IT9022176A1

IT9022176A1 - Mutante di bacillus subtilis e procedimento per la produzione di surfattina impiegante tale mutante.

Info

Publication number: IT9022176A1
Application number: IT022176A
Authority: IT
Inventors: Paolo Carrera; Paola Cosmina; Gianni Frascotti
Original assignee: Eniricerche Spa
Priority date: 1990-11-23
Filing date: 1990-11-23
Publication date: 1992-05-23
Also published as: IT1243392B; IT9022176A0

Description

DESCRIZIONE

La presente invenzione riguarda un mutante stabile di Bacillus subtilis capace di produrre la surfattina in rese elevate, un procedimento per la produzione di surfattina impiegante detto ceppo e l'uso della surfattina così ottenuta in problematiche di tipo farmaceutico, energetico ed ambientale.

In questi ultimi anni l'interesse per i biosurfattenti di origine microbica per l'uso come agenti nel recupero assistito degli idrocarburi, stabilizzazione delle emulsioni e, più in generale, in campo energetico ed ambientale, è notevolmente aumentato, in quanto detti prodotti sono biodegradabili e quindi, potenzialmente, meno tossici dei composti sintetici attualmente utilizzati.

Un biosurfattante di particolare interesse, prodotto da Bacillus subtilis, è la surfattina.

Detto composto, caratterizzato da Kakinuma et al. [Agric .Biol.Chem., 3Jk 971-972 (1969); Agric.Biol.Chem. , 23.: 1523-1524 (1969);

Agric.Biol.Chem. , 33^ 973-976 (1969)), è un lipopeptide ciclico formato da un eptapeptide e da una porzione lipidica costituita da una miscela di β-idrossi-acidi grassi con una catena con un numero di atomi di carbonio compreso tra 13 e 15 avente la seguente struttura:

L-Leu - £-OH-C13-15 - L-Glu - L-Leu

D-Leu - L-Asp - L-Val - D-Leu

~La surfattina ha la proprietà di inibire la formazione del coagulo sanguigno e la 3 5'monofosfato diesterasi e di U sare gli eritrociti, gli sferoplasti ed i protoplasti batterici .

Inoltre la surfattina inibisce la reazione fibrinogeno-trombina, rallentando così la formazione della fibrina; tale proprietà rende detta sostanza adatta come principio attivo per la preparazione di composizioni utili come anticoagulanti nella profilassi della trombosi e, in generale, per la prevenzione di malattie come l'infarto del miocardio, l'embolia polmonare, etc.

La surfattina mostra una attività anti-colesterasica, in quanto abbassa il livello del colestorolo nel plasma e nel fegato, una attività fungicida ed una antibiotica.

Detto lipopeptide esplica le sue funzioni batteriostatiche, ad esempio, sulla crescita di Micobatteri anche a basse concentrazioni (5-10 ppm).

Ancora, la surfattina è un potente tensioattivo, riduce infatti la tensione superficiale dell'acqua da 72 mN/M a 27 mN/M ad una concentrazione dello 0,005%.

Per le sue molteplici attività, la surfattina riveste un particolare interesse in quanto trova una vasta applicazione in campo farmaceutico, energetico ed ambientale.

Arima, K. et al. (US 3,687,926 e Biochem. Bioph. Res. Commun., 31:488-494 (1968)) riportano un procedimento per la preparazione della surfattina avente la seguente struttura:

(CH3)2CH (CH2)9CHCH2CO-L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val

- O - L-Leu-D-Leu-L-Asp caratterizzato dall’impiego del ceppo B.subtilis ATCC 21331 o ATCC 21332.

Tale procedimento, tuttavia, presenta gli inconvenienti derivanti dalle basse rese di produzione della surfattina (0,05-0,1 g/litro di prodotto grezzo e 0,04-0,05 g/1 di prodotto purificato) .

Ne consegue che detto procedimento è economicamente poco accettabile da un punto di vista industriale.

Pertanto, sono stati proposti nella tecnica procedimenti per migliorare le rese di produzione della surfattina che si basano, essenzialmente, sull'impiego di particolari terreni di coltura o di mutanti del ceppo B.subtilis ATCC 21332 o di particolari soluzioni tecniche.

Così ad esempio, Cooper D.G. et al., [(1981), Appi. Environ. Microbiol., 42: 408-412)]

descrivono un procedimento per la produzione di surfattina mediante coltura di B.subtilis ATCC 21332 che si basa, tra l'altro, sulla rimozione in continuo della schiuma prodotta durante la fermentazione e nella quale è contenuto circa il 90-99% della surfattina prodotta.

La rimozione della schiuma ha lo scopo di prevenire l’azione inibitrice della surfattina sulla crescita batterica che si manifesta quando la sostanza raggiunge alte concentrazioni.

Operando in tali condizioni, tuttavia, si ottiene una produzione di surfattina pari a 0,7-0,8 g/litro.

Inoltre la rimozione in continuo della schiuma può causare una diminuzione del volume di di lavoro di fermentazione che fuoriesce con la schiuma stessa.

Sheppard J. e Mulligan C., (1987), (Appi. Microbiol. Biotechnol., 7J_: 110-116) descrivono un metodo mediante il quale si ottiene una resa di 0,16 g/ litro coltivando le cellule di B.subtilis in terreno supplementato con un idrolizzato proteico di torba.

Ancora Mulligan, C. et al. [Appi. Microbiol. Biotech., 31: 486-489, (1989)] descrivono un procedimento per migliorare la produzione di surfattina caratterizzato dall'impiego di un mutante del ceppo wild type B.subtilis ATCC 21332.

Gli autori riportano una resa di produzione della surfattina dopo 40 ore pari a 0,562 g/litro (pag. 488, tabella 1) cioè circa 3,4 volte superiore a quella ottenuta coltivando il ceppo wild type nelle stesse condizioni.

Nonostante quindi la gran mole di lavoro svolta, nessuna proposta si è dimostrata sufficientemente economica da permetterne lo sviluppo su scala industriale e questo principalmente per la bassa produttività dei microorganismi finora disponibili .

E' stato ora trovato che è possibile superare gli inconvenienti della tecnica nota mediante un nuovo mutante di B.subtilis capace di produrre la surfattina in rese elevate.

