ITMI20001474A1 - Procedimoento per il dosaggio di tossine dsp del gruppo delle dinophysistossine e delle yessottossine - Google Patents
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Description
Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:
Procedimento per il dosaggio di tossine DSP del gruppo delle dinophysistossine e delle yessotossine.
CAMPO DELL’INVENZIONE
Il campo tecnico delle presente invenzione riguarda il rilevamento di tossine ed il loro dosaggio mediante un sistema di colture cellulari in vitro.
TECNICA ANTERIORE
L'intossicazione umana causata da ingestione di molluschi o pesci, contaminati da alghe produttrici di sostanze tossiche, è un fenomeno che negli ultimi anni ha manifestato una preoccupante evoluzione in quanto gli episodi di intossicazione sono sempre più frequenti e vengono rilevati in aree del pianeta in cui precedentemente non erano mai stati segnalati.
Finora sono stati descritti svariati tipi di intossicazione, basandosi sulla sintomatologia indotta in animali e, quando possibile, sulle caratteristiche chimiche degli agenti causativi e del loro meccanismo d'azione. Una di queste è la intossicazione diarroica (Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP) dovuta all’ingestione di molluschi (prevalentemente mitili) contaminati (Yasumoto T., Oshima Y., Yamaguchi M., 1978, Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish., 44: 1249).
Benché non siano mai stati registrati esiti letali di intossicazione DSP, questa può creare seri problemi di salute pubblica, che vengono affrontati, secondo le attuali normative (Direttiva CE 91/492/CEE; per l’Italia: G.U. n. 279, 29 novembre 1995, D.M. Sanità 31 luglio 1995), mediante un’accurata prevenzione realizzata mediante monitoraggio continuo della tossicità dei molluschi che, una volta accertata, implica la proibizione della loro raccolta e commercio, finché questi presentano livelli significativi di tossicità.
Attualmente, il dosaggio degli agenti classificati come tossine DSP può essere condotto mediante analisi chimiche (HPLC accoppiata eventualmente a Risonanza Magnetica Nucleare e Spettrometria di Massa) (Quilliam M.A.; J. AOAC Int., 1995, 78:555) e immunologiche (RIA, ELISA), quali quelle descrìtte ad esempio in EP 509819, effettuate su estratti più o meno purificati ottenuti da materiale organico secondo le attuali normative, basati sulla disponibilità di anticorpi specifici, per ora disponibili solo per l’acido okadaico (AO) e per alcune dinophysistossine (DTX ).
Le procedure chimiche possono fornire stime accurate della maggior parte dei componenti classificati come agenti DSP, ma non vengono utilizzate routinariamente nel monitoraggio della tossicità DSP nei molluschi, in quanto l'effettiva tossicità del materiale contaminato non è ancora nota. Infatti, per quanto si riconosca l’esistenza di tre gruppi di componenti chimicamente distinti classificati comunque come tossine DSP (Dinophysistossine, Yessotossine e Pectenotossine) (Yasumoto T., Murata M., 1993, Chem. Rev., 93:1897), la reale tossicità di ciascuno dei componenti non è ancora nota. Inoltre la tipologia e le concentrazioni dei composti classificati DSP rilevabili nei molluschi varia a seconda della loro provenienza e del momento di raccolta, cosicché ciascun campione presenta un particolare “profilo tossinologico”.
Le metodiche chimico-fìsiche, applicabili a ciascuno dei tre gruppi di tossine separatamente, non consentono inoltre l’analisi contemporanea di componenti di più gruppi in un medesimo campione.
Il dosaggio delle tossine DSP può essere effettuato inoltre secondo modalità biochimiche o biochimico-cellulari, basate sulla misurazione dell'effetto che le tossine esercitano sulle biomolecole a cui si associano, ad esempio modificandone l'attività, oppure basati sull'effetto citotossico totale esercitato dalle tossine su colture cellulari “sensibili". Attualmente saggi biochimici sono limitati alla misurazione dell'inibizione dell’attività fosfatasica, come ad esempio descritto in WO 96/40983 per il dosaggio di dinophysistossina 1 e acido okadaico, impiegabili solo per le tossine funzionalmente correlate a quest’ultimo (Tubaro A et al., 1996, Toxicon, 34:743) ed aventi lo stesso meccanismo di inibizione di questi particolari enzimi. Nei saggi basati su colture cellulari, l’analisi è limitata alla correlazione fra dosi di tossina somministrata e la diminuzione della sopravvivenza, ovvero la comparsa di alterazioni morfologiche delle popolazioni cellulari impiegate (Fladmark K.E. et al., 1998, Toxicon ; 36:1101).
La terza modalità di dosaggio, infine, comprende metodi biologici di rilevamento della tossicità DSP. Anche in questo caso, ciò che viene valutato è l'effetto globale di diversi componenti, non singolarmente misurati, in un sistema complesso. Appartengono ai sistemi di dosaggio globale delle tossine i saggi su animali vivi (Yasumoto T. et al in: "Seafood Toxins”, Ragelis E.P., Ed., ACS Symposium Series, 262, 1984, pp. 207-214), in cui il materiale contaminato, solitamente estratto con solventi organici da molluschi, viene somministrato a topi, in genere intra-peritonealmente (ibidem), o a piccoli crostacei quali la D. magna (Vernoux J.P et al., 1993, Food Addìi Contam. 10:603), verificando l'eventuale morte entro un intervallo di tempo prefissato.
A livello normativo, l’unico metodo di dosaggio della tossicità dei molluschi accettato è quello su topi, che rileva tuttavia la tossicità complessiva del materiale ottenibile da molluschi contaminati con DTX e/o YTX. E’ infatti a questo saggio che si riferiscono le LD50 intemazionalmente utilizzate per queste tossine (Yasumoto T et al. in: “Harmful Algae”, B Reguera, J. Bianco, MA Fernandez T. Wyatt, Edd.; Xunta de Galicia and Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, 1998, pp 461-464). Questo saggio pone tuttavia problemi di ordine etico, sempre più avvertiti in Europa, e tanto più pressanti se si considera che l’analisi di ogni campione di molluschi richiede comunque il sacrificio di almeno cinque animali. Questo sistema dà inoltre falsi positivi, causati probabilmente dalla presenza di elevati livelli di acidi grassi nel materiale iniettato (Quilliam M.A., Wright J.L.C.; in “Manual on Harmful Marine Microalgae”, Hallgraeff G.M., Anderson D.M., Cembella A.D., Edd., /OC Manuale and Guides No. 33. UNESCO 1995, pp.95-111).
SOMMARIO
La presente invenzione riguarda un procedimento per la determinazione qualitativa e quantitativa delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) del gruppo delle dinophysistossine e del gruppo delle yessotossine, basato sulla valutazione della quantità di proteina E-caderina e degli antigeni ad essa correlati, ECRA100 ed ECRA135 in un sistema cellulare in vitro. Il procedimento secondo l’invenzione permette l’analisi qualitativa ed il dosaggio di tossine quali la yessotossina, la omoyessotossina, la 45-idrossiyessotossina, la 45-carbossiyessotossina, dinophysistossina 1, dinophysistossina 2, dinophysistossina 3, acido okadaico e loro derivati. In una sua realizzazione preferita il dosaggio comprende i passaggi di : a) preparazione dei campioni; b) incubazione dei campioni in un sistema cellulare in vitro; c) preparazione degli estratti citosolubili delle cellule e frazionamento degli stessi in base al peso molecolare dei componenti proteici; d) riconoscimento dell’antigene E-caderina e degli antigeni ad essa correlati ECRA100 ed ECRA135, mediante anticorpi anti-E-caderina. L'invenzione riguarda inoltre l’uso del procedimento per il dosaggio di tossine DSP ai fini della valutazione della contaminazione in prodotti di origine marina, destinati all'uso alimentare.
