ITCS20110012A1 - ANALYTICAL COMPETITION METHOD BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT CELLULAR OR MOLECULAR MARKERS, DEVICE CONSTITUTED BY MICROPLATE OR MICROSTRIP WITH EXTENDED SHAPES FOR THE EXECUTION OF SUCH METHOD AND RELAT. - Google Patents
ANALYTICAL COMPETITION METHOD BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT CELLULAR OR MOLECULAR MARKERS, DEVICE CONSTITUTED BY MICROPLATE OR MICROSTRIP WITH EXTENDED SHAPES FOR THE EXECUTION OF SUCH METHOD AND RELAT. Download PDFInfo
- Publication number
- ITCS20110012A1 ITCS20110012A1 IT000012A ITCS20110012A ITCS20110012A1 IT CS20110012 A1 ITCS20110012 A1 IT CS20110012A1 IT 000012 A IT000012 A IT 000012A IT CS20110012 A ITCS20110012 A IT CS20110012A IT CS20110012 A1 ITCS20110012 A1 IT CS20110012A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- wells
- elongated
- well
- elements
- standard
- Prior art date
Links
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims description 38
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 27
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 16
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 208000026681 Paratuberculosis Diseases 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 11
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 9
- 206010006049 Bovine Tuberculosis Diseases 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 2
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 claims 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 claims 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 20
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 10
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 10
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 7
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 6
- 206010044756 Tuberculous infections Diseases 0.000 description 6
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 6
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 6
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 5
- 101001057048 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) ESAT-6-like protein EsxB Proteins 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229940074372 bovine tuberculin Drugs 0.000 description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 3
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 description 2
- 241001673391 Entandrophragma candollei Species 0.000 description 2
- 206010065048 Latent tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 2
- YNTLVCDWTWUMDV-UHFFFAOYSA-N 4-(4-aminophenyl)-n,2,3-trimethylaniline Chemical compound CC1=C(C)C(NC)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 YNTLVCDWTWUMDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 108700037961 Mycobacterium tuberculosis CFP-10 Proteins 0.000 description 1
- 108700020164 Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
- B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
- B01L3/50855—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates using modular assemblies of strips or of individual wells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
- B01L2300/0858—Side walls
Description
Metodo analitico di competizione tra 2 fasi solide per il rilevamento simultaneo di differenti marker cellulari o molecolari, dispositivo costituito da micropiastre o microstrip con pozzetti di forma allungata per l'esecuzione di detto metodo e relativi kit analitici pronti all'uso Analytical competition method between 2 solid phases for the simultaneous detection of different cellular or molecular markers, device consisting of microplates or microstrips with elongated wells for carrying out this method and related ready-to-use analytical kits
Descrizione dell'invenzione Description of the invention
La presente invenzione si riferisce ad un metodo analitico di competizione tra 2 fasi solide per il rilevamento simultaneo e quantitativo di differenti marker cellulari e molecolari e a kit pronti all'uso che contengono nuovi pozzetti di forma allungata per l'esecuzione di detto metodo, in abbinamento ad aste con elementi sporgenti che vanno introdotti in numero di 3 o 4 o 6 in detti pozzetti, utile anche per la diagnosi rapida di tubercolosi nell'uomo e per la diagnosi rapida di tubercolosi bovina abbinata alla diagnosi di paratubercolosi in stadio precoce condotte attraverso il rilevamento di marker superficiali di linfociti T cooperanti e di linfociti T citotossici sensibilizzati dall'infezione. The present invention relates to an analytical method of competition between 2 solid phases for the simultaneous and quantitative detection of different cellular and molecular markers and to ready-to-use kits containing new elongated wells for carrying out said method, in combination rods with protruding elements that must be introduced in number of 3 or 4 or 6 in said wells, also useful for the rapid diagnosis of tuberculosis in humans and for the rapid diagnosis of bovine tuberculosis combined with the diagnosis of early stage paratuberculosis conducted through the detection of superficial markers of cooperating T lymphocytes and of cytotoxic T lymphocytes sensitized by infection.
In particolare l'invenzione si riferisce a: In particular, the invention refers to:
- nuovo metodo analitico di competizione tra 2 fasi solide per il rilevamento simultaneo di differenti marker di superficie cellulare o di differenti marker molecolari, come ad esempio gli epitopi di un antigene, che prevede i seguenti passi: - new analytical method of competition between 2 solid phases for the simultaneous detection of different cell surface markers or of different molecular markers, such as the epitopes of an antigen, which includes the following steps:
a) il materiale in esame sul quale si intende rilevare la presenza di differenti marker viene immobilizzato in un pozzetto di forma allungata che costituisce la prima fase solida; a) the material under examination on which the presence of different markers is to be detected is immobilized in an elongated well which constitutes the first solid phase;
b) si lava il pozzetto; b) the well is washed;
c) dopo il lavaggio del pozzetto di forma allungata, una quantità standardizzata di mix di ligandi, ovvero di molecole ciascuna delle quali si leghi specificamente ad uno dei marker da rilevare, viene inoculata nel pozzetto; c) after washing the elongated well, a standardized quantity of ligand mix, ie of molecules each of which binds specifically to one of the markers to be detected, is inoculated into the well;
d) nel pozzetto vengono immersi 3 o 4 o 6 elementi sporgenti da un'asta, sulla quale sono posizionati a distanza modulare che coincide con la distanza modulare dei pozzetti di microstrip o micropiastre standard, che costituiscono la seconda fase solida, su ciascuno dei quali è stato precedentemente immobilizzato uno dei marker da rilevare; e) durante un determinato tempo di incubazione si instaura una reazione di competizione tra le 2 fasi solide per la cattura dei ligandi, che possono legarsi specificamente sia ai marker del materiale in esame immobilizzato sul pozzetto, che ai marker separatamente immobilizzati su ciascuno di detti elementi; d) 3 or 4 or 6 elements protruding from a rod are immersed in the well, on which they are positioned at a modular distance that coincides with the modular distance of the wells of standard microstrips or microplates, which constitute the second solid phase, on each of which one of the markers to be detected was previously immobilized; e) during a given incubation time a competition reaction is established between the 2 solid phases for the capture of the ligands, which can bind specifically both to the markers of the test material immobilized on the well, and to the markers immobilized separately on each of said elements ;
g) detti elementi vengono estratti e sottoposti a saggio immunoenzimatico o altro saggio di rilevamento quantitativo di ciascun ligando, che sarà presente sul rispettivo elemento in quantità inversamente proporzionale alla quantità dello stesso marker presente nel materiale in esame; g) said elements are extracted and subjected to an enzyme immunoassay or other quantitative detection test of each ligand, which will be present on the respective element in an amount inversely proportional to the quantity of the same marker present in the material under examination;
- pozzetti di forma allungata di microstrip o micropiastre di materiale idoneo alla coltivazione e/o alla fissazione di cellule o airimmunoadsorbimento di cellule o di antigeni o di anticorpi, di formato idoneo ad accogliere al loro interno 3 o 4 o 6 elementi sporgenti da un'asta, sulla quale detti elementi sono disposti a distanza modulare che coincide con la disposizione modulare dei pozzetti standard di micropiastre o di microstrip; - wells of elongated shape of microstrips or microplates of material suitable for the cultivation and / or fixation of cells or airimmunoadsorption of cells or antigens or antibodies, of a format suitable for accommodating within them 3 or 4 or 6 elements protruding from a rod, on which said elements are arranged at a modular distance which coincides with the modular arrangement of the standard wells of microplates or microstrips;
- kit diagnostici pronti all'uso per il rilevamento simultaneo e quantitativo di differenti marker, basati sul metodo di competizione tra 2 fasi solide, come per esempio kit per la diagnosi di tubercolosi neH'uomo e kit per la diagnosi di tubercolosi bovina abbinata alla diagnosi di paratubercolosi in stadio precoce, che prevedono: l'incubazione del campione ematico in due pozzetti di forma allungata per l'adsorbimento selettivo dei linfociti T cooperanti in un pozzetto e dei linfociti T citolitici nell'altro pozzetto; il successivo lavaggio dei pozzetti di forma allungata; l'inoculazione nei pozzetti di forma allungata di un mix standardizzato di antigeni di micobatteri e l'introduzione di 4 elementi, ciascuno sensibilizzato con uno dei marker che si intende rilevare sui linfociti adsorbiti; il rilevamento quantitativo di ciascun antigene legato sul rispettivo elemento attraverso saggio immunoenzimatico condotto immergendo singolarmente detti elementi in pozzetti di micropiastra o microstrip standard non adsorbente, pre-riempiti e contenenti, in sequenza, soluzione di lavaggio, coniugato, soluzione di lavaggio e substrato cromogeno, o in micropiastre contenenti coniugato e, dopo lavaggio, in micropiastre contenenti substrato cromogeno, secondo quanto descritto nei brevetti EP 1 499 894 Bl, USPTO 7,510,687, SIPO PCR ZL 03 8 10029.0 e PCT WO/2003/085401 del 16.10.2003, dai quali la presente invenzione deriva. - ready-to-use diagnostic kits for the simultaneous and quantitative detection of different markers, based on the competition method between 2 solid phases, such as for example a kit for the diagnosis of tuberculosis in humans and a kit for the diagnosis of bovine tuberculosis combined with the diagnosis of early stage paratuberculosis, which include: incubation of the blood sample in two elongated wells for the selective adsorption of cooperating T lymphocytes in one well and cytolytic T lymphocytes in the other well; the subsequent washing of the elongated wells; the inoculation in the elongated wells of a standardized mix of antigens of mycobacteria and the introduction of 4 elements, each sensitized with one of the markers to be detected on the adsorbed lymphocytes; the quantitative detection of each antigen bound on the respective element by means of an enzyme immunoassay conducted by individually immersing said elements in wells of microplate or standard non-adsorbent microstrip, pre-filled and containing, in sequence, washing solution, conjugate, washing solution and chromogenic substrate, or in microplates containing conjugate and, after washing, in microplates containing chromogenic substrate, as described in patents EP 1 499 894 B1, USPTO 7,510,687, SIPO PCR ZL 03 8 10029.0 and PCT WO / 2003/085401 of 16.10.2003, from which the present invention derives.
