IT9020072A1 - Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali, loro preparazione e loro impiego - Google Patents
Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in dna ricombinanti episomiali, loro preparazione e loro impiegoInfo
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Description
Domanda di brevetto per Invenzione Industriale dal titolo:
"Cellule umane per l'elevata espressione di geni inseriti in DNA ricombinanti episomiali, loro preparazione e loro impiego"
RIASSUNTO
Sono descritte cellule umane modificate che consentono l'espressione di prodotti codificati da un qualsiasi gene sottoposto al controllo dell'LTR di HIV-1.
DESCRIZIONE
Campo dell invenzione
La presente invenzione si riferisce a cellule umane 293 il cui genoma cellulare è stato modificato per l'integrazione dei vettori pSU3⁄4Rtat e pHEBo e che sono state successivamente trasformate con i vettori episomiali pRPneoU3RX, ove X rappresenta un gene posto sotto il controllo dell'LTR di HIV-1, ed al loro processo di preparazione.
Stato della tecnica
Normalmente l'espressione di geni esogeni in cellule eucariotiche si effettua utilizzando cellule di roditori o di scimmia, più raramente cellule umane, che vengono trasformate con vettori di integrazione costituiti da retrovirus [Cepko.C.L.; Roberts,B.E.; Mulligan R.C. : Construction and applications of a highly transmissible murine shuttle vector. Celi 37 1053 - 1062 (1984)] 0 basati sulle sequenze dei virus SV40 [ Elder, J.t.; Spritz, R.A. ; Weissman, S.M. : Simian virus 40 as a eukaryotic cloning vehicle. Ann. Rev. Genet. 15 : 295 <- >340 (1981)] e del papilloma bovino [ DiMaio.D. : Papillomavirus cloning vectors. The papillomaviruses (ed. Howley, P.M. and Salzraan, N.P.), Plenum Press, New York, p.293 (1987) ]. Quest'ultimo può rimanere allo stato episomiale ed amplificarsi in cellule di topo. La produzione ottenuta con tali cellule è variabile e non sempre elevata. Inoltre, particolarmente nelle cellule trasformate da retrovirus, il DNA esogeno frequentemente si riarrangia con conseguente perdita dell'espressione. Secondo la presente invenzione è possibile invece utilizzare cellule umane e si usa un vettore episomiale capace di amplificarsi e di essere alternativamente ad espressione costitutiva o inducibile tramite la transattivazione dell'LTR di HIV da parte di tat. L'espressione costitutiva è ottenibile in cellule 293tat, l'espressione inducibile in cellule 293 normali che vengono transfettate transitoriamente con plasmidi che esprimono tat.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
L'LTR di HIV-1 (il virus agente eziologico dell'AIDS) contenente il promotore-enhancer della trascrizione, è attivato da una serie di fattori trascrizionali che riconoscono sequenze diverse ed il cui effetto è additivo. Due dei piu' potenti fattori transattivanti sono EIA, una proteina precoce di adenovirus, e tat. codificato da un gene di HIV-1 (FIGURA 1 ove le frecce indicano un forte aumento della trascrizione di RNA in seguito all'effetto di EIA e tat sull' LTR di HIV-1)).
Secondo la presente invenzione si utilizzano cellule umane 293 (ATCC CRL 1573) trasformate dalla regione precoce di adenovirus 5 che esprimono costitutivamente EIA. Tali cellule sono state cotransfettate con il vettore di integrazione da noi costruito pSU3Rtat (FIGURA 2) e con pHEBo che esprime la resistenza all'igromicina B. Il risulatato di questa cotransfezione è che ambedue i vettori si integrano permanentemente nel genoma cellulare cosicché le cellule trasformate possono venire selezionate in terreno contenente igromicina B e contemporaneamente sono in grado di esprimere tat in maniera costitutiva.
Tali cellule, che esprimono ora costitutivamente EIA e tat sono state quindi ulteriormente trasformate con i vettori episoraiali da noi costruti pRPneoUR3rX, ove X rappresenta un gene sotto il controllo dell'LTR di HIV-1, costituiti da DNA ricombinanti costruiti con il .genoma del virus BK e perciò dotati di capacità replicativa in cellule umane. In particolare sono stati impiegati per questa operazione due vettori in cui sono stati inseriti il gene batterico per l'enzima cloramfenicolo acetil-transferasi (CAT), cioè pRPneoU3RCAT, e il gene strutturale per l'antigene di superficie del virus dell'epatite B (HBsAg), cioè pRPneoU3RHBsAg (FIGURA 2). Quest'ultimo è di notevole interesse medico per le sue possibili applicazioni a scopo diagnostico e vaccinale. La selezione dei cloni trasformati dopo la seconda transfezione è stata operata con G418, un antibiotico aminoglicosidico al quale diventano resistenti le cellule che esprimono il gene neo, contenuto appunto in detti vettori episomiali. I prodotti di ambedue i geni sono stati espressi a livelli molto elevati in cellule 293tat con una conversione, in due minuti, nei diversi cloni cellulari, del 98-99% del cloramfenicolo alle sue forme monoacetilate e con una concentrazione di HBsAg nel terreno di coltura che raggiunge 750 ng/ml o 50 ng/10 cellule/24h, il che rappresenta circa 50 volte la produzione ottenuta in cellule 293 normali (TABELLA 1).
