ITFI20110181A1 - Herg1 e glut-1 in tumori colorettali. - Google Patents
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Description
DOMANDA DI BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO: HERG1 E GLUT-1 NEL CANCRO COLORETTALE
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione à ̈ relativa al campo delle metodiche prognostiche ed in particolare ad un metodo per la determinazione della prognosi peggiore in pazienti con cancro colorettale non metastatico in fase precoce.
STATO DELL’ARTE
Il cancro colorettale (CRC) à ̈ responsabile di circa il 9.4% di tutte le cause di cancro nel mondo ed à ̈ la quarta forma più frequente nell’uomo e la terza nella donna. La sopravvivenza dipende fortemente dallo stadio del tumore, secondo la classificazione TNM. In particolare, lo stadio II (con linfonodi negativi) rappresenta un ampio spettro della malattia, in cui la sopravvivenza a cinque anni può variare dall’ 85% al 50%. La stadiazione patologica del tumore à ̈ ai giorni nostri il principale predittore di prognosi e trattamento in pazienti con CRC. Comunque, à ̈ presente una considerevole variabilità prognostica indipendente dallo stadio che probabilmente riflette l’eterogeneità molecolare. Conseguentemente, l’efficacia della chemioterapia adiuvante, sebbene ben dimostrata in CRC con linfonodi positivi, necessita di essere validata per casi TNM II. Pertanto, per pazienti con linfonodi negativi sono necessari marcatori prognostici e predittivi piu’ efficaci che affianchino la stadiazione clinica e patologica.
L’instabilità dei micro satelliti (MSI) e le alterazioni di p53 sono tra le alterazioni tumorali piu’ frequenti associate alla cancerogenesi del CRC. Infatti, un difetto nella riparazione del DNA si osserva in circa il 15% dei carcinomi del colon, mentre alterazioni di p53 si ritrovano nella metà dei CRC. Sebbene varie caratteristiche tumorali incluse MSI e p53 siano state ipotizzate influenzare il decorso clinico del CRC, nessuna à ̈ stata ancora validata per uso clinico.
I candidati molecolari potenzialmente implicati nella progressione del CRC possono essere individuati dal percorso dell’ipossia. L’ipossia tumorale à ̈ uno degli elementi chiave delle progressione tumorale, essendo associata ad un fenotipo maggiormente aggressivo e ad un’aumentata propensione alla formazione di metastasi. L’ipossia può innescare diversi processi poiché induce l’espressione di vari geni specifici attraverso l’azione del Fattore di Trascrizione Inducibile dall’Ipossia (HIF-1). L’aumentata espressione delle proteine dipendenti da HIF-1 permette alle cellule tumorali di sopravvivere nel duro microambiente tumorale, principalmente inducendo la neo-angiogenesi. L’impatto dell’ipossia sulla progressione tumorale si riflette anche sugli effetti sul trattamento: infatti, l’ipossia rappresenta uno dei principali mediatori della radio- e chemio-resistenza dei tumori, così come delle modificazioni morfologiche che riducono la penetrazione dei farmaci nel tumore. Marcatori endogeni di ipossia tumorale comprendono il Fattore di Crescita Endoteliale Vascolare-A (VEGF-A), l’Anidrasi Carbonica IX (CA-IX), il Trasportatore di Glucosio 1 (Glut-1) ed il Recettore per il Fattore di Crescita Epidermico (EGF-R). l’espressione dei marcatori di ipossia à ̈ alterata nel CRC ed à ̈ apparentemente correlata alla progressione del CRC; comunque, il loro impatto prognostico sul CRC rimane ancora da definire. I canali di potassio voltaggio-dipendenti sono attori nuovi ed inattesi nello sviluppo e progressione del CRC (Arcangeli et al, Curr. Med. Chem. 2009 16: 66-93; Ousingsawat et al, Clin. Cancer Res 2007 13: 824-831). E’ stato dimostrato che i canali del potassio della famiglia ether-a-gò-gò (hERG1) sono espressi nel CRC mentre sono assenti negli adenomi del colon (Lastraioli et al, Cancer Res 200464:606-611) e sono funzionalmente associati al percorso di VEGF-A (Masi et al, Br. J. Cancer 2005 93: 781-792; Pillozzi et al, Blood 2007110: 1238-1250). Questi dati sono stati confermati da altri gruppi sia in modelli murini di CRC (Ousingsawat et al, Plugers Arch-Eur. J. Physiol 2008456:847-855) e CRC primari umani (Dolderer et al, Eur J Surg Oncol 201036:72-77). Complessivamente, l’espressione di hERG1 può essere considerata come un marcatore affidabile di CRC.
E’ necessario identificare nuovi marcatori per definire il rischio di ricorrenza in pazienti con carcinomi colorettali negli stati precoci.
