IT202100018647A1 - Polvere di collagene, procedimento per la sua preparazione e suoi usi. - Google Patents

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Description

DESCRIZIONE dell?invenzione avente per titolo:
?Polvere di collagene, procedimento per la sua preparazione e suoi usi?
Riassunto dell?invenzione
La presente invenzione ha per oggetto una polvere di collagene idrolizzato avente specifiche caratteristiche, un procedimento per la sua preparazione e suoi usi in terapia e non solo.
Contesto tecnico
Il collagene ? la proteina predominante del tessuto connettivo negli animali, incluso l?uomo, e rappresenta la proteina pi? abbondante nei mammiferi (circa il 25% della massa proteica totale), costituendo nell?uomo circa il 6% del peso corporeo, trovandosi in tutte le strutture di sostegno come legamenti, muscoli, articolazioni, membrane sinoviali, cartilagine, ossa e cute.
Il collagene ? composto da fibre orientate parallelamente tra loro in modo da garantire un buon sostegno meccanico e un?elevata resistenza alla trazione.
Esistono svariati tipi di collagene; il collagene ?di tipo I? rappresenta il 90% del collagene totale ed entra nella composizione dei principali tessuti connettivi, come pelle, tendini, ossa e cornea. L'unit? strutturale del collagene ? rappresentata dal tropocollagene che ? una proteina di circa 285 kDa formata da tre catene polipeptidiche con andamento sinistrorso che si associano a formare una tripla elica destrorsa.
Con l?avanzare degli anni la quantit? di collagene nei tessuti del corpo diminuisce, mentre diverse patologie e alcuni traumi possono modificare la composizione delle fibre collagene, provocando la degenerazione dei tessuti connettivi e portando a una resistenza alla trazione ridotta. Le membrane sinoviali e i tendini diventano fragili, meno resistenti alla trazione, la cartilagine diventa pi? sottile o addirittura scompare completamente. Le somministrazioni e infiltrazioni di collagene possono rallentare questo processo e, in alcuni casi, accelerare la rigenerazione a seguito di infortuni. Le infiltrazioni di collagene si applicano in caso di lesioni muscolari e dell?apparato legamentoso delle articolazioni (ad esempio strappi muscolari o strappi dei legamenti), nei processi di degenerazione articolare, vertebrale e tendinea, ad esempio nelle tendiniti.
Esistono vari integratori, creme e polveri contenenti collagene in commercio per svariati usi, dal farmaceutico all?alimentare. Esiste tuttavia ancora la necessit? di disporre di nuove formulazioni a base di collagene, che siano versatili e consentano l?utilizzo in un ampio ventaglio di applicazioni.
Scopi dell?invenzione
? uno scopo dell?invenzione fornire una nuova polvere di collagene idrolizzato avente una specifica granulometria.
? un altro scopo dell?invenzione fornire una nuova polvere di collagene idrolizzato in cui detto collagene ? costituito da oligomeri aventi specifici pesi molecolari.
? un altro scopo dell?invenzione fornire delle composizioni farmaceutiche e nutraceutiche che contengano detta polvere di collagene.
? un altro scopo dell?invenzione fornire dei dispositivi medici per la somministrazione della detta polvere di collagene e/o delle composizioni che la contengano.
? un ulteriore scopo dell?invenzione fornire l?uso in terapia della detta polvere di collagene e/o delle composizioni farmaceutiche che la contengano.
? infine un ulteriore scopo dell?invenzione fornire l?uso nutraceutico e/o cosmetico della polvere di collagene dell?invenzione.
Breve descrizione dei disegni
La Figura 1 mostra la distribuzione granulometrica della polvere di collagene dell?Esempio 1, come distribuzione logaritmica (curva a campana) e cumulativa %.
La Figura 2 mostra riporta i dati numerici sperimentali della distribuzione granulometrica della Figura 1.