Le microstrip o micropiastre con pozzetti di forma allungata hanno le dimensioni delle microstrip standard a 8 o a 12 pozzetti o delle micropiastre standard a 96 pozzetti a sezione trasversale circolare; la modifica consiste nel sovradimensionamento dei pozzetti nella direzione della lunghezza della microstrip o secondo la direzione delle file o, alternativamente, delle colonne della micropiastra, in relazione al formato desiderato, in modo che esse contengano un numero inferiore di pozzetti, secondo una delle modalità di seguito indicate: The microstrips or microplates with elongated wells have the dimensions of the standard 8- or 12-well microstrips or the standard 96-well microplates with circular cross section; the modification consists in oversizing the wells in the direction of the length of the microstrip or according to the direction of the rows or, alternatively, of the columns of the microplate, in relation to the desired format, so that they contain a smaller number of wells, according to one of the methods of indicated below:
- 2 pozzetti di forma allungata, ciascuno corrispondente all'estensione di 4 pozzetti standard, possono essere presenti nella microstrip della dimensione di una microstrip standard a 8 pozzetti e ciascun pozzetto di forma allungata può accogliere 4 elementi sporgenti da un'asta, sulla quale detti elementi sono disposti a distanza modulare che coincide con la disposizione modulare dei pozzetti standard di micropiastre o di microstrip; - 2 elongated wells, each corresponding to the extension of 4 standard wells, can be present in the microstrip of the size of a standard 8-well microstrip and each elongated well can accommodate 4 elements protruding from a rod, on which said elements are arranged at a modular distance which coincides with the modular arrangement of the standard wells of microplates or microstrips;
- 2 pozzetti di forma allungata, ciascuno corrispondente all'estensione di 6 pozzetti standard, possono essere presenti nella microstrip della dimensione di una microstrip standard a 12 pozzetti e ciascun pozzetto di forma allungata può accogliere 6 dei suddetti elementi; - 2 elongated wells, each corresponding to the extension of 6 standard wells, can be present in the microstrip of the size of a standard 12 well microstrip and each elongated well can accommodate 6 of the aforementioned elements;
- 3 pozzetti di forma allungata , ciascuno corrispondente all'estensione di 4 pozzetti standard, possono essere presenti nella microstrip della dimensione di una microstrip standard a 12 pozzetti e ciascun pozzetto di forma allungata può accogliere 4 dei suddetti elementi; - 3 elongated wells, each corresponding to the extension of 4 standard wells, can be present in the microstrip of the size of a standard 12 well microstrip and each elongated well can accommodate 4 of the above elements;
- 4 pozzetti di forma allungata , ciascuno corrispondente all'estensione di 3 pozzetti standard, possono essere presenti nella microstrip della dimensione di una microstrip standard a 12 pozzetti e ciascun pozzetto di forma allungata può accogliere 3 dei suddetti elementi. - 4 elongated wells, each corresponding to the extension of 3 standard wells, can be present in the microstrip of the size of a standard 12 well microstrip and each elongated well can accommodate 3 of the above elements.
Nella micropiastra delle dimensioni di una micropiastra standard possono essere presenti: The microplate of the size of a standard microplate may contain:
- 2 pozzetti di forma allungata , ciascuno corrispondente all'estensione di 4 pozzetti standard, in ciascuna delle 12 colonne contrassegnate da 1 ad 12, per un totale di 24 pozzetti di forma allungata , ciascuno idoneo ad accogliere 4 dei suddetti elementi; - 2 pozzetti di forma allungata , ciascuno corrispondente all'estensione di 6 pozzetti standard, in ciascuna delle 8 file contrassegnate da A ad H, per un totale di 16 pozzetti di forma allungata , ciascuno idoneo ad accogliere 6 dei suddetti elementi; - 2 elongated wells, each corresponding to the extension of 4 standard wells, in each of the 12 columns marked from 1 to 12, for a total of 24 elongated wells, each suitable to accommodate 4 of the aforementioned elements; - 2 elongated wells, each corresponding to the extension of 6 standard wells, in each of the 8 rows marked from A to H, for a total of 16 elongated wells, each suitable to accommodate 6 of the aforementioned elements;
- 3 pozzetti di forma allungata , ciascuno corrispondente all'estensione di 4 pozzetti standard, in ciascuna delle 8 file contrassegnate da A ad H, per un totale di 24 pozzetti di forma allungata , ciascuno idoneo ad accogliere 4 dei suddetti elementi; - 3 elongated wells, each corresponding to the extension of 4 standard wells, in each of the 8 rows marked from A to H, for a total of 24 elongated wells, each suitable to accommodate 4 of the aforementioned elements;
- 4 pozzetti di forma allungata , ciascuno corrispondente all'estensione di 3 pozzetti standard, in ciascuna delle 8 file contrassegnate da A ad H, per un totale di 32 pozzetti di forma allungata, ciascuno idoneo ad accogliere 3 dei suddetti elementi. - 4 elongated wells, each corresponding to the extension of 3 standard wells, in each of the 8 rows marked from A to H, for a total of 32 elongated wells, each suitable to accommodate 3 of the aforementioned elements.
La superfìcie interna dei pozzetti di forma allungata può essere utilizzata per la coltivazione di cellule delle quali si vuole rilevare la presenza e la quantità di determinati marcatori superficiali, o per la fissazione di cellule di sezioni sottili ottenute col microtomo da materiale congelato o da materiale incluso. The inner surface of the elongated wells can be used for the cultivation of cells whose presence and quantity of certain surface markers is to be detected, or for the fixation of cells of thin sections obtained with the microtome from frozen material or from embedded material. .
Il fondo dei pozzetti di forma allungata può essere alternativamente piatto o concavo, a ciascun formato può essere abbinata una superficie interna liscia o ondulata che consente di aumentare la quantità di materiale immobilizzato da sottoporre ad analisi. La superfìcie interna dei pozzetti di forma allungata può essere utilizzata per l'immobilizzazione di cellule tramite molecole di cattura immunoadsorbite e, eventualmente, per la separazione delle stesse cellule presenti in un pool; ad esempio i vari linfociti presenti in un campione ematico possono essere separati e immobilizzati tramite specifici anticorpi adsorbiti alla superficie e diretti contro un marcatore superficiale specifico per ciascuno dei tipi di cellule linfocitarie che si vuole immobilizzare. The bottom of the elongated wells can be alternatively flat or concave, each format can be combined with a smooth or wavy internal surface that allows to increase the quantity of immobilized material to be analyzed. The internal surface of the elongated wells can be used for the immobilization of cells by means of immunoadsorbed capture molecules and, possibly, for the separation of the same cells present in a pool; for example, the various lymphocytes present in a blood sample can be separated and immobilized by specific antibodies adsorbed to the surface and directed against a specific surface marker for each of the types of lymphocyte cells to be immobilized.
La superfìcie interna dei pozzetti di forma allungata può essere utilizzata per l'adsorbimento o la coltivazione o la fissazione di cellule che hanno subito infezione, ad esempio per rilevare la presenza di antigeni virus-specifici o virus-indotti susseguenti all'infezione con stipiti da strada o vaccinali. The inner surface of the elongated wells can be used for the adsorption or cultivation or fixation of cells that have undergone infection, for example to detect the presence of virus-specific or virus-induced antigens following infection with stem cells. street or vaccinated.
La superfìcie interna dei pozzetti di forma allungata può essere utilizzata per l'adsorbimento di antigeni dei quali si vuole rilevare la presenza di differenti epitopi. The internal surface of the elongated wells can be used for the adsorption of antigens of which the presence of different epitopes is to be detected.
L'elenco non è esaustivo ed è fornito solo a scopo esemplificativo. The list is not exhaustive and is provided for illustrative purposes only.
Gli elementi sporgenti da un'asta a distanza modulare coincidente con la disposizione modulare dei pozzetti di micropiastre o microstrip standard vengono introdotti nei pozzetti di forma allungata in numero di 3 per le microstrip a 4 pozzetti di forma allungata, ognuno dei quali ha l'estensione di 3 pozzetti standard, in numero di 4 per le microstrip a 2 o a 3 pozzetti di forma allungata, ognuno dei quali ha l'estensione di 4 pozzetti standard, o in numero di 6 per le microstrip a 2 pozzetti di forma allungata, ognuno dei quali ha l'estensione di 6 pozzetti standard. The elements protruding from a rod with a modular distance coinciding with the modular arrangement of the wells of standard microplates or microstrips are introduced into the elongated wells in number of 3 for the 4-well elongated microstrips, each of which has the extension of 3 standard wells, 4 in number for elongated 2-well or 3-well microstrips, each of which has the extension of 4 standard wells, or 6 in number for elongated 2-well microstrips, each of them which has the extension of 6 standard wells.
Un esempio di saggio di rilevamento quantitativo e simultaneo dei marker presenti nel materiale in esame - dopo l'immobilizzazione sulla fase solida 1 costituita dalla superficie interna del pozzetto di forma allungata e dopo la reazione di competizione avvenuta tra la fase solida 1 e la fase solida 2 costituita dagli elementi sensibilizzati immersi nel pozzetto di forma allungata in presenza di ligandi in fase liquida - è quello immunoenzimatico condotto secondo quanto descritto nei sopra citati brevetti dai quali la presente invenzione deriva, ovvero immergendo gli elementi in singoli pozzetti di micropiastra standard non adsorbente, pre-riempiti dei reagenti necessari all'esecuzione del test, e precisamente coniugati e substrato cromogeno già pronti all'uso. Il test immunoenzimatico induce lo sviluppo di una densità ottica - D.O. -inversamente proporzionale alla quantità di ciascun marcatore presente sul materiale in esame ed entrato in competizione con l'analogo marcatore adsorbito a uno degli elementi. Tale competizione si instaura solo in presenza degli specifici marker nel materiale in esame, limitando la quantità di immunocomplesso formato sulla superfìcie del rispettivo elemento sporgente rispetto alla quantità totale dello specifico ligando, presente nel mix di ligandi aggiunti nel pozzetto di forma allungata in quantità nota per il rilevamento dei marker ricercati. An example of an assay of quantitative and simultaneous detection of the markers present in the material under examination - after the immobilization on the solid phase 1 constituted by the internal surface of the well of elongated shape and after the competition reaction occurred between the solid phase 1 and the solid phase 2 consisting of the sensitized elements immersed in the elongated well in the presence of ligands in the liquid phase - is the immunoenzymatic one conducted according to what is described in the aforementioned patents from which the present invention derives, or by immersing the elements in single wells of standard non-adsorbent microplate, pre-filled with the reagents necessary for the execution of the test, and precisely conjugates and chromogenic substrate ready to use. The enzyme immunoassay induces the development of an optical density - D.O. - inversely proportional to the quantity of each marker present on the material under examination and competing with the similar marker adsorbed to one of the elements. This competition occurs only in the presence of specific markers in the material under examination, limiting the amount of immune complex formed on the surface of the respective protruding element with respect to the total amount of the specific ligand, present in the mix of ligands added to the well of elongated shape in a known quantity for the detection of the searched markers.