DEFINIZIONI E ABBREVIAZIONI CA-IX: Anidrasi Carbonica-IX
CRC: cancro colorettale
EGF-R: Recettore per il Fattore di Crescita Epidermico
Glut-1: Trasportatore di Glucosio 1
HIF-1: Fattore di Trascrizione Inducibile dall’Ipossia
IHC: immunoistochimica
MSI: Instabilità dei Microsatelliti
OS: Sopravvivenza Globale
TNM VEGF-A: Fattore di Crescita Endoteliale Vascolare-A
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
Durante uno studio il cui obiettivo era la valutazione dell’impatto prognostico della proteina hERG1 insieme a marcatori di ipossia (VEGF-A, GLUT-1, CA-IX e EGF-R) in un’ampia casistica di pazienti con CRC non metastatico à ̈ emerso sorprendentemente che l’espressione di hERG1 e l’assenza di Glut-1 identifica un gruppo di pazienti a prognosi sfavorevole appartenenti agli stadi III di cancro colorettale che potrebbero beneficiare della terapia adiuvante, indipendentemente dallo stadio del tumore. Anche un marcatore biologico classico, p53, e le caratteristiche clinicopatologiche sono state inserite nello studio. OS à ̈ stata considerata quale principale indicatore prognostico.
Pertanto l’oggetto della presente invenzione à ̈ un metodo per la determinazione della prognosi sfavorevole in un paziente con cancro colorettale non metastatico in fase precoce, detto metodo comprendente la determinazione tramite IHC della positività per hERG1 insieme alla negatività per Glut-1 in un campione dell’adenocarcinoma di detto paziente.
Ulteriore oggetto della presente invenzione à ̈ un kit per il metodo descritto nell’invenzione, detto kit comprendente almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-hERG1 ed almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-Glut-1.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Immunoistochimica e valutazione del sistema di punteggio per hERG1 in campioni di CRC.
La Figura 1 mostra sezioni rappresentative di campioni di adenocarcinoma colorettale caratterizzati da tre diversi punteggi per hERG1. A) Punteggio 0 (0% di cellule positive); B) Maggiore ingrandimento dello stesso campione riportato in A); C) Punteggio 1 (1-49% di cellule positive per campo microscopico); D) maggiore ingrandimento dello stesso campione riportato in C); E) Punteggio 2 (50% di cellule positive per campo microscopico); F) Maggiore ingrandimento dello stesso campione in E). Barra: 200Î1⁄4m (A, C, E); 50Î1⁄4m (B, D, F).
Figura 2. Colorazione immunoistochimica per hERG1, VEGF-A, Glut-1, EGF-R, CA-IX e p53 in tre diversi campioni di CRC.
La Figura 2 mostra immagini di IHC relative a tre campioni rappresentativi marcati con i marcatori di ipossia (CA-IX, VEGF-A, Glut-1) insieme a hERG1. A-D) Rilevazione immunoistochimica di diversi marcatori nello stesso campione di stadio TNM II: A) hERG1 pos; B) VEGF-A pos; C) Glut-1 neg; D) EGF-R pos.
E-H) Rilevazione immunoistochimica di diversi marcatori nello stesso campione di stadio TNM II: E) VEGF-A pos; F) CA-IX pos: notare che CA-IX era espressa da piccoli gruppi di cellule (vedi frecce); G) Glut-1 pos: notare che, come indicato dalle frecce, l’espressione di Glut-1 era focale, confinata ad aree distinte del campione tumorale; H) p53 pos.
I-L) Rilevazione immunoistochimica di diversi marcatori nello stesso campione di stadio TNM I: I) campione hERG1 neg, in cui non si osserva alcuna marcatura; J) CA-IX pos: notare che l’espressione di CA-IX era intensa, sebbene localizzata in piccoli gruppi di cellule; K) Glut-1 pos: notare che l’espressione era focale ed intensa; D) EGF-R neg. Barra: 50Î1⁄4m.
Figura 3 mostra le curve di Kaplan-Meier della sopravvivenza globale in funzione delle diverse combinazioni delle caratteristiche tumorali (stadio TNM, espressione di Glut-1 e di hERG1)
Figura 4 mostra un modello dell’interazione tra hERG1, Glut-1 e VEGF-A nella progressione del CRC.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione sorge da uno studio il cui obiettivo era di valutare l’impatto di marcatori di ipossia ben noti insieme ad un canale per il K<+>voltaggio dipendente, hERG1, sulla OS dei pazienti con CRC non metastatico. I risultati dello studio, sebbene ancora preliminari, forniscono evidenza del fatto che la positività per hERG1 insieme alla negatività per un marcatore di ipossia, Glut-1, permette di identificare un gruppo di pazienti, appartenenti agli stadi I e II, che li avvicina alla prognosi dei pazienti con CRC in stadio III.