Descrizione dell?invenzione
Secondo uno dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto una polvere di collagene idrolizzato (qui di seguito anche solo ?polvere di collagene?) che presenta la seguente granulometria:
- al massimo il 10% delle particelle ha un diametro medio (d0.1) inferiore a 2,5 micron; - almeno il 50% delle particelle ha un diametro medio (d0.5) inferiore a 10 micron; - almeno il 90% delle particelle ha un diametro medio (d0.9) inferiore a 20 micron. Per diametro medio si intende qui indicare il diametro medio della singola particella di collagene ottenuta tramite il processo descritto nel seguito, la cui forma ? assimilabile in prima approssimazione ad una sfera.
Secondo una forma di realizzazione preferita, nella polvere di collagene dell?invenzione il 100% delle particelle ha un diametro medio da 0,5 a 50 micron, preferibilmente da 0,6 a 40 micron.
Secondo una forma di realizzazione preferita, nella polvere di collagene dell?invenzione che presenta la granulometria sopra riportata, gli oligopeptidi del collagene sono caratterizzati dai seguenti pesi molecolari:
- almeno il 30% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 80 a 120 kDa;
- almeno il 25% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 50 a 70 kDa;
- almeno il 25% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 25 a 45 kDa;
- almeno l?85% del detto collagene ha un peso molecolare compreso da 25 a 120 kDa. Secondo una forma di realizzazione preferita, nella polvere di collagene dell?invenzione che presenta la granulometria sopra riportata, gli oligopeptidi del collagene sono caratterizzati dai seguenti pesi molecolari:
- almeno il 30% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 80 a 120 kDa;
- almeno il 25% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 50 a 70 kDa;
- almeno il 25% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 25 a 45 kDa;
- almeno il 14.5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 100 a 110 kDa;
- almeno l?11.5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 80 a 90 kDa;
- almeno l?8.0% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 40 a 45kDa;
- almeno l?85% del detto collagene ha un peso molecolare compreso da 25 a 120 kDa. Secondo una forma di realizzazione preferita, nella polvere di collagene dell?invenzione che presenta la granulometria sopra riportata, gli oligopeptidi del collagene sono caratterizzati dai seguenti pesi molecolari:
- almeno il 3.0% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale pari a circa 120 kDa;
- almeno il 14.5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 100 a 110 kDa;
- almeno l?11.5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 80 a 90 kDa;
- almeno il 7.0% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale pari a circa 70 kDa;
- almeno l?8.0% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale pari a circa 60 kDa;
- almeno il 10,5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale pari a circa 50 kDa;
- almeno l?8.0% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 40 a 45kDa;
- almeno il 9.5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale pari a circa 35kDa;
- almeno il 6,5% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale pari a circa 25kDa;
- almeno l?85% del detto collagene ha un peso molecolare compreso tra 25 e 120kDa. La determinazione dei pesi molecolari ? stata effettuata mediante elettroforesi proteica. L?elettroforesi proteica ? una tecnica analitica comunemente utilizzata per l?analisi di estratti proteici e della loro integrit?. L?apparecchiatura e le condizioni utilizzate per la valutazione dei pesi molecolari mediante elettroforesi proteica sono riportate nella Sezione Sperimentale che segue.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la polvere di collagene idrolizzato dell?invenzione ? prodotta per proteolisi a partire da atelocollagene, a sua volta derivante dall?eliminazione delle estremit? telopepdiche del collagene di tipo I. Preferibilmente il collagene dell?invenzione ? di origine equina. Preferibilmente, il tessuto biologico equino da cui viene estratto il collagene ? il tendine, in particolare il tendine flessore.
Secondo una forma di realizzazione preferita, la polvere di collagene dell?invenzione mostra la distribuzione granulometrica della Figura 1.
Secondo un altro dei suoi aspetti, l?invenzione ha per oggetto un procedimento per la preparazione della polvere di collagene dell?invenzione che comprende:
(i) sospendere del collagene di tipo I, privato delle porzioni telopeptidiche, in acqua acidificata e sottoporlo a proteolisi; e
(ii) essiccare detto collagene in forma micronizzata.
