ITAR940021A1 - Dispositivo e metodo per la determinazione di analiti intracellulare - Google Patents
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Description
Titolo:
Dispositivo e metodo per la determinazione di analiti intracellulari.
Riassunto
La presente invenzione riguarda un dispositivo e un metodo per lisare il sangue umano o animale o qualsiasi altra sospensione cellulare e per determinare la concentrazione degli analiti contenuti all'interno delle cellule, per esempio l’emoglobina eritrocitaria. Il dispositivo è costituito da una striscia reattiva composta da un supporto rigido, un mezzo di trasferimento del campione, un elemento analitico costituito da una membrana microporosa avente pori di dimensioni mediamente comprese tra 0,02 e 2 μιτι, e comunque inferiori a quelle delle cellule del campione, e da un sistema di generazione del segnale. Il campione migra per capillarità lungo uno o più condotti capillari e un mezzo di trasferimento fino alla membrana microporosa. Tale membrana provoca la lisi cellulare e l’analita intracellulare reagisce specificamente con un sistema chimico di generazione del segnale contenuto nella membrana stessa. I prodotti della reazione vengono infine analizzati quantitativamente mediante un rivelatore ottico.
Stato della tecnica
La quantificazione delle sostanze chimiche presenti nel mezzo intracellulare, e in particolare delie sostanze contenute all’interno di cellule sospese nei liquidi biologici quali il sangue, il liquor cefalorachidiano, le urine, il liquido amniotico, l'espettorato o qualsiasi altro liquido biologico comunemente impiegato come campione per analisi di laboratorio, sta assumendo sempre maggiore importanza nella diagnostica medica e veterinaria. Altre importanti applicazioni sono la valutazione dell’effetto terapeutico e degli effetti collaterali di droghe e farmaci, l'effetto citotossico di inquinanti ambientali e veleni e simili. Allo stato attuale, la determinazione qualitativa e quantitativa di tali sostanze intracellulari richiede normalmente la separazione delle cellule dal liquido in cui si trovano immerse mediante centrifugazione o filtrazione, la loro rottura (lisi) mediante mezzi chimici o meccanici, una o più tappe di separazione dei componenti intracellulari oggetto della analisi e loro determinazione mediante una delle tecniche comunemente impiegate nei laboratori di analisi chimiche e biochimiche. Tali operazioni vengono normalmente condotte in laboratori attrezzati e richiedono l’intervento di personale specializzato. Inoltre, con l'esclusione di alcune tecniche molto sofisticate impiegate nel campo della ricerca scientifica, solo alcuni componenti intracellulari presenti in elevata concentrazione e che mostrano qualche proprietà chimico-fìsica facilmente misurabile, possono essere attualmente analizzati senza ricorrere ad una o più delle fasi descritte. In ogni caso, la analisi dei componenti chimici o biochimici intracellulari richiede tempi lunghi, variabili da alcuni minuti a qualche giorno dal momento del prelievo del campione.
Uno dei componenti intracellulari più frequentemente dosati nei laboratori di analisi chimico-cliniche è la emoglobina contenuta all’interno degli eritrociti. Tale determinazione riveste particolare importanza per la diagnosi delle varie forme di anemia e di altre patologie ematologiche, nonché per la analisi preliminare del sangue di potenziali donatori. I metodi comunemente usati per questa analisi impiegano un reattivo che provoca la lisi eritrocitaria e converte l’emoglobina in un derivato stabile, quale la cian-metemoglobina, che viene determinato quantitativamente mediante fotometria di assorbimento molecolare.
Altri componenti intracellulari presenti negli eritrociti o in altri tipi cellulari il cui dosaggio riveste interesse medico o veterinario sono la Met-emoglobina, le emoglobine glicosilate e in particolare la HbA1c, particolarmente importante nella valutazione del controllo metabolico del paziente diabetico, le varie emoglobine patologiche, l’acido ascorbico, i coenzimi piridinici (NADH e NADPH), gli enzimi intracellulari e in particolare la glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH), ΑΤΡ, l’ADP, il 3’,5’-AMP ciclico, il glutatione, il fosfato inorganico, ecc.
Oltre alle difficoltà di ordine metodologico di cui sopra, occorre considerare che molti di questi componenti intracellulari, in particolare gli enzimi e le sostanze facilmente ossidabili, vanno facilmente e rapidamente incontro a denaturazione dopo che la cellula è stata disintegrata, per cui la rapidità del dosaggio, oltre che rappresentare un notevole vantaggio di ordine pratico, è sovente una condizione necessaria per ottenere risultati accurati e significativi.
In considerazione di quanto detto, una semplificazione ed una maggiore celerità dei dosaggi dei componenti intracellulari, oltre alla possibilità di una effettuazione accurata di tali determinazioni da parte di personale non qualificato, è altamente desiderabile.
