ITBO20090554A1 - Metodo per individuare la predisposizione al carcinoma della prostata. - Google Patents
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Description
D E S C R I Z I O N E
"Metodo per individuare la predisposizione al carcinoma della prostata."
La presente invenzione è relativa ad un metodo per individuare la predisposizione al carcinoma della prostata.
Il carcinoma alla prostata è un problema primario di salute pubblica, la cui importanza è in preoccupante aumento in quanto nel mondo ne sono affetti oltre 500 mila uomini e recenti stime indicano che entro il 2015 sarà la neoplasia più frequente nella popolazione maschile.
Le cause della malattia restano ancora misconosciute, anche se esiste una predisposizione genetica ereditaria. E<'>fondamentale quindi scoprirlo, effettuando una diagnosi precoce, prima che compaia una sintomatologia già indice di malattia.
E’ noto che in molti casi di tumore alla prostata sono presenti mutazioni a carico del gene “RNASEL”, che ha una funzione difensiva contro i virus.
Scopo della presente invenzione è fornire un metodo per individuare la predisposizione al carcinoma della prostata mediante un esame genetico semplice, veloce e indolore in grado di individuare le persone ad alto rischio di tumore.
Secondo la presente invenzione viene fornito un metodo per individuare la predisposizione al carcinoma della prostata secondo quanto licitato nelle rivendicazioni allegate.
La presente invenzione verrà ora descritta esponendone un esempio di attuazione non limitativo.
Le quantità delle sostanze prese in considerazione nella descrizione che segue vengono indicate al solo scopo di chiarirne le proporzioni reciproche, che sono da intendere come indicative.
Per l’attuazione del metodo secondo la presente invenzione si prelevano circa 10 mi di saliva della persona che deve essere sottoposta al test, si lascia decantare il soluto (costituito prevalentemente da cellule dell’epitelio e linfociti), si scarta il solvente costituito da acqua, sali minerali, parte di enzimi e batteri. Il soluto viene successivamente centrifugato in provetta per dna (eppendorf) a 6500 giri per 10 minuti .
Si scarta quindi il solvente, si aggiunge acqua distillata sterile e si ricentrifuga; questa operazione viene preferibilmente effettuata due volte.
Il sedimento viene poi trattato mediante un KIT di estrazione Promega con resina magnetica a base di atomi per estrarre il DNA. Questo tipo di kit è di per sé noto e si basa sul principio chimico fisico del DNA e della sua polarizzazione, avendo cariche positive e negative. Infatti le cariche negative vengono agganciate dagli ioni Fe 3+ e trattenute da un sistema magnetico che calamita gli atomi di ferro agganciati a loro volta al DNA.
Procedimento di estrazione:
Si prelevano 200 μl di campione (sedimento trattato) trasferita in una eppendorf da 2 mi.
si aggiungono 500 μl di tampone di lisi A per lisi cellule e 5 μl di RNase. Si chiude la provetta e si agita vigorosamente.
Si aggiungono 250 μl di tampone di lisi B e si agita per 10-15 secondi.
Si deve quindi incubare il materiale per 10 minuti a temperatura ambiente.
Bisogna poi aggiungere 750 μl di soluzione precipitante e quindi agitare vigorosamente.
Centrifugare per 10 minuti in una microcentrifuga ad alta velocità (13000xg)
Trasferire il sumatante ( fase liquida) in una eppendorf nuova.
Mescolare vigorosamente una bottiglia di Magnesil PMPS per 15 /30 secondi. Assicurandosi che sia ben sciolto, aggiungere 50.0 μΐ di soluzione di Magnesilal sumatante.
Agitare vigorosamente l' eppendorf e prendere nota del volume del liquido nella provetta.
Aggiungere 0.8 volumi di isopropanolo.
Capovolgere la provetta 10-15 volte per mescolare.
Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (22-25°) agitando di tanto in tanto.
Lavare la superficie interna della provetta cosi come le particelle. Inserire la provetta nel porta provette magnetico e lasciarla per 1 minuto.
Lasciare la provetta nel basamento del porta provette, eliminare la fase liquida con una pipetta.
Levare la provetta dall’alloggiamento, aggiungere 250 μl di tampone di lisi B, e capovolgerla 2-3 volte per agitarla.
Rimettere la provetta nel porta provette magnetico e lasciare che le particelle si raccolgono al fondo per 1 minuto.
Rimuovere il liquido.