L’ipossia à ̈ una delle cause piu’ comuni di fallimento nel trattamento del cancro. Infatti, l’ipossia à ̈ stata dimostrata essere un importante predittore di scarsa risposta alla radio chemioterapia nel cancro di testa e collo così come nel cancro della cervice. A causa di questa influenza sulle opzioni terapeutiche, l’ipossia rappresenta un rilevante ostacolo anche per il trattamento del CRC. Comunque, nonostante la sua rilevanza, uno studio atto a determinare l’impatto prognostico e predittivo di marcatori biomolecolari appartenenti al percorso dell’ipossia nel CRC à ̈ tuttora mancante.
Nella nostra analisi abbiamo incluso l’espressione dei canali di K<+>hERG1 insieme a indicatori di ipossia classici (VEGF, CA-IX, Glut-1 ed EGF-R). Infatti, i canali di K<+>voltaggio dipendenti, incluso hERG1, stanno diventando i piu’ originali ma credibili marcatori molecolari nel CRC. Infatti, una associazione statisticamente significativa à ̈ emersa tra l’espressione di hERG1 e di tutti gli altri marcatori di ipossia che abbiamo analizzati. Questo risultato inoltre conferma, in ambito clinico, quanto sta emergendo dai dati biologici e sperimentali e candida, per la prima volta, un canale di potassio come membro del percorso dell’ipossia/angiogenesi,, almeno nei CRC.
Un altro essenziale marcatore di ipossia, VEGF-A, oltre ad essere fortemente associato all’espressione di hERG1, à ̈ risultato essere moderatamente associato con due altri marcatori di ipossia tumorale: CA-IX e Glut-1. Inoltre, l’espressione di VEGF-A era fortemente associata con la presenza di p53 mutata, indicata dalla positività per p53 in IHC. Questo conferma che l’ipossia, forse attraverso un’aumentata attività trascrizionale mediata da HIF-1 del gene vegf-a seleziona cloni con p53 mutata resistenti all’ipossia, contribuendo così alla progressione del CRC.
Comunque, la positività per p53 non ha mostrato alcun impatto significativo sulla sopravvivenza dei pazienti con CRC. Questo à ̈ in accordo con i risultati ottenuti da analisi recenti.
Al contrario, l’analisi univariata della OS, oltre a confermare il ben noto ruolo prognostico dello stadio TNM, indica CA-IX come un indicatore di prognosi infausta nel CRC. L’isoenzima IX dell’Anidrasi Carbonica à ̈ coinvolto nel mantenimento del pH extracellulare ed à ̈ stato ripetutamente dimostrato essere fortemente indotto dall’ipossia tumorale. Questo à ̈ rilevante anche nei CRC, che mostrano anomala espressione di CA-IX soprattutto nelle aree del tumore ad elevata proliferazione. I nostri risultati sottolineano inoltre l’importanza dell’espressione di CA-IX nel CRC.
L’analisi multivariata, oltre a confermare l’importanza prognostica dello stadio TNM, ha mostrato che solo due dei marcatori di ipossia che abbiamo analizzato, diversi da CA-IX, rimanevano nel modello: hERG1, la cui positività aveva un impatto negativo sull’OS, e Glut-1 che, al contrario, era un predittore di prognosi favorevole, se positivo. In altre parole, la positività dell’espressione di hERG1, insieme all’assenza di Glut-1, segue lo stesso andamento del ben noto impatto prognostico negativo della valutazione clinico patologica dello stadio TNM.
E’ possibile costruire un modello (Figura 4) in cui l’interazione tra Glut-1 ed hERG1 à ̈ descritta ed interpretata. Quando la massa tumorale raggiunge un volume critico può essere presente un’area ipossica nella porzione centrale della lesione. In tali condizioni, l’espressione di Glut-1 à ̈ attivata (triangoli con gradiente di colore da grigio chiaro a scuro). Successivamente, le condizioni normossiche sono ripristinate a causa dell’angiogenesi mediata da VEGF-A (rettangolo con gradiente di colore grigio) regolato dai canali di potassio hERG1, la cui espressione aumenta durante la progressione tumorale (triangolo con gradiente di colore da grigio scuro a chiaro). Quindi, l’espressione di Glut-1 à ̈ ridotta (triangoli con gradiente da grigio chiaro a scuro). Nelle fasi tardive della progressione tumorale sia VEGF-A che hERG1 sono overespresse (rettangoli grigio scuro e bianco, rispettivamente).
In tale modello, l’espressione di Glut-1 à ̈ elevata fino a che l’ipossia à ̈ presente all’interno della massa tumorale, mentre l’espressione di Glut-1 decresce appena le condizioni di normossia vengono ripristinate, come conseguenza della neoangiogenesi mediata da VEGF-A, la cui secrezione à ̈ attivata e regolata dai canali hERG1. Pertanto, nel corso della progressione tumorale, viene stabilita una condizione che à ̈ caratterizzata dalla presenza di hERG1, dalla continua espressione di VEGF-A e la scomparsa di Glut-1. Tale condizione permette la costituzione di un fenotipo maggiormente aggressivo (sia resistente ai farmaci che metastatico).