Sommario della presente invenzione
La presente invenzione consiste in un sistema originale per la determinazione rapida degli analiti intracellulari a scopo diagnostico mediante l'impiego di una striscia reattiva . Il sistema consente la determinazione quantitativa di sostanze contenute all'interno delle cellule, tipicamente della emoglobina eritrocitaria, in tempi rapidi e con elevata accuratezza. Un piccolo volume del campione, per esempio sangue intero ottenuto mediante prelievo venoso o digitopuntura, viene applicato su un supporto rigido che, mediante uno o più capillari, lo trasferisce ad un mezzo di trasferimento del campione, costituito da una matrice macroporosa idrofila. Quest'ultimo distribuisce il campione sull’elemento analitico, costituito da una membrana microporosa idrofila e da un sistema di generazione del segnale, cioè un sistema chimico di rivelazione dell’analita. L'elemento analitico causa la lisi delle cellule sfruttando l'elevato effetto idrodinamico causato dalla membrana microporosa sulla componente liquida della sospensione cellulare. L’analita intracellulare così liberato reagisce con il sistema di generazione del segnale e dà origine a un prodotto di reazione facilmente rivelabile per via fotometrica. Tipicamente, il prodotto della reazione modifica la reflettanza della superficie della membrana in determinate regioni della radiazione elettromagnetica visibile, infrarossa o ultravioletta. L’entità di questo cambiamento può essere misurata mediante un reflettometro ed è correlata alla concentrazione dell’analita nel campione. Alternativamente il prodotto della reazione chimica può essere rivelato per via fluorimetrica o luminometrica.
La presente invenzione è destinata alla analisi delle sostanze intracellulari quali l’emoglobina, la Met-emoglobina, le emoglobine glicosilate e in particolare la HbA1c, le emoglobine patologiche, l’acido ascorbico, i coenzimi piridinici (NADH e NADPH), le proteine intracellulari, gli enzimi intracellulari e in particolare la glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH), ΑΤΡ, l’ADP, il 3’, 5’-AMP ciclico, il glutatione, il fosfato inorganico, ecc.
Per una miglior comprensione della presente invenzione si rimanda alla descrizione dettagliata seguente e ai disegni relativi.
Breve descrizione dei disegni
La Fig. 1 mostra una visione prospettica della configurazione preferita della striscia reattiva.
La Fig. 2 è una visione laterale in sezione longitudinale della configurazione preferita della striscia reattiva e mostra la disposizione del mezzo di trasferimento e dell’elemento analitico nel supporto rigido.
La Fig. 3 è la visione prospettica di una seconda configurazione preferita della striscia reattiva
La Fig. 4 è una visione laterale in sezione longitudinale della configurazione mostrata in Fig. 3
La Fig. 5 è una visione dall'alto della parte del supporto rigido che ha la funzione di ricezione del campione, in cui sono mostrati i condotti capillari in una terza configurazione preferita.
La Fig. 6 corrisponde alla sezione trasversale della Fig. 5 e mostra i rapporti topologici tra il supporto rigido, un condotto capillare, il mezzo di trasferimento e l’elemento analitico.
La Fig. 7 è una visione dall’alto della parte del supporto rigido che ha la funzione di ricezione del campione, in cui sono mostrati i condotti capillari in una quarta configurazione preferita.
La Fig. 8 corrisponde alla sezione trasversale della Fig. 7 e mostra i rapporti topologici tra il supporto rigido, un condotto capillare, il mezzo di trasferimento e l’elemento analitico.
La Fig. 9 mostra in sezione la configurazione preferita della sede del supporto rigido che alloggia il mezzo di trasferimento e l'elemento analitico
La Fig. 10 è una visone esplosa della Fig. 9 e mostra la sagoma della sede e la disposizione del mezzo di trasferimento e dell’elemento analitico.
La Fig. 11 mostra lo schema a blocchi del dispositivo di lettura
Descrizione dettagliata della presente invenzione
Il supporto rigido.
Il supporto rigido (1) è uno degtli elementi della striscia reattiva ed ha lo scopo di accogliere il campione, trasferirlo per capillarità all’elemento analitico e di consentire il corretto posizionamento dell’elemento analitico rispetto al dispositivo di lettura. Il supporto (1) è costituito da resine naturali o sintetiche quali nylon, policarbonato, polimetacrilato, polistirene, poliuretano, ABS, polivinilcloruro, celluloide, ecc. o vetro, metallo o da qualsiasi altro materiale da cui esso possa essere ottenuto mediante la tecnica delio stampaggio o altra tecnica di produzione industriale.