Altre tecniche di rilevamento qualitativo e quantitativo sono applicabili, quali i test di immunofluorescenza, l'immunoadsorbimento di particelle di metallo in grado di emettere segnali rilevabili con opportune strumentazioni e altre tecniche di laboratorio utili allo scopo. Other qualitative and quantitative detection techniques are applicable, such as immunofluorescence tests, immunoadsorption of metal particles capable of emitting signals detectable with appropriate instruments and other laboratory techniques useful for the purpose.
A titolo esemplificativo e non esaustivo dell'uso dei pozzetti di forma allungata per l'esecuzione del metodo di competizione tra 2 fasi solide attraverso kit pronti all'uso, si descrivono i kit per la diagnosi rapida di tubercolosi umana e per la diagnosi rapida di tubercolosi bovina abbinata alla diagnosi di paratubercolosi in stadio precoce, utilizzando gli antigeni o gli apteni di uso comune per tali diagnosi, che possono essere sostituiti da eventuali nuovi marker la cui utilità sia messa in risalto dal progresso scientifico. By way of non-exhaustive example of the use of elongated wells for the execution of the competition method between 2 solid phases through ready-to-use kits, we describe the kits for the rapid diagnosis of human tuberculosis and for the rapid diagnosis of Bovine tuberculosis combined with the diagnosis of early stage paratuberculosis, using commonly used antigens or haptens for such diagnoses, which can be replaced by any new markers whose usefulness is highlighted by scientific progress.
Stato dell'Arte State of the art
Attualmente la diagnosi di tubercolosi nell'uomo, infezione sostenuta da Mycobacterium tuberculosis, si esegue mediante: Currently, the diagnosis of tuberculosis in humans, infection caused by Mycobacterium tuberculosis, is performed by:
- prova in vivo con skin test, che va letta dopo 72 ore, che evidenzia una reazione di ipersensibilità ritardata di tipo IV dell'ospite infetto, in seguito all'inoculazione di apteni del micobatterio tubercolare; - in vivo test with skin test, which must be read after 72 hours, which highlights a type IV delayed hypersensitivity reaction of the infected host, following the inoculation of tuberculous mycobacterium haptens;
- prova in campione ematico mediante gamma-interferon test, commercialmente disponibile, che va letta dopo 24 ore, che evidenzia il rilascio di interleuchine, in particolare del gamma-interferon, dai linfociti TH1 cooperanti della risposta cellulomediata, se precedentemente sensibilizzati dall'infezione tubercolare, quando sono posti in coltura e sono stimolati dalla presenza di antigeni tubercolari. - blood sample test by gamma-interferon test, commercially available, which must be read after 24 hours, which highlights the release of interleukins, in particular gamma-interferon, from TH1 lymphocytes cooperating in the cell-mediated response, if previously sensitized by tuberculous infection , when they are cultured and stimulated by the presence of tuberculous antigens.
Nell'uomo la distinzione tra tubercolosi attiva e tubercolosi latente è importante per una terapia mirata e di appropriata durata, di 9 o 6 mesi, rispettivamente, e per il monitoraggio dell'evoluzione dell'infezione in corso di terapia; essa è basata sul rilevamento del numero di linfociti TH1 che secernono gamma-interferon e altre interleuchine in presenza di specifici antigeni: ESAT-6, CFP-10, TB7.7. In humans, the distinction between active tuberculosis and latent tuberculosis is important for a targeted therapy of appropriate duration, of 9 or 6 months, respectively, and for monitoring the evolution of the infection during therapy; it is based on the detection of the number of TH1 lymphocytes that secrete gamma-interferon and other interleukins in the presence of specific antigens: ESAT-6, CFP-10, TB7.7.
Nel bovino, attualmente la diagnosi di tubercolosi bovina, infezione sostenuta da Mycobacterium bovis, si esegue mediante: In cattle, currently the diagnosis of bovine tuberculosis, infection sustained by Mycobacterium bovis, is carried out by:
- prova in vivo o skin test, che va letta dopo 72 ore, che evidenzia una reazione di ipersensibilità ritardata di tipo IV dell'ospite infetto, in seguito all'inoculazione di apteni del micobatterio; - in vivo test or skin test, which must be read after 72 hours, which highlights a type IV delayed hypersensitivity reaction of the infected host, following the inoculation of mycobacterium haptens;
- prova in campione ematico mediante gamma-interferon test, che va letta dopo 18-24 ore, che evidenzia il rilascio di interleuchine, in particolare del gamma-interferon, dai linfociti TH1 cooperanti della risposta cellulo-mediata, se precedentemente sensibilizzati dall'infezione tubercolare, quando sono posti in coltura e sono stimolati dalla presenza di antigeni o apteni tubercolari. - blood sample test by gamma-interferon test, which must be read after 18-24 hours, which highlights the release of interleukins, in particular gamma-interferon, from TH1 lymphocytes cooperating in the cell-mediated response, if previously sensitized by the infection tuberculous, when cultured and stimulated by the presence of tuberculous antigens or haptens.
Nel bovino la distinzione tra tubercolosi attiva e tubercolosi latente appare superflua, in quanto i piani di profilassi obbligatoria approvati a livello nazionale e internazionale non consentono il mantenimento di animali infetti, a qualsiasi stadio. Lo skin test, che richiede il sopralluogo in allevamento del Veterinario Ufficiale per 2 volte a distanza di 3 giorni, viene gradualmente sostituito dal test commerciale di rilevamento del gammainterferon. In cattle, the distinction between active tuberculosis and latent tuberculosis appears superfluous, as the mandatory prophylaxis plans approved at national and international level do not allow the maintenance of infected animals, at any stage. The skin test, which requires the Official Veterinarian to visit the farm twice 3 days apart, is gradually replaced by the commercial gammainterferon detection test.
Necessità di metodi rapidi Need for rapid methods
La predisposizione di kit per il test rapido di screening di infezione tubercolare neN'uomo, eseguibile in 3 ore e con minima attrezzatura avrebbe grande utilità nel corso delle grandi campagne sanitarie, in caso di emergenze sanitarie, per il controllo sanitario in caso di grandi spostamenti di persone da zone a rischio d'infezione e per i territori ove le dotazioni strutturali e infrastrutturali non consentono il monitoraggio capillare dei soggetti infetti con i metodi diagnostici attualmente commercializzati. The preparation of kits for the rapid screening test for tuberculous infection in humans, which can be performed in 3 hours and with minimal equipment, would be of great use during large health campaigns, in case of health emergencies, for health checks in case of large movements of people from areas at risk of infection and for territories where the structural and infrastructural equipment does not allow the capillary monitoring of infected subjects with the diagnostic methods currently marketed.
La predisposizione di kit per il test rapido di screening per tubercolosi bovina renderebbe più agevoli i controlli stabiliti dai piani di profilassi nazionali e sovranazionali, consentendo un grande risparmio di risorse, sia nelle zone che hanno già ottenuto la sua eradicazione, che nelle zone dove la tubercolosi è ancora presente ed è necessario un assiduo controllo dei capi allevati per arginare la diffusione dell'infezione tra le popolazioni animali e il rischio di trasmissione all'uomo di questa importante zoonosi. The preparation of kits for the rapid screening test for bovine tuberculosis would make the controls established by national and supranational prophylaxis plans easier, allowing a great saving of resources, both in the areas that have already achieved its eradication, and in the areas where the tuberculosis is still present and constant control of the animals reared is necessary to stem the spread of the infection among animal populations and the risk of transmission to humans of this important zoonosis.
Kit diagnostici rapidi e di facile esecuzione sono necessari anche per la diagnosi in stadio precoce di paratubercolosi o malattia di Johne, infezione sostenuta da Mycobacterium avium subspecie paratuberculosis, quando la risposta immunitaria dell'ospite infetto è di ti po cel lulare e si ha escrezione del patogeno con contaminazione dell'ambiente e trasmissione nella popolazione di animali; la risposta immunitaria umorale, rilevabile attraverso normali test sierologici, si sviluppa negli stadi successivi e presenta minori problematiche di indagine. La paratubercolosi, oltre ad inficiare la redditività degli allevamenti di ruminanti, è una sospetta zoonosi probabilmente correiabile al morbo di Crohn nell'uomo. Quick and easy-to-perform diagnostic kits are also needed for the early diagnosis of paratuberculosis or Johne's disease, infection sustained by Mycobacterium avium subspecie paratuberculosis, when the immune response of the infected host is cellular and excretion of the pathogenic with environmental contamination and transmission in the animal population; the humoral immune response, detectable through normal serological tests, develops in the subsequent stages and presents fewer investigation problems. Paratuberculosis, in addition to affecting the profitability of ruminant farms, is a suspected zoonosis probably correctable to Crohn's disease in humans.
Si illustrano di seguito sia un metodo che un dispositivo e relativi kit pronto all'uso, ideati per la diagnosi rapida di tubercolosi umana e per la diagnosi rapida di tubercolosi bovina abbinata alla diagnosi di paratubercolosi in stadio precoce, per l'emissione del referto analitico entro 3 ore, basati sul rilevamento dei linfociti T citolitici, dei linfociti TH1 cooperanti della risposta cellulare e dei linfociti TH2 cooperanti della risposta umorale sensibilizzati in conseguenza dell'infezione tubercolare. Both a method and a device and related ready-to-use kits are illustrated below, designed for the rapid diagnosis of human tuberculosis and for the rapid diagnosis of bovine tuberculosis combined with the diagnosis of early stage paratuberculosis, for the issuance of the analytical report. within 3 hours, based on the detection of cytolytic T lymphocytes, TH1 lymphocytes cooperating in the cellular response and TH2 lymphocytes cooperating in the humoral response sensitized as a consequence of tuberculous infection.
