 2022) ed una sequenza a monte di quella leader e dell'introne (dal nucleotide 1 al nucleotide 1101).

L'intera sequenza di 2028 coppie di basi è stata quindi scomposta nei vari suoi elementi per identificare quelli capaci di conferire una attività promotrice dell'espressione del gene reporter della betaglucuronidasi (gene UidA di E. Coli detto GUS) . Attraverso metodiche standard di biologia molecolare la sequenza della Figura 1 è stata usata, tal quale o priva dell'introne, nella costruzione di geni chimerici con il gene reporter GUS. L' introne è stato anche usato da solo in associazione al gene GUS per verificarne l'eventuale attività promotrice dell'espressione (Figura 2).

I costrutti indicati in Figura 2 sono usati per la trasformazione di calli derivati da embrioni di riso, ottenuta attraverso il metodo biolistico (bombardamento con DNA).

Uno dei vantaggi forniti dal promotore è che esso, usato nella sua naturale configurazione, non necessita di essere messo "in frame" con il gene che si desidera far esprimere (come è invece necessario per 1 'alfa-tubulina 1 di riso) e non si ottengono di conseguenza proteine chimeriche la cui attività può rivelarsi difettosa o dannosa per il metabolismo della pianta .

Per il suo impiego il promotore viene associato alla sequenza del gene che si desidera far esprimere formando così un gene chimerico (unità trascrizionale o costrutto di DNA) che, una volta inserito in una cellula ospite, è in grado di far produrre la proteina desiderata.

L'introne presente nel promotore può anch'esso essere utilizzato in associazione con altre sequenze promotrici attive nelle piante con il fine di elevare i livelli di espressione delle proteine che vengono poste sotto il loro controllo.

L'espressione "gene che si desidera far esprimere" designa secondo la presente invenzione, una sequenza di DNA che può essere espressa in una cellula di una pianta appropriata, per esempio, un gene che codifica per un enzima, un recettore, un fattore di regolazione, o una qualsiasi altra proteina di interesse.

I costrutti di DNA comprendenti il promotore

dell'invenzione operativamente legato ad un gene che codifica per una proteina di interesse costituiscono un ulteriore oggetto della presente invenzione.

L'espressione "operativamente legato" significa secondo la presente invenzione che l'espressione del gene che codifica per la proteina di interesse è regolata dal promotore; in particolare detto gene è una regione di DNA localizzata a valle di detto promotore.

Anche i costrutti che utilizzano l'introne, presente nella sequenza a valle di altri promotori utili nella trasformazione delle piante e diversi da fanno parte della presente invenzione.

Sono moltissimi i geni chimerici (costrutti) che possono essere preparati con il promotore

dell'invenzione, preferibilmente, il gene operativamente legato al promotore dell'invenzione, codifica per una proteina di particolare utilità nel miglioramento genetico dei cereali sia in termini di produttività che di resistenza a patogeni o stress abiotici. Tra queste proteine di interesse vanno annoverate le forme mutate di tubulina di riso capaci di conferire alla pianta una maggiore tolleranza agli erbicidi ed alle basse temperature.

I costrutti dell'invenzione sono principalmente utilizzati per la trasformazione delle piante e a tale scopo essi possono essere inseriti in vettori appropriati secondo i metodi noti. Ad esempio possono essere utilizzati come vettori plasmidici, fagi e simili, che possono essere amplificati in un ospite batterico e quindi trasferiti in cellule vegetali utilizzando tecniche di trasformazione opportune.

I vettori comprendenti i costrutti dell'invenzione possono essere preparati clonando il costrutto in tali vettori usando le normali tecniche di ingegneria genetica.

Come vettori si possono ad esempio utilizzare sia plasmidi binari (es. pBinl9), utilizzati nella trasformazione delle piante mediata da Agrobatterio tumefaciens , che possono propagarsi sia in E. Coli che in Agrobatterio, sia plasmidi propagabili solo in E. Coli (es. serie PUC) utili per la trasformazione con metodi chimico-fisici ("particle gun", elettroporazione, PEG).