In un suo ulteriore aspetto l’invenzione riguarda l’antigene immunologicamente correlato alia E-caderina: ECRA100 e l’uso degli antigeni E-caderina, ECRA100 ed ECRA135 per la determinazione della presenza e per il dosaggio di tossine in un campione.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Fig. 1. Effetto della presenza di acido okadaico e yessotossina su E-caderina e antigeni correlati in cellule MCF-7.
Cellule MCF-7 sono state trattate per 18 ore a 37° C con acido okadaico 50 nM, yessotossina 50 nM, con entrambi gli agenti ad una concentrazione di 50 nM, o con veicolo (controllo). Al termine del trattamento le cellule sono state impiegate per la preparazione di estratti cellulari e 50 μg di proteina da ciascun campione sono stati frazionati mediante SDS-PAGE e sottoposti ad analisi mediante immunoblotting con anticorpo anti-E-caderina. I trattamenti sono specificati nella parte superiore della illustrazione, mentre a sinistra sono indicate la mobilità elettroforetica delle subunità di β-galattosidasi (118 kDa) e fruttoso, 6-P cinasi (90 kDa) usate come riferimenti di peso molecolare.
E' possibile osservare il pattern caratteristico osservato in presenza di AO e YTX o di entrambi, rispetto a cellule di controllo: infatti nella corsia corrispondente al trattamento con solo acido okadaico è possibile osservare la comparsa dell’antigene ECRA135, presente anche nel doppio trattamento (acido okadaico yessotossina), mentre nella corsia del trattamento con sola yessotossina è possibile osservare il notevole aumento dell’immunoreattività corrispondente all’antigene ECRA100 , mantenuta anche nel doppio trattamento.
Fig. 2. Effetto di concentrazioni crescenti di acido okadaico sui livelli di E-caderina e antigeni correlati in cellule MCF-7.
Cellule MCF-7 sono state trattate per 20 ore a 37°C con le concentrazioni di acido okadaico indicate. Al termine del trattamento sono stati ottenuti gli estratti cellulari, che sono stati sottoposti a frazionamento mediante SDS-PAGE e immunoblotting, per rilevare il loro contenuto di E-caderina (cerchio pieno), ECRA135 (quadrato) ed ECRA100 (triangolo), come descritto in “Materiali e Metodi”.
I valori sono espressi come percentuale deH’immunoreattività totale (E-caderina ECRA135 + ECRA100) in ciascun campione (simboli pieni), ovvero come valori di immunoreattività totale relativa (∑), misurata come percentuale della immunoreattività totale del campione rispetto a quella del controllo (o campione ottenuto da cellule che hanno ricevuto solo il veicolo) (cerchi vuoti). I dati rappresentano le medie S.D. ottenute in 3-7 diversi esperimenti.
Fig. 3. Effetto di concentrazioni crescenti di yessotosina sui livelli di E-caderina e antigeni correlati in cellule MCF-7.
Cellule MCF-7 sono state trattate per 20 ore a 37°C con le concentrazioni di yessotossina indicate. Al termine del trattamento sono stati ottenuti gli estratti cellulari, che sono stati sottoposti a frazionamento mediante SDS-PAGE e immunoblotting, per rilevare il loro contenuto di E-caderina (cerchio pieno) ed ECRA100 (triangolo), come descritto in “Materiali e Metodi".
<( >valori sono espressi come percentuale della immunoreattività totale (E-caderina ECRA135 + ECRA100) in ciascun campione (simboli pieni), ovvero come valori di immunoreattività totale relativa (∑), misurata come percentuale deH’immunoreattività totale del campione rispetto a quella del controllo (o campione ottenuto da cellule che hanno ricevuto solo il veicolo) (cerchi vuoti).
I dati rappresentano le medie ± S.D. ottenute in 3-7 diversi esperimenti.
Fig. 4. Effetto della yessotossina sulle alterazioni indotte da concentrazioni crescenti di acido okadaico a carico dei livelli di E-caderina e antigeni correlati in cellule MCF-7.
Cellule MCF-7 sono state trattate per 20 ore a 37°C con le concentrazioni di acido okadaico indicate, e in presenza (linea continua) o assenza (linea tratteggiata) di YTX 10 nM. Al termine del trattamento sono stati ottenuti gli estratti cellulari, che sono stati sottoposti a frazionamento mediante SDS-PAGE e immunoblotting, per rilevare il loro contenuto di E-caderina (Pannello A), ECRA13S (Pannello B) ed ECRA100 (Pannello C), e l'immunoreattività totale relativa (∑) dei campioni (Pannello D), come descritto in “Materiali e metodi”.
I valori sono espressi come percentuale della immunoreattività totale (E-caderina ECRA135 + ECRA100) in ciascun campione (Pannelli A-C), ovvero come valori di immunoreattività totale relativa (∑, Pannello D), misurata come percentuale della immunoreattività totale del campione rispetto a quella del controllo (o campione ottenuto da cellule che hanno ricevuto solo il veicolo). I dati rappresentano le medie ± S.D. ottenute in 3 diversi esperimenti.
Fig. 5. Effetto del'acido okadaico sulle alterazioni indotte da concentrazioni crescenti di yessotossina a carico dei livelli di E-caderina e antigeni correlati in cellule MCF-7.
Cellule MCF-7 sono state trattate per 20 ore a 37°C con le concentrazioni di yessotossina indicate, e in presenza (linea continua) o assenza (linea tratteggiata) di AO 50 nM. Al termine del trattamento sono stati ottenuti gli estratti cellulari, che sono stati sottoposti a frazionamento mediante SDS-PAGE e immunoblotting, per rilevare il loro contenuto di E-caderina (Pannello A), ECRA13S (Pannello B) ed ECRA100 (Pannello C), e l'immunoreattività totale relativa (∑, Pannello D), come descritto in “Materiali e Metodi".
I valori sono espressi come percentuale deH’immunoreattività totale (E-caderina ECRA135 + ECRA100) in ciascun campione (Pannelli A-C), ovvero come valori di immunoreattività totale relativa {∑, Pannello D), misurata come percentuale della immunoreattività totale del campione rispetto a quella del controllo (o campione ottenuto da cellule che hanno ricevuto solo il veicolo). I dati rappresentano le medie ± S.D. ottenute in 3 diversi esperimenti.
Fig. 6. Effetto di AO e YTX aggiunta a estratti grezzi ottenuti da epatopancreas di mitili su E-caderina e antigeni correlati.
Cellule MCF-7 sono state trattate con gli estratti indicati, preparati come descritto nel testo, o con il solo veicolo (controllo), per 18 ore a 37°C. Al termine del trattamento le cellule sono state impiegate per la preparazione di estratti cellulari e 50 pg di proteina da ciascun campione sono stati frazionati mediante SDS-PAGE e sottoposti ad analisi mediante immunoblotting con anticorpo anti-E-caderina.
Anche in presenza di estratti grezzi di mitili e' possibile osservare il pattern caratteristico osservato in figura 1 : in presenza di AO e YTX o di entrambi, rispetto a cellule di controllo e a cellule di controllo trattate con estratto di mitili non addizionato con le tossine: nella corsia corrispondente al trattamento con solo acido okadaico (AO) è possibile osservare la comparsa dell'antigene ECRA135, presente anche nel doppio trattamento (AO YTX), mentre nella corsia del trattamento con sola YTX è possibile osservare il notevole aumento deH’immunoreattività corrispondente all’antigene ECRA100, mantenuta anche nel doppio trattamento (AO+YTX).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Il metodo della presente invenzione riguarda un procedimento per il dosaggio delle tossine DSP, in particolare della classe delle dinohysistossine e delle yessotossine, basato sull'osservazione dei livelli cellulari dell’antigene E-caderina e di antigeni immunologicamente correlati alla E-caderina (ECRA100 ed ECRA135), in un sistema cellulare che esprime la E-caderina.
