ITFI20080117A1 - Uso di cobalto ferriti come agenti di contrasto per risonanza magnetica. - Google Patents

Uso di cobalto ferriti come agenti di contrasto per risonanza magnetica. Download PDF

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ITFI20080117A1
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Marco Bitossi
Daniele Bonacchi
Alessandro Lascialfari
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Description

Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
Uso di cobalto ferriti come agenti di contrasto per risonanza magnetica
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce al campo degli agenti di contrasto per risonanza magnetica.
Stato deH'arte:
Come è noto la tecnica MRI permette di creare immagini di materiali inerti e/o esseri viventi sfruttando la densità di protoni (nuclei di idrogeno) o altri nuclei tramite l'uso di gradienti di campo magnetico e opportune sequenze di impulsi di radiofrequenza. In particolare si può sfruttare il contrasto creato da parti diverse del materiale caratterizzate da diversi tempi di rilassamento nucleare spin-spin (T2) e spin-reticolo (Ti) per meglio evidenziare le immagini e per ottenere specifiche informazioni.
L'aumento del contrasto "naturale" di immagine, a parità di parametri sperimentali usati, viene ottenuto attraverso l'uso di agenti (o mezzi) di contrasto (AdC). Gli agenti di contrasto aumentano il contrasto fra tessuti normali e danneggiati e generalmente accorciano i tempi di rilassamento nucleare Ti e T2dei liquidi contenuti nei tessuti.
I parametri che caratterizzano gli agenti di contrasto e ne misurano l’efficienza sono la rilassività nucleare trasversa (R2) e longitudinale (RO definite come l’aumento portato alle velocità di rilassamento dei protoni del solvente (acqua) da 1 mmol/l di centro paramagnetico.
I materiali ideali per avere un più veloce rilassamento nucleare sono strutture ricche di elettroni disaccoppiati cioè sostanze paramagnetiche. Tali sostanze, caratterizzate da un centro magnetico e un rivestimento organico, sono generalmente AdC positivi.
Altri agenti di contrasto a base di particelle superparamagnetiche (generalmente ferriti), esibiscono alti momenti magnetici e generalmente sono AdC negativi.
Attualmente la maggior parte dei composti paramagnetici usati sono a base di gadolinio (Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-HP-D03A) e le molecole componenti hanno diametri medi di circa 0.35nm. Le particelle superparamagnetiche più diffusamente usate negli esperimenti di risonanza sono commercialmente note come Endorem® (by Guerbet Group, Feridex® in USA), Resovist® (by Schering) e Sinerem® (by Guerbet Group, Combidex® in USA); in ciascuna di esse il nucleo centrale di ferrite (diametro circa 5-6 nm) e<1>rivestito da un guscio organico e i diametri finali medi sono rispettivamente ~150 nm e ~15 nm rispettivamente. Da questo caratteristico diametro medio discende il nome di particelle SPIO (superparamagnetic ìron oxide particles) per Endorem® e Resovist®, e USPIO (ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles) per Sinerem®. Per aumentare la stabilità di tali particelle in soluzioni acquose, esse sono rivestite di un polimero (destrano) a formare soluzioni colloidali. Dopo essere state iniettate per via endovenosa, queste particelle sono intrappolate dalle cellule del sistema reticolo-endoteliale (ad esempio le cellule di Kupffer nel fegato, nella milza). Esse fungono da agenti di contrasto negativi e inducono una diminuzione del segnale (zone scure) in questi organi; sono generalmente usate per la detezione di tumori epatici. Gli studi attuali tendono a creare un legame fra questi materiali e molecole specifiche in grado di giungere a bersaglio (target) su specifici ricettori cellulari caratteristici di una determinata patologia. Le applicazioni MRI di questi composti superparamagnetici sono varie e spaziano dall’angiografia, alla diagnosi di tumori e della patologia aterosclerotica.
I progressi della biologia molecolare hanno portato a nuovi, specifici metodi di Imaging diagnostico e fra questi la Molecular Imaging e’ uno dei più promettenti, grazie all’utilizzo di specifici “markers" e aH’ottima risoluzione spaziale. Recenti studi sulla “marcatura” cellulare in MRI hanno fatto uso di un composto che va a bersaglio su recettori cellulari specifici, realizzato tramite leganti chimicamente attaccati a particelle SPIO o USPIO.