Il promotore 1'introne in esso presente, i costrutti e i vettori della presente invenzione possono dunque essere introdotti in cellule ospite, al fine di far esprimere il gene desiderato ed ottenere così la produzione delle proteine di interesse.

Cellule ospite vantaggiose secondo la presente invenzione sono cellule vegetali, in particolare, cellule di cereali. E' così possibile ad esempio inserire nel genoma di cellule vegetali uno o più costrutti dell'invenzione al fine di ottenere una o più proteine di interesse dalla pianta ottenuta per rigenerazione delle cellule trasformate.

Così, secondo un altro dei suoi aspetti, la presente invenzione concerne le cellule e le piante transgeniche trasformate con il promotore con il solo introne , con i costrutti o con i vettori dell'invenzione.

Secondo la presente invenzione, l'espressione "cellule e piante transgeniche", comprende cellule di piante, le piante e la loro progenie.

I costrutti dell'invenzione possono essere inseriti nel genoma di cellule di qualsiasi pianta, ma preferibilmente essi sono inseriti nel genoma di cereali, vantaggiosamente nel genoma di riso o di mais, orzo, frumento, avena.

Particolari combinazioni di piante trasformate sono ad esempio cereali (riso, mais, orzo, frumento, avena ed altri) che contengano forme mutate di tubulina espresse sotto il controllo del promotore

Le forme mutate di tubulina particolarmente vantaggiose sono quelle in grado di conferire alla pianta nella quale vengono trasferite una maggiore resistenza ad erbicidi o alla basse temperature. Questo sistema di trasformazione avvalendosi di un promotore e di una sequenza mutata di tubulina, entrambe di riso, rappresenta un approccio ideale di trasferimento genetico perchè si avvale di sequenze endogene, già presenti nei cereali, e di livelli di espressione moderati, non nocivi per il metabolismo della cellula. Un tale sistema di trasformazione, anche quando unicamente utilizzato per selezionare le piante trasformate, rappresenta di per sé un elemento di grande novità perchè abolisce l'uso degli antibiotici nella fase di selezione dei trasformanti. L'ottenimento di cereali resistenti ad erbicidi e freddo rappresenta poi il valore aggiunto derivato dall'applicazione degli insegnamenti dell'invenzione.

Sono evidenti i vantaggi derivanti dall'impiego delle sequenze dell'invenzione.

Un primo vantaggio E quello che scongiura fenomeni di riarrangiamento genetico o silenziamento genico frequentemente associati all'utilizzo di sequenze promotrici di origine virale. Il è stato infatti isolato dal genoma di riso e corrisponde ad uno dei geni di questa famiglia genica. Per queste ragioni,

non può subire nè riarrangiamento nè

silenziamento genico in quanto già presente nel genoma della pianta dove funziona in concomitanza all'espressione, anche elevata, di altri geni della sua stessa famiglia genica. Il suo utilizzo comporta pertanto una condizione sostanzialmente trascurabile di manipolazione genetica.

Un ulteriore vantaggio innovativo associato all'uso di

emerge dalla sua forza come promotore, che è

rilevante ma non eccessiva: garantisce così livelli significativi di espressione del transgene (o gene chimerico) senza compromettere o alterare il generale metabolismo della cellula vegetale. Infine può essere usato in associazione con geni codificanti per forme mutate di tubulina, proteina ad esso già naturalmente associata. Forme mutate di tubulina possono conferire alla pianta dove sono presenti vantaggi selettivi nella crescita, ad esempio in presenza dì erbicidi o basse temperature. Si realizza così un ulteriore grande vantaggio con importanti ricadute economiche ma con il minimo di manipolazione genetica.

Grazie alle sue proprietà, il dell'invenzione rappresenta quindi un promotore, particolarmente utile allo sviluppo di una nuova metodologia per la produzione di piante transgeniche caratterizzata da una drastica riduzione del rischio genetico e dell'impatto ambientale.

Il promotore secondo l'invenzione è isolabile dal genoma di riso ma resta inteso che sequenze di DNA aventi essenzialmente la sequenza indicata nella Figura 1, così come le sue varianti isolate da altre varietà o i suoi mutanti biologicamente equivalenti, sono compresi nella presente invenzione.