Finora i procedimenti analitici hanno consentito di sviluppare test immunoenzimatici di competizione in fase liquida, caratterizzati dal fatto che molecole uguali alle molecole da rilevare nel campione vengono marcate e addizionate al campione in fase liquida; le molecole marcate competono con le molecole da rilevare nel campione per il legame a molecole di cattura adsorbite alla fase solida; le molecole marcate addizionate al campione in quantità nota saranno legate dalle molecole di cattura adsorbite alla fase solida in quantità inversamente proporzionale alla quantità delle molecole da rilevare presenti nel campione; le molecole del campione, infatti, legandosi alla fase solida impediscono il legame delle molecole marcate e, non essendo in grado di indurre il segnale generato dal marcatore, non vengono rilevate direttamente dal test, ma inducono un abbassamento del segnale che ci sarebbe se tutte le molecole marcate, in assenza di competitori, fossero state catturate sulla fase solida. Up to now, the analytical procedures have made it possible to develop enzyme immunoassay competition tests in the liquid phase, characterized by the fact that molecules equal to the molecules to be detected in the sample are labeled and added to the sample in the liquid phase; the labeled molecules compete with the molecules to be detected in the sample for binding to capture molecules adsorbed to the solid phase; the labeled molecules added to the sample in a known quantity will be bound by the adsorbed capture molecules to the solid phase in an amount inversely proportional to the quantity of the molecules to be detected present in the sample; the molecules of the sample, in fact, by binding to the solid phase prevent the binding of the labeled molecules and, not being able to induce the signal generated by the marker, are not detected directly by the test, but induce a lowering of the signal that would occur if all the labeled molecules, in the absence of competitors, had been captured on the solid phase.
Tali reazioni competitive dei test immunoenzimatici sono ampiamente utilizzate per il rilevamento di anticorpi e di antigeni, ma consentono il rilevamento di un unico tipo di molecola per ciascun saggio. Such competitive enzyme immunoassay reactions are widely used for antibody and antigen detection, but allow for the detection of only one type of molecule for each assay.
Lo sviluppo di dispositivi a più elementi immunoadsorbenti, che possono essere introdotti contemporaneamente in un unico pozzetto allungato e che poi possono essere analizzati separatamente in pozzetti standard perché disposti alla stessa distanza modulare dei pozzetti di micropiastre o di microstrip standard, consente di rilevare simultaneamente differenti marker in un campione di materiale, utilizzando un nuovo tipo di saggio competitivo che non si basa sulla competizione di molecole in fase liquida per il legame alla fase solida, bensì sull'attrazione competitiva sviluppata dai marker immobilizzati su due fasi solide verso molecole addizionate in fase liquida; le molecole marcate o ligandi, aggiunti in fase liquida in quantità nota, possono legarsi alla fase solida costituita dal pozzetto allungato o alla fase solida costituita dagli elementi sensibilizzati introdotti nel pozzetto stesso; su questi ultimi la quantità di ciascun ligando marcato sarà limitata dalla competizione esercitata dalla fase solida costituita dal pozzetto; l'analisi separata mediante saggio immunoenzimatico del ligando catturato da ciascun elemento indurrà un segnale inversamente proporzionale alla quantità di marker del materiale in esame che ha sottratto dalla fase liquida il ligando stesso, impedendogli di essere catturato dal dispositivo. The development of multi-element immunoadsorbent devices, which can be introduced simultaneously in a single elongated well and which can then be analyzed separately in standard wells because they are arranged at the same modular distance as the wells of standard microplates or microstrips, allows for the simultaneous detection of different markers in a sample of material, using a new type of competitive assay that is not based on the competition of molecules in the liquid phase for binding to the solid phase, but on the competitive attraction developed by the immobilized markers on two solid phases towards molecules added in the liquid phase ; the labeled molecules or ligands, added in the liquid phase in a known quantity, can bind to the solid phase constituted by the elongated well or to the solid phase constituted by the sensitized elements introduced into the well itself; on the latter the quantity of each labeled ligand will be limited by the competition exerted by the solid phase constituted by the well; the separate analysis by enzyme immunoassay of the ligand captured by each element will induce a signal inversely proportional to the amount of marker of the material under examination that has subtracted the ligand from the liquid phase, preventing it from being captured by the device.
Il vantaggio del metodo consiste nel poter rilevare simultaneamente differenti marker nel materiale in esame, utilizzando elementi che: The advantage of the method consists in being able to simultaneously detect different markers in the material under examination, using elements that:
- nella prima parte della procedura di esecuzione del metodo sono tutti esposti alla competizione esercitata dai marker da rilevare immobilizzati sul pozzetto allungato, che consente di analizzare una quantità di campione maggiore rispetto a quella contenuta nei pozzetti standard; - in the first part of the method execution procedure they are all exposed to the competition exerted by the markers to be detected immobilized on the elongated well, which allows to analyze a greater quantity of sample than that contained in the standard wells;
- nella seconda parte della procedura di esecuzione del metodo vengono analizzati separatamente, senza che vi sia necessità di differenziare il segnale di rilevamento per ciascun marker in esame. - in the second part of the procedure for carrying out the method, they are analyzed separately, without the need to differentiate the detection signal for each marker under examination.
La possibilità di rilevare direttamente mediante saggio immunoenzimatico i differenti marker superficiali di linfociti, che possono essere individuati simultaneamente distinguendo, inoltre, se sono presenti su linfociti T cooperanti o su linfociti T citolitici, apre la possibilità di sviluppo di metodi rapidi per la diagnosi di infezioni tubercolari, basati sul rilevamento simultaneo di marker di superficie di linfociti sensibilizzati dall'infezione, invece che sul rilevamento delle citochine, quali il gamma-interferon, che sono prodotte dai linfociti sensibilizzati quando stimolati dagli antigeni di micobatteri che si legano ai marker di superficie, ma che necessitano di 18-24 ore per essere rilevate. The possibility of detecting directly by enzyme immunoassay the different superficial markers of lymphocytes, which can be identified simultaneously, also distinguishing if they are present on cooperating T lymphocytes or on cytolytic T lymphocytes, opens up the possibility of developing rapid methods for the diagnosis of infections. tuberculous, based on the simultaneous detection of surface markers of infection-sensitized lymphocytes, rather than on the detection of cytokines, such as gamma-interferon, which are produced by sensitized lymphocytes when stimulated by mycobacterial antigens that bind to surface markers, but which take 18-24 hours to detect.
Il nuovo metodo analitico di competizione tra 2 fasi solide per il rilevamento simultaneo di differenti marker di superficie cellulare prevede i seguenti passi: The new analytical method of competition between 2 solid phases for the simultaneous detection of different cell surface markers involves the following steps:
a) il materiale in esame sul quale si intende rilevare la presenza di differenti marker viene immobilizzato in pozzetti di forma allungata che costituiscono la prima fase solida; a) the material under examination on which the presence of different markers is to be detected is immobilized in elongated wells which constitute the first solid phase;
b) si lava i pozzetti; b) the wells are washed;
c) dopo il lavaggio dei pozzetti di forma allungata, una quantità standardizzata di mix di ligandi, ovvero di molecole ciascuna delle quali si leghi specificamente ad uno dei marker da rilevare, marcati con biotina, viene inoculata nel pozzetto; c) after washing the elongated wells, a standardized quantity of mix of ligands, ie molecules each of which binds specifically to one of the markers to be detected, labeled with biotin, is inoculated into the well;
d) nel pozzetto vengono immersi 4 elementi sporgenti da un'asta, sulla quale sono posizionati a distanza modulare che coincide con la distanza modulare dei pozzetti di microstrip o micropiastre standard, che costituiscono la seconda fase solida, su ciascuno dei quali è stato precedentemente immobilizzato uno dei marker da rilevare; e) durante un determinato tempo di incubazione si instaura una reazione di competizione tra le 2 fasi solide per la cattura dei ligandi, che possono legarsi specificamente sia ai marker del materiale in esame immobilizzato sul pozzetto, che ai marker separatamente immobilizzati su ciascuno di detti elementi; d) 4 elements protruding from a rod are immersed in the well, on which they are positioned at a modular distance which coincides with the modular distance of the wells of standard microstrips or microplates, which constitute the second solid phase, on each of which it has been previously immobilized one of the markers to be detected; e) during a given incubation time a competition reaction is established between the 2 solid phases for the capture of the ligands, which can bind specifically both to the markers of the test material immobilized on the well, and to the markers immobilized separately on each of said elements ;
g) detti elementi vengono estratti e sottoposti a saggio immunoenzimatico di rilevamento quantitativo di ciascun ligando, che sarà presente sul rispettivo elemento in quantità inversamente proporzionale alla quantità dello stesso marker presente nel materiale in esame, utilizzando un coniugato contenente avidina che si legherà alla biotina grazie all'alta affinità delle molecole. g) these elements are extracted and subjected to an enzyme immunoassay for quantitative detection of each ligand, which will be present on the respective element in an amount inversely proportional to the quantity of the same marker present in the material under examination, using a conjugate containing avidin which will bind to the biotin thanks the high affinity of the molecules.
Kit per diagnosi di tubercolosi neM'uomo basata sul rilevamento simultaneo di differenti marker mediante competizione tra 2 fasi solide Kit for the diagnosis of tuberculosis in humans based on the simultaneous detection of different markers by competition between 2 solid phases
Il kit diagnostico pronto all'uso per tubercolosi umana, per campione singolo, comprende: The ready-to-use diagnostic kit for human tuberculosis, for single sample, includes:
- 1 microstrip a 3 pozzetti di forma allungata sensibilizzati come di seguito specificato, di cui uno pre-riempito con diluente; - 1 elongated 3-well microstrip sensitized as specified below, one of which is pre-filled with diluent;
- 2 pipette monouso da 1 mL; - 2 disposable 1 mL pipettes;
- 1 flacone di soluzione di lavaggio da 20 mL con dispensatore; - 1 bottle of 20 mL washing solution with dispenser;
- 3 fiale contenenti mix standardizzato di antigeni di Mycobacterium tuberculosis ESAT-6, CFP-10 e TB 7.7 coniugati con biotina; - 3 ampoules containing standardized mix of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6, CFP-10 and TB 7.7 antigens conjugated with biotin;
- 1 dispositivo a 12 elementi sporgenti, sensibilizzato come di seguito specificato; - 1 device with 12 protruding elements, sensitized as specified below;
- 1 micropiastra standard non immunoadsorbente a 96 pozzetti pre-riempiti con i reagenti necessari all'esecuzione del test: soluzione di lavaggio, coniugato e substrato cromogeno; - 1 standard 96-well non-immunoadsorbent microplate pre-filled with the reagents necessary for the execution of the test: washing solution, conjugate and chromogenic substrate;
- tamponi di carta bibula. - bibulous paper pads.