E’ stato infatti sorprendentemente osservato che la presenza di tossine appartenenti alla classe delle dinophysistossine (Yasumoto T et al., 1993, Chem Rev: 93, 1897) e delle yessotossine (Yasumoto T et al. ibid.; Satake et al., 1977, Nat Toxins, 5: 107; Ciminiello et al., 2000, Eur J Org Chem, 291), in un sistema cellulare opportuno, è associato con variazioni misurabili dei livelli intracellulari di E-caderina e dei suoi antigeni correlati ECRA100 ed ECRA135.
La E-caderina è una molecola di adesione cellulare, denominata anche uvomorulina o L-CAM o Celi CAM 120/80, la cui sequenza nucleotidica è depositata in banca dati (SwissProt) con il numero Z18923. Per gli scopi della presente invenzione, è definita inoltre E-caderina una proteina di peso molecolare circa 126 kDa (Mr di 126.1 ± 4.1 kDa), in accordo con la letteratura (Damsky C.H. et al., 1983, Celi, 34:455) come determinato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) e riducenti, e riconosciuta da anticorpi anti-E-caderina. Sono inoltre definiti antigeni immunologicamente correlati alla E-caderina, gli antigeni ECRA100 ed ECRA135, (ECRA: E-Cadherin Related Antigens), aventi peso molecolare medio rispettivamente di 100 kDa (Mr di 101.9 3.2 kDa) e 135 kDa (Mr di 136.3 3.3), come rilevato in una serie di misurazioni effettuate mediante SDS-PAGE. Tali antigeni sono riconosciuti da anticorpi specifici anti-Ecaderina.
Ai fini della presente invenzione, è definito come sistema cellulare un sistema di cellule, coltivate in vitro secondo metodi noti nello stato dell’arte, posto che esprimano la proteina E-caderina, preferibilmente umana, derivanti da linee cellulari o da colture primarie. Preferibilmente tali linee cellulari sono mammifere e ancor più preferibilmente sono umane, quali ad esempio HeLa, Caco-2, A549, BxPc3, MCF-7. In una sua realizzazione ancor più preferita il sistema cellulare è costituito dalla linea cellulare MCF-7 (ECACC No: 86012803), coltivata secondo metodi noti al tecnico del ramo. Rientra quindi nella definizione di sistema cellulare opportuno secondo la presente invenzione, anche un sistema cellulare costituito ad esempio da linee cellulari non umane, trasfettate con sequenze codificanti per la E-caderina, preferibilmente umana.
Le tossine evidenziabili e dosabili secondo il metodo della presente invenzione sono le tossine appartenenti alla classe delle dinophysistossine, preferibilmente costituite da DTX1, DTX2, DTX3, acido okadaico, nonché quelle appartenenti alla classe delle yessotossine, quali yessotossina, 45-carbossiyessotossina, omoyessotossina, 45-idrossiyessotossina (in accordo con Yasumoto T et al., 1993, Chem Rev: 93, 1897; Satake et al., 1977, Nat Toxins, 5: 107;
Ciminiello et al., 2000, Eur J Org Chem., 291), nonché i loro derivati.
I “pattern” molecolari osservati negli estratti cellulari di colture trattate
con diverse concentrazioni e combinazioni delle tossine dei due gruppi
sono riassunti nella seguente tabella:
Tabella 1. Presenza delle specie molecolari immunologicamente
correlate alla E-caderina in presenza di tossine del gruppo delle
dinophysistossine (DTX) e delle yessotossine (YTX).
* Valori espressi come percentuale rispetto aH'immunoreattivItà totale (E-caderina ECRA100+ ECRA135) del campione.
<4 >Valori espressi come percentuale dell'immunoreattività totale del campione rispetto aH'immunoreattivItà totale del controllo (immunoreattività totale relativa: ∑). Concentrazioni di tossine utilizzate:
In sintesi quindi, la presenza di tossine del gruppo delle
dinophysistossine in quantità superiore a 25nME (espresse come
concentrazioni equivalenti di acido okadaico) in un sistema cellulare è
associata con: a) diminuzione deirimmunoreattività per la E-caderina; b) comparsa dell’antigene correlato alla E-caderina, ECRA135; c) diminuzione della immunoreattività totale relativa (∑). La presenza di tossine del gruppo delle yessotossine, in quantità superiore a 0.2 nME (espresse come concentrazioni equivalenti di yessotossina), è invece associata con: d) diminuzione deirimmunoreattività per la E-caderina; e) aumento dell'antigene correlato alla E-caderina, ECRA100; f) assenza o presenza dell'antigene ECRA135 in quantità non rilevabili, ad essempio mediante immunoblotting; g) aumento deirimmunoreattività totale relativa (∑).
In un suo primo aspetto l’invenzione fornisce quindi un procedimento per identificare qualitativamente la presenza di dinophysistossine e yessotossine, presenti o separatamente o contemporaneamente in un sistema cellulare, o in un campione di cui si voglia determinare la contaminazione, basato sulla valutazione della comparsa o dell'aumento, rispettivamente degli antigeni ECRA13S ed ECRA100 e sulla valutazione della quantità di antigene E-caderina. Preferibilmente tale valutazione è effettuata rispetto ad un controllo di cellule non trattate con tossine, oppure trattate con il solo veicolo, preparato in modo analogo al campione.
E’ stato osservato che il "pattern" caratteristico di ciascun gruppo di tossine, sintetizzato in tabella 1 ed osservabile in figura 1, viene mantenuto anche quando le due classi di tossine sono contemporaneamente presenti nella coltura cellulare, anche in quantità superiori a 35 nM per AO e 0.4 nM per YTX. Rappresenta quindi ulteriore oggetto della presente invenzione, un procedimento per (a determinazione contemporanea ed indipendente della presenza di ciascuno dei due gruppi di tossine in un sistema cellulare o in un campione. La valutazione viene effettuata preferibilmente mediante metodi immunologie!, ancor più preferìbilmente dopo frazionamento degli estratti cellulari. Altri metodi di riconoscimento delle specie molecolari E-caderina, ECRA135 ed ECRA100, possono essere comunque utilizzati, quali metodi biochimici, basati su valutazione di caratteristiche quali la glicosilazione degli antigeni ECRA135 ed ECRA100.
Le variazioni degli antigeni E-caderina, ECRA100 ed ECRA135 sono proporzionali alle concentrazioni di tossine utilizzate, infatti la presenza di yessotossine in un sistema cellulare, è associata con l'aumento dell'antigene ECRA100, (così come osservabile negli estratti cellulari da esso preparati) fino al 60% deH’immunoreattività totale (E-caderina antigeni correlati: ECRA135 ed ECRA100), rispetto a cellule di controllo non trattate con la tossina (ed in queste condizioni l’antigene ECRA135 è assente), mentre la presenza di dinophysistossine nel campione è associata con la comparsa dell'antigene ECRA13S, che arriva a costituire fino al 40% dell’immunoreattività totale per E-caderina e antigeni correlati, rispetto a cellule di controllo non trattate con la tossina, e l’antigene ECRA100 è assente o costituisce al massimo il 10% deH’immunoreattività totale. Viene definita ai fini della presente invenzione come immunoreattività totale, la somma deH’immunoreattività per E-caderina e per gli antigeni correlati ECRA135 ed ECRA100 in un campione, misurata ad esempio mediante analisi densitometrica dell’elettroferogramma, e come immunoreattività totale relativa (∑), la percentuale dell’immunoreattività totale del campione rispetto aH'immunoreattività totale del controllo, costituito da cellule trattate con il solo veicolo, o non trattate.