Secondo un altro dei suoi aspetti, l'invenzione concerne l'uso del promotore per il controllo dell'espressione di geni di piante.

L'invenzione concerne inoltre l'uso dell'introne presente in elemento di potenziamento dell'espressione di altre sequenze promotrici usate nella trasformazione delle piante e diverse da proTudl6.

Ancora, secondo un altro dei suoi aspetti, l'invenzione riguarda un metodo per far esprimere un gene che codifica per una proteina desiderata che comprende far esprimere in una cellula vegetale o in una pianta tale gene sotto il controllo del promotore o dell ' dell 'invenzione.

VALUTAZIONE DELL'ATTIVITÀ

La attività promotrice è valutata anche istochimicamente attraverso la colorazione dei calli con specifici substrati che sviluppano colore in modo proporzionale all'attività enzimatica GUS presente a sua volta dipendente dalla forza del promotore cui il gene UidA è legato.

I risultati ottenuti da questi esperimenti, rappresentativi di molti altri, sono riportati in Figura 3. Il gene chimerico contenente l'intera sequenza a monte dell'ATG dell'isotipo beta 16 di tubulina, incluso 1'introne presente nella sequenza leader, mostra una attività promotrice elevata decisamente superiore a quella osservata nel gene chimerico privo dell'introne. Questi dati suggeriscono che ha un ruolo importante nel sostenere un'alta attività promotrice dell' espressione della sequenza situata a monte del sito di inizio della trascrizione.

I risultati ottenuti indicano inoltre che

possa essere impiegato per esercitare

questo effetto di potenziamento dell'attività promotrice anche su altri promotori abitualmente utilizzati nei procedimenti di trasformazione genetica delle piante, come già dimostrato per un analogo introne presente nella regione codificante del gene della tubulina alfa 1 di riso.

Gli esempi che seguono illustrano alcuni aspetti rappresentativi dell'invenzione.

ESEMPIO 1

Produzione della sonda molecolare proB7 attraverso PCR inversa.

Il DNA genomico è isolato da germogli di riso di 5 giorni attraverso una metodica di estrazione nota che utilizza il CTAB (bromuro di esadeciltri-metilammonio) alla concentrazione del 2% peso/volume, come sostanza capace di migliorare il grado di purezza della preparazione. Un microgrammo di DNA è poi digerito con l'enzima MspI e successivamente richiuso per azione della T4 DNA ligasi. La reazione di ligazione che porta alla circolarizzazione dei frammenti di DNA genomico è condotta durante la notte a 16°C, in un volume di 700 microlitri con 10.5 unità Weiss di T4 DNA ligasi. Il tampone di reazione è quello fornito dalla ditta New England Biolabs.

Alla fine della reazione il DNA genomico autolegatosi è precipitato con etanolo alla concentrazione finale del 70%. Il DNA precipitato viene successivamente risospeso in 10 microlitri di H20 sterile;

La reazione di PCR inversa è innescata dai seguenti oligonucleotidi degenerati, sintetizzati chimicamente: Forward (T2) GTGTGTGATGAGCANGGNAT

Reverse. (T3) ATTGCCCNCCNTGGATGTG

Un tipico protocollo di amplificazione per PCR inversa è il seguente:

1 microlitro di DNA genomico autoligatosi proveniente dalla precedente reazione

lOOng di ciascun oligonucleotide-primer

0.5 unità di Taq DNA polimerasi

1OmM Tris-HCl pH 8.3

50 mM KC1

1.5 mM MgCl2

dUTP, dCTP/dATP, dGTP tutti a concentrazione finale di 200 mM

Volume della reazione 10 microlitri

Profilo termico e cicli di reazione:

1. 94°C per 2 min. 1 ciclo

2. 94°C per 20 sec.

3. 54°C per 20 sec.

4. 72°C per 2 min.

Gli step 2, 3 e 4 sono ripetuti per 10 cicli.

5. 94°C per 20 sec.

6. 50°C per 20 sec.

7. 72°C per 2 min.

