IT9020630A1 - Soluzioni tampone contenenti collagenasi, loro preparazione ed uso per la diluizione di sieri umani - Google Patents
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Description
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce ad una soluzione tampone a pH 7.0-7. 5 contenente collagenasi ed al suo impiego in metodiche ELISA "a cattura" per la ricerca di anticorpi specifici di classe basate sull'uso di coniugati enzimatici nei quali l'enzima viene legato all 'anticorpo per mezzo della glutaraldeide
Stato della tecnica
E' noto che il fattore del complemento Clq presente nel siero umano possiede sei filamenti claviformi che rappresentano gli elementi di riconoscimento per particolari siti presenti sulle IgG e IgM (Shelton, E. et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972,62:65 ). L'affinità del Clq è più bassa per le IgG monomeriche che per le IgM e gli anticorpi (IgG e IgM) aggregati o legati all'antigene o denaturati (Sledge.C.R. e Bing, D.H. : J.Biol.Chem. , 1973, 248:28l8).
La presenza nel siero di complessi macromolecolari costituiti da C1q e da anticorpi IgM è stata da noi ritenuta responsabile della falsa positività riscontrata eseguendo la ricerca delle IgM specifiche mediante test ELISA "a cattura" di anticorpi che impiegano anticorpi rivelatori coniugati alla fosfatasi alcalina (ALP) con glutaraldeide e, comunque, è generalizzabile a tutti i tests ELISA basati sulla cattura di anticorpi specifici di classe.
Mettendo il siero a contatto con la fase solida, rappresentata dalle pareti di pozzetti di micropiastre rivestiti con anticorpi anti IgM umane tali complessi IgM-Clq vengono catturati. Successivamente, addizionando al pozzetto l'anticorpo coniugato con ALP, previamente combinato con gli antigeni verso i quali si ricercano le IgM, questo si lega al C1q e quando viene messo a contato con un substrato specifico per l'ALP genera un segnale aspecifico.
Usando invece per la diluizione dei sieri il tampone oggetto della presente invenzione, l'enzima collagenasi in esso contenuto agisce sulle sequenze amminoacidiche del Clq distaccando da questo i filamenti capaci di legare le IgM. Descrizione dettagliata dell'invenzione
Il tampone secondo l'invenzione è costituito da:
Bifosfato di sodio anidro : 1,09 g/1
Monofosfato di sodio monoidrato : 0.37 g/1
Sodio cloruro : 8,5 g/1
Siero albumina bovina : 10 g/1
Brij-35 : 0,5 g/1
IgG umane aggregate : 0,5 g/1
Collagenasi tipo IV : 1.000 - 3-000 U./l
Sodio azide : 1.001 g/1
ed ha un pH 7.0 - 7.5.
Metodo di preparazione della soluzione tampone
1,09 g di bifosfato di sodio anidro, 0,37 g di monofosfato di sodio monoidrato e 8,5 g di sodio cloruro vengono disciolti in 900 mi di acqua distillata sterile e a questa soluzione, dopo aver aggiustato il pH a 7-2 con sodio idrato 0,1 N, vengono aggiunti e solubilizzati 10.0 g di siero albumina bovina mantenendo sotto agitazione lenta per circa 30 minuti. Alla soluzione così ottenuta vengono aggiunti sequenzialmente i seguenti reagenti :
- Brij-35 0.50 g
- IgG umane aggregate 0.50 g
- Collagenasi tipo IV 1.500.00 U.I.
- Sodio azide 1-00 g
Al termine, dopo aver portato al volume finale di 1000 mi con acqua distillata sterile, la soluzione viene filtrata sterilmente su membrane filtranti. I recipienti necessari per la preparazione e la conservazione della soluzione devono essere stati previamente sottoposti a sterilizzazione.
Vengono ora descritti alcuni esempi, per meglio illustrare, senza alcun fine limitativo, gli scopi ed i vantaggi della presente invenzione.
Saggio ELISA confronto fra tampone diluente dei sieri tal quale e addizionato di collagenasi su un pannello di sieri falsi positivi .
Circa 100 sieri appartenenti ad una popolazione mista {donatori e gravide) e risultati negativi con un metodo di riferimento IFA sono stati saggiati mediante un test ELISA a cattura di IgM basato su un sistema di rivelazione costituito da anticorpi coniugati con ALP precombinati con antigeni estrattivi di diversi microrganismi ( Toxoplasma gondii, Virus della Rosolia, Citomegalovirus e Treponema pallidum). L'analisi ha dato i seguenti risultati : 94 sieri negativi e 6 falsi positivi.
Aliquote di tutti e 6 i sieri falsi positivi sono state diluite nel tampone diluente tal quale (Bifosfato di sodio anidro : 1,09 g/1, Monofosfato di sodio monoidrato : 0.37 g/1. Sodio cloruro : 8,5 g/1. Siero albumina bovina : 10 g/1, Brij-35 : 0,5 g/1, IgG umane aggregate : 0,5 g/1, Sodio azide : 1.00 g/1) e addizionato di collagenasi alla concentrazione di 0,01 g/1 pari ad un'attività enzimatica di 1.500 U/l e analizzate in duplicato con i test ELISA a cattura di IgM precedentemente usati per la loro selezione e comprendenti le seguenti fasi :
Fase 1
Sono state saturate per adsorbimento fisico le pareti di pozzetti di piastre da microtitolazione {Nunc-MBC -Danimarca) mediante incubazione per una notte a temperatura ambiente ( 20°-25°C) in camera umida con 0,100 ml/pozzetto di una soluzione 20 μg/ml di anticorpi anti IgM (catena μ ) limane in tampone 0.1 M a pH 9.8.