Costituisce pertanto ulteriore oggetto della presente invenzione, un procedimento per il dosaggio di tossine appartenenti al gruppo delle dinophysistossine e delle yessotossine, presenti sia separatamente che contemporaneamente in una coltura cellulare o in un campione, che comprende: a) il trattamento del sistema cellulare con diluizioni seriali del campione ed in parallelo con quantità crescenti di ciascuno dei due gruppi di tossine b) la costruzione di curve standard di immunoreattività per gli antigeni E-caderina, ECRA135, ECRA100 e della immunoreattività totale relativa (∑) per ciascuno dei due gruppi di tossine, dove tali curve standard sono costruite preferibilmente utilizzando quali composti di riferimento l'acido okadaico per la classe delle dinophysistossine e la yessotossina per la classe delle yessotossine, in concentrazioni comprese tra 0 e 80 nME di acido okadaico per le dinophysistossine e tra 0 e 10 nME di yessotossina per le yessotossine; c) l'interpolazione sulla curva standard delle concentrazioni di tossina corrispondente ai valori di immunoreattività di ciascuno dei tre antigeni e di ∑ (immunoreattività totale relativa) come misurati nel campione o nel sistema cellulare.
La E-caderina e gli antigeni ad essa correlati ECRA135 ed ECRA100, sono rivelati negli estratti cellulari mediante metodi immunobiochimici. Preferibilmente essi sono visualizzati dopo frazionamento degli estratti cellulari mediante elettroforesi, trasferimento delle proteine su filtro e riconoscimento con anticorpi anti-E-caderina (immunoblotting o Western bloting). Altri metodi immunologia di riconoscimento degli antigeni correlati alla E-caderina possono comunque essere utilizzati e rientrano pertanto nella portata della presente invenzione, ad esempio il RadiolmmunoAssay (RIA), oppure il metodo Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) con anticorpi specifici per la E-caderina e/o per gli antigeni ECRA135 ed ECRA100 o con altri metodi noti ai tecnico del ramo. Altri metodi di riconoscimento degli antigeni ECRA13S ed ECRA100, non immunologia, quali quelli basati ad esempio su caratteristiche biochimiche delle proteine, ad esempio il grado o il tipo di glicosilazione, possono essere utilizzati e rientrano pertanto nella portata della presente invenzione. Il dosaggio o la determinazione della presenza di tossine della classe delle dinophysistossine e delle yessotossine per l’accertamento della contaminazione di un prodotto alimentare, secondo il procedimento dell'invenzione, è di particolare utilità per i prodotti di origine marina, in particolare per i molluschi, preferibilmente mitili, destinati al consumo alimentare e può essere utilizzato come sistema di selezione routinario per la prevenzione della messa in commercio di campioni contaminati.
In una sua realizzazione preferita, il procedimento secondo l’invenzione prevede pertanto che il campione, preferibilmente costituito da estratti di molluschi, ancor più preferibilmente da estratti di mitili, preparati secondo le procedure standard (definite ad esempio in G.U. n° 279, 29 novembre 1995, D.M. Sanità 31 luglio 1995) e qui definiti come estratti grezzi, opzionalmente ulteriormente purificati, preferibilmente mediante estrazione e separazione in presenza di solventi organici, sia posto in coltura, dopo diluizione eventualmente anche seriale, nel sistema cellulare prescelto ed incubato con le cellule nelle stesse condizioni di coltura delle cellule (ad es. 37°C, 5% C02) per un tempo compreso tra le 12 e le 24 ore, preferibilmente 20 ore.
Le cellule in coltura sono quindi lavate alcune volte in soluzioni isotoniche, quali il PBS (Phosphate Buffered Solution), e sono quindi lisate secondo metodi noti nello stato dell'arte, in presenza di detergenti ionici quali ad esempio SDS e sodio deossicolato, opzionalmente in associazione con detergenti non-ionici, quali TritonX-100 e con inibitori delle proteasi, quali ad esempio PMSF, aprotlnina etc. La procedura di lisi viene condotta ad una temperatura inferiore a 37°C, preferìbilmente a 4°C, al fine di minimizzare il degradarsi dei campioni proteici. Variazioni del procedimento di lisi cellulare sono comunque facilmente ottenibili da un tecnico del ramo, mediante variazioni delle concentrazioni di detergente, dei tempi di lisi etc.
Il lisato cellulare viene quindi parzialmente purificato, preferìbilmente mediante centrifugazione, e vengono preparati gli estratti citosoiubili contenenti le proteine cellulari solubilizzate. L’estratto citosolico può essere trattato con agenti riducenti, quali ad es. il β-mercaptoetanolo (5%) e sottoposto a denaturazione totale mediante bollitura in SDS 2%. Quantità di estratti citosoiubili corrispondenti a circa 30-50 μg proteine totali, vengono quindi frazionati in base al peso molecolare. Il frazionamento avviene preferìbilmente mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide in concentrazione compresa tra 7 e 12%, preferibilmente 10%, di una miscela acrilammide/bis-acrilammide, in condizioni denaturanti (SDS-PAGE), preferibilmente anche riducenti, secondo la procedura di Laemmli (Laemmli U.K., 1970, Nature, 227:680). Possono esser utilizzati altri metodi noti di separazione delle proteine in base al loro peso molecolare, ad esempio l’elettroforesi capillare (Manabe T, Electrophoresis, 1999, 20:3116), la gel filtrazione (Siegei et al. Biochem. Biophys Acta, 1966, 112:346).
Le proteine frazionate vengono quindi trasferite su una matrice solida o filtro, ad esempio di nitrocellulosa o di PVDF, secondo metodi noti nell'arte, quali ad esempio il blotting, l’elettroblotting, o il capillary blotting. Preferìbilmente viene utilizzato l’elettroblotting, e la matrice solida o filtro viene quindi utilizzato per il successivo riconoscimento immunologico con un anticorpo anti-E-caderina, secondo la procedura di Western Blotting: in accordo con tale metodo, la matrice di supporto su cui sono state trasferite le proteine, viene cimentata in un opportuno tampone (ad es. TBS: Tris 20 mM pH 7.5, NaCI 150 mM), preferibilmente contenente CaCI2 in concentrazione compresa tra 0,5 e 3 mM, preferibilmente 1 mM, con l’anticorpo primario anti-E caderina. Gli anticorpi anti-E caderina sono preferibilmente monoclonali, quali ad esempio l’anticorpo anti-E-caderina prodotto da Zymed Labs. Inc. (HECD-1), utilizzato preferibilmente ad una concentrazione compresa tra 1-10 μg/ml di tampone, preferibilmente 2μg/ml. Le concentrazioni di anticorpo e le condizioni di immunoblotting qui descritte sono tuttavia facilmente modificabili da un tecnico del ramo e variano a seconda dell’anticorpo utilizzato. Possono essere utilizzati quali anticorpi primari altri anticorpi o sieri policlonali o monoclonaii anti-E-caderina.
L'anticorpo primario viene quindi riconosciuto mediante un anticorpo secondario avente la specificità opportuna, nel caso specifico con un anticorpo anti-lgG di topo coniugato con una molecola rivelatrice, ad esempio la perossidasi di rafano (HRP), la fosfatasi alcalina, la biotina-HRP, etc.. Alternativamente, l'anticorpo primario può essere marcato direttamente con le molecole rivelatrici. La rivelazione delle bande corrispondenti alla E-caderina e agli antigeni ad essa correlati ECRA135 ed ECRA100, è quindi ottenuta secondo procedure note al tecnico del ramo, ad esempio mediante sviluppo di chemiluminescenza secondo il metodo ECL della Amersham-Pharmacia.