Inoltre è noto che particelle magnetiche possano assorbire le radiazione elettromagnetica provocando un riscaldamento locale (ipertermia magnetica)! Rosenweig, R. E. J. Magn. Magn. Mater. 2002, 252, 370. ]. Questo effetto può essere utilizzato per la terapia del cancro sia per effetto ipertermico di per se (effetto apoptotico o necrotico indotto dalla temperatura) che come mezzo per controllare il rilascio di farmaci in modo localizzato.
E’ ovvio quindi alla luce di quanto sopra riportato l’importanza di poter disporre di mezzi di contrasto sempre più efficaci per rispondere al meglio alla necessità di una chiara visione degli organi da ispezionare con le tecniche suddette ed inoltre quanto sarebbe importante poter disporre di mezzi di contrasto capaci di esercitare contemporaneamente anche un effetto ipertermico e quindi in grado di espletare contemporaneamente la funzione di agente di contrasto e di composto terapeutico (teranostica)
Breve descrizione delle figure
Fig. 1 riporta la rilassività trasversa di due prodotti secondo l’invenzione (E7Vvac e NBR1)
Fig. 2 (a - c) riporta il confronto di segnale MRI ottenuto con sequenze GE-PDW fra NBR1 e il composto commerciale Endorem a concentrazioni diverse.
Fig. 3 (a - d) mostra le immagini del cervello (a sinistra) e del fegato (a destra) rispettivamente: immediatamente dopo l’iniezione di NBR1 (a), dopo 1 giorno (b), dopo 6 giorni (c) e dopo 6 giorni con l’uso di Endorem (d).
Descrizione dettagliata dell’invenzione:
La presente invenzione riguarda pertanto agenti di contrasto aventi un rilassamento nucleare particolarmente veloce e capaci di essere utilizzati anche nella terapia per ipertermia.
E’ stato infatti sorprendentemente trovato che nanoparticelle magnetiche di cobalto ferrite con un diametro medio compreso tra i 4 ed i 100 nm hanno un valore di rilassività trasversale R2, ed un rapporto tra R2 ed R1 superiore a quello di agenti di contrasto attualmente disponibili in commercio a base di ossido di ferro (ENDOREM).
Inoltre, tali proprietà rimangono inalterate anche quando suddette nanoparticelle di cobalto ferrite vengono funzionalizzate e/o inglobate in costrutti costituiti da materiali compositi.
Il metodo più comune per produrre nanoparticelle magnetiche coinvolge la co-precipitazione di sali ferrosi e ferrici in un mezzo alcalino in assenza o presenza di agenti surfattanti come il PEG, il destano, polimeri sintetici, ecc. Nei metodi senza l’uso di agenti surfattanti, le nanoparticelle precipitate sono isolate per mezzo di decantazione magnetica o centrifugazione. Il precipitato viene quindi trattato con acido nitrico, centrifugato e peptidizzato in acqua per produrre un sol magnetico addico stabile. Nella sintesi di particelle di ossido di ferro si possono aggiustare molti parametri per controllarne le dimensioni, le caratteristiche magnetiche, la stabilità in soluzione e le proprietà di superficie. Sebbene i metodi di co-precipitazione siano usati per la loro semplicità, le nanoparticelle prodotte risultano polidisperse.
Un ulteriore metodo di preparazione, che consente di eliminare il problema suddetto è il metodo di preparazione polyol come ad esempio descritto nella domanda di brevetto PCT/EP2007/064143 a nome della stessa richiedente, qui brevemente riassunta per completezza.
Tale metodo infatti consente di sintetizzare dispersioni di nanoparticelle magnetiche con una stretta distribuzione di dimensioni e quindi ad alta efficacia di contrasto.
Le nanoparticelle magnetiche secondo l’invenzione si possono preparare secondo processi noti come ad esempio il processo polyol ampiamente descritto in letteratura che, in breve, consiste neN’utilizzo di un alcool ad alto punto di ebollizione che consente di lavorare ad alte temperature e di compassare le particelle in via di formazione impedendone l’accrescimento.