Infine, una conseguenza clinica pratica deriva da tale modello e dai risultati dell’analisi multivariata. Infatti, partendo dalle categorie di rischio calcolate dal modello multivariato finale, i pazienti sono stati stratificati in quattro diversi gruppi di rischio: A) TNM I-II, con Glut-1 pos, qualunque hERG1; B) TNM I-II con Glut-1 neg ed hERG1 neg; C) TNM I-II con Glut-1 pos e hERG1 pos; D) TNM III, qualunque Glut-1 e qualunque hERG1 (vedi curve in Figura 3). Le probabilità di OS a tre anni all’interno dei gruppi hanno permesso di concludere che il gruppo di pazienti che mostra positività per hERG1 e contemporanea negatività per Glut-1, nonostante appartengano al gruppo I o II, ha una probabilità di rischio che si sovrappone perfettamente al rischio dei pazienti in stadio TNM III. Sebbene questi risultati debbano essere confermati in un gruppo di pazienti piu’ ampio, possiamo concludere che la rilevazione IHC per hERG1 e Glut-1 potrebbe identificare un sottogruppo di pazienti con CRC localizzato di stadio I e II, a prognosi peggiore. Attualmente, nella pratica clinica, le opzioni terapeutiche per CRC sono dirette al trattamento di pazienti in stadio III e, almeno per quei casi nei quali un maggiore rischio di ricorrenza può essere identificato da caratteristiche clinico-patologiche, stadio II. Tuttavia, i nostri dati suggeriscono che quei pazienti con tumori primari positivi per hERG1 e negativi per Glut-1 potrebbero plausibilmente ricevere un’indicazione per una terapia adiuvante piu’ aggressiva, sebbene appartengano allo stadio clinico patologico II o addirittura I.
SEZIONE SPERIMENTALE MATERIALI E METODI.
Pazienti: lo studio di coorte include pazienti non sottoposti a trattamento che sono stati sottoposti a chirurgia con intento curativo per adenocarcinoma colorettale presso il Dipartimento di Chirurgia Generale e Oncologia, Azienda Ospedaliero-Universitaria, Careggi, Firenze.
I pazienti affetti da epatite virale C o che erano stati sottoposti a radioterapia o chemioterapia preoperatoria per cancro rettale sono stati esclusi. I campioni di tumore sono stati raccolti durante l’intervento chirurgico, dopo l’ottenimento di un consenso informato scritto, ed immediatamente processati per la conservazione dei campioni (vedi oltre). Tutti i campioni sono stati classificati come adenocarcinomi e stadiati secondo la classificazione dell’American Joint Committee on Cancer (AJCC) da patologi con esperienza. Solo i campioni risultati essere di stadio TNM da I a III sono stati inclusi nello studio ed ulteriormente processati.
Analisi Immunoistochimica: l’immunoistochimica (IHC) à ̈ stata condotta su sezioni di 7Î1⁄4m di campioni di adenocarcinoma colorettale, su vetrini a carica positiva. Dopo la sparaffinatura e la reidratazione delle sezioni, le perossidasi endogene sono state bloccate con una soluzione di H2O2all’1% in PBS. Successivamente, lo smascheramento antigenico à ̈ stato condotto come segue: a) con trattamento con Proteinasi K (5Î1⁄4g/ml) (per hERG1, VEGF-A, CA-IX e Glut-1); b) con trattamento in forno a microonde a 600W in Tampone Citrato a pH 6.0, per 10 (per EGF-R) o 20 minuti (per p53). I seguenti anticorpi sono stati utilizzati alle diluizioni riportate in parentesi: 1) anticorpo policlonale anti-hERG1 prodotto nel laboratorio della Dr Arcangeli e distribuito da Alexis Biochemicals, Losanna, Svizzera; diluizione 1:100); anticorpo monoclonale anti-hERG1 (prodotto nel laboratorio della Dr Arcangeli e distribuito da Alexis Biochemicals, Losanna, Svizzera; diluizione 1:200); 3) anti- VEGF-A (anticorpo policlonale anti VEGF-A (A-20), Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz CA, USA, diluizione 1:100); 4) anti-Glut-1 (anticorpo policlonale di coniglio anti-GLUT1 umana, Dako Cytomation, Glostrup, Danimarca, diluizione 1:100); 5) anticorpo monoclonale anti-CA-IX (Anticorpo monoclonale murino M75, descritto in Pastorekova et al, Gastroenterology 1997 112:398-408, diluizione 1:100); 6) anti-EGF-R IgG policlonale di coniglio (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz CA, USA, diluizione 1:100); 7) anticorpo monoclonale murino anti-p53 umana (Dako Cytomation, Glostrup, Danimarca; diluizione 1:50). L’incubazione con l’anticorpo primario à ̈ stata condotta per tutta la notte a 4°C, eccetto che per l’anticorpo anti-p53, che à ̈ stato incubato per 30 minuti a temperatura ambiente. L’immunorivelazione à ̈ stata condotta con un kit commerciale (PicTure Plus kit e DAB, Zymed, Carlsbad CA USA) secondo le indicazioni del produttore. I campioni sono stati valutati da due osservatori indipendenti. La colorazione à ̈ stata effettuata secondo le indicazioni del produttore presenti nella brochure allegata alla confezione dell’anticorpo. Per CA-IX, à ̈ stato seguito il metodo descritto in Pastorekova et al, Gastroenterology 1997112:398-408.