Alternativamente alle procedure di Western Blotting, l'estratto citosolubile, contenente proteine marcate ad esempio con isotopi radioattivi (ad esempio <M>S o <125>l), può essere cimentato con l’anticorpo anti-E-caderina prima del frazionamento elettroforetico, ad esempio secondo procedure di RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) e il peso molecolare determinato successivamente mediante elettroforesi in gel di acrilammide.
Le quantità relative degli antigeni E-caderina e degli antigeni immunologicamente correlati, ECRA135 ed ECRA100, nel campione avviene quindi mediante esposizione di una lastra fotografica Kodak X-Omat. L'elettroferogramma è preferibilmente sottoposto ad analisi densitometrica, e l’assorbanza dell'area dei picchi di ogni campione in unità arbitrarie, registrata e usata per la quantificazione degli antigeni rilevati dall’anticorpo e per la determinazione dei valori di immunoreattività totale e di immunoreattività totale relativa (I). Per la semplice analisi qualitativa, la lastra può essere esaminata ad occhio nudo ed il pattern molecolare caratteristico dei due gruppi di tossine può essere riconosciuto direttamente, oppure mediante analisi comparativa con un controllo quale il sistema cellulare non sottoposto a trattamento con le tossine, oppure con un marcatore di peso molecolare.
Il procedimento di dosaggio secondo l'invenzione presenta i seguenti vantaggi rispetto ai saggi conosciuti:
- selettività, dovuta alla misurazione di due antigeni molecolari distinti (ECRA135 ed ECRA100) in risposta alle due diverse classi di tossine DTX e YTX, che consente di determinare la presenza di una o dell'altra classe, o di entrambe, in un campione,
- semplicità di esecuzione, in quanto entrambe le classi di tossine sono rivelate contemporaneamente mediante un unico saggio ed un unico anticorpo,
- precisione, dovuta ad una quantificazione precisa e non basata sulla valutazione di alterazioni morfologiche, difficilmente quantificabili, - accuratezza dei dosaggi, dovuti alla univoca caratterizzazione del parametro molecolare misurato.
Costituisce inoltre oggetto della presente invenzione l’antigene molecolare ECRA100, riconosciuto da anticorpi anti E-caderina ed avente peso molecolare medio di 100 kDa (Mr di 101.9 ± 3.2 kDa) (valori medi determinati da misurazioni effettuate mediante elettroforesi denaturante e riducente, secondo il metodo di Laemmli, per interpolazione delle distanze di migrazione in confronto con le distanze di migrazione di marcatori di peso molecolare noto, in particolare della subunità di βgalattosidasi (118 kDa) e fruttoso,6-P cinasi di 90 kDa). Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione, l'uso degli antigeni molecolari E-caderina, ECRA135 ed ECRA100 per la determinazione della presenza e per il dosaggio di tossine, preferibilmente per la determinazione della presenza e per il dosaggio di tossine della classe delle yessotossine (YTX) e delle dinophysistossine (DTX).
L’invenzione verrà ulteriormente descritta negli esempi sperimentali di seguito riportati, che non ne costituiscono tuttavia alcuna limitazione. PARTE SPERIMENTALE MATERIALI E METODI
Materiali. Gli anticorpi anti-ig di topo coniugati con perossidasi di rafano e i reagenti impiegati per la rilevazione con sistema ECL erano prodotti della Amersham-Pharmacia. I mezzi per colture cellulari sono stati ottenuti dalla Life Technologies, e i contenitori in plastica per colture cellulari erano prodotti Nunc. L’acido okadaico (sale di ammonio) era un prodotto della Alexis Corporation. La yessotossina è stata acquistata dall’ Institute of Environmental Science and Research Limited (New Zealand). L'anticorpo monoclonale anti-E-caderina impiegato in questa sperimentazione era un prodotto della Zymed Laboratories, Inc. (HECD-1). I marker di peso molecolare, precolorati, sono stati ottenuti dalla Sigma. La membrana di nitrocellulosa ‘‘Protran B83" è stata ottenuta dalla Schleìcher & Schuell.
Colture cellulari e trattamenti.
La linea cellulare MCF-7 impiegata in questo studio è stata ottenuta dalla European Collection of Celi Cultures (ECACC No: 86012803; CB No: CB2705). Le cellule sono state mantenute a 37°C in un’atmosfera contenente CO2 al 5%, in capsule Petri, con un mezzo di coltura costituito da MEM modificato da Dulbecco, contenente siero fetale bovino (10%) e aminoacidi non essenziali (1%), glutammina 2mM.
I trattamenti delle cellule venivano effettuati con aggiunta di adeguati quantitativi di tossina utilizzando soluzioni preparate in etanolo assoluto, e le colture di controllo ricevevano un identico volume di veicolo. Le soluzioni di lavoro dei diversi agenti erano ottenute per diluizioni seriali di soluzioni madre, costituite da acido okadaico 50 μΜ e da yessotossina 500 μΜ, rispettivamente, ed erano mantenute a -20°C, in contenitori di vetro, al riparo dalla luce. La concentrazione di etanolo assoluto nel mezzo di coltura non ha mai raggiunto valori superiori allo 0.5%, una concentrazione che si è verificato non essere influente sui parametri molecolari misurati in questa indagine.
Le concentrazioni finali raggiunte dagli agenti nelle colture e i tempi di trattamento sono specificati nella descrizione dei risultati ottenuti.
Preparazione degli estratti cellulari.
Gli estratti cellulari impiegati in queste analisi erano ottenuti dalie cellule aderenti alla capsula di coltura al termine dei trattamenti indicati, conducendo la procedura a 4°C. Le cellule erano lavate per tre volte con tampone fosfato 20 mM, pH 7.4, contenente NaCI 0.15 M (PBS) ed erano quindi lisate mediante l'aggiunta di 25 μΙ di tampone di lisi/cm<2 >capsula di coltura, e lasciando le cellule in contatto con tale soluzione per 10 minuti a 4°C. Il tampone di lisi era costituito da PBS contenente: Na deossicolato 0.5% (w/v), Na dodecilsolfato (SDS) 0.1% (w/v), Triton X100 1% (w/v), fenilmetil sulfonil fluoruro (PMSF) 0.1 mg/ml. I Usati cellulari erano quindi centrifugati per 30 minuti a 16000xg, e i sovranatanti di questa centrifugazione (estratti citosolubili) erano recuperati e utilizzati per la misurazione colorimetrica del contenuto proteico totale impiegando acido bicinconinico (Smith P.K et al., 1985, Anal. Biochem ., 150:76). Gli estratti citosolubili erano quindi portati a una concentrazione finale di SDS 2%, β-mercaptoetanolo 5% e glicerolo 20%, ed erano trattati per 5 min a 100°C prima di essere utilizzati per il frazionamento elettroforetico delle proteine.
Frazionamento delle proteine mediante elettroforesi in presenza di SDS (SDS-PAGE) e analisi mediante immunoblotting.
I campioni, solitamente contenenti la stessa quantità di proteina corrispondente a circa 50 pg, erano sottoposti a elettroforesi con gel di poliacrilamide contenenti SDS, secondo la procedura di Laemmli (Laemmli U.K. , 1970, Nature, 227:680), usando gel di separazione contenenti poliacrilammide al 10%. Al termine dell’elettroforesi (170 Volts, circa 3 ore), le proteine erano trasferite elettroforeticamente su una membrana di nitrocellulosa Protran B83, ed erano quindi visualizzate mediante colorazione con Ponceau S.