Normalmente si procede aggiungendo ad un volume noto di alcool (ad esempio DEG dietilenglicol) i precursori dei metalli desiderati (preferibilmente acetati, carbonati, solfati, ossalati, cloruri). Si scalda quindi la soluzione mantenendola in agitazione fino a completa solubilizzazione dei precursori, si aggiunge eventualmente acqua in opportuna quantità per facilitare l’idrolisi dei precursori, si scalda per alcune ore ad una temperatura superiore a 150 °C e quindi si lascia raffreddare ottenendo una sospensione stabile di nanoparticelle monodisperse con una stretta distribuzione dimensionale.
Secondo l’invenzione si sono realizzate metodiche di sintesi che sono in grado di permettere il controllo dimensionale (e quindi dell’ipertermia) delle nano particelle magnetiche che vengono ottenute sempre in sospensione.
Questo può essere effettuato ricorrendo ad un processo in continuo. In questo caso si procede come sopra descritto per il processo polyol ma la sintesi viene effettuata con l'aggiunta (in quantità equimolare con i reagenti) di un “innesco” costituito da nano particelle magnetiche precedentemente sintetizzate. In questo modo a fine reazione si ottengono nanoparticelle magnetiche aventi dimensioni maggiori di quelle introdotte all’inizio della sintesi.
Nella pratica si procede ad una prima preparazione come per il processo polyol; successivamente si effettua una nuova reazione nelle stesse condizioni della prima, con tutti i materiali di partenza in quantità identiche a quelle già utilizzate e con l'aggiunta di quanto ottenuto dalla prima reazione. Le nanoparticelle magnetiche così ottenute (che sono di quantità doppia e di dimensioni maggiori di quelle introdotte all’inizio della sintesi) possono essere nuovamente usate come “innesco” per una reazione successiva. Il ciclo può essere ripetuto un numero indefinito di volte fino all’ottenimento delle particelle delle dimensioni desiderate.
Secondo un’ulteriore realizzazione dell’invenzione le nanoparticelle si possono preparare con un processo di sostituzioni semicontinue.
In pratica si effettua una prima sintesi secondo il processo polyol, ma al termine del periodo di riscaldamento stazionario a 180 °C il prodotto non viene raffreddato ma viene travasato in un pallone di dimensioni doppie in cui sono stati caricati tutti i materiali di partenza in quantità identiche al prodotto già reagito. Si porta nuovamente la temperatura a 180°C, si mantiene per 3 ore e quindi il ciclo viene ripetuto per un numero variabile di volte fino all'ottenimento delle dimensioni desiderate del prodotto.
Un ulteriore processo di preparazione delle particelle secondo l’invenzione consiste in un processo di accrescimento.
In questo caso la sìntesi è condotta come secondo il processo polyol sopra descritto ma il periodo di mantenimento in temperatura a 180 °C del prodotto viene prolungato per un numero variabile di ore. Si ottiene così un prodotto le cui dimensioni sono dipendenti dal tempo di permanenza in temperatura.
Le nanoparticelle magnetiche inoltre possono essere preparate con un processo analogo a quello polyol sopra descritto ma operando il riscaldamento esclusivamente in un forno a microonde che permette di ridurre notevolmente i tempi di reazione e di avere un migliore controllo delle dimensioni e della morfologia.
La funzionalizzazione delle nanoparticelle, quando desiderata o necessaria, è stata ottenuta secondo metodi noti facendo reagire derivati monofunzionali o di-funzionali con le nanoparticelle come sopra definite in modo da rivestire la loro superficie come descritto nella domanda di brevetto PCT/EP2002/050036 a nome della stessa richiedente.
Esempi di composti mono- e di-funzionali sono composti di formula generale:
R1-(CH2)n-R2
in cui:
n è un intero compreso fra 2 e 20;
R-ι è scelto fra: CONHOH, CONHOR, PO(OH)2, PO(OH)(OR), COOH, COOR, SH, SR;
R2è il gruppo esterno ed è scelto tra: H, OH, NH2, COOH, COOR; R è un gruppo Ci_Balchile, ad esempio etile, o un metallo alcalino, preferibilmente K, Na o Li.
Come detto nella citata domanda di brevetto la derivatizzazione avviene facendo reagire una dispersione di nanoparticelle in un solvente organico (ad esempio etilene glicole) con il legante scelto mantenendo sotto agitazione a temperatura ridotta per alcune ore. Il prodotto viene poi eventualmente separato per estrazione con particolari solventi o fatto precipitare, ad esempio con acetone, centrifugato, separato ed eventualmente ridisperso in opportuno solvente.