Questi valori sono fra i più alti finora descritti in sistemi di cellule eucariotiche. Inoltre la cinetica di produzione mostra che a 7 giorni la secrezione di HBsAg nel terreno è
produzione cumulativa dell'antigene continuando la coltura delle cellule oltre la prima settimana.
Il sistema descritto si presta quindi a vaste applicazioni per l'elevata espressione di prodotti codificati da qualsiasi gene che sia posto sotto il controllo dell'LTR di HIV-1. Un ulteriore vantaggio è rappresentato dal fatto che il sistema di espressione è specifico per cellule umane ed assicura perciò la massima genuinità e corrispondenza conformazionale dei prodotti ricombinanti ai prodotti naturali da usare nell'uomo. Inoltre, visto l'impiego di DNA ricombinanti costruiti con il genoma del virus BK, che si replicano in cellule umane, l'espressione genica risulta amplificata. Il sistema descritto può' quindi essere utilizzato per la produzione di reagenti a scopo terapeutico, diagnostico e vaccinale.
Parte sperimentale
Costruzione dei vettori
pRPneoU3R deriva dal vettore pRPneo-c, costruito a partire dal vettore pRP-C [ Grossi,M.P.; Caputo,A. ; Rimessi, P.; Chiccoli.L.; Balboni,P.G.; Barbanti-Brodano.G. : New BK virus episomal vector for coraplementary DNA expression in human cells. Arch.Virol. 102:275"283 (1988)] per inserzione nel sito BamHI del gene batterico neo, che conferisce alle cellule eucariotiche resistenza all'antibiotico G4l8. Il vettore pRPneo-c è stato modificato sostituendo il promotore precoce di SV40, situato tra i siti riconosciuti dagli enzimi di restrizione Xhol e EcoRV, con l'LTR di HIV-1 derivato dal vettore pU3RIH [ Sodroski.J. ; Rosen.C.; Wong-Staal,F.; Salahuddin.S.Z, ; Popovic.M.; Arya.S.; Gallo,R.C.; Haseltine, W. Transacting transcriptional regulation of human T-cell leukemia virus type III long terminal repeat. Science 227:171-173 (1985)]· pRPneoU3RCAT e pRPneoU3RHBs derivano entrambi dal vettore pRPneoU3R per inserimento nel sito unico Xhol del gene batterico per l'enzima cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) [Alton,N.; Vapnek.D.: Nucleotide sequence analysis of thè chloramphenìcol resistance transposon Tn9- Nature 282:864-869 (1979)1 o dell'antigene di superficie del virus dell'Epatite B (HBs) sottotipo adw [Moriarty, A.M.; Hoyer.B.H.; Shish.J.W.; Gerin.J.L.; Haraer.D.H. : Expression of thè hepatitis B virus surface antigen gene in celi culture by using an SV40 vector. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:2606-2610 (I98I)]. Per quanto riguarda pSU3Rtat, questo vettore è stato costruito attraverso alcuni passaggi intermedi. Inizialmente l'LTR di HIV-1 ottenuto dal vettore pU3RIH [ Science 227:171-173 (1985)1 ed il cDNA codificante per tat di HIV-1 ottenuto dal plasmide pGEMIIItat, sono stati inseriti assieme nel sito Xhol del vettore pRPneo-c [ Arch.Virol. 102:275-283 (1988)] generando il vettore pRPneoSU3Rtat. La regione contenuta nel frammento EcoRI che dirige l'espressione di tat è stata poi inserita nel plasmide pUC19 [ Yanish-Peron.C.; Vieire, J.; Messing.J. : Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of thè M13mpl8 and pUG19 vectors. Gene 33:103-119 (1985)]·
Per ottenere l'espressione costitutiva dei prodotti, cellule umane 293 [Graham,F.L.; Smiley.W.C.; Nairn.R. : Characteristics of a human celi line transformed by DNA from human adenovirus type 5· Journal of General Virology 36:59~72 (1977)] sono state cotransfettate utilizzando la coprecipitazione del DNA in fosfato di calcio [Graham,F.L.; Van der Eb.A.J. : A new technique for thè assay of thè infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52:456-^167 (1973) <e >Wigler.M.; Pellicer.A.; Silverstein ,S.; Axel.R.; Urlaub.G.; Chasin.L. : DNA-mediated transfer of thè adenine phosphoribosyltransferase locus into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 76:1373-1376 (1979)] con i vettori di integrazione pSU3Rtat e pHEBo. Quest'ultimo conferisce la resistenza all'igromicina B : perciò cloni resistenti sono stati prelevati, dopo selezione in terreno contenente igromicina B (200 pg/ml), e propagati in coltura. I cloni che esprimono tat sono stati individuati tramite transfezione con il plasmide pTZIIICAT, dove CAT è diretto dall'LTR di HIV-1, e saggio enzimatico per l'attività della cloramfenicolo-acetiltransferasi (CAT) [Gorman,C.M.; Moffat.L.F.; Howard,B.H.: Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Celi. Biol. 2:1044-1051 (1982)].