I siti di legame sulla membrana erano quindi saturati mediante incubazione di 1 ora a temperatura ambiente con una soluzione di Tris-HCI 20 mM, pH 7.5 a 25°C, NaCI 150 mM (TBS), contenente il 3% (w/v) di latte scremato in polvere e CaCI2 1 mM. La membrana era quindi incubata per 1 ora a temperatura ambiente con TBS, contenente l'1 % (w/v) di latte scremato in polvere, CaCI2 1 mM, e 2 pg di anticorpo antiE-caderina/ mi tampone. Al termine della incubazione, la membrana era lavata quattro volte per cinque minuti, seguita da una quinta volta per 10 minuti con TBS, contenente Tween 20 allo 0.05% (w/v) (tampone TBS-Tween). La membrana era poi incubata per 1 ora a temperatura ambiente con TBS-Tween, contenente l’1% (w/v) di latte scremato in polvere e anticorpo secondario (anti-lg di topo coniugati con perossidasi di rafano) diluito 1 :3000. Al termine di questa incubazione, la membrana era lavata come descritto precedentemente, e l’antigene era quindi rivelato con la procedura ECL mediante esposizione di una lastra fotografica Kodak X-Omat. L’elettroferogramma era quindi sottoposto ad analisi densitometrìca, e l’assorbanza dell'area dei picchi, in unità arbitrarie, era registrata e usata per la quantificazione degli antigeni rilevati.
Composti di riferimento utilizzati
Ai fini della seguente sperimentazione, sono state utilizzate le tossine acido okadaico (AO) e yessotossìna (YTX) (vedi Materiali e Metodi) rispettivamente come composti di riferimento per la classe delle dinophysistossine e per quella delle yessotossine (in accordo con Yasumoto T et al., 1993, Chem Rev: 93, 1897; Satake et al., 1977, Nat Toxins, 5: 107; Ciminiello et al., 2000, Eur J Org Chem., 291). Le concentrazioni di tossina utilizzate sono quindi espresse in quantità equivalenti dei due composti di riferimento.
Esempio 1: Variazioni del contenuto celluiare di E-caderina e degli antigeni correlati ECRA13S ed ECRA100, in seguito a trattamento di cellule in coltura con acido okadaico (AO) e yessotossìna (YTX).
Cellule MCF-7 sono state trattate per 18 ore a 37°C con AO 50 nM, YTX 50 nM, con entrambi gli agenti a una concentrazione di 50 nM, o con veicolo (controllo). Al termine del trattamento le cellule sono state impiegate per la preparazione di estratti cellulari e 50 μg di proteine da ciascun campione, sono stati frazionati mediante SDS-PAGE e sottoposti ad analisi mediante immunoblotting con anticorpo anti-E-caderina.
Come mostrato in figura 1, il materiale immunoreattivo è presente in netta prevalenza in corrispondenza della banda di peso molecolare 126 KDa (Mr di 126.1 ± 4.1 kDa) in accordo con i dati di letteratura (Damsky C.H et al., 1983, Celi, 34:455), sia nel controllo che nel trattamento con acido okadaico, ma in questo trattamento essa e’ associata con la comparsa dell’antigene ECRA135 (Mr di 136.3 3.3 kDa). Nel trattamento con yessotossina l'immunoreattività è invece associata prevalentemente con la banda di 100 kDa (Mr di 101.9 3.2 kDa), corrispondente ali’antigene ECRA100 e la E-caderina è rilevabile comunque come una banda di intensità poco inferiore. Nel doppio trattamento AO YTX sono rilevabili entrambe le bande caratteristiche dei singoli trattamenti, ECRA,35 ed ECRA100, insieme con la banda di E-caderina nativa.
L’analisi densitometrica di elettroferogrammi corsi in condizioni analoghe ed ottenuti in condizioni sperimentali simili, ha inoltre mostrato che: nel trattamento di controllo con solo veicolo, la E-caderina costituisce il componente maggiore (92.1 5.4%, n = 6) della immunoreattività totale. A volte, ed in seguito a sovraesposizione, si può osservare come componente minore l'antigene ECRA100 (E-Cadherin Related Antigen). In cellule trattate con AO 50nM si osserva una netta diminuzione della immunoreattività totale relativa {∑), che raggiunge il 15.4 ± 8.7 % di quella rilevabile negli estratti preparati da cellule di controllo. Alla E-caderina nativa, che rappresenta comunque la componente maggiore (77.6 ± 12.3 % della immunoreattività totale), si affianca la rilevazione del componente ECRA135 che costituisce il 20.6 9.6 % della immunoreattività totale, mentre ECRA100, non sempre rilevabile, può arrivare a rappresentare Γ1.8 3.1 % della immunoreattività totale. Anche il trattamento di cellule MCF-7 con YTX (1 μΜ) determina una modifica nelle proporzioni relative di E-caderina e antigeni correlati, infatti dopo 24 ore di incubazione, i livelli di immunoreattività totale relativa (∑) sono quasi raddoppiati (190 ± 32%, n = 4) rispetto a quelli rilevabili nelle cellule di controllo. In tali condizioni sperimentali, ECRA13S non è rilevabile, mentre la E-caderina ed ECRA100 sono presenti in quantità quasi equivalenti, costituendo, rispettivamente, il 52.0 ± 1.7 e 48.0 ± 1.7 (n = 4) dell'immunoreattività totale.
Dai dati mostrati in Figura 1 è possibile sinteticamente riassumere che: il trattamento con AO induce la comparsa di un antigene con mobilità elettroforetica corrispondente a un Mr di circa 135 kDa (ECRA13Sl) che si aggiunge alla E-caderina endogena o nativa (Mr circa 126 kDa), mentre nello stesso sistema sperimentale il trattamento con YTX induce un aumento relativo di un antigene con mobilità elettroforetica di circa 100 kDa (ECRA100), presente a bassi livelli in cellule di controllo. I risultati ottenuti suggeriscono quindi che vi è una relazione quantitativa fra i livelli di E-caderina, ECRA135 ed ECRA100, e le concentrazioni di AO e YTX somministrate a cellule in coltura e mostrano inoltre che le alterazioni qualitative nel profilo di E-caderina e antigeni correlati, indotte singolarmente da AO e YTX, sono mantenute anche quando le cellule MCF-7 sono trattate con le due tossine contemporaneamente.
Esempio 2. Relazione quantitativa fra i livelli di E-caderina, ECRA135 ed ECRA100, e concentrazioni di OA e YTX somministrate a cellule in coltura.
Sulla base dei dati precedenti, si sono condotti esperimenti mirati alla individuazione delle dosi minime di AO e YTX capaci di indurre le modifiche nei livelli di E-caderina e antigeni correlati in cellule MCF-7. La figura 2 riassume i dati ottenuti somministrando AO e mostra che la diminuzione dei livelli di materiale immunoreattivo all’anticorpo anti-E-caderina da noi impiegato, normalizzato rispetto alla superficie colturale da cui è stato ottenuto il campione, inizia ad essere rilevabile quando cellule MCF-7 sono trattate per 20 ore con concentrazioni di AO superiori a 10 nM, ed è massima per concentrazioni superiori a 75 nM. Questo decremento di immunoreattività totale relativa (∑) è accompagnato dall'accumulo di ECRA135, che è rilevabile quando cellule MCF-7 sono trattate con AO 20-30 nM, ed è massimo per concentrazioni di AO di 75 nM (Fig. 2). Il trattamento di cellule MCF-7 con concentrazioni di AO comprese nel medesimo intervallo si riflette in una relativa diminuzione dei livelli di ECRA100, che sono minimi per concentrazioni di AO superiori a 50 nM. Dai dati presentati in figura 2 è inoltre rilevabile che, nelle condizioni utilizzate, l'intervallo di proporzionalità del saggio è costituito da concentrazioni equivalenti di acido okadaico pari a 30-75 nM, corrispondenti a circa 25-60 ng/ml AO.