L’attribuzione di un punteggio positivo à ̈ stata effettuata come segue: a) per VEGF-A quando i campioni mostravano piu’ del 10% di cellule positive (Galizia et al, Clin Cancer Res 200410:3490-3499); b) per Glut-1 quando sono identificate aree che mostrano una marcatura inequivocabile, mentre aree con epitelio normale, stroma ed effetti di bordo sono stati ignorati, senza utilizzare alcun sistema di punteggio. I globuli rossi costituiscono un controllo interno positivo; c) per CA-IX, come riportato in Korkeila et al, 2009 Br. J Cancer 100:874-880, senza l’uso di un sistema di punteggio; d) per EGF-R quando erano presenti almeno 1% di cellule positive nel campione; e) per p53, un valore soglia del 10% à ̈ stato adottato, come riportato in Veloso et al, Virchows Arch.2000 437:241-247. Per hERG1, oltre alla valutazione dell’assenza o presenza della proteina hERG1, à ̈ stato utilizzato un sistema di punteggio. hERG1 era espresso nel citoplasma delle cellule neoplastiche e sulla membrana con un profilo di espressione diffuso. Le sezioni colorate sono state osservate ad un ingrandimento 40x, campo per campo, dall’alto a sinistra fino al basso a destra. Ad ogni campo à ̈ stata assegnata una percentuale di positività , rappresentativa dell’area totale delle sezione colorata. Un metodo di punteggio semi-quantitativo che assegna un punteggio IHC come percentuale di cellule tumorali positive (numero di cellule tumorali positive su numero di cellule tumorali totali) à ̈ stato usato con un valore soglia del 50%. Pertanto, i campioni sono stati considerati negativi (punteggio 0) quando non era presente alcuna marcatura; un punteggio 1 à ̈ stato attribuito a campioni che mostravano una positività in percentuale compresa tra 1 e 49% mentre un punteggio 2 à ̈ stato attribuito quando la percentuale di cellule positive era superiore al 50%. Alle aree di necrosi, stroma, epitelio normale e distinti effetti di bordo non à ̈ stato attribuito alcun punteggio. In ogni caso, i campioni sono stati valutati da due operatori indipendenti.
Analisi statistica: La distribuzione di tutti i pazienti in studio à ̈ stata riportata in funzione delle loro caratteristiche demografiche, cliniche e biologiche e riassunte come frequenze e percentuali. Le variabili continue sono state riportate come mediana ed intervallo di variazione. Le seguenti variabili cliniche e demografiche sono state prese in esame: età al momento dell’intervento, sesso, localizzazione del tumore, classificazione TNM e presenza di colloide. La valutazione biologica à ̈ stata condotta attraverso la valutazione dei seguenti marcatori: canali hERG1, Glut-1, VEGF-A, CA-IX, p53 ed EGF-R. Tutti i marcatori sono stati categorizzati come Sì/No relativamente alla loro espressione. Sia nell’analisi di associazione che di sopravvivenza, l’età à ̈ stata categorizzata in due gruppi (70 anni v ≥70 anni). La presenza di un’associazione tra caratteristiche demografiche, cliniche e biologiche à ̈ stata valutata attraverso il test del χ<2>ed il test esatto di Fisher, quando appropriato. Un valore di P a due code ≤0.05 à ̈ stato considerato significativo. Tutte le variabili sono state analizzate per il loro impatto sulla sopravvivenza globale (OS).