Le fig. 1 e 2 mostrano una configurazione preferita del supporto (1). In questa configurazione, il supporto (1) presenta un rilievo (2) dove avviene (a deposizione del campione (8). La superficie superiore di detta zona di deposizione del campione (2) presenta due o più, preferibilmente 12, canali o condotti capillari (3) di sezione circolare, quadrata o di altra forma, che hanno la funzione di convogliare il campione verso il mezzo di trasferimento (6). Detti canali capillari (3) hanno preferibilmente sezione rettangolare di larghezza variabile da 0,05 a 1 mm, preferibilmente da 0,15 a 0,3 mm e altezza variabile da 0,1 a 3 mm, preferibilmente da 0,3 a 1 mm. In corrispondenza della estremità dei canali capillari rivolta verso il centro della zona di deposizione (2), il campione incontra il mezzo di trasferimento (6), che per un maggiore effetto capillare aspira il campione dai canati capillari e lo trasferisce al sottostante elemento analitico (7). In questa configurazione preferita la superficie superiore del supporto rigido (1) presenta, in prossimità della estremità opposta a quella in cui avviene la deposizione del campione, rilievi di forma prismatica o di altra forma (4), in numero di 1 o più, preferibilmente tre, che hanno lo scopo di facilitare l'inserimento e la rimozione della striscia reattiva dal dispositivo di lettura. In una diversa configurazione preferita (Fig. 3 e 4) il supporto (1) presenta un unico canale o condotto capillare (3), di sezione circolare, quadrata o di altra forma, preferibilmente di sezione rettangolare di larghezza variabile da 0,05 a 1 mm, preferibilmente da 0,15 a 0,3 mm, altezza variabile da 0,1 a 6 mm, preferibilmente da 0,3 a 2 mm e lunghezza variabile da 5 a 50 mm, preferibilmente tra 10 e 15 mm. Detto canale capillare serve per trasferire il campione (8) dal suo punto di applicazione (2), situato ad una estremità appuntita del supporto rigido (1), fino al mezzo di trasferimento (6) e da questo all’elemento analitico (7).
In una diversa configurazione preferita, il supporto rigido (1) ha la forma illustrata in Fig. 1 e i condotti capillari (3) presenti nella zona di deposizione dei campione (2) sono disposti come mostrato nelle Fig. 5 e 6. In questa configurazione, i canali capillari sono in comunicazione con il mezzo di trasferimento (6) attraverso fessure capillari (3A) ricavate su un setto, facente parte del supporto rigido (1) che separa la parte centrale della zona di deposizione del campione (2) dalla sede del mezzo di trasferimento e dell’elemento analitico (5). Dette fessure capillari possono essere in numero variabile e avere forma e dimensioni variabili, sono in comunicazione con i canali capillari (3) e hanno la funzione di distribuire il campione in modo omogeneo sul mezzo di trasferimento (6).
In una diversa configurazione preferita, il supporto rigido (1) ha la forma illustrata in Fig. 1 e i condotti capillari (3) presenti nella zona di deposizione del campione (2) sono disposti come mostrato nelle Fig. 7 e 8. In questa configurazione, i canali capillari sono in diretta comunicazione con il mezzo di trasferimento (6) attraverso la loro base, che è aperta nella parte centrale della zona di deposizione del campione (2). Il campione, applicato nella zona di deposizione (2), riempie uno o più canali capillari (3) e giunge in contatto con il mezzo di trasferimento (6) direttamente attraverso le aperture presenti sulla base della parte centrale dei capillari (3). Dette aperture possono avere forma e dimensioni variabili e hanno la funzione di distribuire il campione in modo omogeneo sul mezzo di trasferimento (6).
Il mezzo di trasferimento
l( mezzo di trasferimento (6) è uno strato di materiale macroporoso, tessuto o non tessuto, che ha lo scopo trasferire il campione dal o dai condotti capillari (3) presenti nel supporto rigido (1) alla superficie superiore dell’elemento analitico (7). Funzione primaria del mezzo di trasferimento è anche la diffusione del campione al suo interno in modo che il trasferimento del campione all’elemento analitico (7) awenga uniformemente su tutta la superficie di quest’ultimo.
Il mezzo di trasferimento (6) deve inoltre presentare caratteristiche di porosità e di idrofilicità tali da non ostacolare il passaggio degli elementi cellulari presenti nel campione.
Sono utili a questo scopo numerosi materiali, quali tessuti di fibre naturali e sintetiche o non-tessuti di fibre naturali o sintetiche o membrane macroporose di materiali sintetici o naturali. Per esempio possono essere usati a questo scopo materiali fibrosi macroporosi a base di cellulosa, seta, poliestere, poliammide, lana di vetro, poliestere, polipropilene, ecc. Il mezzo di trasferimento (6) è costituito da uno strato sottile, di spessore compreso tra 0,05 e 3 mm, preferibilmente tra 0,2 e 0,8 mm, di detti materiali macroporosi in cui la porosità media è maggiore o molto maggiore delle dimensioni medie delle cellule presenti in sospensione nel campione. Preferibilmente, il mezzo di trasferimento (6) è costituito da un materiale fibroso macroporoso non tessuto a base di cellulosa, seta, poliestere, poliammide, lana di vetro, polipropilene, ecc., la cui porosità media consenta il passaggio, attraverso tutto il suo spessore, delle cellule presenti nel campione. Tipicamente, la porosità media del mezzo di trasferimento (6) è superiore a 2 μm, preferibilmente superiore a 10 μιτι. Esempi di tali materiali preferiti sono i prodotti a base di fibra poliestere denominati Loprosorb e Leucosorb, della Pali Co.