I cloni che producono tat sono stati transfettati con il vettore pRPneoU3RCAT o con pRPneoU3RHBs, dove i geni CAT e HBs sono diretti dall'LTR di HIV-1. Una seconda serie di cloni è stata quindi ottenuta sfruttando l'espressione della aminoglicoside-Fosfotransferasi , codificata dal gene neo che è presente in ambedue i plasmidi. Questo enzima inattiva il G4l8, un antibiotico simile alla neomicina che è tossico per le cellule eucariotiche [Southern,P.J.; Berg.P. : Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of thè SV40 early region promoter. J. Mol. Appi.
Genet. l:327_34l (1982)]. I cloni ottenuti in terreno addizionato di G4l8 (200 pg/ml) sono stati espansi in colture cellulari che sono state in seguito saggiate con la reazione enzimatica per l'espressione di CAT e con un test ELISA [Corallini ,A.; Pagnani.M.; Viadana,P. ; Silini, E.; Mottes.M.; Milanesi,G. ; Gerna.G.; Vettor.R.; Trapella.G. ; Silvani,V,; Gaist.G.; Barbanti-Brodano, G.: Association of BK virus with human brain tumors and tumors of pancreatic islets. Int. J. Cancer 39·*6θ~67 (1987)] per l'espressione dell'antigene HBs.
L’espressione inducibile è stata ottenuta transfettando cellule 293 normali con pRPneoU3RCAT o con pRPneoU3RHBs e selezionando i cloni in terreno con G4l8. L'espressione di CAT e dell'antigene HBs, piuttosto bassa costitutivamente, è stata indotta transitoriamente transfettando le cellule con vettori che esprimono tat ( pSU3Rtat, pRPneoU3Rtat o pRPneoSVtat).
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Cellule umane 293 il cui genoma cellulare è stato modificato con i vettori di integrazione pSU3Rtat e pHEBo e che sono state successivamente trasformate con i vettori episomiali pRPneoU3RX, ove X rappresenta un gene posto sotto il controllo dell'LTR di HIV-1.
- 2. Cellule secondo la rivendicazione 1 in cui il vettore episomiale è pRPneoU3RCAT.
- 3. Cellule secondo la rivendicazione 1 in cui il vettore episomiale è pRPneoU3RHBs.
- 4. Vettore episomiale pRPneoU3RX ove X rappresenta un gene sotto il controllo dell'LTR di HIV-1.
- 5. Vettore secondo la rivendicazione 4 in cui X è CAT.
- 6. Vettore secondo la rivendicazione 4 in cui X è HBsAg.
- 7. Vettore di integrazione pSU3Rtat.
- 8. Processo per la preparazione di cellule secondo le rivendicazioni 1- 3 in cui cellule umane 293. trasformate dalla regione precoce di adenovirus 5. sono cotransfettate con il vettore di integrazione pSU3Rtat e con pHEBo e quindi trasformate con il vettore episomiale pRPneoU3RX ove X è un gene sotto ±1 controllo dell'LTR di HIV-1.
- 9. Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il vettore episomiale è pRPneoU3RCAT.
- 10. Processo secondo la rivendicazione 8 in cui il vettore episomiale è pRPneoU3RHBs.
- 11. Enzima cloramfenicolo acetil-transferasi (CAT) prodotto con le cellule secondo la rivendicazione 1.
- 12. Antigene di superficie del virus dell'epatite B (HBsAg) prodotto con le cellule secondo la rivendicazione 1.
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