Nella microstrip con pozzetti di forma allungata , il pozzetto di forma allungata 1 è sensibilizzato con anticorpo monoclonale anti CD4 per il legame con i linfociti T cooperanti, che si adsorbono alla superficie; il pozzetto di forma allungata 2 è sensibilizzato con anticorpo monoclonale anti CD8 per il legame con i linfociti T citolitici, che si adsorbono alla superfìcie; il pozzetto di forma allungata 3 non è sensibilizzato e funge da controllo negativo per evidenziare eventuali reazioni aspecifiche. In the microstrip with elongated wells, the elongated well 1 is sensitized with anti CD4 monoclonal antibody for binding with cooperating T lymphocytes, which adsorb to the surface; the elongated well 2 is sensitized with anti CD8 monoclonal antibody for binding to the cytolytic T lymphocytes, which adsorb to the surface; the elongated well 3 is not sensitized and acts as a negative control to highlight any non-specific reactions.
Gli elementi del dispositivo sono sensibilizzate con gli anticorpi monoclonali: The elements of the device are sensitized with monoclonal antibodies:
1 - anti - ESAT -6; 1 - anti - ESAT -6;
2 - anti - CFP-10; 2 - anti - CFP-10;
3 - anti - TB 7.7; 3 - anti - TB 7.7;
4 - nessuna sensibilizzazione - controllo negativo; 4 - no sensitization - negative control;
5 - anti - ESAT -6; 5 - anti - ESAT -6;
6 - anti - CFP-10; 6 - anti - CFP-10;
7 - anti - TB 7.7; 7 - anti - TB 7.7;
8 - nessuna sensibilizzazione - controllo negativo; 8 - no sensitization - negative control;
9 - anti - ESAT -6; 9 - anti - ESAT -6;
10 - ariti - CFP-10; 10 - arites - CFP-10;
11 - anti - TB 7.7; 11 - anti - TB 7.7;
12 - nessuna sensibilizzazione - controllo negativo. 12 - no sensitization - negative control.
La micropiastra standard non immunoadsorbente a 96 pozzetti è pre-riempita con: - soluzione di lavaggio nei pozzetti delle file A, B,C, E, F e G; The 96 well non-immunoadsorbent standard microplate is pre-filled with: - washing solution in the wells of rows A, B, C, E, F and G;
- coniugato avidina / enzima nei pozzetti della fila D; - avidin / enzyme conjugate in the wells of row D;
- substrato cromogeno nei pozzetti della fila H. - chromogenic substrate in the wells of row H.
1. ADSORBIMENTO DEI LINFOCITI - Il campione ematico addizionato di anticoagulante va dispensato, in due aliquote da 1 mL, nel pozzetto di forma allungata 1 e nel pozzetto di forma allungata 2 della microstrip. Si lascia ad incubare per consentire l'adsorbimento dei linfociti T cooperanti alla superficie del pozzetto di forma allungata 1 e dei linfociti T citolitici alla superfìcie del pozzetto di forma allungata 2. 2. COMPETIZIONE TRA 2 FASI SOLIDE PER IL LEGAME CON GLI ANTIGENI STANDARDIZZATI -Al termine dell'incubazione, i pozzetti di forma allungata vanno lavati 3 volte con soluzione di lavaggio; in ciascun pozzetto di forma allungata si inocula una fiala contenente il mix standardizzato di antigeni ESAT-6, CFP-10 e TB 7.7 coniugati con biotina. 1. ADSORPTION OF LYMPHOCYTES - The blood sample with the addition of anticoagulant should be dispensed, in two 1 mL aliquots, in the elongated well 1 and in the elongated well 2 of the microstrip. It is left to incubate to allow the adsorption of the cooperating T lymphocytes to the surface of the elongated well 1 and of the cytolytic T lymphocytes to the surface of the elongated well 2. 2. COMPETITION BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE BINDING WITH STANDARDIZED ANTIGENS - At the end of the incubation, the elongated wells should be washed 3 times with washing solution; a vial containing the standardized mix of ESAT-6, CFP-10 and TB 7.7 antigens conjugated with biotin is injected into each elongated well.
Sulla microstrip si appoggia il dispositivo sensibilizzato a 12 elementi sporgenti in modo da immergere 4 elementi sporgenti in ogni pozzetto di forma allungata e si lascia ad incubare. The sensitized device with 12 protruding elements is placed on the microstrip so as to immerse 4 protruding elements in each elongated well and it is left to incubate.
Gli anticorpi adsorbiti agli elementi del dispositivo legano gli antigeni coniugati con biotina competendo, nel pozzetto di forma allungata 1, con i linfociti CD4 sensibilizzati dall'infezione tubercolare adsorbiti alla superfìcie e competendo, nel pozzetto di forma allungata 2, con i linfociti CD8 sensibilizzati dall'infezione tubercolare adsorbiti alla superfìcie. The antibodies adsorbed to the device elements bind the biotin-conjugated antigens by competing, in the elongated well 1, with the CD4 lymphocytes sensitized by tuberculous infection adsorbed to the surface and competing, in the elongated well 2, with the CD8 lymphocytes sensitized by the tuberculous infection adsorbed to the surface.
Al termine dell'incubazione, la quantità di antigeni coniugati con biotina legati in immunocomplesso su ogni specifico elemento sporgente è inversamente proporzionale alla presenza dei marker dei linfociti sensibilizzati e immobilizzati sulla superficie del pozzetto di forma allungata , che hanno legato parte degli stessi antigeni attraverso gli specifici recettori superficiali. At the end of the incubation, the quantity of antigens conjugated with biotin bound in immune complex on each specific protruding element is inversely proportional to the presence of the markers of the sensitized and immobilized lymphocytes on the surface of the elongated well, which have bound part of the same antigens through the specific surface receptors.
3. LEGAME DEL CONIUGATO AGLI ELEMENTI - Al termine dell'incubazione, il dispositivo va sollevato e gli elementi vanno immerse nei pozzetti della fila A della micropiastra standard a 96 pozzetti, in modo che ciascun elemento sporgente penetri in un pozzetto contenente soluzione di lavaggio. 3. BINDING THE CONJUGATE TO THE ELEMENTS - At the end of the incubation, the device is lifted and the elements are immersed in the wells of row A of the standard 96-well microplate, so that each protruding element enters a well containing washing solution.
Dopo il lavaggio nei pozzetti della fila A, gli elementi sporgenti vanno asciugati su carta bibula. After washing in the wells of row A, the protruding elements must be dried on bibulous paper.
Il lavaggio va ripetuto anche nei pozzetti delle file B e C, sempre seguito da asciugatura. The washing must also be repeated in the wells of rows B and C, always followed by drying.
Gli elementi sporgenti vanno, quindi, immerse nei pozzetti della fila D, contenenti il coniugato avidina/enzima - generalmente perossidasi di rafano HRP. Si lascia ad incubare. The protruding elements are then immersed in the wells of row D, containing the avidin / enzyme conjugate - generally horseradish peroxidase HRP. It is left to incubate.
4. REAZIONE CROMOGENA - Gli elementi sporgenti vanno lavati nei pozzetti delle file E, F e G, asciugate di volta in volta e infine immerse nei pozzetti della fila H, contenenti il substrato cromogeno - generalmente trimetilbenzidina TMB. 4. CHROMOGENIC REACTION - The protruding elements are washed in the wells of rows E, F and G, dried each time and finally immersed in the wells of row H, containing the chromogenic substrate - generally TMB trimethylbenzidine.
Dopo incubazione, gli elementi sporgenti vanno estratte e si procede alla lettura spettrofotometrica tramite lettore ELISA della D.O. della soluzione nei pozzetti della fila H della micropiastra. After incubation, the protruding elements are extracted and the spectrophotometric reading is carried out using the ELISA reader of the D.O. of the solution in the wells of row H of the microplate.
5. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI - La D.O. rilevata è inversamente proporzionale alla quantità di linfociti presenti nel campione di sangue, rispettivamente cooperanti CD4 o citotossici CD8, per il rispettivo antigene tubercolare; l'interpretazione dei risultati del test va fatta in relazione alla D. O. rilevata in corrispondenza degli elementi sporgenti che, in assenza di linfociti competitori nel pozzetto di forma allungata, legano la massima quantità di ciascun antigene, mentre gli altri elementi sporgenti fungono da controllo negativo interno a ciascun pozzetto di forma allungata . 5. INTERPRETATION OF RESULTS - The D.O. detected is inversely proportional to the quantity of lymphocytes present in the blood sample, respectively cooperating CD4 or cytotoxic CD8, for the respective tuberculous antigen; the interpretation of the test results must be made in relation to the OD detected in correspondence with the protruding elements which, in the absence of competing lymphocytes in the elongated well, bind the maximum quantity of each antigen, while the other protruding elements act as an internal negative control to each elongated well.
Il controllo positivo va allestito parallelamente utilizzando linfociti sensibilizzati che, se opportunamente dosati, consentono di ottenere una curva di taratura utile per l'interpretazione quantitativa dei risultati analitici. The positive control must be set up in parallel using sensitized lymphocytes which, if properly dosed, allow to obtain a calibration curve useful for the quantitative interpretation of the analytical results.
Analisi dei campioni per diagnosi di tubercolosi nel bovino e di paratubercolosi in stadio precoce Analysis of samples for the diagnosis of tuberculosis in cattle and early stage paratuberculosis
Per la specie bovina le microstrip con pozzetti di forma allungata vengono utilizzate, nella diagnosi di tubercolosi e di paratubercolosi in stadio precoce, come di seguito descritto. For the bovine species, microstrips with elongated wells are used in the diagnosis of tuberculosis and early stage paratuberculosis, as described below.
Il kit pronto all'uso per diagnosi di tubercolosi bovina abbinata a diagnosi di paratubercolosi in stadio precoce, per campione singolo, deve comprendere: The ready-to-use kit for the diagnosis of bovine tuberculosis combined with the diagnosis of early stage paratuberculosis, for single sample, must include:
- 1 microstrip a 3 pozzetti di forma allungata sensibilizzati come di seguito specificato, di cui uno pre-riempito con diluente; - 1 elongated 3-well microstrip sensitized as specified below, one of which is pre-filled with diluent;
- 2 pipette monouso da 1 mL; - 2 disposable 1 mL pipettes;
- 1 flacone da 20 mL contenente soluzione di lavaggio per i pozzetti di forma allungata / - 1 bottle of 20 mL containing washing solution for the elongated wells /
- 3 fiale contenenti mix standardizzato di apteni PPD tubercolina bovina, PPD tubercolina aviare e johnina coniugati con biotina; - 3 ampoules containing standardized mix of haptens PPD bovine tuberculin, PPD avian tuberculin and johnina conjugated with biotin;
- 1 dispositivo con 12 elementi sporgenti, sensibilizzati come di seguito specificato; - 1 micropiastra standard non immunoadsorbente a 96 pozzetti pre-riempiti con i reagenti necessari all'esecuzione del test: soluzione di lavaggio, coniugato e substrato cromogeno; - 1 device with 12 protruding elements, sensitized as specified below; - 1 standard 96-well non-immunoadsorbent microplate pre-filled with the reagents necessary for the execution of the test: washing solution, conjugate and chromogenic substrate;
- tamponi di carta bibula. - bibulous paper pads.