Come mostrato nelle Figg. 9 e 10, il mezzo di trasferimento viene alloggiato in una sede (5), preferìbilmente di forma cilindrica, ricavata sul supporto (1). La faccia superiore del mezzo di trasferimento (6) è perciò rivolta verso il campione che proviene dal o dai condotti capillari (3) qui rappresentati da una apertura ricavata nel tetto della sede (5), mentre la faccia opposta si trova in stretto contatto con l’elemento analitico (7). Le singole unità del mezzo di trasferimento (6), ricavate da fogli o da nastri continui del materiale macroporoso, hanno forma e dimensioni variabili, preferibilmente la forma è quella di un dischetto e il diametro è compreso tra 2 e 10 mm, preferìbilmente tra 4 e 7 mm.
Eventualmente, il materiale macroporoso che costituisce il mezzo di trasferimento (6) può essere trattato con agenti tensioattivi allo scopo di rendere più omogenea la distribuzione del campione e di favorire la rottura degli elementi cellulari presenti nel campione. Inoltre, esso potrà contenere, allo stato essiccato, sostanze chimiche atte a prevenire la formazione di aggregati cellulari o, se il campione è sangue umano o animale, a impedirne la coagulazione. Qualora il campione sia una sospensione cellulare contenente tipi differenti di cellule, il mezzo di trasferimento (6) è costituito da materiali macroporosi capaci di trattenere, per impedimento fìsico o mediante interazioni chimiche o chimico-fìsiche specifiche, uno o più tipi cellulari non desiderati, consentendo quindi il passaggio solamente del o dei tipi cellulari contenenti l’analita di interesse.
L’elemento analìtico
L’elemento analitico (7) della striscia reattiva è costituito da una membrana microporosa. Le caratteristiche chimico-fisiche delia membrana microporosa che costituisce l'elemento analitico sono determinanti ai fini del funzionamento del presente metodo e dispositivo. Infatti, la funzione di rottura (lisi) delle cellule presenti in sospensione nel campione viene svolta in maniera completa ed ottimale soltanto se la membrana presenta elevata idrofilicità e se la porosità media della membrana è di dimensioni inferiori a quelle delle cellule contenute nel campione. Tale membrana è perciò formata da materiale microporoso che presenta elevate caratteristiche di idrofilicità e di capillarità e può essere ricavata per fustellatura o per tranciatura da uno dei molti materiali esistenti in commercio. Il materiale di cui è costituita la membrana può essere poliammide, acetato di cellulosa, nitrocellulosa, polivinilidene fluoruro, polisulfone o altro polimero organico microporoso supportato o non supportato, normalmente impiegato per la microfiltrazione di liquidi polari. Preferibilmente l'elemento analitico (7) è costituito da una membrana microporosa semplice o composita formata da polimeri molto idrofili, quali la poliammide e gli esteri della cellulosa e presenta una porosità media compresa tra 0,01 e 2 pm., preferibilmente tra 0,02 e 0,5 pm. Lo spessore della membrana che costituisce l’elemento analitico (7) è compreso tra 0,05 e 1 mm, preferibilmente tra 0,1 e 0,3 mm. Preferibilmente l’elemento analitico (7) è una membrana composita asimmetrica di poliammide supportata, per esempio la membrana Nylon 66 composita 0,2/0,04 pm della Pali Co. Tale membrana presenta una superficie con porosità media di 0,2 pm (superficie 7A), la superficie opposta con porosità media di 0,04 pm (superficie 7B), con spessore medio di 0,15 mm.
In una configurazione preferita della presente invenzione l’elemento analitico (7) ha forma e dimensioni variabili. Preferibilmente la forma è quella di un dischetto di diametro compreso tra 2 e 10 mm, preferibilmente tra 4 e 7 mm (Fig. 9 e 10). L’elemento analitico (7) è alloggiato e fissato in una apposita sede (5) ricavata nel supporto (1), in intimo contatto con il mezzo di trasferimento (6). La sede (5) ha preferibilmente forma cilindrica e alloggia l’elemento analitico (7) al di sotto del mezzo di trasferimento (6), in modo tale che la superficie provvista di pori di dimensioni maggiori (7A) sia in stretto contatto con il mezzo di trasferimento (6) del campione.
Il sistema di generazione del segnale è costituito da una o più sostanze chimiche presenti allo stato essiccato sulla membrana microporosa che costituisce l’elemento analitico (7). Tra tali sostanze sono compresi enzimi, coenzimi, anticorpi, antigeni, substrati, cromogeni, fluorofori, ionofori, tamponi, sali e quanto altro serve per produrre una reazione specifica con l’analita in esame e per generare un prodotto che può essere rivelato per via reflettometrica, fluorimetrica o luminometrica.