Nella fase (i), delle sospensioni acide concentrate di collagene, con concentrazioni in peso di collagene dal 3% al 5% (p/v), vengono incubate con enzimi proteolitici, ad esempio con pepsina, al fine di modulare i pesi molecolari delle catene polipeptidiche del collagene. In questa fase le macromolecole di collagene (cio? le triple-eliche) vengono parzialmente destrutturate e aperte. Questo trattamento ne aumenta la biodisponibilit?, il bioassorbimento. Successivamente, la sospensione viene spruzzata sotto forma di aerosol, che viene poi rapidamente essiccato portando all?ottenimento di una polvere; tale procedimento ? noto nella pratica industriale con il nome di ?spray-drying?.
A titolo di esempio, la proteolisi pu? essere effettuata utilizzando una soluzione acida, ad esempio di acido acetico in acqua demineralizzata, a pH compreso tra 3,0 e 4,0, contenente pepsina al 2.5-10.0% (p/v) alla temperatura di circa 37?C, per alcune ore, ad esempio per 2-24 ore.
Altre metodiche possono alternativamente essere utilizzate per produrre la polvere di collagene dell?invenzione.
La polvere di collagene dell?invenzione si ? dimostrata particolarmente efficace in una serie di utilizzi, ad esempio come integratore, in cosmetica e in campo medico. In particolare, si ? osservato che la sua caratteristica distribuzione di pesi molecolari promuove un?ottima rigenerazione a livello del derma e delle mucose.
Per il suo utilizzo, la polvere di collagene dell?invenzione pu? essere utilizzata come tale o, se necessario, dopo opportuno trattamento di sterilizzazione (ad esempio utilizzando irraggiamento ? o ?, secondo le tecniche note). La polvere di collagene dell?invenzione pu? ad esempio essere spruzzata o applicata su ferite, ustioni, piaghe o simili, oppure, alternativamente pu? essere formulata in una composizione farmaceutica o nutraceutica o cosmetica, o inclusa in dispositivi medicali.
?Composizione farmaceutica, nutraceutica o cosmetica? indica una composizione comprendente la polvere di collagene dell?invenzione in associazione con almeno un veicolo accettabile per l?uso a cui tale composizione ? destinata. Un ?veicolo farmaceuticamente accettabile? include diluenti, agenti conservanti, riempitivi, agenti disintegranti, agenti bagnanti, agenti emulsionanti, agenti sospendenti, agenti dolcificanti, agenti aromatizzanti, agenti profumanti, agenti antibatterici, agenti antifungini, agenti lubrificanti e agenti di erogazione. Descrizioni di veicoli farmaceuticamente accettabili e fattori coinvolti nella loro selezione sono noti alla tecnica.
A seconda dell?uso a cui ? destinata, la composizione dell?invenzione pu? essere liquida o solida, o essere formulata in gel, creme, unguenti, paste e simili, che possono essere anche sterili, se necessario, ad esempio in caso di preparati iniettabili o da utilizzare su ferite aperte. Come detto, la polvere di collagene dell?invenzione pu? anche essere utilizzata in combinazione con dispositivi medicali, come ad esempio, ma non solo, patch e garze medicate per la cura delle ferite, ustioni e piaghe di qualsiasi natura, o pu? essere confezionata come soluzione sterile in siringhe pre-riempite.
L?uso della polvere di collagene dell?invenzione o delle composizioni che la contengono, in terapia, in cosmesi e come integratore alimentare costituisce un ulteriore oggetto dell?invenzione.
A titolo di esempio, la polvere di collagene dell?invenzione pu? essere utilizzata per il trattamento delle ferite e delle piaghe, mediante applicazione diretta o attraverso dei dispositivi medicali, o pu? essere usata per il trattamento dei disturbi delle articolazioni, ad esempio mediante infiltrazione, per il trattamento della cistite interstiziale, ad esempio per iniezione di composizioni viscose e/o adesive, per applicazione vaginale, ad esempio nel trattamento delle vulvovaginiti, ecc.
La polvere di collagene dell?invenzione pu? altres? essere utilizzata per la rigenerazione e la bio-rivitalizzazione del derma e per la visco-supplementazione e rigenerazione nella sinovia in caso di danni osteo-condrali.