Campioni di tale ceppo mutante sono stati depositati in data 23 Aprile 1990, presso l'American Type Culture Collection dove hanno ricevuto il numero di deposito ATCC 55033.

Pertanto costituisce uno scopo della presente invenzione il ceppo B.subtilis ATCC 55033.

Costituisce inoltre uno scopo della presente invenzione un procedimento per la produzione di surfattina in rese elevate che comprende l’impiego del ceppo B.subtilis ATCC 55033.

Costituisce ancora uno scopo della presente invenzione l'uso della surfattina così ottenuta in campo farmaceutico, energetico ed ambientale.

Ulteriori scopi della presente invenzione appariranno evidenti dalla descrizione e dagli esempi che seguono.

In particolare, il ceppo B.subtilis ATCC 55033 secondo la presente invenzione è caratterizzato da una elevata stabilità genetica (capacità di mantenere stabilmente la mutazione acquisita) e da una elevata resistenza ad alte concentrazioni di surfattina.

Tale ceppo è stato ottenuto mediante mutazione del ceppo wild type B.subtilis ATCC 21332.

A tale scopo possono essere impiegati metodi convenzionali che consistono nell'esporre cellule del ceppo wild type all'azione di agenti mutageni chimici o fisici, nel selezionare i ceppi in cui la produzione di surfattina risulta alterata ed infine nell'isolare quelle colonie in cui la produttività risulta aumentata.

Agenti mutageni chimici possono essere scelti, ad esempio, tra dietil-solfato NMU (nitroso-metiluretano) , NMG (N-metil-N'-nitro-N-nitroso guanidina), mentre quelli fisici tra raggi X, UV (ultra violetti) e raggi gamma in dosi mutageniche.

Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione il ceppo wild type B.subtilis ATCC 21332 è stato mutagenizzato utilizzando NMG in concentrazioni tali da indurre mutazioni nel genoma dei microorganismi.

La selezione dei mutanti capaci di produrre surfattina in rese elevate (mutanti overproduttori ) è stata quindi effettuata mediante analisi della dimensione dell'alone di emolisi che compare intorno alle colonie di B.subtilis cresciute su terreno di coltura quale, ad esempio, TBAB (DIFCO) addizionate con sangue.

E' noto, infatti, che il diametro dell'alone di emolisi è proporzionale alla quantità di surfattina prodotta dalle cellule di B.subtilis (Mulligan, C. e Cooper, D. (1984), J. Ferment. Technol., 62: 158-179).

L'overproduttività del mutante B.subtilis ATCC 55033 così isolato è stata quindi confermata effettuando una fermentazione in beuta del ceppo in questione impiegando come controllo il ceppo wild type.

B.subtilis ATCC 55033 appare particolarmente adatto per la realizzazione di un procedimento di fermentazione per la produzione di surfattina in rese elevate.

L'attuazione di un procedimento secondo la presente invenzione può consistere, ad esempio, nel preparare un inoculo di tale ceppo mutagenizzato in condizioni aerobiche, in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto.

Il mezzo è mantenuto in agitazione ad una temperatura compresa tra 25°e 40°C, preferibilmente da 30° a 37°C, per un periodo di tempo inferiore a 20 ore, preferibilmente da 6 a 10 ore.

Infatti, si è osservato che un inoculo "vecchio" (20 ore) causa una produzione della schiuma difficilmente controllabile al punto che dopo 5 ore la fermentazione deve essere bloccata a causa dell'estensiva perdita del mezzo di coltura che fuoriesce con la schiuma stessa.

Diversamente inoculi "giovani" (6-10 ore) consentono una graduale formazione della schiuma ed una perdita limitata del mezzo di coltura.

Successivamente l'inoculo, in percentuale compresa tra il 5% e il 10% (volume/volume) rispetto al volume di lavoro, è addizionato al mezzo di férmentazione contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, vitamine quali biotina o tiamina, ed un amminoacido scelto tra L-Valina, L-Leucina, D-Leucina o L-Isoleucina adatti a favorire la crescita cellulare e la produzione di surfattina.

La densità cellulare iniziale della fermentazione è generalmente pari ad un O.D.ggg compreso tra 0,025 e 0,040.

Sorgenti di carbonio assimilabili includono carboidrati come glucosio, amidi idrolizzati, melassa, saccarosio od altre sorgenti di carbonio convenzionali .

Esempi di sorgenti di azoto possono essere scelti, ad esempio, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o prodotti contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne.

I seguenti cationi ed anioni sono ugualmente adatti per gli scopi della presente invenzione: potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese, e nitrati. Preferito, secondo la presente invenzione, è un terreno di fermentazione avente la composizione riportata nell'esempio 2.

La fermentazione è condotta in un mezzo (fermentatore o bioreattore) agitato ed intensamente areato, ad una temperatura usualmente compresa tra 25° e 40° C, preferibilmente tra 30° e 37°C, rimuovendo in continuo la schiuma formatasi che contiene più del 98% della surfattina prodotta.

Aria compressa sterile è diffusa nel mezzo di fermentazione in quantità variabile da 0,2 a 1,0 voi/voi/minuto .

Il pH del mezzo di fermentazione è mantenuto entro valori compresi tra 6,0 e 7,2 e di preferenza tra 6,7 e 6,9.

La regolazione del pH potrà essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio.

Tuttavia, è preferibile mantenere il pH al valore desiderato utilizzando idrossido di sodio (NaOH) 10 N.

La velocità di agitazione, che è una delle cause della produzione della schiuma, viene generalmente scelta in modo tale da consentire una elevata crescita batterica .senza causare effetti drammatici sulla formazione della schiuma.

Tipicamente la velocità di agitazione iniziale è compresa tra 150 e 400 rpm, preferibilmente tra 200 e 300 rpm.

Infine, il volume di lavoro della fermentazione, che appare essere un elemento critico nella formazione della schiuma, è scelto in modo tale da limitare la produzione della schiuma e quindi la perdita della biomassa cellulare che fuoriesce con la schiuma prodotta.

La rimozione della schiuma che si forma nel processo di fermentazione causa una diminuzione del volume di lavoro e la perdita delle cellule in esso contenute.