Nella microstrip con pozzetti di forma allungata , il pozzetto di forma allungata 1 è sensibilizzato con anticorpo monoclonale anti CD4 per il legame con i linfociti T cooperanti, che si adsorbono alla superficie; il pozzetto di forma allungata 2 è sensibilizzato con anticorpo monoclonale anti CD8 per il legame con i linfociti T citolitici, che si adsorbono alla superfìcie; il pozzetto di forma allungata 3 non è sensibilizzato e funge da controllo negativo per evidenziare eventuali reazioni aspecifiche. In the microstrip with elongated wells, the elongated well 1 is sensitized with anti CD4 monoclonal antibody for binding with cooperating T lymphocytes, which adsorb to the surface; the elongated well 2 is sensitized with anti CD8 monoclonal antibody for binding with cytolytic T lymphocytes, which adsorb to the surface; the elongated well 3 is not sensitized and acts as a negative control to highlight any non-specific reactions.
Gli elementi del dispositivo sono sensibilizzate con gli anticorpi monoclonali: The elements of the device are sensitized with monoclonal antibodies:
1 - anti - PPD tubercolina bovina; 1 - anti - PPD bovine tuberculin;
2 - anti - PPD tubercolina aviare; 2 - anti - PPD avian tuberculin;
3 - anti - johnina; 3 - anti - johnina;
4 - nessuna sensibilizzazione - controllo negativo; 4 - no sensitization - negative control;
5 - anti - PPD tubercolina bovina; 5 - anti - PPD bovine tuberculin;
6 - anti - PPD tubercolina aviare; 6 - anti - PPD avian tuberculin;
7 - anti - johnina; ; 7 - anti - johnina; ;
8 - nessuna sensibilizzazione - controllo negativo; 8 - no sensitization - negative control;
9 - anti - PPD tubercolina bovina; 9 - anti - PPD bovine tuberculin;
10 - anti - PPD tubercolina aviare; 10 - anti - PPD avian tuberculin;
11 - anti - johnina; 11 - anti - johnina;
12 - nessuna sensibilizzazione - controllo negativo. 12 - no sensitization - negative control.
La micropiastra standard non immunoadsorbente a 96 pozzetti è pre-riempita con: - soluzione di lavaggio nei pozzetti delle file A, B,C, E, F e G; The 96 well non-immunoadsorbent standard microplate is pre-filled with: - washing solution in the wells of rows A, B, C, E, F and G;
- coniugato avidina / enzima nei pozzetti della fila D; - avidin / enzyme conjugate in the wells of row D;
- substrato cromogeno nei pozzetti della fila H. - chromogenic substrate in the wells of row H.
1. ADSORBIMENTO DEI LINFOCITI - Il campione ematico va dispensato in due aliquote di 1 mL nel maxi-pozzetto 1 e nel pozzetto di forma allungata 2. Si pone ad incubare per consentire l'adsorbimento dei linfociti T cooperanti alla superficie del pozzetto di forma allungata 1 e dei linfociti T citolitici alla superficie del pozzetto di forma allungata 2. 1. ADSORPTION OF LYMPHOCYTES - The blood sample must be dispensed in two aliquots of 1 mL in the maxi-well 1 and in the elongated well 2. It is placed to incubate to allow the adsorption of the cooperating T lymphocytes to the surface of the elongated well. 1 and cytolytic T lymphocytes at the surface of the elongated well 2.
2. COMPETIZIONE TRA 2 FASI SOLIDE PER IL LEGAME CON GLI APTENI STANDARDIZZATI - Al termine dell'incubazione, i pozzetti di forma allungata vengono lavati 3 volte con soluzione di lavaggio e in ciascuno di essi si inocula 1 fiala del mix standardizzato di apteni PPD tubercolina bovina, PPD tubercolina aviare e johnina coniugati con biotina. 2. COMPETITION BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR BINDING WITH STANDARDIZED APTENS - At the end of the incubation, the elongated wells are washed 3 times with washing solution and in each of them 1 vial of the standardized mix of tuberculin PPD haptens is injected bovine, avian tuberculin PPD and johnina conjugated with biotin.
Sulla strip si appoggia il dispositivo sensibilizzato a 12 elementi sporgenti, in modo da immergere 4 elementi sporgenti in ogni pozzetto di forma allungata e si lascia ad incubare. The sensitized device with 12 protruding elements is placed on the strip, so as to immerse 4 protruding elements in each elongated well and it is left to incubate.
Gli anticorpi adsorbiti agli elementi legano gli apteni coniugati con biotina competendo nel pozzetto di forma allungata 1 con i linfociti CD4 sensibilizzati dall'infezione tubercolare o paratubercolare adsorbiti alla superficie e competendo nel pozzetto di forma allungata 2 con i linfociti CD8 sensibilizzati dall'infezione tubercolare o paratubercolare adsorbiti alla superficie. Antibodies adsorbed to the elements bind biotin-conjugated haptens by competing in elongated well 1 with tuberculous infection sensitized CD4 lymphocytes or paratuberculously adsorbed to the surface and competing in elongated well 2 with tuberculously sensitized CD8 lymphocytes or paratubercle adsorbed to the surface.
Al termine dell'incubazione, la quantità di apteni legati in immunocomplesso su ogni specifico elemento è inversamente proporzionale alla presenza di linfociti sensibilizzati e immobilizzati sulla superficie del pozzetto di forma allungata , che hanno legato parte degli apteni attraverso gli specifici recettori superficiali. At the end of the incubation, the quantity of haptens bound in immunocomplex on each specific element is inversely proportional to the presence of sensitized and immobilized lymphocytes on the surface of the elongated well, which have bound part of the haptens through the specific surface receptors.
3. LEGAME DEL CONIUGATO AGLI ELEMENTI - Al termine dell'incubazione, il dispositivo viene sollevato e gli elementi vengono immerse nei pozzetti della fila A della micropiastra standard a 96 pozzetti, in modo che ciascun elemento sporgente penetri in un pozzetto contenente soluzione di lavaggio. 3. BINDING THE CONJUGATE TO THE ELEMENTS - At the end of the incubation, the device is lifted and the elements are immersed in the wells of row A of the standard 96-well microplate, so that each protruding element enters a well containing washing solution.
Dopo il lavaggio nei pozzetti della fila A, gli elementi vengono asciugate su carta bibula. After washing in the wells of row A, the elements are dried on bibulous paper.
Il lavaggio viene ripetuto anche nei pozzetti delle file B e C, sempre seguito da asciugatura. The washing is also repeated in the wells of rows B and C, always followed by drying.
Gli elementi sporgenti vanno, quindi, immerse nei pozzetti della fila D, contenenti il coniugato. The protruding elements are then immersed in the wells of row D, containing the conjugate.
Si lascia ad incubare. It is left to incubate.
4. REAZIONE COLORIMETRICA - Gli elementi vengono lavate nei pozzetti delle file E, F e G, asciugate di volta in volta e infine immerse nei pozzetti della fila H, contenenti il substrato cromogeno. 4. COLORIMETRIC REACTION - The elements are washed in the wells of rows E, F and G, dried each time and finally immersed in the wells of row H, containing the chromogenic substrate.
Dopo incubazione, gli elementi sporgenti vengono estratti e si procede alla lettura spettrofotometrica della D. O. della soluzione nei pozzetti della fila H della micropiastra attraverso lettore ELISA. After incubation, the protruding elements are extracted and the spectrophotometric reading of the O.D. of the solution in the wells of row H of the microplate is carried out by means of an ELISA reader.
5. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI - La D.O. rilevata sarà inversamente proporzionale alla quantità di linfociti presenti nel campione ematico, rispettivamente cooperanti (CD4) o citotossici (CD8), per il corrispettivo aptene; l'interpretazione dei risultati del test va fatta in relazione alla D. O. rilevata in corrispondenza degli elementi sporgenti che, in assenza di linfociti competitori nel pozzetto di forma allungata, legano la massima quantità di ciascun aptene, mentre gli altri elementi sporgenti fungono da controllo negativo interno a ciascun pozzetto di forma allungata . 5. INTERPRETATION OF RESULTS - The D.O. detected will be inversely proportional to the quantity of lymphocytes present in the blood sample, respectively cooperating (CD4) or cytotoxic (CD8), for the corresponding hapten; the interpretation of the test results must be made in relation to the OD detected in correspondence with the protruding elements which, in the absence of competing lymphocytes in the elongated well, bind the maximum quantity of each hapten, while the other protruding elements act as an internal negative control to each elongated well.
Il controllo positivo va allestito parallelamente utilizzando linfociti sensibilizzati che, se opportunamente dosati, consentono di ottenere una curva di taratura utile per l'interpretazione quantitativa dei risultati analitici. The positive control must be set up in parallel using sensitized lymphocytes which, if properly dosed, allow to obtain a calibration curve useful for the quantitative interpretation of the analytical results.