Risospendere (riportare in soluzione) il campione in 1 mi di etanolo al 70% e rimettere la provetta nel portaprovette magnetico per 1 minuto. Eliminare la parte liquida con pipetta.
Ripetere questa operazione di lavaggio con etanolo al 70% per tre volte.
Asciugare il campione a temperatura ambiente per 15-30 minuti (oppure a 65°C per 10 minuti).
Il tempo necessario all’asciugatura può essere aumentato qualora il campione si presenti ancora umido. Non deve esserci nessuna traccia di etanolo.
Aggiungere 100 μl di campione, agitare ed incubare a 65°C per 5 minuti.
Inserire quindi la provetta nel porta provette magnetico per 1 minuto. Raccogliere il campione e trasferirlo in una nuova provetta. Ottenuto il DNA, si procede all’ identificazione della mutazione puntiforme del gene RNASEL.
I richiedenti hanno identificato due mutazioni particolarmente significative nella razza caucasica: sono gli snp’s (sequenze di nucleotidi) R462Q- D541E.
L’identificazione avviene mediante tecnica di PCR rea] time, utilizzando preferibilmente uno strumento che amplifica ed identifica la mutazione genetica mediante un sistema a fluorescenza, commercialmente noto come 7300 real time PCR systems.
Si riportano ora delle brevi note relative al principio del metodo PCR.
La PCR permette di simulare la replicazione generazionale di DNA per le sequenze geniche scelte.
Come il processo di replicazione naturale, il processo PCR crea copie multiple della sequenza scelta.
Un ciclo PCR è composto da denaturazione, ibridazione e estensione.
Questo processo ha luogo nel thermal cycler, uno strumento che controlla automaticamente ed alterna le temperature per periodi di tempo programmati e per il numero di cicli PCR adeguati.
Per permettere la replicazione del DNA nel processo di amplificazione è necessario aggiungere alla miscela di reazione il DNA bersaglio, una DNA polimerasi, i primer, i dNTP, i sali e i tamponi.
Il principio della reai time PCR, si basa sulla rilevazione e quantificazione di un segnale fluorescente durante amplificazione PCR.
La quantità di fluorescenza emessa è proporzionale alla quantità di prodotto della PCR e permette il monitoraggio dell’amplificazione. La fluorescenza viene misurata durante ogni ciclo di amplificazione. La rilevazione ciclo per ciclo del prodotto di PCR accumulato è possibile combinando il ciclo termico. La rilevazione della fluorescenza e l’analisi software avvengono su un unico strumento. Tutti i sistemi real time si basano sulla rilevazione e quantificazione di un reporter fluorescente che produce un segnale che aumenta in modo direttamente proporzionale alia quantità di prodotto PCR della reazione.
In questo caso la determinazione dei polimorfismi si basa con Taqman.
Nel corso dell’ibridazione, prima la sonda di idrolisi bersaglio specifica e poi i primers ibridizzano specificamente con le sequenze complementari del filamento di DNA bersaglio.
La sonda di idrolisi porta due marcatori fluorescenti: un marcatore giallo reporter ed un marcatore blu che è il quencher.
Quando la sonda è intatta R e Q sono molto vicini ed il segnale è smorzato.
La DNA polimerasi estende il primer e subito dopo entrerà in contatto con la sonda.
Siccome la sonda non può essere estesa, è digerita dalla polimerasi. La polimerasi utilizza la sua attività 5’ nucleasica per digerire la sonda marcata in piccoli frammenti separando il reporter del quencher.
La separazione delle due molecole interrompe il trasferimento di energia di risonanza fluorescente, eliminando quindi lo spegnimento del reporter.
In seguito all’eccitazione il reporter emetterà ora un segnale fluorescente.
Le due mutazioni puntiformi R462Q e la D541E sono genotipizzate usando una 5’ nucleare assay con taqman MGB probes.
Primers e Probe sono disegnati con il Assay-by-design Service dell’ Applied biosystems.
La preparazione del campione per la lettura su PCR avviene nel seguente modo.
Si prepara una Mix di campione formata da:
TAQ MAN 12.5 μΐ
Primers 1.25 μΐ
Acqua 6.25 μΐ
Campione 5.0 μΐ 1
Totale 25 μΐ
Si inseriscono quindi all<5>interno della PCR le microprovette contenente la mix campione.
Si imposta il programma PCR.
Nel corso della sperimentazione è stata usata una reai time 7300 dell’Applyed Byosistems.