OS à ̈ stata definita come il tempo tra l’intervento chirurgico e la morte, indipendentemente dalla causa. Il tempo di osservazione dei pazienti vivi al momento dell’ultimo follow up à ̈ stato censurato. Il tempo di follow up mediano à ̈ stato stimato secondo il metodo inverso di Kaplan Meier (Schemper et al, Control Clin Trials 199617:343-346). In analisi univariata, le stime di OS sono state calcolate secondo il metodo del prodotto-limite di Kaplan e Meier (Kaplan et al, J. Am. Statistical Association 195853:457-481). I confronti tra le curve di sopravvivenza stimate sono stati effettuati attraverso il test per i ranghi. I rischi relativi e gli appropriati intervalli di confidenza al 95% sono stati calcolati con il modello dei rischi proporzionali di Cox. Un modello di regressione multivariata di Cox à ̈ stato infine costruito per valutare l’effetto indipendente di ciascun fattore con OS. Partendo da un modello completo comprendente: sesso, età , localizzazione del tumore, TNM, colloide, hERG1, Glut-1, VEGF-A e CA-IX, le variabili non significative sono state progressivamente rimosse utilizzando una procedura graduale a rovescio, basata sul test dei rapporti di verosimiglianza. Un valore di probabilità di 0.10 à ̈ stato usato sia per i criteri di rimozione che di re-ingresso. I rischi relativi e gli intervalli di confidenza al 95% (CIs) sono stati riportati per ciascuna variabile mantenuta nel modello finale. I dati sono stati analizzati utilizzando il software statistico SAS 9.2 (Sas Corporation- USA).
Abbiamo convertito il modello di predizione di Cox ad un punteggio del rischio che à ̈ direttamente correlato alla probabilità di un individuo di morire per qualunque causa. Infine, partendo dalla distribuzione dei punteggi di rischio e degli strati identificati dalla combinazione dei tre predittori mantenuti dal modello di Cox, abbiamo empiricamente classificato i pazienti in quattro differenti gruppi di rischio.
RISULTATI
Risultati immunoistologici
Abbiamo studiato 135 pazienti con cancro colorettale in stadio da I a III, raccolti nel periodo tra Settembre 2001 e Luglio 2008, sottoposti ad intervento di chirurgia radicale per CRC primario presso la divisione di Chirurgia Generale e Oncologia, azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze. In tutti i campioni abbiamo determinato con l’IHC l’espressione dei canali di potassio hERG1 insieme a vari marcatori di ipossia (VEGF-A, CA-IX, Glut-1, EGF-R) così come marcatori classici per il CRC (p53).
E’ stato precedentemente riportato (Lastraioli et al, Cancer Res 200464:6006-611) che la proteina hERG1 può essere identificata in campioni primari di CRC tramite IHC, con un protocollo che impiega un anticorpo policlonale sviluppato da noi. Negli esperimenti riportati à ̈ stato utilizzato un anticorpo monoclonale che riconosce un epitopo extracellulare localizzato nella regione S5-poro della proteina hERG1. L’analisi statistica condotta con il test χ<2>effettuato sui dati ottenuti dall’IHC ha mostrato una correlazione statisticamente significativa (P0.001) tra il risultati ottenuti con i due anticorpi. L’assenza di un segnale aspecifico con l’uso dell’anticorpo monoclonale ci ha permesso di valutare in maniera migliore la percentuale di cellule positive per campo microscopico e quindi di distinguere definiti gruppi di punteggi.
In base al punteggio di immunoreattività sono stati identificati tre gruppi: i campioni sono stati considerati negativi (punteggio 0) quando non era presente alcuna marcatura; il punteggio 1 à ̈ stato attribuito ai campioni che presentavano una positività in percentuale compresa tra 1 e 49%, mentre un punteggio 2 à ̈ stato attribuito quando la percentuale di cellule positive era maggiore del 50% (vedi Materiali e Metodi). Nella figura 1 A-F sono riportate sezioni rappresentative che mostrano i tre differenti punteggi per hERG1.
La Figura 2 mostra immagini di IHC relative a tre campioni rappresentativi colorati con i marcatori di ipossia (CA-IX, VEGF, Glut-1) insieme ad hERG1. In questo caso, i dettagli dei profili di marcatura sono riportati nella legenda della Figura 2.
Caratteristiche cliniche
La Tabella 1 mostra le caratteristiche clinico patologiche dei pazienti, così come la distribuzione dei marcatori biologici in studio. Dei 135 pazienti, 72 (53%) erano femmine e 63 (47%) maschi. L’età mediana era di 68 anni (intervallo 40-90). Cinquantasette tumori erano localizzati nel colon destro, 14 nel trasverso, 33 nel colon sinistro e 31 nel retto.
Tabella I: Distribuzione dei marcatori clinico patologici e biomolecolar e risultati dell’analisi univariata
Parametro Numero di Sopravvivenza HR (CI 95%) P-Value (LR Test)
Pazienti a 3 anni
EtÃ
<70 anni<73 (54.1 %) 0.59 1 (ref.)>0.652
≥ 70 anni62 (45.9 %)<0.55>1.14 (0.65-1.97)
Sesso
Femmina<72 (53.3 %) 0.55 1 (ref.)>0.588
Maschio63 (46.7 %)<0.59>1.16 (0.67-2.02)
Localizzazione
Colon Destro<57 (42.2 %) 0.53 1 (ref.)>
Colon Sinistro<33 (24.4 %) 0.77 0.71 (0.34-1.51)>0.800
Colon Trasverso<14 (10.4 %) 0.52 0.98 (0.40-2.44)>
Retto31 (23.0 %)<0.50>0.80 (0.40-1.59)
Stadio TNM
I29 (21.5 %)<0.74>1 (ref.)