Per superare questo inconveniente sono possibili due approcci. In un caso il terreno di crescita fresco sterile può essere continuamente addizionato al bioreattore (fermentazione in continuo) e nel secondo caso il brodo di coltura (contenente le cellule batterche) che fuoriesce con la schiuma può essere riciclato nel bioreattore (riciclo del terreno di coltura).

Secondo una forma preferita di realizzazione del procedimento della presente invenzione il terreno di coltura eliminato con la schiuma rimossa viene riciclato nel bioreattore utilizzando, ad esempio, un sistema automatizzato come riportato in figura 8.

Una tale fermentazione potrebbe presentare l'inconveniente derivante dal fatto che, la concentrazione della surfattina presente nel terreno di riciclo potrebbe avere un effetto negativo sull' ulteriore produzione di surfattina nel bioreattore dovuta all’inibizione che detta sostanza esercita sulla crescita batterica (Cooper et al.).

I risultati ottenuti hanno invece mostrato, sorprendentemente, un incremento della biomassa e valori costanti di surfattina nel bioreattore.

Ciò indica che l'alimentazione di detto bioreattore con una soluzione concentrata di surfattina proveniente dal contenitore di raccolta ha un effetto limitato sulla crescita cellulare e che la surfattina non esercita alcun effetto inibitorio sulla propria sintesi da parte del ceppo mutante B.subtilis ATCC 55033.

Questi risultati, suggeriscono che il mutante della presente invenzione, diversamente dal ceppo wild type B.subtilis ATCC 21332, potrebbe essere più resistente ad elevate concentrazioni di surfattina.

Secondo una ulteriore forma di realizzazione del procedimento della presente invenzione, la schiuma e il terreno di coltura rimossi dal bioreattore possono essere trattati mediante un sistema ad ultrafiltrazione assemblato come riportato in figura 12. Quindi il terreno di coltura, privo della surfattina, viene poi riciclato nel bioreattore.

Quando la fermentazione è condotta nelle condizioni preferite si ottiene una concentrazione di surfattina grezza da 2,0 a 4,0 g/litro in un periodo da 40 a 90 ore.

Al termine del procedimento di fermentazione si procede al recupero e alla purificazione della surfattina dalla schiuma e dal surnatante acellulare o cellulare.

A tale scopo possono essere impiegati metodi convenzionali, quale ad esempio precipitazione con un acido inorganico, come acido solforico o cloridrico, o con un composto metallico bivalente quale calcio, o saturando con ammonio solfato.

Questo trattamento consente la precipitazione selettiva della surfattina e di alcuni lipopeptidi e lipoproteine prodotti da B.subtilis.

Tale fase di precipitazione può, eventualmente, essere preceduta dal trattamento del surnatante acellulare mediante un sistema ad ultrafiltrazione allo scopo di eliminare le impurezze più grossolane e concentrare il volume di lavoro da purificare.

Il precipitato contenente la surfattina viene quindi purificato utilizzando una dèlie tecniche note quale, ad esempio, estrazione con solventi organici come cloroformio o cloruro di metilene, o precipitazione salina mediante CaC^ o NaCl.

Operando secondo il procedimento della presente invenzione si ottiene una quantità di surfattina purificata (99%) da 1,2 a 2,0 g/litro.

La caratterizzazione chimico-fisica della surfattina ottenuta secondo il procedimento della presente invenzione può essere condotta mediante l'impiego di tecniche cromatografiche, spettroscopiche e spettrometriche operando secondo metodi convenzionali .

I risultati ottenuti mediante spettrometria di massa (FAB), spettri all'infrarosso (IR), risonanza magnetica nucleare (NMR) e cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) hanno confermato i dati di letteratura.

Inoltre, si è confermata la presenza di molecole di acidi grassi che differiscono non solo per la lunghezza della catena carboniosa ^C13-C15^' ma anc^e Per struttura che può essere normale, iso ed anteiso.

La caratterizzazione delle proprietà tensioattive ed aggregative della surfattina ottenuta con il procedimento della presente invenzione confermano i dati di letteratura.

Pertanto la surfattina ottenuta con il procedimento secondo la presente invenzione è particolarmente adatta come tensioattivo, come agente stabilizzante di composti terapeutici, come medicamento per il trattamento della trombosi, embolia, infiammazioni ed in campo energetico e ambientale .

Breve descrizione delle figure:

Figura 1

Fotografia di una piastra di terreno TBAB (DIFCO) adddizionata con sangue in cui si possono evidenziare gli aloni di emolisi del ceppo wild type B.subtilis ATCC 21332 e del mutante overproduttore B.subtilis ATCC 55033.

Figura 2

Si riporta la curva di calibrazione in cui sull'asse delle ordinate si riporta il peso secco (g/1) della biomassa e sull'asse delle ascisse si riporta l'assorbanza a 600 nm.

Figura 3

Si riporta la curva che correla il diametro (cm) dell'alone di emolisi ottenuto su terreno TBAB addizionato con sangue (ordinata) con la quantità di surfattina (mg/ml) addizionata a tale terreno (ascissa).

Figura 4

Curva di crescita del mut nte B.subtilis ATCC 55033 seguita nel tempo in funzione dell'assorbenza misurata alla lunghezza d'onda di 600 nm e confrontata con la curva di crescita del ceppo wild type.

Xn ascissa è riportato il tempo espresso in ore e sull'asse delle ordinate il valore di assorbanza (O.D.60Q).

Figura 5

Si riporta il grafico di crescita cellulare e di produzione della surfattina rilevati durante una fermentazione in beuta del mutante B.subtilis ATCC 55033.

In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata, a sinistra, si riporta il valore (in scala logaritmica) di assorbanza della coltura cellulare alla lunghezza d’onda di 600 nm, mentre a destra si riporta la quantità (g/1) di surfattina prodotta da B.subtilis ATCC 55033.

Figura 6

Si riporta il grafico di crescita cellulare rilevato durante una fermentazione in beuta del mutante B.subtilis ATCC 55033 in presenza degli amminoacidi Val, Leu e Ile (*) e di Ile (o).

In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata, a sinistra, si riporta il valore (in scala logaritmica) di assorbanza della coltura cellulare alla lunghezza d'onda di 600 nm.