Fase 2
Dopo tre lavaggi con acqua distillata contenente Tween - 20 allo 0,05 2 sono stati addizionati alle piastre 0.100 ml/pozzetto dei sieri di controllo negativo e positivo e dei sieri in esame diluiti 1 : 101 in fisiologica tamponata a pH 7.2 contenente Brij - 35 allo 0.052 e albumina bovina (BSA) allo 0,1 %.
In alcuni esperimenti al tampone diluente del sieri sopradescritto è stata addizionata la collagenasi (tipo IV, attività specifica 150 U/mg, Worthington) alla concentrazione di 1.5 U/ml.
La piastra è stata incubata per un'ora a 37° C
Fase 3
Dopo 5 lavaggi con fisiologica tamponata contenente Brij - 35 allo 0,05 2 sono stati addizionati alle piastre 0,100 ml/pozzetto di un complesso costituito da anticorpi coniugati con ALP (Ab-ALP) combinati con antigeni estrattivi (Ag) di Toxoplasma gondii (Toxo), di virus della Rosolia ( Rosolia), di Citomegalovirus (CMV) o di Treponema pallidum (Sifilide) a diluizioni ottimali ( Ag : 10 -20 μg/ml ; Ab-ALP :5 - 10 μg/ml) in fisiologica tamponata contenente Brij - 35 allo 0.052 e BSA allo 0.12.
La piastra è stata incubata per 1 ora a 37° C.
Fase 4
Dopo cinque lavaggi con fisiologica tamponata contenente Brij 35 allo 0.05 % sono stati addizionati alle piastre 0.100 ml/pozzetto di una soluzione di p-nitrofenilfosfato (substrato croniogeno ALP specifico) a 1 mg/ml in tampone dietanolamina 1.1 M pH 9-8 contenente La piastra è stata incubata per 30 minuti esatti a 37’ C ed al termine sono stati aggiunti 0,025 ml/pozzetto di NaOH 3M per bloccare la reazione enzimatica.
L'assorbenza delle soluzioni nei pozzetti è stata determinata con un fotometro per micropiastre a lettura verticale a 405 nm, dopo aver azzerato contro aria.
Il valore dell'assorbanza soglia per discriminare la negatività dalla positività (cut-off) è stato calcolato con la formula seguente :
Cut-off = (Assorbanza media controllo negativo Assorbanza media controllo positivo) x 0,5
Sono stati considerati negativi i sieri che mostravano un'assorbenza minore al valore del cut-off e positivi i sieri la cui assorbanza risultava maggiore o uguale a tale valore. I risultati ottenuti sono stati riportati nella Tabella I e dimostrano che l'aggiunta di collagenasi (1-5 U/ml) al tampone diluente dei sieri porta alla negativizzazione (valore di assorbanza media < valore cut-off) di tutti i sieri falsi positivi.
ESEMPIO 2
Saggio ELISA : confronto fra tampone diluente dei sieri tal quale e addizionato di collagenasl su un pannello di sieri positivi
Venti sieri suddivisi in quattro gruppi di cinque sieri, risultati rispettivamente positivi in IgM anti Toxoplasma gondii, anti virus della Rosolia, anti CMV e anti Treponema pallidum con un metodo di riferimento (IFA), sono stati diluiti nel tampone diluente tal quale (Bifosfato di sodio anidro : 1,09 g/1. Monofosfato di sodio monoidrato : 0.37 g/1, Sodio cloruro : 8,5 g/1, Siero albumina bovina : 10 g/1. Brij-35 ·' 0,5 g/1. IgG umane aggregate : 0,5 g/1, Sodio azide : 1.00 g/1) e addizionato di collagenasi tipo IV (1.500 U/l) ed analizzati utilizzando i test ELISA descritti nell'esempio 1. I risultati ottenuti sono stati riportati nella tabella II e dimostrano che l'aggiunta di collagenasi al tampone diluente dei sieri non determina nei sieri veri positivi variazioni di assorbenza significative dal punto di vista diagnostico.
Tabella I
TBAELLA II
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Soluzione tampone a ρΗ 7.0-7.5 contenente collagenasi 2. Soluzione tampone secondo la rivendicazione 1 in cui la collagenasi è collagenasi tipo IV 3. Soluzione tampone secondo la rivendicazione 2 in cui la collagenasi di tipo IV è presente in concentrazioni di 1.000 - 3-000 U/l. 4. Soluzione tampone secondo la rivendicazione 3 in cui la collagenasi di tipo IV è presente in concentrazioni di 1.500 U/l. 5· Soluzione tampone secondo la rivendicazione 4 costituita da: (Bifosfato di sodio anidro : 1,09 g/1, Monofosfato di sodio monoidrato : 0.37 g/1, Sodio cloruro : 8,5 g/1. Siero albumina bovina : 10 g/1, Brij-35 0,5 g/1, IgG umane aggregate : 0,5 g/1, collagenasi tipo IV : 1.500 U/l, Sodio azide : 1.00 g/1) 6. Uso di soluzione tampone secondo le rivendicazioni 1 - 5 per la diluizione di sieri umani in test ELISA. 7- Uso di soluzioni tampone secondo la rivendicazione 6 in cui il test Elisa è effettuato per la ricerca delle IgM specifiche usando anticorpi traccianti coniugati alla fosfatasi alcalina con glutaraldeide. 8. Uso secondo la rivendicazione 7 in cui gli anticorpi traccianti coniugati alla fosfatasi alcalina sono precombinati con antigeni estrattivi di microrganismi.
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