Gli step 5, 6 e7 sono ripetuti per 25 cicli.

8. 72°C per 10 min. 1 ciclo

9. 60°C per 5 min. 1 ciclo

10. 15°C fino alla raccolta dei tubi e all'analisi dei prodotti .

Alla fine della reazione i prodotti di amplificazione vengono analizzati su gel di agarosio alla concentrazione 1% peso/volume. La banda di 0.7 Kb che contiene la sonda proB7 è isolata attraverso l'impiego di una resina (QIAEX) in commercio (Qiagen Co).

Il DNA eluito viene quindi sequenziato attraverso il metodo Sanger (per incorporazione di dideossinucleotidi marcati in modo differenziale con composti fluorescenti) utilizzando come innesco gli oligonucleotidi T2 e T3. Dopo sequenziamento, il DNA eluito risulta lungo 764 coppie di basi. Da questo viene successivamente preparato il frammento proB7 che è usato come sonda molecolare dopo averlo marcato per incorporazione di 32P-dCTP attraverso la reazione di "nick-translation";

ESEMPIO 2

Screening della libreria genomica di DNA di riso.

Le caratteristiche salienti di questa libreria acquisita commercialmente dalla Ditta Clontech sono le seguenti :

Vettore : fago lambda EMBL3

sito di clonaggio : BamHI

DNA genomico : da fusticini eziolati di riso : varietà IR36 (Oryza sativa L. indica)

dimensione media degli inserti : 15 kilobasi

Titolo : 10<8 >pfu/ml

50.000 placche fagiche (pfu) di questa libreria sono state piastrate su terreno LB contenente agarosio (1.5i) per infezione del ceppo batterico K802 e per un totale di 10 piastre corrispondente a 500.000 placche fagiche ricombinanti. Le placche sono state successivamente trasferite su supporto di nylon (10 membrane per 10 piastre) ed il DNA in esse contenuto è stato estratto "in situ", denaturato e legato covalentemente al supporto di nylon. L'ibridazione molecolare iniziale è stata condotta in condizioni standard (42°C, 50% formamide) marcando due gruppi di sonde di cDNA.

Il primo gruppo comprende il cDNA dei plasmidi OsTubl6 e OsTub50 corrispondente a due diversi isotipi di betatubulina di riso.

Il secondo gruppo comprende il cDNA dei plasmidi OsTubAl, OsTubA2 e OsTubA3 corrispondente a tre diversi isotipi di alfa-tubulina di riso.

Due serie identiche di 10 filtri di nylon ciascuna sono state ibridate con i due gruppi di sonde al fine di riconoscere nei cloni fagici positivi quelli che contenevano sequenze omologhe alle alfa o alle beta tubuline di riso.

In questo modo sono stati preliminarmente identificati 151 cloni positivi all'ibridazione. Il DNA di 40 di questi cloni fagici è stato isolato e la presenza e le dimensioni dell'inserto di beta o alfa tubulina è stata verificata attraverso "Southern blot" digerendo il DNA con diversi enzimi di restrizione ed utilizzando ancora le sonde di cDNA specifiche per l'uno o l'altro tipo di tubulina.

Questa analisi ha permesso di riconoscere, nell'ambito del gruppo di beta tubulina, dodici cloni fagici che contenevano sequenze con un forte segnale di ibridazione molecolare. Questi dodici DNA sono stati successivamente ibridati, sempre con metodica "Southern", con la sonda proB7 marcata con fosforo 32 per "nick-translation" . 5 di questi cloni davano un segnale positivo all'ibridazione al contrario degli altri 7 che non mostravano segnale.

I 5 cloni positivi all'ibridazione con la sonda proB7 sono stati successivamente analizzati per la lunghezza dell'inserto di DNA genomico di riso e per la presenza di siti di restrizione convenienti per le fasi di manipolazioni successive. Questa analisi ha condotto all'identificazione di due cloni contenenti un frammento di DNA capace di ibridare intensamente con la probe proB7, di dimensioni desiderate (circa 2 kìlobasi) con ideali siti di clonaggio (Sali, Xhol, Sacl) . Si è così proceduto al sequenziamento di entrambi i cloni avvenuto per cicli successivi di reazione con l'utilizzo di vari oligonucleotidi sintetici complementari ad uno dei due strand di DNA, a risalire fino alle 2028 basi.