II47 (34.8 %)<0.74>0.83 (0.33-2.06) <0.001
III59 (43.7 %)<0.36>2.54 (1.17-5.52)
Colloide
No 100 (74.1 %) 0.55 1 (ref.) 0.504
Sì 35 (25.9 %) 0.60 0.81 (0.44-1.49)
hERG1
Neg 104 (77.0 %) 0.59 1 (ref.) 0.203
Pos 31 (23.0 %) 0.50 1.49 (0.80-2.76)
VEGF-A
Neg 25 (18.5 %) 0.52 1 (ref.) 0.299
Pos 110 (81.5 %) 0.58 0.69 (0.34-1.39)
Glut-1
Neg 88 (65.2 %) 0.51 1 (ref.) 0.111
Pos 47 (34.8 %) 0.68 0.60 (0.32-1.13)
CA-IX
Neg 93 (68.9 %) 0.64 1 (ref.) 0.022
Pos 42 (31.1 %) 0.31 2.02 (1.10-3.85)
EGFR
Neg 28 (22.2 %) 0.55 1 (ref.) 0.845
Pos 98 (77.8 %) 0.58 0.94 (0.48-1.81)
p53
Neg 80 (61.1 %) 0.55 1 (ref.) 0.876
Pos 51 (38.9 %) 0.63 1.05 (0.58-1.88)
Relazione tra i marcatori biologici e le caratteristiche cliniche
Un segnale positivo all’IHC per hERG1 à ̈ stato osservato nel 23% dei pazienti (31/135). L’espressione di VEGF-A à ̈ stata rilevata nell’82% (110/135), Glut-1 nel 35% dei campioni (47/135), mentre CA-IX era espressa in 42 di 135 pazienti, pari al 31%. EGF-R e p53 erano positivi in 98 di 126 (78%) e 51 di 131 (39%) dei campioni, rispettivamente (Tabella 1).
E’ emersa una associazione statisticamente significativa tra hERG1 e Glut-1 (p=0.002), hERG1 ed EGF-R (p=0.050), hERG1 e CA-IX (p=0.018), hERG1 e VEGF-A (p=0.049), VEGF-A e p53 (p=0.002), CA-IX e p53 (p=0.030). un’associazione al limite della significatività statistica à ̈ stata osservata tra VEGF-A e CA-IX (p=0.070), VEGF-A e Glut-1 (p=0.080). Inoltre, l’espressione di Glut-1 era significativamente associata con l’età dei pazienti (p=0.043), mentre EGF-R correlava con lo stadio TNM (p=0.003), così come con il contenuto di colloide (p=0.032). Un’associazione ai limiti della significatività statistica à ̈ stata osservata anche tra Glut-1 e la colloide (p=0.080), così come tra Glut-1 e la localizzazione del tumore (p=0.090).
La Figura 2 mostra immagini di IHC relative a tre campioni rappresentativi colorati con i marcatori di ipossia (CA-IX, VEGF, Glut-1) insieme ad hERG1. In questo caso, i dettagli dei profili di marcatura sono riportati nella legenda della Figura 2.
Caratteristiche cliniche
La Tabella 1 mostra le caratteristiche clinico patologiche dei pazienti, così come la distribuzione dei marcatori biologici in studio. Dei 135 pazienti, 72 (53%) erano femmine e 63 (47%) maschi. L’età mediana era di 68 anni (intervallo 40-90). Cinquantasette tumori erano localizzati nel colon destro, 14 nel trasverso, 33 nel colon sinistro e 31 nel retto.
Relazione tra i marcatori biologici e le caratteristiche cliniche
Un segnale positivo all’IHC per hERG1 à ̈ stato osservato nel 23% dei pazienti (31/135). L’espressione di VEGF-A à ̈ stata rilevata nell’82% (110/135), Glut-1 nel 35% dei campioni (47/135), mentre CA-IX era espressa in 42 di 135 pazienti, pari al 31%. EGF-R e p53 erano positivi in 98 di 126 (78%) e 51 di 131 (39%) dei campioni, rispettivamente (Tabella 1).