I costrutti polimerici di cui si è detto precedentemente hanno caratteristiche diverse a seconda del tipo di polimero impiegato per la loro preparazione come descritto nella suddetta domanda di brevetto PCT/EP2007/064143.
Sono costituiti da nanoparticelle magnetiche, eventualmente funzionalizzate, inglobate in un polimero idrosolubile o insolubile in acqua. Polimeri idrosolubili secondo l’invenzione possono essere tensioattivi, polielettroliti, polipeptidi e proteine idrosolubili, come preferiti sono polimeri idrosolubili scelti fra copolimeri a blocchi, polietilenglicoli modificati, polisaccaridi modificati, fosfolìpidi, poliamminoammidi, proteine globulari.
Fra i polimeri insolubili in acqua utili secondo l’invenzione si possono ricordare poliesteri, poliammidi, polianidridi, poliortoesteri, peptidi, poliamminoammidi, preferiti sono i polimeri scelti fra poliesteri e poliamminoammidi; detti polimeri insolubili possono a loro volta essere stabilizzati con agenti di superficie quali: tensioattivi, polielettroliti, polipeptidi e proteine idrosolubili], preferiti sono gli agenti di superficie scelti fra copolimeri a blocchi, polietilenglicoli modificati, polisaccaridi modificati, fosfolipidi, polamminoammidi, proteine globulari.
Le particelle di Co-ferrite oggetto di questa invenzione mostrano proprietà superparamagnetiche e quindi cadono nella classe degli agenti superparamagnetici tendenzialmente ad azione di contrasto negativa. Come già osservato sopra, per determinare l’efficienza di tali AdC si deve valutare l'efficienza rilassometrica tramite il valore della rilassività trasversa R2 e il rapporto R2/R1. A questo scopo abbiamo usato l’AdC commerciale Endorem® come materiale di riferimento con cui confrontare i valori di rilassività ottenuti nei composti di nuova sintesi. Tale materiale è stato usato come riferimento anche nella realizzazione di immagini di fantocci, con l’uso di un MRI Imager a basso campo, e di modelli animali tramite un Imager ad alto campo. Gli esperimenti realizzati hanno fatto uso : (a) della tecnica di rilassometria tramite spettrometri NMR a trasformata di Fourier, denominati Apollo-Tecmag, Spinmaster-Stelar 0 MSL200-Bruker con elettromagnete o superconduttore a campo (cioè frequenza) variabile da circa 0.2 a circa 70 Mhz; (b) della tecnica MRI su fantocci utilizzando un Imager a basso campo 0.2 Tesla, Artoscan®-Esaote; (c) della tecnica MRI su modelli animali utilizzando un Imager a 4.7 Tesla, Avance200-Bruker.
Gli esperimenti sono stati condotti su campioni di:
nanoparticelle di cobalto ferrite (qui di seguito denominate c4b9) dal diametro cristallino di 7.2nm, disperse in glicoli (Esempiol); nanoparticelle di cobalto ferrite c4b9 inglobate in polimeri (denominate E7Vvac), con diametro idrodinamico medio 145 nm, disperse in acqua; nanoparticelle di cobalto ferrite dal diametro cristallino di 6,7nm, inglobate in polimeri biocompatibili (denominate NBR1_32C C2) con diametro idrodinamico medio di 93.40nm (esempio 3) disperse in acqua.
Esempio 1
Preparazione di cobalto ferrite con il metodo delle sostituzioni semicontinue
Prodotto: c4b1
Stadio 1 (Prodotto: c4b1)
Reagenti:
Fe : Co rapporto 2 : 1
9.53 g CO(AC)2.4H20 (23.7% Co w/w)
Co(ll) = 2.259 g = 0.038 moli
21.42 g Fe(CH3COO)3 (Sheperd pasta; c. 20% Fe w/w)
Fe(lli) = 4.284 g = 0.077 moli
269.04 g DEG
Sintesi:
Stadio 1
Un pallone a 4 colli è stato equipaggiato con un agitatore, un condensatore a bolle munito di valvola per eventuale distillazione, una sonda ed uno stopper (collo addizionale).
I reagenti sono versati nel pallone con DEG e la miscela è portata a 110° C fino a solubilizzazione (1 h).