Il sequenziamento di ambedue i cloni relativo alla sequenza di 2 kilobasi a monte del sito ATG di inizio della traduzione ha dato identici risultati avvalorando l'ipotesi che i due cloni sono in realtà identici e confermando così la veridicità e l'affidabilità della sequenza stessa.

ESEMPIO 3

COSTRUZIONE DEI GENI CHIMERICI E DEI PLASMIDI PER LA TRASFORMAZIONE

La base molecolare di tutti i plasmidi usati nei saggi di trasformazione è costituita dal vettore pBI221 acquisito commercialmente (Stratagene). Questo vettore contiene il gene per la beta-glucuronidasi di E. Coli (gene uidA) a valle del promotore virale 35S CaMV. Il promotore virale è stato eliminato per doppia digestione con gli enzimi BamHI/HindIII e al suo posto è stato integrato il promotore dell'ubiquitina di mais (Ubil), come controllo di riferimento delle tras formazioni.I diversi elementi della sequenza promotrice proTubl6 sono stati invece clonati nel plasmide secondo il seguente protocollo sperimentale. Le regioni di interesse: completa senza 1'introne ed il solo introne

sono state amplificate per PCR con opportuni primers contenenti alle due estremità la sequenza di riconoscimento per gli enzimi HindlII Sali o Smal, usando come templato il DNA del clone lambda contenente il frammento genomico dell'isotipo 16 di beta tubulina di riso. Le regioni di interesse sono state amplificate attraverso il seguente protocollo sperimentale :

1. :

primer forward : 5'-GATAAGCTTCCTCCTACAAGTAGCCATTCC primer reverse : 5' ATGTCGACTTTGCACTGCAAAGGGAAGTG

2. :

primer forward : 5'-GATAAGCTTCCTCCTACAAGTAGCCATTCC primer reverse : 5'-ATGTCGACATGATCCAACCACGCGATCC

3. :

primer forward : 5'-CCCAAGCTTGGTTGGATCATCACAACTCG primer reverse : 5'- CTCATCTTTGCACTGCAAGGG

Profilo termico e cicli di reazione:

1. 94°C per 2 min. 1 ciclo

2. 94°C per 50 sec.

3. 58°C per 50 sec.

4. 72°C per 2 min.

Gli step 2, 3 e 4 sono ripetuti per 15 cicli.

5. 72°C per 7 min. 1 ciclo

6. 15°C fino alla raccolta dei tubi e all'analisi dei prodotti

Una volta inserite le diverse regioni di DNA nei corrispondenti siti di clonaggio HindlII, Sali e Smal presenti nel plasmide di trasformazione usato nella costruzione dei geni chimerici con GUS, ne è stata controllata l'identità per sequenziamento.

ESEMPIO 4

ESPERIMENTI DI TRASFORMAZIONE TRANSIENTE DI CALLI DI RISO

Si utilizzano semi maturi di riso della varietà Taìpei 309, sterilizzati per trattamento con una soluzione al 5% di ipoclorito di sodio per 20 min. e successivamente disposti su piastre contenenti il terreno di coltura MS e agarosio. A queste piastre viene aggiunto 2,4 D (acido 2,4-dicloro-fenossiacetico) alla concentrazione finale di 2 mg/1. In queste condizioni a 37°C, i semi sviluppano calli in corrispondenza dell'embrione nel tempo di una settimana. Da questi semi vengono rimossi gli embrioni che hanno prodotto callo, successivamente trasferiti, il giorno prima del bombardamento biolistico, in terreno osmotico contenente MS-agarosio e 0.6M mannitolo.

Il bombardamento dei calli si avvale dello strumento PDS1000/He della Ditta Bio-Rad, secondo le procedure da questa indicate. I DNA plasmidici corrispondenti alle diverse configurazioni chimeriche descritte sopra vengono adesi per precipitazione su microsfere d'oro del diametro di 1 micron che fungono da proiettili.