E’ emersa una associazione statisticamente significativa tra hERG1 e Glut-1 (p=0.002), hERG1 ed EGF-R (p=0.050), hERG1 e CA-IX (p=0.018), hERG1 e VEGF-A (p=0.049), VEGF-A e p53 (p=0.002), CA-IX e p53 (p=0.030). un’associazione al limite della significatività statistica à ̈ stata osservata tra VEGF-A e CA-IX (p=0.070), VEGF-A e Glut-1 (p=0.080). Inoltre, l’espressione di Glut-1 era significativamente associata con l’età dei pazienti (p=0.043), mentre EGF-R correlava con lo stadio TNM (p=0.003), così come con il contenuto di colloide (p=0.032). Un’associazione ai limiti della significatività statistica à ̈ stata osservata anche tra Glut-1 e la colloide (p=0.080), così come tra Glut-1 e la localizzazione del tumore (p=0.090).
Impatto sulla sopravvivenza
Il follow up mediano era di 35 mesi. All’analisi univariata, i cui risultati sono riportati in Tabella 1, le seguenti variabili sono risultate avere un significativo impatto sulla OS: lo stadio TNM (stadio II vs stadio I: HR=0.83, 95%CI= 0.33-2.06; stadio III vs I: HR=2.54, 95%CI: 1.17-5.52; p0.001) e l’espressione di CA-IX (pos vs neg: HR=2.02, 95%CI= 1.10-3.71; p=0.022).
L’analisi multivariata, come riportato in Tabella II, ha identificato i seguenti fattori prognostici indipendenti: TNM (stadio II vs stadio I: HR=0.75, 95%CI=0.30-1.87; stadio III vs I: HR=3.55, 95%CI= 1.59-7.91; p0.001), hERG1 (pos vs neg: HR=0.31, 95%CI=0.16-0.63; p=0.001). gli stessi risultati sono stati confermati da un’analisi di sensibilità condotta su 122 casi privi di informazioni mancanti e comprendenti le informazioni relative a p53 ed EGF-R.
Partendo dai punteggi di rischio calcolati dal modello multivariato finale, i pazienti sono stati stratificati in quattro differenti gruppi di rischio: A) stadio TNM I-II, con Glut-1 pos, qualsiasi hERG1; B) stadio TNM I-II con Glut-1 neg ed hERG1 neg; C) stadio TNM I-II con Glut-1 neg e hERG1 pos; D) stadio TNM III, qualunque Glut-1 e qualunque hERG1, con una probabilità di OS a tre anni uguale a 95%, 72%, 51% e 36%, rispettivamente (Figura 3).
Tabella II: Analisi Multivariata
Variabile Coefficiente (SE) Hazard Ratio 95% IC P value
TNM
I - 1 (Ref.) <0.001 II -0.28611 (0.46752) 0.75 0.30-1.87
III 1.26618 (0.40922) 3.55 1.59-7.91
Herg1
Neg - 1 (Ref.)
Pos 0.76697 (0.33345) 2.15 1.12- 4.13 0.021
Glut1
Neg - 1 (Ref.)
Pos -1.15571 (0.35403) 0.31 0.16-0.63 0.001
Claims (6)
- RIVENDICAZIONI 1. Un metodo per la determinazione della prognosi sfavorevole in un paziente con cancro colo rettale non metastatico in stadio precoce, detto metodo comprendente la determinazione tramite Immunoistochimica (IHC) della positività per hERG1 insieme alla negatività per Glut-1 in un campione di adenocarcinoma di detto paziente.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui la determinazione della positività e negatività di hERG1 e Glut-1, rispettivamente, à ̈ anche determinata tramite IHC la positività o l’espressione negativa dei marcatori VEGF-A, CA-IX, p53 e EGF-R.
- 3. Metodo secondo le rivendicazioni 1-2 in cui per la determinazione della positività per hERG1 à ̈ utilizzato un anticorpo che riconosce un epitopo extracellulare localizzato nella regione S5-poro della proteina hERG1.
- 4. Un kit per il metodo prognostico secondo la rivendicazione 1, detto kit comprendente almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-hERG1 e almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-Glut-1.
- 5. Un kit secondo la rivendicazione 4 comprendente inoltre almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-VEGF-A, almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-CA-IX, almeno un contenitore contenente l’anticorpo anti-EGF-R.
- 6. Un kit secondo qualunque delle rivendicazioni 4-5 in cui l’anticorpo anti-hERG1 riconosce un epitopo extracellulare localizzato nella regione S5-poro della proteina hERG1.
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-
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| LASTRAIOLI E ET AL: "herg1 gene and HERG1 protein are overexpressed in colorectal cancers and regulate cell invasion of tumor cells", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 64, no. 2, 15 January 2004 (2004-01-15), pages 606 - 611, XP002383047, ISSN: 0008-5472, DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-03-2360 * |
| SAKASHITA ET AL: "Glut1 expression in T1 and T2 stage colorectal carcinomas: its relationship to clinicopathological features.", EUROPEAN JOURNAL OF CANCER, vol. 37, no. 2, 1 January 2001 (2001-01-01), pages 204 - 209, XP055013540, ISSN: 0959-8049 * |
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