Figura 7

Si riporta il grafico di produzione della surfattina durante una fermentazione in beuta del mutante B.subtilis ATCC 55033 in presenza degli amminoacidi Val Leu Ile (*) e di Ile (o).

In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata, a destra, si riporta la quantità (g/1) di surfattina prodotta.

Figura 8

Si riporta lo schema del fermentatore da 2 litri con riciclo dove:

1) fermentatore; 2) linea ingresso aria; 3) pompa; 4) linea aria esausta; 5) recipiente di raccolta schiuma e 6) linea di riciclo del terreno colturale .

Figura 9

Si riporta la velocità di crescita del ceppo B.subtilis ATCC 55033 ottenuta in fermentatore da 2 litri utilizzando inoculi di età differenti. In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata la velocità di crescita.

Figure 10 e 11

Si mostrano i grafici di crescita cellulare e di produzione di surfattina rilevati durante una fermentazione "con riciclo" del mutante B.subtilis ATCC 55033.

In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata, -a snistra, si riporta il valore (in scala logaritmica) di assorbanza della coltura cellulare alla lunghezza d’onda di 600 nm, mentre a destra si riporta la quantità relativa rilevata dalla misura dell'area dei tre picchi cromatografici principali in cui è stata evidenziata la presenza di surfattina.

Figura 12

Si riporta lo schema di produzione di surfattina con ultrafiltrazione in continuo del prodotto dove:

1) fermentatore; 2) linea ingresso aria; 3) pompa; 4) linea aria esausta; 5) recipiente di raccolta schiuma, 6) Cartuccia da ultrafiltrazione e 7) Recipiente di riciclo del terreno colturale.

Figura 13

A) si riportano le curve di crescita comparate del mutante B.subtilis ATCC 55033 durante una fermentazione con riciclo ed una con ultrafiltrazione. In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata si riporta il valore (in scala logaritmica) di assorbanza della coltura cellulare alla lunghezza d'onda di 600 nm.

B) si confrontano le quantità di surfattina presenti nel bioreattore in un esperimento di fermentazione con ultrafiltrazione ed uno con riciclo.

In ascissa è riportato il tempo in ore; in ordinata si riporta la quantità di surfattina (g/1) Figura 14

Si riporta la curva di calibrazione ottenuta correlando la quantità di surfattina espressa in g/1 (ascissa) con il valore risultante dalla somma delle aree di sei picchi risolti mediante analisi HPLC (ordinata).

Figura 15

Profilo cromatografico di un campione di 25 ug di surfattina purificata. I tre picchi principali sono costituiti da surfattina legata ad acidi grassi con lunghezza variabile tra 13 e 15 atomi di carbonio.

Figura 16

I profili cromatografici in figura, sono il risultato di analisi diretta su 50 μΐ di sopranatante acellulare prelevato durante una fermentazione. I profili si riferiscono a prelievi effettuati dopo 3-4-27-30 ore dall'inizio dell'esperimento. La comparsa del prodotto è ben evidenziata dalla comparsa e dal successivo incremento dei picchi cromatografici relativi alle diverse componenti di surfattina (C13-C14-C15).

Figura 17

Caratterizzazione di un campione di surfattina purificata mediante tecnica FAB (Fast Atom Bombardment). I picchi principali evidenziati si riferiscono a prodotti aventi peso molecolare rispettivamente 1008-1022-1036 corrispondenti a frazioni di surfattina cui sono legati β-acidi grassi con catena di lunghezza variabile.

Figura 18

Spettro IR (Infrared Ray) di un campione di surfattina purificato. L’interpretazione dello spettro è riportata nell'esempio 6C.

La presente invenzione sarà meglio illustrata dai seguenti esempi.

Esempio 1

Preparazione del mutante B.subtilis overproduttore di surfattina.

Il ceppo wild type B.subtilis ATCC 21332 (disponibile presso il centro di raccolta American Type Culture Collection) è precoltivato a 37° C per una notte su terreno di sporulazione Schaeffer avente la seguente composizione:

Nutrient broth (DIFCO) 8.0 g/1 KC1~ ' 1.0 g/1 MgS04 1,25xl0_1 g/1 agar (DIFCO) 16,0 g/1 MnCl2 x 4 H20 l,98xl0"3 g/1 FeS04 x 7 H20 2,78xl0-4 g/1 Na2S04 1,42xl0-1 g/1 H2O 1,0 litro PH 7,0,

Quindi una ansata di detta precoltura è inoculata in 10 mi di terreno VY della DIFCO (Veal Infusion Broth 25 g/1 e Yeast Extract 5 g/1) e coltivata a 37eC per 16 ore.

Una aliquota (100 pi) di detta coltura viene trasferita in una beuta da 100 mi contenente 10 mi di terreno VY fresco e coltivata, sotto blanda agitazione (200 giri al minuto, rpm), a 37°C fino ad ottenimento di una densità ottica (O.D.), determinata a 600 nm con uno spettrofotometro Beckman (mod. DU70), pari a 0,7.

Successivamente, le cellule batteriche sono separate dal surnatante mediante centrifugazione a 5.000 rpm per 10 minuti, utilizzando un rotore mod. SS.34 su una supercentrifuga Sorvall, lavate con 5 mi di tampone TM (Tris-HCl 0,05 M, Acido maleico 0,05 M, (NH)4SC>41 g/litro, MgS04.7H20 0,1 g/litró, 'CatNO)^ 5 mg/litro, FeS04.7H20 0,25 mg/ litro) portato a pH 6,0 con NaOH 5N, nuovamente separate per centrifugazione con le modalità sopra descritte e risospese in 5 mi di tampone TM.

La sospensione cellulare è quindi addizionata con 5 mi di una soluzione di N-metil-N '-nitro-N-nitrosoguanidina idratata (1:1 con H2Q) (Fluka) in tampone TM (0,3 mg/ml) e poi incubata, sotto agitazione, a 37°C.

Dopo 30 minuti la sospensione è nuovamente centrifugata e le cellule così recuperate sono lavate con 5 mi di tampone TM e poi risospese in 50 mi di terreno VY fresco.

Aliquote (1 mi) di detta sospensione sono coltivate, sotto blanda agitazione, a 37°C per una notte e, dopo aggiunta di 0,2 mi di glicerolo sterile, sono congelate a - 80°C.