Per esempio, nel caso in cui l'analita intracellulare sia l’emoglobina eritrocitaria, la membrana microporosa che costituisce l’elemento analitico (7) viene trattata con una delle soluzioni reattive normalmente impiegate per la determinazione fotometrica quantitativa della emoglobina, per esempio il reattivo di Drabkin (International Commettee for Standardization in Haematology. Recommendations for haematology in human blood. Br. J. Haematol. 13 (Suppl.): 71-75, 1967), la sodio azide (Vanzetti, G. An azidemethemoglobin method for hemoglobin determination in blood. J. Lab. din. Med. 67: 116-126, 1966), il sodio dodecil solfato (Thodorsen L. Automated cyanide-free method for haemoglobin determination on Technicon H1. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50: 643-648, 1990) o altro reattivo noto in letteratura specifico per la determinazione quantitativa dell’emoglobina.
Il campione che viene applicato sulla striscia reattiva migra per capillarità lungo il o i condotti capillari (3) ricavati nello spessore del materiale di cui è formato il supporto (1) e raggiunge il mezzo di trasferimento (6) che si imbibisce del campione e lo distribuisce uniformemente sulla superficie dell'elemento analitico (7) provvista di pori di dimensioni maggiori (7A). Quindi II campione penetra nella membrana microporosa che costituisce l’elemento analitico (7) e gli elementi cellulari presenti in sospensione nel campione subiscono la rottura (lisi) a causa dell’elevato effetto idrodinamico su! campione provocato dalla membrana stessa. La lisi può essere favorita anche dalla eventuale presenza di agenti tensioattivi cationici, anionici o non ionici, quali sodio dodecil solfato, Triton, sali di ammonio quaternario, acidi colici, saponi, ecc., preventivamente essiccati nella membrana o nel mezzo di trasferimento (6).
L’impiego di tali agenti tensioattivi è particolarmente utile per favorire la lisi degli elementi cellulari diversi dagli eritrociti contenuti nel sangue intero. Nel caso in cui il campione da analizzare sia costituito da sangue intero e l’analita da determinare sia contenuto negli eritrociti, l’uso di detti agenti non è necessario in quanto il flusso idrodinamico causato dalla membrana microporosa con le caratteristiche sopra descritte è di per sé sufficiente a provocare la lisi delle cellule rosse.
Una volta avvenuta la lisi il contenuto delie cellule (lisato) diffonde verso la superficie opposta (7B) dell’elemento analitico. Durante la diffusione attraverso lo spessore della membrana microporosa il Usato scioglie le sostanze reattive preventivamente essiccate suiia membrana stessa e un componente (l’analita) del lisato reagisce specificamente con tali sostanze dando luogo alla formazione di un prodotto colorato, fluorescente o luminescente, la cui concentrazione nella superficie 7B può quindi essere determinata per via ref lettometrica, fluorimetrica o luminometrica.
Il dispositivo di lettura.
Il dispositivo di lettura, di cui la Fig. 11 mostra uno schema a blocchi, è costituito da un trasduttore di segnale e da un circuito elettronico provvisto di software per la elaborazione del segnale. Il trasduttore di segnale (10 11) converte il segnale generato sulla superficie 7B dell’elemento analitico (7) in segnale elettrico e presenta una configurazione diversa a seconda che il segnale generato dall'elemento analitico sia di tipo reflettometrico, fluorimetrico o luminometrico. Nella configurazione mostrata in Fig. 11 il segnale generato dall’elemento analitico è di tipo reflettometrico, dovuto alla formazione del prodotto della reazione tra l’analita e il sistema di generazione del segnale. Tale prodotto è in grado di assorbire la radiazione elettromagnetica nel campo del visibile, dell'ultravioletto o dell'infrarosso. La formazione di questo prodotto di reazione altera le caratteristiche di reflettanza della superficie dell'elemento analitico rivolta verso il dispositivo di lettura, in modo tale che la reflettanza di tale superficie ad una particolare lunghezza d’onda è funzione della concentrazione del prodotto della reazione e quindi della concentrazione nel campione dell’analita specifico che ha dato origine al prodotto. Il trasduttore di segnale (10 11) è costituito dalla sorgente luminosa (10) che emette radiazione elettromagnetica di lunghezza d’onda compresa nella regione del visibile, dell’ultravioletto o dell’infrarosso e da un blocco di rivelazione e di riferimento (11). La radiazione emessa dalla sorgente luminosa colpisce la superficie esterna dell’elemento analitico (7B); una parte della radiazione riemessa per diffusione dalla superficie stessa viene raccolta dal blocco di rivelazione e di riferimento (11). Da quest'ultimo blocco escono due segnali, uno destinato al blocco di controllo luminosità (12) e l’altro destinato airamplificatore del segnale (13). Quest’ultimo amplifica il segnale campione in ingresso portandolo da valori di tensione di 0,5-1 mV a valori di 0,5-1 V. Il segnale campione così amplificato viene inviato al blocco comparatore e convertitore tensione/tempo (15). Quest’ultimo riceve dal blocco 14 anche un segnale stabile a onda triangolare che viene utilizzato per generare un segnale digitale proporzionale al segnale campione amplificato. Il segnale campione digitalizzato viene elaborato attraverso il blocco 16, memorizzato sul blocco 17 e inviato sia al display che ad una uscita seriale.