La temperatura è poi elevata a 180°C lasciando a ricadere per 3 h sotto agitazione fino a formazione di una sospensione di colore nero.
Stadio 2 (Prodotto: c4b2)
Reagenti:
Fe : Co rapporto = 2 : 1
19.06 g CO(AC)2'4H20 (23.7% Co w/w)
Co(ll) = 4.518 g = 0.076 moli
42.84 g Fe(CH3COO)3 (Sheperd pasta; c. 20% Fe w/w)
Fe(lll) = 8.568 g = 0.154 moli
538 g DEG
575 g c4b1
Sintesi:
Un pallone a 4 colli da 2 litri è equipaggiato di agitatore, condensatore a bolle provvisto di valvola per eventuale distillazione, sonda e stopper (collo addizionale). Il cobalto acetato ed il ferro acetato sono posti nel pallone con DEG e si aggiunge il prodotto c4b1 , ancora caldo dal primo stadio.
La temperatura è portata a 180°C e si lascia a ricadere per 3 h. Si ottengono 1105 g di prodotto.
Lo stadio 2 è ripetuto per sette volte ed il prodotto finale è chiamato c4b9.
Esempio 2
Funzionalizzazione di particelle di cobalto ferrite con etil-12-(idrossiamina)-12-ossododecanoato.
Prodotto: CoFe38M1
Reagenti:
etil 12-(idrossiamina)-12-ossododecanoato MW = 273.37g/moles CoFe204(c4b9) MW = 234.62 g/moles Butanolo MW = 74.12
Acqua
Reagenti:
60 g di c4b9 in DEG (3% CoFe204 w/w) 7.67 mmoli
0.90 g etil-12-(idrossiamina)-12-ossododecanoato 3.29 mmoli 120 g butanolo
Sintesi:
120 g di butanolo e 0.60 g di etil-12-(idrossiamina)-12-ossododecanoato sono posti in un pallone da 500 mi flask (si ha completa solubilizzazione in pochi minuti).
60 g di una dipsersione di nanoparticelle di cobalto ferrite in glicol sono aggiunte alla soluzione e il tutto è lasciato sotto agitazione per 2 h.
Il prodotto è stato lavato con 200 g di acqua (formazione di una fase doppia butanolo/acqua-glicol) e la fase alcolica è stata separata dalla fase acquosa con un imbuto separatore.
Il prodotto solido è stato raccolto eliminando il butanolo sotto vuoto e ridisperdendo in acetone.
Esempio 3
Preparatione di un costrutto costituito da: particella di cobalto ferrite nanometrica, PLGA e albumina.
Prodotto: E7Vvac
Reagenti: Quantità Peso molecolare
Acqua UP 1000 mi 18 d = 1.00 g/cm<3>Acetone 25 mi 58,08 d = 0.79 g/cm<3>PLGA 75/25 0.05 g
CoFe38M1 0.02 g
BSA Frazione V 1 9
Sintesi:
Si preparano una soluzione di PLGA in acetone (0.05 g in 25 mi di acetone) ed una soluzione di BSA in acqua ultrapura (1 g di BSA in 1000 mi di acqua) quindi 0,4 mi di una sospensione al 5% (w/V) di sospensione di CoFe38M1 in acetone sono aggiunti alla soluzione di PLGA.
Si installa una doppia pompa peristaltica per l'aggiunta in continuo di soluzione di acetone (contenente PLGA e CoFe38M1) in corrente d’acqua contenente BSA (rapporto in volume acetone/acqua: 1/40). I corrispondenti tubi di immersione prelevano la soluzione direttamente dai serbatoi contenenti le due soluzioni.
II rapporto di pompaggio delle due pompe peristaltiche è di 1/40 in modo che le due soluzioni sono consumate nello stesso tempo.
Il prodotto del mescolamento finale è raccolto in cilindro graduato.
Il rapporto di pompaggio è fissato in modo che il mescolamento delle due soluzioni avvenga in 10 minuti.
La soluzione finale risultante è trattata sotto vuoto in modo da rimuovere completamente l’acetone.
La soluzione finale risultante e concentrata sotto vuoto spinto a T < 45°C o per mezzo di ultrafiltrazione fino alla concentrazione desiderata.