La selezione dei mutanti di B.subtilis, è quindi condotta seminando diluizioni seriali (circa 2x10 cellule/piastra) di dette aliquote su piastre di terreno TBAB (Tryptose Blood Agar Base (DIFCO) 33 g/litro) addizionato, dopo sterilizzazione a 120 °C per 20 minuti, con 5% di sangue defibrinato di montone (SOLAVO S.p.A.) filtrato su garza sterile.

~Dopo 16-24 ore di incubazione in termostato a 37°C si determina il diametro dell'alone di emolisi che compare intorno alle colonie batteriche (figura 1).

E' noto, infatti, che la dimensione dell'alone di emolisi è proporzionale alla quantità di surfattina prodotta dalle cellule di B.subtilis (Mulligan, C. e Cooper, D. (1984), J. Ferment. Technol., (52: 158-179).

Una delle colonie overproduttrici di surfattina, indicata B■subtilis SMS274, è stata depositata come ATCC 55033.

Esempio 2

Produzione di surfattina in beuta.

Una colonia di B.subtilis SMS274 viene inoculata in 10 mi di terreno VY e coltivata, a 200 rpm, a 37°C per 16 ore.

Successivamente 100 μΐ di detta precoltura sono trasferiti in una beuta, con una capacità di 2 litri, contenente 1 litro di terreno minimo avente la seguente composizione:

Glucosio 40.00 g/1

NH4C1 4,00 g/1

KH2PO4 4.00 g/1

NaHP04 5,64 g/1

MgS04 X 7 H'20 0,20 g/1

CaCl2 x 2 H20

1.00 xlQ-3 g/1

FeSO. x 7 H-O 20.00 xlO-3 g/1

4 2

MnCl2 X 4 H20 1,98 xlO'4 g/1

EDTA 1,50 xlO-3 g/1

pH 7.0

La crescita è condotta, sotto agitazione (250 rpm) , a 37eC per 24 e 48 ore in incubatore termostatato della New Brunswick .

In tutti gli esperimenti si utilizza come controllo il ceppo B.subtilis ATCC 21332 coltivato nelle medesime condizioni.

La crescita cellulare (biomassa) è monitorata determinando la densità ottica del brodo di coltura a 600 nm (spettrofotometro, DU 70, Beckman Instruments, INC., USA) utilizzando cuvette con un cammino ottico da 1 cm (Bio-Rad Laboratories; USA). Quindi i valori di O.D. sono convertiti a g/1 mediante una curva standard ottenuta utilizzando varie diluizioni della biomassa secca (di peso noto) del microorganismo (figura 2).

La surfattina è determinata depositando aliquote del surnatante acellulare, ottenuto dopo centrifugazione di 2 mi di brodo di coltura (Biofugé A/'Heraeus Sepatech; FRG) a 7.000 rpm per 5 minuti a 4°C, su piastre di terreno TBAB addizionato con sangue e determinando la dimensione dell’alone formatosi.

Il surnatante è diluito con acqua distillata sino a 1:10.000.

Il grado di emolisi delle cellule del sangue (dimensione degli aloni) è utilizzato come indicazione della produttività di surfattina da parte dei microorganismi.

Stime della quantità di prodotto sono effettuate mediante una curva standard ottenuta correlando le dimensioni degli aloni di emolisi con concentrazioni note di surfattina (figura 3).

In figura 4 si riportano le curve di crescita del mutante SMS274 e del ceppo wild type ATCC 21332 ottenute determinando nel tempo i valori di

Dall'analisi di tale figura si rileva che il mutante B.subtilis SMS274 ha una crescita del tutto paragonabile a quella del ceppo wild-type.

In figura 5 si riportano le curve di crescita e di produzione della surfattina per il mutante SMS274 e per il ceppo wild type.

Da tale figura si rileva che livelli determinabili'di' surfattina sono presenti dopo 10 ore dall'inizio della fermentazione, cioè all'inizio della vera fase logaritmica. La quantità di surfattina presente nel terreno di fermentazione incrementa in modo lineare rispetto alla fase stazionaria di crescita con una velocità di accumulo (..P/..t) di circa 0,32 g/l.h. Nella fase stazionaria si raggiunge un valore di surfattina pari a 3,5 g/1. In questa prova è stata determinata solamente la quantità di surfattina presente nel mezzo di coltura che, in tali condizioni sperimentali, si può assimilare approssimativamente alla produzione totale di surfattina.

Esempio 3

Studio dell’effetto di amminoacidi sulla crescita e produzione di surfattina di B.subtilis SMS274.

Una serie di esperimenti è stata condotta per verificare l'influenza di amminoacidi sulla crescita e la produzione di surfattina da parte del mutante SMS274.

Gli esperimenti vengono condotti in beute da 2 litri contenenti 1 litro di terreno minimo supplementato con 5 mg/1 di ciascuno dei seguenti amminoacidi L-Leucina (Leu), L-Valina (Val), L-Isoleucina (Ile) o D-leucina operando come nell'esempio 2.

I risultati rivelano che la presenza dei tre amminoacidi L-Leu, L-Val, L-Ile nel terreno di fermentazione induce un incremento della biomassa (figura 6).

Nelle prime 20 ore la produzione di surfattina è simile a quella ottenuta per il bianco (lo stesso ceppo coltivato in terreno privo di amminoacidi addizionali), comunque nella fase stazionaria il contenuto della surfattina nel terreno aumenta e alla fine della fermentazione la quantità di surfattina è circa il 30% in più rispetto alla quantità di surfattina determinata per il controllo (figura 7) e tabella 1.

Quando nel terreno di fermentazione è addizionata solo Ile, si osserva una inibizione della crescita cellulare e un ritardo di 1 ora nella formazione di surfattina.

Comunque, dopo 60 ore dall'inizio della fermentazione si determina un aumento di circa il 20% della produzione di surfattina rispetto al controllo ed un rapporto della surfattina per cellula di 1,19 che indica un aumento della produzione cellulare di surfattina.

TABELLA 1

Amminoacidi srfgQ /biomassa srf60 OD60

g/i 600 nm g/1 per g/1

(+/- 10%) (+/- 5%) (+/- 10%)

Val+Ile+Leu 4,5 18,8 0,75

Ile 4,2 11,0 1,19

D-Leu 3,6 16,0 0,74 bianco 3,5 15,0 0,74

Nota: srf surfattina determinata dopo 60 ore mediante analisi HPLC.