Le condizioni di PCR sono:
1° step
2° step
40 cicli a 92°C x 15”
60° x 1 ’
Nel grafico visualizzato dallo strumento si potranno osservare le curve dei rispettivi SNP’s:
Mutato omozigote
Mutato eterozigote
Negativo WT
con conseguente identificazione dell’eventuale mutazione puntiforme R462Q o D541E del gene RNASEL.
Claims (2)
- R I V E N D I C A Z I O N I 1 ) Metodo per individuare la predisposizione al carcinoma della prostata, caratterizzato dal fatto di comprendere le fasi di: - prelevare una quantità determinata di saliva di una persona che deve essere sottoposta al test; - lasciare decantare il soluto (costituito prevalentemente da cellule dell’epitelio e linfociti); - scartare il solvente; - centrifugare il soluto in provetta per dna (per esempio Eppendorf); - trattare il sedimento mediante un KIT di estrazione per estrarre il DNA; - procedere all’ identificazione della mutazione puntiforme del gene RNASEL con conseguente identificazione dell’eventuale mutazione puntiforme R462Q o D541E del gene RNASEL stesso.
- 2) Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che il KIT di estrazione è di tipo Promega con resina magnetica a base di atomi, la cui utilizzazione viene attuata mettendo in atto le seguenti fasi: - 200 μl di campione (sedimento trattato) vengono trasferiti in una eppendorf da 2 mi: - vengono aggiunti 500 pi di tampone di lisi A per lisi cellule e 5 μΐ di Rnase, con successiva agitazione del materiale; - vengono aggiunti 250 μl di tampone di lisi B, con successiva agitazione del materiale; - si incuba il materiale; - vengono aggiunti 750 μl di soluzione precipitante, con successiva agitazione del materiale; - si centrifuga il materiale; - si trasferisce il surnatante ( fase liquida) in una eppendorf nuova; - si mescola vigorosamente una bottiglia di Magnesil PMPS e si aggiungono 50,0 μΐ di soluzione di Magnesilal surnatante al materiale, con successiva agitazione; - si aggiungono 0.8 volumi di isopropano lo, con successiva agitazione del materiale; - si incuba il materiale; - si elimina la fase liquida dal materiale; - si aggiungono 250 μl di tampone di lisi B, con successiva agitazione del materiale; - si elimina la fase liquida dal materiale; - si risospende il campione in 1 ml di etanolo al 70% - si eliminare la fase liquida dal materiale; - si ripetere l’operazione di lavaggio con etanolo al 70% per tre volte; - si asciugare il materiale in maniera da eliminare qualsiasi traccia di etanolo; - si inseriscono in una provetta 100 μl di materiale, lo si agita e lo si incuba, 3) Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che l’identificazione delle mutazioni puntiformi del gene RNASEL viene effettuata mediante tecnica di PCR real time, utilizzando uno strumento che amplifica ed identifica la mutazione genetica mediante un sistema a fluorescenza. 4) Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che lo strumento utilizzato è ad esempio del tipo commercialmente noto come 7300 real time PCR Systems, nel quale la replicazione del DNA nel processo di amplificazione avviene a seguito di aggiunta alla miscela di reazione di DNA bersaglio, di una DNA polimerasi, di primer, di dNTP, di sali e di tamponi, avvenendo una rilevazione e quantificazione di un segnale fluorescente durante l’amplificazione PCR. 5) Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che la preparazione del campione per la lettura su PCR avviene nel seguente modo: - si prepara una mix di campione fonnata da: TAQ MAN 12.5 μl Primers 1 .25 μl Acqua 6.25 μl Campione 5.0 μl l - si inseriscono quindi all’interno della PCR le microprovette contenente la mix di campione; - si imposta il programma PCR. 6) Metodo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto di prevedere l’uso di una reai time 7300 dell’Applyed Byosistems. 7) Metodo secondo la rivendicazione 5 o 6, caratterizzato dal fatto che Le condizioni di PCR sono: 95°C x 10’ tep cicli a 92°Cx 15” 60° x 1
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| ROEKMAN A ET AL: "Germline alternations of the RNASEL gene, a candidate HPC1 gene at lq25, in patients and families with prostate cancer", AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, AMERICAN SOCIETY OF HUMAN GENETICS, CHICAGO, IL, US, vol. 70, 1 May 2002 (2002-05-01), pages 1299 - 1304, XP002985526, ISSN: 0002-9297 * |
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