Due innovazioni originali e caratterizzanti della presente invenzione riguardano il blocco di trasduzione del segnale (10+11) del dispositivo di lettura. Una prima innovazione è relativa alla adozione di una doppia o multipla sorgente luminosa, in modo da effettuare la misura della reflettanza in bicromatismo o in multicromatismo. In pratica questo può essere ottenuto, per esempio, usando due o più LED emittenti due o più differenti lunghezze d’onda o uno o più LED bicolori. Per semplicità, ma non a scopo limitativo, d'ora in avanti si parlerà solo di sorgente luminosa doppia e di bicromatismo. Detti L1 e L2 le due lunghezze d’onda emesse da due sorgenti luminose, la lettura reflettometrica può essere eseguita con L1 mentre l'azzeramento può essere effettuato con L2, oppure viceversa, oppure entrambe le operazioni di azzeramento e lettura possono essere effettuati con L1 oppure entrambe con L2. Queste possibilità alternative offrono i seguenti vantaggi:
1) La disponibilità di due differenti lunghezze d'onda consente di effettuare l’azzeramento ad una lunghezza d’onda che non viene assorbita dal prodotto di reazione presente sulla superficie esterna dell’elemento analitico. In tal modo l'azzeramento annulla tutte le componenti aspecifiche della reflettanza, quali la reflettanza intrinseca della superficie esterna dell’elemento analitico, in modo tale che il segnale ottenuto con la successiva lettura reflettometrica sia funzione soltanto della concentrazione dell’analita in esame.
2) E' possibile effettuare la lettura in bicromatismo, in modo da misurare e annullare la componente del segnale di reflettanza totale dovuto a sostanze interferenti presenti nel campione che presentano assorbimento fotometrico differenziale alle due lunghezze d’onda impiegate nella misura bicromatica. Così, qualora sia noto il rapporto tra la reflettanza della sostanza interferente alle due lunghezze d’onda L1 e L2, è possibile in fase di elaborazione del segnale sottrarre dal segnale reflettometrico totale, ottenuto con L1, la componente dovuta al’interferente e misurata con L2 .
3) E' possibile effettuare con lo stesso dispositivo di lettura misure di analiti differenti che danno origine a prodotti di reazione che assorbono radiazioni elettromagnetiche di differenti lunghezze d’onda. E' sufficiente, a questo scopo, utilizzare alternativamente le diverse sorgenti luminose disponibili per effettuare azzeramenti, letture della reflettanza e correzioni in bicromatismo alle lunghezze d'onda specifiche per i differenti analiti.
4) E' possibile rivelare automaticamente il tempo di inizio della reazione di generazione del segnale. Infatti, se L1 è la lunghezza d’onda alla quale il prodotto della reazione generato dall’analita presenta un assorbimento fotometrico specifico e L2 è una lunghezza d’onda alla quale detto prodotto non presenta assorbimento fotometrico, la comparazione tra i segnali prodotti mediante letture successive di reflettanza della superficie esterna dell’elemento analitico, effettuate alternativamente con L1 e L2, e la successiva elaborazione elettronica di detti segnali consentono di riconoscere il momento in cui ha inizio la formazione del prodotto della reazione, sulla base delle variazioni del segnale di reflettanza con L1 , dal momento in cui l’elemento analitico modifica aspecificamente la propria reflettanza in seguito alla sua bagnatura da parte del campione.
Una seconda innovazione riguarda l’adozione, nel blocco di rivelazione e di riferimento, di due fotoriveiatori. Di questi, il primo è il fotorivelatore primario, impiegato per la misurazione della intensità della radiazione elettromagnetica riemessa per diffusione dall’elemento analitico, mentre il secondo riceve una piccola quota della radiazione emessa direttamente dalla sorgente luminosa. Il principale vantaggio di tale configurazione è la possibilità di mantenere la massima costanza, mediante retroazione, della intensità della radiazione emessa dalla sorgente luminosa.