Esempio 4

Produzione di surfattina in fermentatore con riciclo.

Scopo della sperimentazione è quello di verificare l'influenza di parametri come età dell'inoculo, agitazione e volume di lavoro sulla produzione di surfattina.

Una precoltura su slant del·ceppo B.subtilis SMS274 è inoculata in una beuta da 100 mi contenente 10 mi di terreno VY e incubata, sotto blanda agitazione, a 37° per 16 ore.

Quindi beute con una capacità di 500 mi, contenenti ciascuna 100 mi di terreno minimo, sono inoculate con 1 mi di preinoculo e mantenute a 37°C, sotto agitazione a 350 rpm, alcune per 6 ore (inoculo "giovane") ed altre per 20 ore (inoculo "vecchio" ).

Successivamente le colture (100 mi) sono utilizzate per inoculare un fermentatore con una capacità di 2 litri controllato da centralina elettronica (Instrumentation Laboratories) per il monitoraggio e la correzione automatica della temperatura, del pH, dell'ossigeno disciolto e della velocità di agitazione.

Gli inoculi sono aggiunti ad 1 litro di terreno minimo sterilizzato direttamente nel fermentatore ottenendo volumi di lavoro finali da 1,1 a 1,6 litri.

La densità ottica iniziale (al tempo tQ) della coltura, determinata a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro Beckman (mod. DU70), è mediamente di 0,035.

Le condizioni iniziali di fermentazione sono: - temperatura 37 °C

- areazione 0, 6-0,7 vol/vol/minuto

- agitazione 200-700 rpm

- pH 6, 8-6,9

Tali parametri sono mantenuti costanti automaticamente durante tutto il periodo della fermentazione e, in particolare, il pH è mantenuto ad un valore di circa 6,8 mediante aggiunta di NaOH 10 N.

La durata della fermentazione è compresa tra 10 e 90 ore.

Durante la fermentazione la velocità di agitazione iniziale da 200-220 è portata a circa 400 rpm per mantenere un pQ2 > 15%.

La schiuma prodotta durante la fermentazione è rimossa in continuo utilizzando una linea di uscita dell'aria esausta del fermentatore (figura 8) .

Dopo circa 20 ore dall'inizio della fermentazione, quando cioè si verifica una apprezzabile produzione di surfattina e quindi di schiuma, si attiva, mediante una pompa, un sistema di riciclo del terreno di coltura che fuoriesce dal bioreattore insieme alla schiuma, allo scopo di mantenere costante il volume di lavoro.

Durante la fermentazione la crescita cellulare è controllata mediante determinazione della densità ottica a 600 nra, mentre la surfattina è determinata nel surnatante acellulare mediante analisi HPLC come descritto nell'esempio 8.

I dati ottenuti rivelano che:

- i migliori risultati sono ottenuti con agitazione iniziale di 200-220 rpm; infatti agitazioni superiori (500-700 rpm) causano una produzione della schiuma difficilmente controllabile al punto che dopo 5 ore dall'inizio della fermentazione, l'esperimento deve essere bloccato per l'eccessiva perdita del brodo di coltura.

- un inoculo "vecchio" (20 ore) provoca, a differenza di un inoculo "giovane" (6 ore) una rapida e incontrollata produzione di schiuma già dopo 5 ore dall'inizio della fermentazione (figura 9).

- un volume di lavoro 1,6 litri (da 1,1 a 1,41) è preferibile.

Operando nelle condizioni preferite, si osserva dopo 47 (figura 10) e 80 ore (figura 11) di fermentazione una crescita cellulare, rispettivamente, di 12 e 15 unità di assorbenza (O.D. 600) corrispondente a circa 4 g/litro in peso secco di biomassa batterica (per o*D*600 finale di 15).

La surfattina viene purificata dal surnatante acellulare e dalla schiuma derivante dalla fermentazione mediante il metodo descritto al punto b) dell'esempio 7.

I risultati, in termini di rese di produzione del prodotto purificato, ottenuti dopo 47 e 80 ore sono, rispettivamente, di 1,20 g/1 e di 2,0 g/1. Esempio 5

Fermentazione con ultrafiltrazione in continuo della surfattina.

II sistema consiste nell'accoppiamento on-line di un sistema di ultrafiltrazione con il fermentatore (figura 12).

Lo schema proposto prevede la rimozione in continuo della surfattina prodotta durante la fermentazione mediante trattamento della schiuma e di parte del brodo di fermentazione (la cui fuoriuscita è da imputare alla pressione che si crea all'interno del fermentatore) in una apparecchiatura per ultrafiltrazione (Amicon mod. CH2A) costituita da un recipiente di raccolta, da una pompa peristaltica e da una cartuccia (Àmicon mod. H1P30-43) per ultrafiltrazione a fibre cave con un cut-off nominale di 30.000 daltons.

Come illustrato nella figura 12, il liquido proveniente dal fermentatore passa attraverso la cartuccia (..) e la maggior parte della surfattina (oltre il 95%) viene trattenuta in forma di aggregati all'interno del sistema di ultrafiltrazione. Un sistema a pompa (,,) immette nuovamente all’interno del fermentatore il mezzo di coltura privo del prodotto di interesse.

Durante la fermentazione si controlla la crescita cellulare (mediante determinazione della densità ottica a 600 nm) e la produzione di surfattina (médiante le tecniche cromatografiche descritte nell'esempio 8 punto A). In tabella 2 si riportano i dati comparativi tra un esperimento di fermentazione con ultrafiltrazione ed uno con sistema a riciclo assemblato come nell'esempio 4.

TABELLA 2

Surfattina

Comparti Ultrafiltrazione Riciclo

Fermentatore 0,046 g 3,157 g Schiuma 0,706 g Liquido permeato 0,082 g

Liquido ritenuto 3,002 g

3,002 g 3,863 g Densità ottica

finale O.D.ggg 7,2 unità 15,5 unità I

Surf attina/biomassa 1,36 * 0,78 * dove :

* = grammi di surfattina per grammi di biomassa per litro calcolati secondo la seguente formula:

-g di surfattina

unità (O-D.^QQ) <x >0,318 (fattore di correzione)

Dopo 65 ore dall'inizio della fermentazione, la crescita cellulare era pari a 7,2 unità di assorbenza (O.D.ggg) corrispondente a circa 2,3 g/litro in peso secco di biomassa batterica.