Per entrambi i sistemi diagnostici illustrati, relativi all'uomo e al bovino, i kit pronti all'uso per più campioni devono comprendere: For both human and bovine diagnostic systems illustrated, ready-to-use multi-sample kits should include:
- microstrip con 3 pozzetti di forma allungata , ognuno dei quali è in grado di accogliere 4 elementi sporgenti dei dispositivi sensibilizzati, o le micropiastre a 3 pozzetti di forma allungata disposti in 8 file corrispondenti alle file contrassegnate da A ad H nelle micropiastre standard, sensibilizzati come sopra specificato per ciascun tipo di diagnosi; - microstrip with 3 elongated wells, each of which is able to accommodate 4 protruding elements of the sensitized devices, or the elongated 3-well microplates arranged in 8 rows corresponding to the rows marked from A to H in the standard, sensitized microplates as specified above for each type of diagnosis;
- fiale con il mix standardizzato di antigeni o di apteni coniugati con biotina; - vials with the standardized mix of antigens or haptens conjugated with biotin;
- dispositivi a 12 elementi sporgenti sensibilizzati come sopra descritto per ciascun tipo di diagnosi; - sensitized 12 protruding elements devices as described above for each type of diagnosis;
- micropiastre standard a 96 pozzetti non immunoadsorbenti o un numero sufficiente di microstrip standard a 12 pozzetti non immunoadsorbenti, pre-riempite con coniugato; - 96-well non-immunoadsorbent standard microplates or a sufficient number of non-immunoadsorbent 12-well standard microstrips, pre-filled with conjugate;
- micropiastre standard a 96 pozzetti non immunoadsorbenti o un numero sufficiente di microstrip standard a 12 pozzetti non immunoadsorbenti, pre-riempite con substrato cromogeno; - 96-well non-immunoadsorbent standard microplates or a sufficient number of non-immunoadsorbent 12-well standard microstrips, pre-filled with chromogenic substrate;
- eventuali micropiastre standard a 96 pozzetti non imm unoadsorbenti o un numero sufficiente di microstrip standard a 12 pozzetti non immunoadsorbenti, pre-riempiti con soluzione di lavaggio, o, alternativamente, flaconi con soluzione di lavaggio dotati di erogatore; - any non-immunoadsorbent standard 96-well microplates or a sufficient number of non-immunoadsorbent standard 12-well microstrips, pre-filled with washing solution, or, alternatively, bottles with washing solution equipped with a dispenser;
- tamponi di carta bibula per l'asciugatura degli elementi; - bibulous paper pads for drying the elements;
- supporto per contenere e muovere contemporaneamente i dispositivi a 12 elementi sporgenti, descritto nei sopra citati brevetti EP 1 499 894 Bl, USPTO 7,510,687, SIPO PCR ZL 03 8 10029.0 e PCT WO/2003/085401 del 16.10.2003, dai quali la presente invenzione deriva. - support for simultaneously containing and moving the devices with 12 protruding elements, described in the aforementioned patents EP 1 499 894 Bl, USPTO 7,510,687, SIPO PCR ZL 03 8 10029.0 and PCT WO / 2003/085401 of 16.10.2003, from which the present invention arises.
L'esecuzione manuale dei test prevede che, dopo l'incubazione dei campioni ematici nei pozzetti di forma allungata e il lavaggio di questi ultimi, in ciascuno di essi vada inoculato il mix standardizzato di antigeni di micobatteri prescelto e venga posizionato il supporto contenente 8 dispositivi a 12 elementi sporgenti sensibilizzati, che consente di spostare contemporaneamente i dispositivi stessi, in modo che i loro elementi sporgenti siano: - immersi nei pozzetti di forma allungata e poste ad incubare; - lavate e asciugate; - immerse nei pozzetti standard contenenti il coniugato e poste ad incubare; - lavate e asciugate; - immerse nei pozzetti standard contenenti il substrato cromogeno e poste ad incubare; - estratte per la lettura mediante lettore ELISA di questi ultimi pozzetti, nei quali si sviluppata la reazione cromogena. The manual execution of the tests requires that, after the incubation of the blood samples in the elongated wells and the washing of the latter, the standardized mix of antigens of mycobacteria chosen is inoculated in each of them and the support containing 8 devices is positioned with 12 sensitized protruding elements, which allows the devices themselves to be moved at the same time, so that their protruding elements are: - immersed in the elongated wells and placed to incubate; - wash and dry; - immersed in the standard wells containing the conjugate and placed to incubate; - wash and dry; - immersed in the standard wells containing the chromogenic substrate and placed to incubate; - extracted for reading by ELISA reader of these last wells, in which the chromogenic reaction develops.
La semplicità delle operazioni che si susseguono nel procedimento diagnostico rende agevole l'automatizzazione dell'uso dei kit predisposti come descritto. The simplicity of the operations that follow one another in the diagnostic procedure makes it easy to automate the use of the kits prepared as described.
Breve descrizione delle figure Brief description of the figures
In figura 1 è schematizzata una microstrip a 3 pozzetti di forma allungata idonei ad accogliere 4 elementi. Figure 1 schematically shows a 3-well microstrip of elongated shape suitable for accommodating 4 elements.
In figura 2 è schematizzata una microstrip a 4 pozzetti di forma allungata idonei ad accogliere 3 elementi. Figure 2 schematically shows an elongated 4-well microstrip suitable for accommodating 3 elements.
In figura 3 è schematizzata una microstrip a 2 pozzetti di forma allungata idonei ad accogliere 6 elementi. Figure 3 schematically shows a 2-well microstrip of elongated shape suitable for accommodating 6 elements.
In figura 4 è schematizzata una microstrip a 2 pozzetti di forma allungata idonei ad accogliere 4 elementi. Figure 4 schematically shows a 2-well microstrip of elongated shape suitable for accommodating 4 elements.
In figura 5 è schematizzata una micropiastra a 24 pozzetti di forma allungata idonei ad accogliere 4 elementi. Figure 5 schematically shows a microplate with 24 wells of elongated shape suitable for accommodating 4 elements.
In figura 6 è schematizzata una micropiastra a 32 pozzetti di forma allungata idonei ad accogliere 3 elementi. Figure 6 schematically shows a 32-well microplate of elongated shape suitable for accommodating 3 elements.
Forme di realizzazione dell'invenzione Embodiments of the invention
In Figura 1 è rappresentato un esempio di microstrip a 3 pozzetti di forma allungata per 4 elementi, per la predisposizione di kit pronti all'uso per diagnosi rapida di tubercolosi, basata sul rilevamento quantitativo e simultaneo di differenti marker linfocitari mediante competizione tra 2 fasi solide. La microstrip (11) a 3 pozzetti allungati ha dimensione di una microstrip standard a 12 pozzetti; ogni pozzetto allungato (10) è idoneo ad accogliere 4 elementi (12) del dispositivo (13) con 12 elementi sporgenti da un'asta a distanza modulare coincidente con la distanza modulare dei pozzetti di micropiastre o microstrip standard. Figure 1 shows an example of an elongated 3-well microstrip for 4 elements, for the preparation of ready-to-use kits for rapid diagnosis of tuberculosis, based on the quantitative and simultaneous detection of different lymphocyte markers by competition between 2 solid phases . The elongated 3-well microstrip (11) has the size of a standard 12-well microstrip; each elongated well (10) is suitable for accommodating 4 elements (12) of the device (13) with 12 elements protruding from a rod having a modular distance coinciding with the modular distance of the wells of standard microplates or microstrips.
In Figura 2 è rappresentato un esempio di microstrip a 4 pozzetti di forma allungata per 3 elementi, per la predisposizione di kit pronti all'uso per il rilevamento quantitativo e simultaneo di differenti marker mediante competizione tra 2 fasi solide. La microstrip (21) ha dimensione di una microstrip standard a 12 pozzetti; ogni pozzetto allungato (20) è idoneo ad accogliere 3 elementi (22) del dispositivo (23). Figure 2 shows an example of an elongated 4-well microstrip for 3 elements, for the preparation of ready-to-use kits for the quantitative and simultaneous detection of different markers by competing between 2 solid phases. The microstrip (21) has the size of a standard 12-well microstrip; each elongated well (20) is suitable to accommodate 3 elements (22) of the device (23).
In Figura 3 è rappresentato un esempio di microstrip a 2 pozzetti di forma allungata per 6 elementi, per la predisposizione di kit pronti all'uso per il rilevamento quantitativo e simultaneo di differenti marker mediante competizione tra 2 fasi solide. La microstrip (31) a 2 pozzetti allungati per 6 elementi ha dimensione di una microstrip standard a 12 pozzetti; ogni pozzetto allungato (30) è idoneo ad accogliere 6 elementi (32) del dispositivo (33). Figure 3 shows an example of an elongated 2-well microstrip for 6 elements, for the preparation of ready-to-use kits for the quantitative and simultaneous detection of different markers by competition between 2 solid phases. The 6-element elongated 2-well microstrip (31) has the size of a standard 12-well microstrip; each elongated well (30) is suitable for accommodating 6 elements (32) of the device (33).
In Figura 4 è rappresentato un esempio di microstrip a 2 pozzetti di forma allungata per 4 elementi, per la predisposizione di kit pronti all'uso per il rilevamento quantitativo e simultaneo di differenti marker mediante competizione tra 2 fasi solide. La microstrip (41) a 2 pozzetti allungati per 4 elementi ha dimensione di una microstrip standard a 8 pozzetti; ogni pozzetto allungato (40) è idoneo ad accogliere 4 elementi (42) del dispositivo (43). Figure 4 shows an example of an elongated 2-well microstrip for 4 elements, for the preparation of ready-to-use kits for the quantitative and simultaneous detection of different markers by competition between 2 solid phases. The elongated 2-well microstrip (41) for 4 elements has the size of a standard 8-well microstrip; each elongated well (40) is suitable for accommodating 4 elements (42) of the device (43).
In Figura 5 è rappresentato un esempio di micropiastra a 24 pozzetti di forma allungata per 4 elementi, per la predisposizione di kit pronti all'uso per diagnosi rapida di tubercolosi, basata sul rilevamento quantitativo e simultaneo di differenti marker linfocitari mediante competizione tra 2 fasi solide. La micropiastra (51) a 24 pozzetti allungati ha dimensione di una micropiastra standard a 96 pozzetti; ogni pozzetto allungato (50) è idoneo ad accogliere 4 elementi (52) del dispositivo (53). Figure 5 shows an example of an elongated 24-well microplate for 4 elements, for the preparation of ready-to-use kits for rapid diagnosis of tuberculosis, based on the quantitative and simultaneous detection of different lymphocyte markers by competition between 2 solid phases . The elongated 24-well microplate (51) has the size of a standard 96-well microplate; each elongated well (50) is suitable for accommodating 4 elements (52) of the device (53).
In Figura 6 è rappresentato un esempio di micropiastra a 32 pozzetti di forma allungata per 3 elementi (62), per la predisposizione di kit pronti all'uso per il rilevamento quantitativo e simultaneo di differenti marker mediante competizione tra 2 fasi solide. La micropiastra (61) a 32 pozzetti allungati ha dimensione di una micropiastra standard a 96 pozzetti; ogni pozzetto allungato (60) è idoneo ad accogliere 3 elementi (62) del dispositivo (63). Figure 6 shows an example of an elongated 32-well microplate for 3 elements (62), for the preparation of ready-to-use kits for the quantitative and simultaneous detection of different markers by competition between 2 solid phases. The 32-well elongated microplate (61) has the size of a standard 96-well microplate; each elongated well (60) is suitable to accommodate 3 elements (62) of the device (63).