Questo tipo di analisi è stata ripetuta impiegando YTX, e i dati riportati nella figura 3 mostrano che un incremento del materiale immunoreattivo all’anticorpo anti-E-caderina, normalizzato rispetto alla superficie colturale da cui è stato ottenuto il campione, è rilevabile quando cellule MCF-7 sono trattate per 20 ore con concentrazioni di tossina circa di 0.2 nM, raggiungendo valori massimi per concentrazioni di YTX uguali e superiori a 1 nM. Anche l’accumuio di ECRA100, accompagnato dalla riduzione di E-caderina nativa, appare indotto da concentrazioni di YTX comprese fra 0.2 e 1 nM (Fig. 3), mentre ECRA135 non è mai stato rilevato dopo trattamento di cellule MCF-7 con la sola YTX.
Dai dati presentati in figura 3 è inoltre rilevabile che, nelle condizioni utilizzate, l'intervallo di proporzionalità del saggio è costituito da concentrazioni equivalenti di yessotossina pari a 0.2-0.5 nM, corrispondenti a circa 2.4-6 ng/ml YTX.
Esempio 3. Misurazione contemporanea degli effetti di OA e YTX su cellule in coltura.
La diversità riscontrata nelle risposte indotte da AO e YTX, e la possibilità di correlarne l’intensità con la concentrazione dell’agente presente nel sovranatante delle cellule, hanno indotto a verificare se il trattamento di cellule MCF-7 con AO e YTX, contemporaneamente presenti, si risolvesse con la rilevazione di modifiche nella popolazione di antigeni correlati alia E-caderina simili a quelle già osservate con i due composti separatamente aggiunti ai nostri sistemi sperimentali.
I risultati ottenuti nell'Esempio 1 (Fig. 1), mostravano che estratti ottenuti da cellule MCF-7 trattate per 18 ore con AO e YTX, contemporaneamente presenti a una concentrazione di 50 nM, contengono livelli misurabili di E-caderina, di ECRA135 e di ECRA100 e che le alterazioni qualitative nel profilo di E-caderina e antigeni correlati, indotte singolarmente da AO e YTX, erano mantenute anche quando le cellule MCF-7 venivano trattate con le due tossine contemporaneamente, suggerendo la possibilità di poterle rilevare contemporaneamente nel nostro sistema sperimentale.
Allo scopo di individuare la relazione dose-risposta per ciascuna delle due classi di tossine, anche in presenza dell’altra, sono stati condotti ulteriori esperimenti in modo analogo a quanto riportato negli esempi precedenti. Le cellule MCF-7 erano trattate per 20 ore con dosi crescenti di ciascun agente in presenza o in assenza di dosi efficaci dell’altro. La figura 4 riporta i dati ottenuti quando cellule MCF-7 sono state trattate con dosi crescenti di AO in presenza o in assenza di YTX 10 nM, e mostra che l’incremento dei livelli cellulari di ECRA135 indotto da concentrazioni di AO superiori a 30 nM è mantenuto in presenza di YTX, sebbene i livelli relativi di ECRA135 siano all'ìncirca dimezzati rispetto a quelli misurati in assenza di YTX. I bassi livelli di ECRA100, trovati in estratti ottenuti da cellule trattate con AO (Fig. 2), non sono invece rilevati quando l’incubazione è condotta in compresenza di YTX 10 nM, che mantiene i livelli relativi di ECRA100 fra il 40 e il 50% della immunoreattività totale. Questo effetto si accompagna a una relativa diminuzione di E-caderina nativa, i cui livelli relativi sono ulteriormente diminuiti all’aumentare della concentrazione di AO in presenza di YTX 10 nM, raggiungendo circa il 40% dell’immunoreattività totale relativa (∑) (Fig. 4). In queste condizioni sperimentali, i livelli di immunoreattività totale rilevabile in estratti da cellule MCF-7 erano comunque progressivamente ridotti dopo trattamento delle cellule con dosi crescenti di AO, e la contemporanea presenza di YTX 10 nM non appariva in grado di mantenere l’incremento relativo di immunoreattività, nemmeno a basse dosi di AO (Fig. 4).
Quando questi esperimenti sono stati ripetuti analizzando l’effetto di dosi crescenti di YTX nel nostro sistema sperimentale, in assenza e in presenza di AO 50 nM, abbiamo ottenuto risultati coerenti con i precedenti (Fig. 5). Veniva così confermato che YTX induce un aumento dose-dipendente di ECRA100, i cui livelli relativi sono ridotti dalla compresenza di AO nel mezzo di coltura (Fig. 5). Era anche confermato che ECRA135 non è rilevabile in assenza di AO, e che i livelli relativi di ECRA135 diminuiscono all’aumentare delle dosi di YTX (Fig. 5). Inoltre, veniva confermato che i livelli relativi di E-caderina nella immunoreattività totale sono progressivamente diminuiti all’aumentare delle concentrazioni di YTX aggiunte al mezzo di coltura. Tale effetto, tuttavia, non era riievabile quando cellule MCF-7 erano trattate in presenza di AO 50 nM, la cui presenza manteneva i livelli relativi di E-caderina a circa il 70% della immunoreattività totale, indipendentemente dalle concentrazioni di YTX impiegate nel trattamento. Il raddoppiamento della immunoreattività totale relativa (∑) indotta da dosi crescenti di YTX, infine, non era osservabile quando le cellule erano trattate con questo agente in presenza di AO 50 nM (Fig. 5). In queste condizioni sperimentali, infatti, i livelli deH'immunoreattività totale relativa (∑) erano mantenuti a circa il 20% di quella rilevabile in cellule non trattate, indipendentemente dalle concentrazioni di YTX presenti durante il trattamento con AO 50 nM.
In base ai risultati è possibile affermare che la procedura qui descritta consente di misurare con ragionevole accuratezza i livelli complessivi di agenti tossici dei gruppi di YTX e DTX presenti contemporaneamente nel medesimo campione, superando cosi i limiti delle procedure finora disponibili per la misura di tali composti in estratti ottenuti da materiale contaminato.
Esempio 4. Alterazioni dei livelli di E-caderina e antigeni correlati In cellule MCF-7 trattate con estratti grezzi di mitili e contenenti AO e YTX.
Preparazione di estratti grezzi da epatopancreas di mitili.
Estratti grezzi sono stati preparati da mitili ( Mitylus galloprovincialis ) non contaminati, acquistati sul mercato. Gli estratti sono stati preparati seguendo il metodo ufficiale in Italia (G.U. N. 279, 29 novembre 1995, D.M. Sanità 31 Luglio 1995). Gli epatopancreas sono stati prelevati e 25 gr sono stati omogeneizzati con 125 mi di acetone, con omogeinizzatore Potter-Elvejham con pistone in teflon. L'omogenato è stato filtrato su carta da filtro e il residuo è stato ripreso due volte con 50 mi di acetone e nuovamente filtrato. I tre estratti sono stati combinati e l’acetone è stato evaporato a 40°C. Il residuo acquoso è stato quindi estratto con 50 mi di etere etilico e la fase eterea è stata recuperata. La fase acquosa è stata riestratta due volte con 50 mi di etere etilico, e i tre estratti eterei sono stati combinati. L'etere è stato quindi evaporato, e il materiale ottenuto rappresentava l’estratto grezzo da epatopancreas di mitili.