Ogni bombardamento prevede l'utilizzo di 1 microgrammo di ciascun DNA plasmidico chimerico. Ogni campione è costituito da 12 calli. I calli di riso sono bombardati ad una pressione di 1100 psi e a una distanza dal cannone di 6 cm.

Il giorno seguente il bombardamento, i calli vengono trasferiti in terreno MS privo di mannitolo ed incubati a 37°C fino alla determinazione dell'attività espressa dal gene GUS.

I saggi di attività istochimica sono condotti 48 ore dopo la trasformazione incubando i calli per 16-20 ore alla temperatura di 37°C in tampone fosfato (lOOmM NaHP04, pH 7; 20% Metanolo; 0.1% Triton X-100) contenente 0.1% peso/volume di substrato cromogenico (X-Glc), secondo la metodologia nota.

I saggi di attività GUS fluorimetrica vengono condotti macinando i calli in azoto liquido e solubilizzando la polvere in un tampone di estrazione composto da 50mM NaHP04, pH7; 5 mM DTT, 1 mM Na2EDTA, 0.1% Triton X-100. Ogni estratto viene poi incubato a 37°C in presenza del substrato MUG alla concentrazione 1 mM. La reazione è cinetica : varie aliquote della reazione vengono prelevate ad intervalli costanti di tempo e la reazione viene in esse immediatamente interrotta per aggiunta di 0.2M Na2C03- I valori di fluorescenza di ciascuna aliquota vengono misurati utilizzando uno spettrofluorimetro che emette un raggio di eccitazione a 365 nm e raccoglie l'emissione di luce a 455 nm. I dati vengono convertiti in nanomoli di MU prodotte al minuto ed i valori così ottenuti vengono normalizzati per il valore di quantità di proteina presente in ciascun estratto.

Claims (15)

1. RIVENDICAZIONI 1. Una regione di DNA che definisce un promotore in grado di sostenere l'espressione di geni posti sotto il suo controllo, avente la sequenza indicata nella Figura 1.
2. 2. Regione di DNA secondo la rivendicazione 1, che è isolata dal genoma di riso e corrisponde al gene della beta-tubulina 16.
3. 3. Porzione della regione di DNA della rivendicazione 1, che si estende dal nucleotide 1160 al nucleotide 2022 e che definisce un introne.
4. 4 . Un costrutto di DNA che comprende il promotore delle rivendicazioni 1 o 2.
5. 5. Un costrutto di DNA secondo la rivendicazione 4, in cui il promotore è operativamente legato ad un gene che codifica per una proteina di interesse .
6. 6. Un costrutto di DNA che comprende 1'introne della rivendicazione 3, operativamente legato a promotori di pianta diversi da dalla beta-tubulina 16.
7. 7. Un costrutto di DNA secondo le rivendicazioni da 4 a 6, in cui detto gene codifica per una proteina mutata ο non mutata, del gruppo delle tubuline di riso.
8. 8. Un vettore di trasformazione delle piante che comprende il promotore delle rivendicazioni 1 o 2.
9. 9. Un vettore di trasformazione delle piante che comprende 1'introne della rivendicazione 3.
10. 10. Un vettore di trasformazione delle piante che comprende un costrutto secondo le rivendicazioni da 4 a 7.
11. 11. Cellule e piante transgeniche che comprendono almeno uno di - il promotore delle rivendicazioni 1 o 2; - 1'introne secondo la rivendicazione 3; - il costrutto secondo le rivendicazioni da 4 a 7; - un vettore secondo le rivendicazioni 8 o 10.
12. 12. Una pianta transgenica secondo la rivendicazione 11.
13. 13. Uso del promotore delle rivendicazioni 1 o 2 per il controllo dell'espressione di geni in cellule vegetali e piante.
14. 14. Uso dell'introne della rivendicazione 3 per il controllo dell'espressione di geni in cellule vegetali e piante.
15. 15. Uso dell'introne secondo la rivendicazione 14 per incrementare i livelli di espressione genica sostenuti da promotori di pianta diversi dalla beta-tubulina 16.