La surfattina concentrata nel sistema di ultrafiltrazione, è poi purificata dal mezzo acellulare mediante il metodo descritto al punto b) dell'esempio 7.

I risultati in termini di produzione della surfattina purificata sono di 1,88 g/litro.

In figura 13 si riportano i dati di crescita cellulare (A) e di efficienza di rimozione della surfattina (B) comparati con quelli ottenuti in una fermentazione con solo riciclo.

Esempio 6

Produzione di surfattina in fermentatore da 20 litri con riciclo.

Si utilizza un fermentatore mod. SET.20 della ditta SETRIC G.A. con una capacità di 20 litri contenente 11 litri di terreno minimo avente la composizione riportata nell’esempio 2.

Una precoltura di 6 ore (1 litro) di B.subtilis SMS274, ottenuta come riportato nell'esempio 4, viene trasferita nel fermentatore (inoculo del 10%). Il volume finale di lavoro risulta quindi pari a 12 litri.

Anche in questo esperimento si impiega un sistema di rimozione in continuo della schiuma prodotta ed il riciclo del terreno di fermentazione.

La fermentazione è condotta a 37°C, con una areazione di 0,5 vol/vol/minuto, agitazione iniziale di 200-220 rpm ed un pH di circa 6,8 mantenuto a tale valore con una soluzione di NaOH 10 N.

Gli altri parametri vengono mantenuti costanti in maniera automatica per tutta la durata dell'esperimento .

Dopo 17-18 ore dall'inizio della fermentazione la schiuma generatasi nello strato superficiale del reattore si accumula insieme a parte del terreno dii fermentazione nel contenitore di i

raccolta e quindi, dopo 28 ore, si attiva la pompa di riciclo del terreno di fermentazione per ristabilire il volume di lavoro nel bioreattore.

In fase stazionaria la crescita cellulare raggiunge un O.D.ggg di 6,6 con un incremento di 5-6 volte rispetto a quello ottenuto in fermentatore da 2 litri.

Alla fine della fermentazione si ottengono 21 g (1,8-1,9 g/1) di surfattina purificata.

Esempio 7

Isolamento e purificazione della surfattina.

Dopo rimozione delle cellule batteriche mediante centrifugazione a 5.000 rpm per 10 minuti in centrifuga Servali utilizzando un rotore mod. GS.3, il recupero della surfattina dal surnatante acellulare e dalla schiuma proveniente dal processo di fermentazione può essere effettuato secondo due protocolli alternativi:

a) Concentrazione mediante ultrafiltrazione seguita da estrazione come al punto (b).

Questo trattamento ha lo scopo di (1) ridurre il volume da trattare nella successiva fase di purificazione (b) e (2) di rimuovere dal surnatante composti a basso peso molecolare che potrebbero precipitare insieme alla surfattina nel successivo step di purificazione (b).

Aliquote del surnatante acellulare vengono trattate con una apparecchiatura ad ultrafiltrazione della Amicon mod.8010. Il sistema consiste di una cartuccia (Amicon) con cut-off di 30.000 daltons contenente 55 fibre cave ad ultrafiltrazione, una pompa peristaltica ed un contenitore di riserva per il campione.

Il liquido trattenuto dalle fibre ritorna nel contenitore di riserva del sistema ad ultrafiltrazione, mentre il liquido (contenente sostanze a basso peso molecolare) viene rimosso dal sistema. La surfattina è recuperata dal contenitore di riserva.

All'analisi HPLC si osserva che nel liquido ritenuto dalla cartuccia è presente oltre il 95% della surfattina prodotta.

b) Acidificazione ed estrazione con solventi organici.

Il surnatante acellulare e la schiuma proveniente dal processo di fermentazione o il liquido proveniente dallo step a) vengono portati a pH 2,0 mediante aggiunta di HCl 6 N.

Il flocculato risultante viene separato dalla soluzione mediante centrifugazione a 10.000 rpm per 15 minuti in centrifuga Servali (rotore mod.GS-3) e portato a secco sotto vuoto impiegando un Rotavapor 461 (Buchi, Svizzera).

Il prodotto grezzo così isolato viene risospeso in solventi organici quali cloroformio o diclorometano e, dopo agitazione per una notte, la miscela risultante viene filtrata su carta da filtro Whatmann n° 4 per rimuovere le impurezze più grossolane.

Il filtrato così ottenuto viene quindi estratto due volte con ugual volume di I^O distillata con un pH compreso tra 7,0 e 9,0 sotto blanda agitazione per circa 15 minuti. Dopo tale periodo la miscela viene posta in un imbuto separatore e lasciata alcune ore per permettere alle due fasi di separarsi. Le fasi acquose, contenenti la surfattina, vengono prelevate, combinate e acidificate a pH 2,0 mediante aggiunta di HC16 N. La surfattina, precipitata sotto forma di granuli biancastri, viene recuperata mediante centrifugazione a 10.000 rpm, asciugata sotto vuoto ed eventualmente pesata per valutare la resa di produzione.

Esempio 8

Caratterizzazione della surfattina purificata. A) Analisi Cromatografica HPLC.

Campioni di surfattina purificata vengono sciolti in tampone di eluizione [50% n-propanolo in 0,1% TFA (acido trifluoroacetico)] ad una concentrazione finale compresa tra 0,1 e 1.0 mg/ml e poi analizzati mediante HPLC.

Si utilizza un sistema cromatografico Beckman costituito da due pompe mod.110 B, un controller mod.421 A, un detector UV mod.163 ed un integratore Shimadzu mod. C-R3A.

Per le separazioni cromatografiche è stata utilizzata una colonna Licrospher .R 100 RP-18 (5μτη) con precolonna Licrospher R

100 RP-18 (5um) (Merck).

Le condizioni cromatografiche sono

- temperatura ambiente (20-25°C)

- velocità di flusso 0,5 ml/minuto

- UV detector 220 nm

- eluente 50% n-propanolo in 0,1% TFA - volume iniettato 100 μΐ

- tempo di separazione 30-40 minuti.