Esempio 1
Nel caso della determinazione della emoglobina umana descritta in questo esempio, il campione è costituito da sangue venoso o capillare, la striscia reattiva ha una delle configurazioni descritte in precedenza, il mezzo di trasferimento è uno strato di materiale macroporoso costituito da fibre di cellulosa e l’elemento analitico (7) è una membrana microporosa di poliammide composita e supportata, per esempio la membrana Nylon 66 0,2/0,04 μm della PALL Co., che presenta porosità media di 0,2 pm su un lato (7A) e di 0,04 pm sull’altro lato (7B). Il mezzo di trasferimento e l’elemento analitico hanno la configurazione descritta nelle Fig. 9 e 10.
Il sistema di generazione del segnale è costituito da una soluzione acquosa di Triton X100 al 0,3 % (peso/volume), K3[Fe(CN)6] al 1 %, (peso/volume), KSCN al 2 % peso/volume) e tampone fosfato 10 mM, pH 7,4. Dopo il trattamento con detta soluzione reattiva, la membrana viene essiccata sotto un flusso di aria calda a 50 °C e mantenuta al riparo della luce e in ambiente con umidità relativa inferiore al 20%. Tale membrana viene quindi usata per ricavare, mediante fustellatura o tranciatura, gli elementi analitici (7) che sono quindi fissati ai supporti delle strisce reattive.
Per la determinazione quantitativa della emoglobina, un piccolo volume del campione (sangue intero venoso o capillare) compreso tra 8 e 50 pL viene applicato sulla zona di deposizione del campione della striscia reattiva. La lettura reflettometrica del test viene effettuata entro 30 “ con il dispositivo di lettura descritto in Fig. 11 , utilizzando due sorgenti luminose: L1 a 556 nm e L2 a 635 nm. L2 viene impiegata per l'azzeramento mentre L1 viene usata per la lettura reflettometrica della superficie 7B dell’elemento analitico. Entro 30 u si forma un derivato stabile delia emoglobina intraeritrocitaria uniformemente distribuito sulla superficie 7B dell'elemento analitico. La reflettanza a 556 nm della superficie 7B dell’elemento analitico raggiunge il valore minimo entro 30 “ dalla applicazione del campione e rimane stabile per almeno altri 60 “. In Tab I sono riportati i risultati e i relativi parametri statistici di una serie di misure di emoglobina totale su sangue intero umano venoso eseguite con il sistema qui descritto.
La risposta analitica del sistema descritto in questo esempio è risultata indipendente dal volume di campione applicato alla striscia reattiva nell’intervallo compreso tra 8 e 50 pL, come mostrato dalla Tab. Il
Esempio 2
Nel caso del dosaggio della giucosio-6-fosfato deidrogenasi (GePDH) descritto in questo esempio, il campione è costituito da sangue venoso o capillare, la striscia reattiva ha una delle configurazoni precedentemente descritte, il mezzo di trasferimento è uno strato di materiale macroporoso costituito da fibre di poliestere, e l’elemento analitico (7) è una membrana di poliammide supportata NT 0,1 delia PALL Co., che presenta una porosità media di 0.1 μm.
Il sistema di generazione del segnale è costituito da una soluzione acquosa di NADP 0,5 mM, glucosio 5 mM, maleinimide 5 mM, MgS04 5 mM, ATP 2 mM, esocinasi 50000 IU/L, diaforesi 10000 IU/L, e tampone Tris 50 mM, pH 7,5. Dopo il trattamento con detta soluzione reattiva, la membrana viene essiccata sotto un flusso di aria calda a 50 °C. Successivamente la membrana viene trattata con una soluzione di N6T (nitro blu tetrazolio) all’1 % (peso in volume) in etanolo al 50 % (voiume/volume). Dopo il trattamento con questa seconda soluzione reattiva, la membrana viene essiccata sotto un flusso di aria calda a 50 °C e mantenuta al riparo della luce e in ambiente con umidità relativa inferiore ai 20%. Tale membrana viene quindi usata per ricavare, mediante fustellatura o tranciatura, gli elementi analitici (7) che quindi sono fissati ai supporti rigidi (1) delle strisce reattive. Per la determinazione quantitativa della G6PDH, un piccolo volume del campione compreso tra 10 e 40 pL (sangue intero venoso o capillare) viene applicato sulla zona di deposizione del campione della striscia reattiva. La lettura reflettometrica del test viene effettuata in bicromatismo entro 120“, con il dispositivo di lettura descritto in Fig. 11, utilizzando due sorgenti luminose: L1 a 635 nm e L2 a 562 nm. L2 viene impiegata per l'azzeramento e per la correzione della interferenza causata dalla emoglobina sul segnale a 635 nm, mentre L1 viene usata per la lettura refletto metrica della superficie inferiore, esterna, dell’elemento analitico, mantenuta a temperatura costante di 37°C. Dal momento di inizio della reazione, corrispondente ad una brusca variazione della reflettanza a 562 nm e rivelato automaticamente dal dispositivo di lettura, vengono eseguite letture alternate con L1 e L2 ogni 5 Il valore della variazione media della reflettanza a 635 nm, corretta per la variazione di reflettanza a 562 nm, viene utilizzato per il calcolo automatico della attività enzimatica della G6PDH. Di seguito sono riportati i parametri statistici risultati da una serie di misure di GePDH su sangue intero umano capillare eseguite con il sistema qui descritto.