Caratterizzazione delle dimensioni per mezzo di DLS:
Esempio 4
Funzionalizzazione di particelle di cobalto ferrite con etil-12-(idrossiamina)-12-ossododecanoato.
Prodotto CoFe38H Reagenti:
etil-12-(idrossiamina)-12-ossododecanoato MW = 273.37g/moli CoFe204(c4b6) MW = 234.62 g/moli Butanolo MW = 74.12
Acqua
Reagenti:
60 g di c4b6 in DEG (3% CoFe204 w/w) 7.67 mmoli 0.90 g etil-12-(idrossiamina)-1 2-ossododecanoato 3.29 mmoles 120 g butanolo
Sintesi:
120 g di butanolo e 0.60 g of etil-1 2-(idrossiamina)-1 2-ossododecanoato sono posti in un pallone da 500 mi flask (si ha completa solubilizzazione in pochi minuti).
60 g di una dipsersione di nanoparticelle di cobalto ferrite in glicol sono aggiunte alla soluzione e il tutto è lasciato sotto agitazione per 2 h.
Il prodotto è stato lavato con 200 g di acqua (formazione di una fase doppia butanolo/acqua-glicol) e la fase alcolica è stata separata dalla fase acquosa con un imbuto separatore.
II prodotto solido è stato raccolto eliminando il butanolo sotto vuoto e ridisperdendo in acetone.
Esempio 5
Preparation di un costrutto costituito da: cobalto ferrite nanometrica, PLGA e albumina.
Prodotto NBR1J32C C2
Reagenti Quantità Peso molecolare
Acqua UP 1000 mi 18 d = 1.00 g/cm<3>Acetone 25 mi 58,08 d = 0.79 g/cm<3>PLGA 75/25 0.05 g
CoFe38H 0.02 g
BSA Frazione V 1 g
Sintesi:
Si preparano una soluzione di PLGA in acetone (0.05 g in 25 mi di acetone) ed una soluzione di BSA in acqua ultrapura (1 g di BSA in 1000 mi di acqua) quindi 0,4 mi di una sospensione al 5% (w/V) di sospensione di CoFe38H in acetone sono aggiunti alla soluzione di PLGA.
Si installa una doppia pompa peristaltica per l'aggiunta in continuo di soluzione di acetone (contenente PLGA e CoFe38H) in corrente d’acqua contenente BSA (rapporto in volume acetone/acqua: 1/40).
I corrispondenti tubi di immersione prelevano la soluzione direttamente dai serbatoi contenenti le due soluzioni.
II rapporto di pompaggio delle due pompe peristaltiche è di 1/40 in modo che le due soluzioni sono consumate nello stesso tempo.
Il prodotto del mescolamento finale è raccolto in cilindro graduato.
Il rapporto di pompaggio è fissato in modo che il mescolamento delle due soluzioni avvenga in 10 minuti.
La soluzione finale risultante è trattata sotto vuoto in modo da rimuovere completamente l’acetone.
La soluzione finale risultante è concentrata sotto vuoto spinto a T < 45°C o per mezzo di ultrafiltrazione fino alla concentrazione desiderata. Carattrizzazione delle dimensioni per mezzo di DLS:
I mezzi di contrasto comprendenti le particelle di cobalto ferrite nanometrica, che sono pure un oggetto della presente invenzione, sono i mezzi di contrasto comunemente usati nelle tecniche MRI e sono normalmente costituiti da soluzioni acquose, eventualmente isotoniche (tipicamente allo 0,9% di cloruro di sodio) contenenti cobalto ferrite fino al 20% w/w tipicamente allo 1 ,1 % w.w. corrispondenti a 11mg/ml.
Nel seguito si riportano i risultati sperimentali principali ottenuti sui diversi campioni con diverse tipologie di misura, che brevemente si possono cosi riassumere :
dati di rilassometria: misurano le rilassivita’ Ri e R2(o gli equivalenti 1/T-ic e irr2c in solidi) a diverse frequenze (il dato piu’ interessante e’ a circa 60 MHz, corrispondente a H=1.5 Tesla, tipico degli imager clinici) sui campioni di cui ai punti (a), (b), (c) e (d), a temperatura ambiente e fisiologica.
esperimenti MRI su fantocci contenenti concentrazioni diverse di campioni di cui al punto (d) (anche Endorem per confronto); esperimenti MRI con Imager Bruker Avance 200 MHz (4.7 Tesla) su ratti, su cui si e’ iniettato Endorem e campioni di cui al punto (d). In questo caso ci si e’ concentrati su immagini di cervello e fegato.