L'analisi HPLC viene impiegata, oltre che per la caratterizzazione della purezza e quantità del campione cromatografato, anche per seguire nel tempo la produzione di surfattina durante la fermentazione .

A tale scopo si utilizza la curva standard riportata in figura 14 dove la somma delle aree di sei picchi è plottata in funzione della concentrazione della surfattina.

Campioni di surnatante acellulare (50 μΐ), eventualmente diluiti con acqua distillata, vengono addizionati con ugual volume di n-propanolo 0,1% TFA e poi iniettati in colonna.

In figura 15 si riporta la separazione di un campione di 50 ug di surfattina purificata mentre in figura 16 si riporta la produzione di surfattina durante una fermentazione con riciclo dopo 3-4-27-30 ore di crescita del ceppo.

B) Spettrometria di massa.

Con la spettrometria di massa si è determinato il peso molecolare dei composti in esame.

Per l'analisi è stato utilizzato uno spettrometro di massa Finnigan mod. MAT/90 equipaggiato con Atomgun Iontech alimentato con gas Xenon accelerato a 7KV mediante ionizzazione FAB (Fast Atom Bombardment).

Come matrice è stata utilizzata sia glicerolo-tioglicerolo (1:1, v/v) che p-nitro-benzil alcool.

Gli spettri di massa sono registrati con un sistema di integrazione dei dati e la calibratura è effettuata in modo automatico impiegando una miscelata di periluorocherosene (PFK).

L'analisi è condotta sia su campioni di surfattina purificata che su frazioni singole provenienti da una separazione cromatografica preparativa (HPLC) condotta come riportato al punto A).

Per i primi campioni lo spettro indica la presenza di tre picchi principali aventi una massa [M+H]<+>, rispettivamente, di 1008, 1022 e 1036 (figura 17).

Tali risultati sono in accordo con quelli riportati da C.N. Mulligan et al. [Appl.Microbiol. Biotechnol., 31: 486-489, (1989)].

Spettri di massa ottenuti per le frazioni singole hanno mostrato la presenza di almeno 6 diversi componenti la cui natura può essere spiegata con la presenza di molecole di acidi grassi con una struttura normal, iso ed anteiso. C) Analisi all'infrarosso (IR).

Per confermare l'esatta struttura della surfattina ottenuta impiegando il ceppo mutato B.subtilis SMS274, un campione purificato è stato analizzato all'infrarosso operando secondo il seguente protocollo:

dopo aver disperso il campione in KBr (1 mg di surfattina in 300 mg di KBr), la sospensione risultante è macinata in capsula d'agata in un mulino a vibrazione per circa 5 minuti, omogeneizzata e poi disposta in una pastigliatrice. Il campione è sottoposto ad una pressione di 10 ton/cm per ottenere una pastiglia trasparente che viene essiccata a 60°C sottovuoto per una notte.

Il campione così trattato è quindi analizzato per mezzo di uno spettrometro con interferometro Digilab mod. FTS15E.

I dati dello spettro (figura 18) sono così interpretabili :

1. Zona C-H.

Le bande di assorbimento a 2958, 2929 e 2856 cm ^ sono predominanti e indicano il gruppo -CH3. Questi dati mostrano anche la presenza di un alto numero di gruppi -CH2· La banda a 1470 cm e una deformazione-vibrazione dei gruppi -CH2 e -CH^. 2. Zona C=Q.

La banda intensa a 1649 cm e dovuta ad ammidi secondarie. La seconda banda intensa a 1539 cm ^ corrisponde al gruppo -CO-NH-R. Una terza banda ammidica medio-debole si osserva a 1261 cm mentre una banda intensa a 1734 cm ^ è dovuta ad un gruppo carbonile.

3. Bendinq CH^, CH^.

6CH2 6CH3 tra 1470 e 1380 cm"1

1470 = 6CH2 6CH3

1380 = 6symCH3-. più intenso indica la preponderanza di CH3, la presenza di CH3 geminali e, probabilmente, l'influenza di un 0=0 in β.

4. Assorbimento (O-H) e (N-H).

Lo spettro mostra vibrazioni dei legami 0-H e N-H a 3070 e 3300 cm . Questi corrispondono ai seguenti gruppi:

3070 cm"1: -CO-NH

3300 cm"1: =N-H

I risultati ottenuti sono in accordo con quanto pubblicato da J.Kratzschmar et al. [J. of Bacteriol. , 170: 5347-5353, (1988)].

Claims

RIVENDICAZIONI 1 Bacillus subtilis ATCC 55033.
2 Procedimento per la produzione di surfattina che comprende : a) il coltivare il ceppo Bacillus subtilis ATCC 55033 sotto condizioni aerobiche in ambiente di coltura liquido contenente sorgenti assimilabili di carbonio, azoto e sali inorganici, eventualmente addizionato con vitamine e amminoacidi, ad un pH compreso tra 6,0 e 7,2, ad una temperatura compresa tra 25° e 42°C; b) il rimuovere la schiuma formatasi dal mezzo di fermentazione; e infine c) il separare e purificare la surfattina così ottenuta.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui il terreno di coltura presente nella schiuma rimossa nello stadio b) viene riciclato nello stadio a).
4. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui la surfattina presente nel terreno di coltura e nella schiuma viene rimossa mediante un sistema ad ultrafiltrazione ed il terreno privo del prodotto viene riciclato nello stadio a).
5. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui sorgenti assimilabili di carbonio sono carboidrati come glucosio o saccarosio, amidi idrolizzati, melassa od altre sorgenti di carboni
6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, in cui la sorgente di carbonio è glucosio.
7. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui sorgenti assimilabili di azoto sono sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio, urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne .
Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui i cationi ed anioni sono potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese e nitrati.
9. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui le viatamine sono scelte tra biotina o tiamina .
10 Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui gli amminoacidi sono scelti tra L-Leucina, D-Leucina, L-Valina o L-Isoleucina .
11. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui il pH ha un valore compreso tra 6,5 e 7,0.
12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, in cui il pH ha un valore compreso tra 6,7 e 6,9.
13. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui la temperatura è compresa tra 30°C e 37°C.