* rispetto a: E. Beutler et al., International Commettee for Standardization in Hematology: Recommended Methods for Red Celi Enzyme Analysis, Brit. J. Haematol. 35, 331-340, (1977).
E’ sottinteso che le specifiche e gli esempi sono illustrativi ma non limitativi della presente invenzione e che altre configurazioni dettate dallo spirito e dallo scopo dell'invenzione potranno essere individuati dagli esperti della tecnica.
Claims (14)
- Rivendicazioni 1. Un dispositivo e un metodo per la determinazione quantitativa di analiti intracellulari presenti in un campione biologico, costituito da un supporto rigido (1) in cui sono presenti uno o più canali capillari, un mezzo di trasferimento (6) costituito da un materiale macroporoso con pori di dimensioni superiori a 2 pm, un elemento analitico (7) costituito da una membrana microporosa con pori di dimensioni inferiori a 2 pm e da un dispositivo di lettura. Gli analiti liberati all’esterno delle cellule a causa della loro lisi provocata dalla membrana microporosa possono essere determinati in base alle caratteristiche spettroscopiche loro proprie o tramite reazioni chimiche, enzimatiche o immunochimiche che generino segnali misurabili per via reflettometrica, fluorimetrica o luminometrica.
- 2. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 1, in cui l'analita intracellulare è una qualsiasi sostanza (un substrato, un metabolita, un enzima, una proteina con attività non enzimatica, uno ione inorganico, un antigene, un recettore, un ormone, ecc.) contenuta all’interno delle cellule presenti nel campione.
- 3. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 2 in cui l’analita intracellulare è costituito dalla emoglobina contenuta nel sangue umano o animale, la cui concentrazione nell’elemento analitico può essere determinata mediante una misura di reflettanza della superficie esterna dell’elemento analitico stesso.
- 4. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 3, in cui la lunghezza d’onda impiegata per la misura della reflettanza è compresa tra 500 e 600 nm, preferibilmente tra 540 e 570 nm.
- 5. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 2 in cui l’elemento analitico è una membrana di poliammide microporosa, supportata, composita, che presenta porosità di dimensioni diverse nelle due superfici.
- 6. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 5 in cui la membrana microporosa supportata composita è costituita da due strati di Nylon 66 di differente porosità uniti saldamente l'uno sull'altro, in modo tale che la membrana presenta sulla superficie in contatto con il mezzo di trasferimento pori di dimensioni medie di 0,2 pm e sulla superficie opposta presenta pori di dimensioni medie di 0,04 pm.
- 7. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 3, in cui la membrana è quella descritta nella rivendicazione 6.
- 8. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 7, in cui il sistema per la produzione del segnale è costituito da K3[Fe(CN)6], KSCN, Triton X100 e un idoneo tampone.
- 9. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 1 , in cui il dispositivo di lettura è un reflettometro contenente due o più sorgenti luminose.
- 10. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 1 , in cui il dispositivo di lettura contiene due fotorivelatori, dei quali uno utilizzato per la rivelazione del segnale e l’altro per mantenere costante, mediante retroazione, l’intensità della radiazione emessa dalla sorgente luminosa.
- 11. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 9, in cui le sorgenti luminose sono costituite da LED monocromatici o bicromatici.
- 12. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 11 , in cui due sorgenti luminose sono utilizzate una per effettuare la misura di reflettanza e l’altra per eseguire l’azzeramento fotoelettrico del dispositivo di lettura.
- 13. Un dispositivo e un metodo di cui alla rivendicazione 11, in cui due sorgenti luminose sono utilizzate una per effettuare la misura di reflettanza e l’altra per eseguire la correzione del segnale in modo da ridurre o annullare l’effetto di sostanze interferenti.
- 14. Un dispositivo e un metodo di cui alle rivendicazioni 8 e 12, in cui la lunghezza d’onda usata per effettuare la misura reflettometrica è 556 nm e la lunghezza d'onda usata per eseguire l’azzeramento è 635 nm.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ITAR940021A IT1271386B (it) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | Dispositivo e metodo per la determinazione di analiti intracellulare |
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|---|---|---|---|
| ITAR940021A IT1271386B (it) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | Dispositivo e metodo per la determinazione di analiti intracellulare |
Publications (3)
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| ITAR940021A0 ITAR940021A0 (it) | 1994-11-15 |
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| ITAR940021A IT1271386B (it) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | Dispositivo e metodo per la determinazione di analiti intracellulare |
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| IT (1) | IT1271386B (it) |
-
1994
- 1994-11-15 IT ITAR940021A patent/IT1271386B/it active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| IT1271386B (it) | 1997-05-27 |
| ITAR940021A0 (it) | 1994-11-15 |
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