Le scoperte ottenute si possono cosi brevemente riassumere.
I dati di rilassometria sui campioni di nanoparticelle di cobalto ferrite hanno mostrato che le nanoparticelle di cobalto ferrite hanno un segnale R2 superiore al prodotto commerciale Endorem a base di ossido di ferro.
I dati di rilassometria sui campioni liquidi hanno mostrato che il composto NBR1 ha R2(cioè’ efficienza) circa il doppio di Endorem® su tutto l’intervallo di applicazione clinica piu’ diffusa (da 0.2 a 1.5 Tesla). Quindi, laddove e’ importante la perdita di segnale per il contrasto di immagine (zone scure) il composto NBR1 e’ un AdC migliore del composto commerciale piu’ usato.
Con l’uso dell’lmager clinico Artoscan (0.2 Tesla, 8 MHz circa), si e’ testato il nanobioreattore NBR1_32C C2 in provette a diversa concentrazione e comparato con Endorem. A conferma dei dati di rilassometria, NBR1_32C C2 e’ piu’ efficace di Endorem nell’abbassare il segnale NMR (zone scure).
Da misure MRI su ratti con Imager da ricerca a 4.7 Tesla, osservando i cambiamenti di contrasto di immagine per effetto della iniezione di NBR1_32C C2 su fegato e cervello, Endorem e il composto NBR1_32C C2 hanno mostrato efficienza simile, sia per quel che riguarda iniezioni per via sistemica sia per quel che riguarda iniezioni intraparenchimali.
RILASSOMETRIA
I dati sui campioni costituiti da nanoparticelle di cobalto ferrite disperse in fase liquida costituita da glicoli hanno un segnale di R2 di circa il doppio rispetto al prodotto commerciale a base di ossido di ferro.
I dati sui campioni liquidi hanno inoltre mostrato che il composto NBR1_32C C2 ha R2 circa il doppio di Endorem® (Fig.1). Questo significa che, laddove e’ importante la perdita di segnale per il contrasto di immagine (ad esempio nel caso di tumore al fegato le cellule sane appaiono scure perche’ raggiunte dall’Ade negativo), il composto NBR1_32C C2 e’ un ottimo AdC. Anche il composto E7Wac ha dimostrato di possedere una buona rilassività trasversa R2, confrontabile con Endorem® (vedi Fig. 1 e Tabella 1).
TABELLA 1
Esperimenti MRI su fantocci
In questo caso si e’ testato il nanobioreattore NBR1_32C C2 in provette a diversa concentrazione e comparato con Endorem. Come si vede dalle sequenze Gradient-Echo (GE) proton density-weighted (PDW, cioè’ pesate in densità’ dei protoni) utilizzate corrispondenti alle figure riportate sotto, NBR1_32C C2 e’ piu’ efficace di Endorem nell’abbassare il segnale NMR (zone scure). In particolare, come si vede dalle figure 2b e 2c, per concentrazioni superiori a 0.03125 mg Fe/ml, il segnale di NBR1_32C C2 si perde mentre quello di Endorem e’ ancora presente. Quindi l’efficacia nel contrastare negativamente l'immagine da parte di NBR1_32C C2 e’ superiore. Si confermano cosi i dati di caratterizzazione rilassometrica.
Esperimenti MRI su ratti
Come ultimo passo dello studio di NBR1_32C C2 come agente di contrasto, si sono effettuate misure MRI su ratti (8, per statistica), andando a vedere i cambiamenti di contrasto di immagine per effetto della iniezione di NBR1_32C C2 su fegato e cervello.
In Fig. 3 si riportano alcune immagini d’esempio nel caso di iniezione per via sistemica. Si sono confrontati i dati con iniezione del composto NBR1_32C C2 con quelli in cui si usa il composto commerciale Endorem.
In conclusione si può’ dire che Endorem e NBR1_32C C2 a 4.7 Tesla hanno efficienza simile ma NBR1_32C C2 e’ piu’ efficace nel contrastare negativamente le cellule sane del fegato.