Claims (9)
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000012A ITCS20110012A1 (en) | 2011-04-21 | 2011-04-21 | ANALYTICAL COMPETITION METHOD BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT CELLULAR OR MOLECULAR MARKERS, DEVICE CONSTITUTED BY MICROPLATE OR MICROSTRIP WITH EXTENDED SHAPES FOR THE EXECUTION OF SUCH METHOD AND RELAT. |
| EP12726186.5A EP2699908A1 (en) | 2011-04-21 | 2012-04-23 | Device, method and kit for the detection of different markers in different cellular or molecular types and their quantification |
| RU2013150683/15A RU2013150683A (en) | 2011-04-21 | 2012-04-23 | DEVICE, METHOD AND KIT FOR IDENTIFYING DIFFERENT MARKERS IN DIFFERENT CELL OR MOLECULAR SAMPLES AND THEIR QUANTITATIVE ASSESSMENT |
| PCT/IB2012/052021 WO2012143912A1 (en) | 2011-04-21 | 2012-04-23 | Device, method and kit for the detection of different markers in different cellular or molecular types and their quantification |
| US14/058,946 US20140113316A1 (en) | 2011-04-21 | 2013-10-21 | Device, method and kit for the detection of different markers in different cellular or molecular types and their quantifications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000012A ITCS20110012A1 (en) | 2011-04-21 | 2011-04-21 | ANALYTICAL COMPETITION METHOD BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT CELLULAR OR MOLECULAR MARKERS, DEVICE CONSTITUTED BY MICROPLATE OR MICROSTRIP WITH EXTENDED SHAPES FOR THE EXECUTION OF SUCH METHOD AND RELAT. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITCS20110012A1 true ITCS20110012A1 (en) | 2012-10-22 |
Family
ID=44554259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000012A ITCS20110012A1 (en) | 2011-04-21 | 2011-04-21 | ANALYTICAL COMPETITION METHOD BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT CELLULAR OR MOLECULAR MARKERS, DEVICE CONSTITUTED BY MICROPLATE OR MICROSTRIP WITH EXTENDED SHAPES FOR THE EXECUTION OF SUCH METHOD AND RELAT. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| IT (1) | ITCS20110012A1 (en) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6018763A (en) * | 1983-07-13 | 1985-01-30 | Morinaga & Co Ltd | Immunological measurement |
| EP0154687A2 (en) * | 1982-03-03 | 1985-09-18 | Becton Dickinson and Company | Carrier plate and screening assembly for immunoassay procedures |
| DE4120139A1 (en) * | 1991-06-19 | 1992-12-24 | Bundesamt Fuer Wehrtechnik U B | Time-saving method for fixed immunoassays in diagnostics - comprises covering pin-surfaces with the substrate to be measured and immersing the pins in plate with complementary cavities |
| WO1996002836A1 (en) * | 1994-07-18 | 1996-02-01 | Pharmacia Biotech Ab | Automatic processing system for use in solid phase biospecific binding and dna sequencing techniques |
| WO2003085401A1 (en) * | 2002-04-11 | 2003-10-16 | Moliseinnovazione Soc. Cons. A R.L. | Device and method to simultaneously detect different antibodies and antigens in clinical alimentary and environmental samples |
| DE10333545A1 (en) * | 2003-07-23 | 2005-04-14 | Hte Ag The High Throughput Experimentation Company | Modular sample holder, to hold and prepare samples for analysis, has a module with sample holders held in a second module in turn held in a third module |
| WO2007039400A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of diagnosis of tuberculosis related immune restoration syndrome (irs) |
| US20070237687A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-11 | Sleeper Gregory D | Fluid retaining assembly and method of using the same |
| DE102008021365A1 (en) * | 2008-04-29 | 2009-01-22 | Siemens Aktiengesellschaft | Method for inserting reagents in microchannels of analyzer, involves providing dispensation unit by which reagents are dispensed, and analyzer, which has microchannels |
| US20100083778A1 (en) * | 2008-10-06 | 2010-04-08 | Dow Global Technologies Inc. | Devices for retaining a nonporous substrate and methods |
-
2011
- 2011-04-21 IT IT000012A patent/ITCS20110012A1/en unknown
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0154687A2 (en) * | 1982-03-03 | 1985-09-18 | Becton Dickinson and Company | Carrier plate and screening assembly for immunoassay procedures |
| JPS6018763A (en) * | 1983-07-13 | 1985-01-30 | Morinaga & Co Ltd | Immunological measurement |
| DE4120139A1 (en) * | 1991-06-19 | 1992-12-24 | Bundesamt Fuer Wehrtechnik U B | Time-saving method for fixed immunoassays in diagnostics - comprises covering pin-surfaces with the substrate to be measured and immersing the pins in plate with complementary cavities |
| WO1996002836A1 (en) * | 1994-07-18 | 1996-02-01 | Pharmacia Biotech Ab | Automatic processing system for use in solid phase biospecific binding and dna sequencing techniques |
| WO2003085401A1 (en) * | 2002-04-11 | 2003-10-16 | Moliseinnovazione Soc. Cons. A R.L. | Device and method to simultaneously detect different antibodies and antigens in clinical alimentary and environmental samples |
| DE10333545A1 (en) * | 2003-07-23 | 2005-04-14 | Hte Ag The High Throughput Experimentation Company | Modular sample holder, to hold and prepare samples for analysis, has a module with sample holders held in a second module in turn held in a third module |
| WO2007039400A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-04-12 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of diagnosis of tuberculosis related immune restoration syndrome (irs) |
| US20070237687A1 (en) * | 2006-04-07 | 2007-10-11 | Sleeper Gregory D | Fluid retaining assembly and method of using the same |
| DE102008021365A1 (en) * | 2008-04-29 | 2009-01-22 | Siemens Aktiengesellschaft | Method for inserting reagents in microchannels of analyzer, involves providing dispensation unit by which reagents are dispensed, and analyzer, which has microchannels |
| US20100083778A1 (en) * | 2008-10-06 | 2010-04-08 | Dow Global Technologies Inc. | Devices for retaining a nonporous substrate and methods |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| DATABASE WPI Week 198511, Derwent World Patents Index; AN 1985-064392 * |
| ERMOLLI M ET AL: "Development of an innovative immunoassay for CP4EPSPS and Cry1AB genetically modified protein detection and quantification", FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS, TAYLOR AND FRANCIS, LONDON, GB, vol. 23, no. 9, 1 September 2006 (2006-09-01), pages 876 - 882, XP008144540, ISSN: 0265-203X, DOI: 10.1080/02652030600699056 * |
| ERMOLLI: "Application of the ELISA Reverse method and device to quantify CP4EPSPS protein in GM RUR Soya", 22 January 2009 (2009-01-22), XP002662216, Retrieved from the Internet <URL:http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/documents/Ermolli%20et%20al.%20Budapest%2011-14.06.06.pdf> [retrieved on 20111023] * |
| ERMOLLI: "Implementation and optimization of the ELISA Reverse method and device", 27 April 2010 (2010-04-27), XP002662215, Retrieved from the Internet <URL:http://gmoglobalconference.jrc.ec.europa.eu/2008/Posters/T.2.23%20ER%20finale.pdf> [retrieved on 20111023] * |
| ERMOLLI: "Protein based methods in GMO detection and quantification in food", 22 January 2009 (2009-01-22), XP002662214, Retrieved from the Internet <URL:http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/documents/Ermolli%20et%20al.%20Praga.pdf> [retrieved on 20111023] * |
| PROSPERO: "ELISA Reverse m&d for multiplex detection and quantification of target proteins in food analyses", 22 January 2009 (2009-01-22), XP002662213, Retrieved from the Internet <URL:http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/documents/Prospero%20-Teramo%20.pdf> [retrieved on 20111023] * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020233741B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US10379121B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US20120308444A1 (en) | Lateral Flow Immunoassay for Detecting Cardiac Troponin I and Myoglobin | |
| US10473655B2 (en) | Immunoassay utilizing trapping conjugate | |
| US20130196311A1 (en) | Method and Device for Combined Detection of Viral and Bacterial Infections | |
| Rosypal et al. | Evaluation of a novel dried blood spot collection device (HemaSpot™) to test blood samples collected from dogs for antibodies to Leishmania infantum | |
| CN204989196U (en) | Qualitative test paper strip of immunity chromatography is united to six antinuclear antibodiess | |
| Lei et al. | Application of an immunomagnetic bead ELISA based on IgY for detection of circulating antigen in urine of mice infected with Schistosoma japonicum | |
| Wanke et al. | Preliminary study of an immunochromatography test for serological diagnosis of canine brucellosis | |
| RU2532352C2 (en) | Method of carrying out immunochromatographic analysis for serodiagnostics | |
| Sato | Laboratorial diagnosis of syphilis | |
| ITCS20110012A1 (en) | ANALYTICAL COMPETITION METHOD BETWEEN 2 SOLID PHASES FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION OF DIFFERENT CELLULAR OR MOLECULAR MARKERS, DEVICE CONSTITUTED BY MICROPLATE OR MICROSTRIP WITH EXTENDED SHAPES FOR THE EXECUTION OF SUCH METHOD AND RELAT. | |
| Bai | Laboratory diagnosis of rickettsial infections | |
| ITCS20120019A1 (en) | DEVICE, METHOD AND KIT FOR DETECTING DIFFERENT MARKERS IN DIFFERENT CELL OR MOLECULAR TYPES AND THEIR QUANTIFICATION | |
| US20140113316A1 (en) | Device, method and kit for the detection of different markers in different cellular or molecular types and their quantifications | |
| Gupta et al. | An overview of diagnostic evaluation of parasitic diseases of dogs and cats | |
| JP2010286375A (en) | Marker, method and kit for diagnosing sensibility to severe drug eruption | |
| KR20240019074A (en) | Testing method for fecal samples and immunochromatography test specimens therefor | |
| NL2015553B1 (en) | A method for detecting a marker for active tuberculosis. | |
| CN201673153U (en) | Preprocessing lateral chromatographic detection assembly | |
| Bishor et al. | Lateral flow assays in veterinary diagnosis. | |
| TH106073B (en) | ELISA analysis test for the detection of VEGF | |
| JP2009288065A (en) | Detection method of shigatoxin2e and antibody to shigatoxin2e |