Valutazione dei livelli di E-caderìna ed antigeni correlati in estratti di mitili Lo scopo di questi esperimenti è stato quello di verificare se AO e YTX possono indurre alterazioni a carico di E-caderina e antigeni correlati anche quando le tossine sono presenti in matrici complesse quali gli estratti grezzi ottenuti da molluschi destinati ad uso alimentare, in particolare mitili.
A questo scopo si è proceduto preparando un estratto grezzo da mitili reperiti sul mercato, nominalmente privi di tossine DSP, al quale sono state aggiunte quantità predefinite di AO e/o YTX. L’estratto grezzo, qui definito “estratto grezzo originario”, è stato quindi preparato come descritto nella sezioni dei Metodi, ed è stato predisposto per la prova come segue. In primo luogo, 1 volume di estratto grezzo originario è stato diluito con 5 volumi di etanolo:dimetilsulfossido (1:1), per ottenere una soluzione che consentisse una agevole applicazione del campione alle colture cellulari, minimizzando la possibilità di errori di volume. All'estratto cosi preparato, qui definito “estratto grezzo diluito", sono stati aggiunti dei quantitativi di AO e/o YTX simili a quelli riscontrabili nei campioni ottenibili da mitili contaminati.
L’estratto grezzo diluito è stato addizionato con AO e/o YTX, e sono stati ottenuti altri tre estratti finali, cosi costituiti:
estratto grezzo diluito contenente 36 ng di ΥΤΧ/μΙ di estratto grezzo originario (definito “estratto di mitili YTX”);
- estratto grezzo diluito contenente 125 ng di ΑΟ/μΙ di estratto grezzo originario (definito “estratto di mitili AO”);
- estrato grezzo diluito contenente 36 ng di YTX e 125 ng di ΑΟ/μΙ di estrato grezzo originario (definito “estratto di mitili YTX+AO”).
La figura 6 riporta i risultati ottenuti in cellule MCF-7. La prova è stata condota impiegando capsule Petri contenenti cellule confluenti in un volume totale di 5 mi del mezzo di coltura cellulare. La quantità di estrato di mitili aggiunto alle cellule era equivalente a 1.3 μΙ di estrato grezzo originario, e, nei casi indicati, conteneva 50 ng di YTX e/o 170 ng di AO.
Il confronto fra i risultati otenuti con campioni preparati da cellule di controllo e da quelle trattate con l'estrato di mitili privo di tossine (estratto di mitili, Fig. 6) mostra che non è rilevabile una modifica qualitativa nella espressione di E-caderina e antigeni correlati imputabile a componenti estrati da mitili non contaminati da tossine DSP. Il tratamento di cellule MCF-7 con estrati di mitili contenente YTX, invece, determinava un netto aumento di ECRA100, che raggiungeva i livelli di E-caderina, portando quasi al raddoppiamento della immunoreatività totale relativa (∑) rilevata (Fig. 6). In cellule tratate con estrati contenenti AO, per converso, si è rilevata la comparsa di ECRA135, accompagnata da una neta diminuzione della immunoreatività totale relativa (∑). Quando entrambe le tossine erano presenti nell’estratto di mitili impiegato nel trattamento, infine, si è rilevato sia l'aumento di ECRA100, che la comparsa di ECRA135 (Fig. 6), accompagnati da un calo della immunoreattività totale relativa (∑).
Le alterazioni a carico di Ε-caderina e antigeni correlati indotte da AO e YTX sono pertanto rilevabili anche quando queste tossine sono contenute in matrici biologiche complesse, quali gli estratti grezzi preparati da epatopancreas di mitili.
Claims (22)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la determinazione qualitativa e quantitativa delle tossine DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning) del gruppo delle dinophysistossine e del gruppo delle yessotossine, basato sulla valutazione della quantità di proteina E-caderina e degli antigeni ad essa correlati, ECRA100 ed ECRA135 in un sistema cellulare in vitro.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove tale determinazione qualitativa consiste nell 'osservazione del contenuto cellulare di proteina E-caderina e degli antigeni ad essa correlati, ECRA100 ed ECRA135 nel sistema cellulare trattato con il campione di cui si vuole valutare la contaminazione.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove tale determinazione quantitativa consiste nell’osservazione delle variazioni del contenuto cellulare di proteina E-caderina e degli antigeni ad essa correlati, ECRA100 ed ECRA135 nel sistema cellulare trattato con il campione di cui si vuole valutare la contaminazione, rispetto ad un sistema cellulare trattato con il controllo.
- 4. Procedimento secondo la rivendicazione 1 dove tali tossine sono scelte tra: yessotossina, omoyessotossina, 45-idrossiyessotossina, 45-carbossiyessotossina, dinophysistossina 1, dinophysistossina 2, dinophysistossina 3, acido okadaico e loro derivati.
- 5. Procedimento in accordo con le rivendicazioni 1-4 che comprende i passaggi di: a) preparazione dei campioni di cui si vuole valutare la contaminazione b) incubazione dei campioni in un sistema cellulare in vitro c) preparazione degli estratti citosolubili delle cellule e frazionamento degli stessi in base al peso molecolare dei componenti proteici d) riconoscimento dell’antigene E-caderina e degli antigeni ad essa correlati ECRA100 ed ECRA135, mediante anticorpi anti-E-caderina.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5 dove tali campioni sono estratti grezzi di molluschi.
- 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6 dove tali estratti grezzi sono preparati mediante estrazione e separazione del campione con solventi organici.
- 8. Procedimento secondo la rivendicazione 5 dove detta incubazione b) avviene utilizzando la linea cellulare MCF-7.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8 dove detta incubazione b) è di durata compresa tra le 12 e le 24 ore.
- 10. Procedimento secondo ia rivendicazione 5 dove detto riconoscimento d) avviene mediante immunoblotting con un anticorpo monoclonale anti-E-caderina.
- 11. Procedimento secondo la rivendicazione 5 dove detto frazionamento c) avviene mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante.
- 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11 dove detto gel è anche riducente.
- 13. Procedimento in accordo con le rivendicazioni 5-12, dove detto riconoscimento d) è seguito da un passaggio e) di valutazione dei valori di immunoreattività ottenuti per gli antigeni: E- caderina, ECRA100 ed ECRA135.
- 14. Procedimento secondo la rivendicazione 13 dove tale valutazione è effettuata con l’ausilio di analisi densitometriche e calcolo dei valori di immunoreattività totale del campione e di immunoreattività totale relativa (I).
- 15. Uso del procedimento in accordo con le rivendicazioni 1-14 dove tale determinazione e dosaggio sono effettuati in prodotti di origine marina.
- 16. Uso del procedimento secondo la rivendicazione 15 dove tali prodotti sono destinati all’uso alimentare.
- 17. Uso del procedimento secondo la rivendicazione 16 dove tali prodotti sono molluschi.
- 18. Uso del procedimento secondo la rivendicazione 17 dove tali molluschi sono mitili.
- 19. Antigene ECRA100 immunologicamente correlato alla E-caderina, di peso molecolare 100 kDa.
- 20. Uso degli antigeni E-caderina, ECRA100 ed ECRA135 per )a determinazione della presenza e per il dosaggio di tossine in un campione.
- 21. Uso degli antigeni in accordo con la rivendicazione 20, dove tali tossine appartengono alla classe delle dinophysistossine e delle yessotossine.
- 22. Uso degli antigeni secondo la rivendicazione 21 dove tali tossine sono scelte tra: yessotossina, omoyessotossina, 45-idrossiyessotossina, 45-carbossiyessotossina, dinophysistossina 1 , dinophysistossina 2, dinophysistossina 3, acido okadaico e loro derivati.
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