Tutte le immagini sono state acquisite con sequenza gradient echo, te 6 ms, tr 200 ms, flip 30°, 4 medie, fette di 1mm , fov 256x256 punti, con risoluzione nel piano di 200x200 micron. Le immagini acquisite sul fegato hanno richiesto la sincronizzazione con l’attività respiratoria dell’animale.
In tutte le immagini del fegato e’ stato utilizzato un campione di riferimento posto accanto al ratto
Procedura
Si e’ iniettato (per via sistemica) l’AdC con concentrazione 6 mg Fe/kg. Al tempo zero, il fegato risulta scuro e il cervello mostra poche tracce dell’Ade (Fig. 3a). Dopo 1 giorno (Fig. 3b), si nota che il cervello risulta svuotato di AdC mentre il fegato risulta ancora scuro, stabilendo l’efficacia di NBR1_32C C2 nel contrastare immagini del fegato. Dopo 6 giorni (Fig. 3c) il fegato mostra presenza di NBR1 in modo piu’ marcato rispetto ad Endorem (Fig.3d), cioè ha una maggiore efficacia a tempi lunghi.
I risultati sperimentali con l’uso di NBR1_32C C2 e concentrazione 0.075 mg Fe/kg, hanno fornito risultati strettamente simili a Endorem, confermando anche una risposta dei tessuti in funzione del tempo simile per i due composti.

Claims (12)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Uso di nanoparticelle magnetiche di cobalto ferrite come mezzi di contrasto in tecniche MRI.
  2. 2. Uso secondo la rivendicazione 1 in cui dette nanoparticelle sono funzionalizzate e/o inglobate in costrutti costituiti da materiali compositi.
  3. 3. Uso secondo le rivendicazioni 1 e 2 in cui dette nanoparticelle hanno un diametro medio compreso tra i 3 ed i 100 nm.
  4. 4. Uso secondo la rivendicazione 3 in cui dette particelle sono funzionalizzate con composti mono- e di-funzionali sono composti di formula generale: Ri-(CH2)n-R2 Ìn cui: n è un intero compreso fra 2 e 20; Ri è scelto fra: CONHOH, CONHOR, PO(OH)2lPO(OH)(OR), COOH, COOR, SH, SR; R2è il gruppo esterno ed è scelto tra: H, OH, NH2, COOH, COOR; R è un gruppo Ci-6alchile, ad esempio etile, o un metallo alcalino, preferibilmente K, Na o Li.
  5. 5. Uso secondo le rivendicazioni 1 in cui dette particelle nanomeriche di cobalto ferrite sono inglobate in un polimero idrosolubile o insolubile in acqua.
  6. 6. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui detti polimeri idrosolubili sono scelti fra: tensioattivi, polielettroliti, polipeptidi e proteine idrosolubili, come preferiti sono polimeri idrosolubili scelti fra copolimeri a blocchi, polietilenglicoli modificati, polisaccaridi modificati, fosfolipidi, poliamminoammidi, proteine globulari.
  7. 7. Uso secondo la rivendicazione 5 in cui detti polimeri insolubili in acqua sono scelti fra: poliesteri, poliammidi, polianidridi, poliortoesteri, peptidi, poliamminoammidi, preferiti sono i polimeri scelti fra poliesteri e poliamminoammidi.
  8. 8. Uso secondo la rivendicazione 7 in cui detti polimeri insolubili sono stabilizzati con agenti di superficie scelti fra:: tensioattivi, polielettroliti, polipeptidi e proteine idrosolubili], preferiti sono gli agenti di superficie scelti fra copolimeri a blocchi, polietilenglicoli modificati, polisaccaridi modificati, fosfolipidi, polamminoammidi, proteine globulari.
  9. 9. Agenti di contrasto per tecniche MRI comprendenti particelle nanometriche di cobalto ferrite.
  10. 10. Agenti di contrasto secondo la rivendicazione 9 costituiti da :
  11. 11. Agenti di contrasto secondo le rivendicazioni 9 e 10 come agenti di teranostica ovvero comprendenti sia la funzione di diagnosi per MRI che terapeutica per ipertermia magnetica
  12. 12. Agenti di contrasto secondo le rivendicazioni 9 e 10 in grado di essere impiegati per il rilascio localizzato e controllato di farmaci mediante ipertermia magnetica.
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