Infatti, la polvere di collagene dell?invenzione ? molto utile per prevenire e trattare l?invecchiamento cutaneo e pu? essere somministrata in creme, lozioni, gel e simili oppure iniettata sotto la pelle come filler, ad esempio ma non solo, per distendere rughe o risolvere altri problemi estetici.
Come detto, la polvere di collagene dell?invenzione pu? anche essere assunta per via orale come integratore alimentare o essere inclusa in composizioni cosmetiche.
La composizione dell?invenzione pu? comprendere, oltre alla polvere dell?invenzione e a eventuali veicoli e additivi opportuni, anche altri principi attivi, come ad esempio acido ialuronico o i suoi sali, ad esempio ialuronato di sodio, di vari pesi molecolari, condroitina o i suoi sali, ad esempio condroitina solfato, probiotici, prebiotici, postbiotici, vitamine, come la Vitamina C, agenti antimicrobici come l?argento, e simili.
Secondo un altro dei suoi aspetti l?invenzione ha per oggetto un metodo per trattare piaghe, ustioni o ferite, disturbi articolari, invecchiamento della pelle, cistite interstiziale e vulvovaginiti, che comprende somministrare a un soggetto che lo necessita una quantit? efficace della polvere o della composizione dell?invenzione.
Il soggetto che riceve la polvere o la composizione dell?invenzione ? generalmente un mammifero, incluso, ma non limitato a, l?essere umano.
L?invenzione verr? ora descritta in dettaglio negli esempi che seguono a scopo illustrativo e in alcun modo limitativo.
Sezione sperimentale
L?apparecchiatura e le condizioni dell?analisi granulometrica sono riportate qui di seguito: Materiale: Polvere di collagene
Apparecchiatura: Hydro 2000S (A)
Indice di rifrazione: 1.6
Assorbimento: 0.01
Intervallo dimensioni: 0.02-2000um
Disperdente: Tegiloxan
Velocit? di agitazione: 2800rpm
Concentrazione: 0,0171 % Vol
Span: 1.778
Unit?: Volume
L?apparecchiatura e le condizioni per la valutazione dei pesi molecolari mediante elettroforesi proteica sono riportate qui di seguito:
Apparato elettroforetico Mini-Protean Tetra Cell (BioRad Laboratories, Inc.) con gel di poliacrilammide. Il gel di poliacrilammide ? stato preparato manualmente (gel di separazione all'8%, gel di concentrazione al 5%) utilizzando una soluzione di acrilammide/bisacrilammide con un rapporto di 37.5:1. Campioni di circa 5 mg sono stati sospesi in 0.2 ml di acido acetico 0.5 M. Successivamente, a ciascun campione ? stata aggiunta una soluzione riducente (0.1 ml) composta da tampone Laemmli (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, glicerolo 10%, SDS 2%, blu di bromofenolo 0.01%, ?-mercaptoetanolo 5%) e urea 2M (0,1 ml). Tutti i campioni sono stati trattati termicamente a 50?C per 1 ora e poi sottoposti a centrifugazione per 1 minuto a 10000 g. In ogni pozzetto elettroforetico sono stati caricati circa 5-15 ?l di sovranatante. Sono stati inoltre caricati gli standard proteici con pesi molecolari precisi (marcatori) compresi tra 10 e 250 kDa al fine di determinare correttamente il peso molecolare delle proteine a peso molecolare sconosciuto. La corsa ? stata condotta a 70 V per circa 10 minuti nel gel di concentrazione e a 120 V per circa 2 ore nel gel di separazione. Al termine della corsa elettroforetica, il gel ? stato immerso in una soluzione di fissazione a base di Coomassie (0.125% Coomassie Blue R 250, 40% metanolo, 10% acido acetico) per 1 ora. Infine, il gel ? stato immerso in una soluzione decolorante (40% metanolo, 10% acido acetico) durante la notte a 4?C e acquisito.
Esempi
Esempio 1
Procedimento per la preparazione della polvere di collagene dell?invenzione
L?esatto quantitativo di fibre grezze di collagene, omogeneizzate, viene trasferito nel contenitore di un mixer da laboratorio, all?interno del quale viene poi aggiunta una soluzione di AcOH (1,5%) in acqua deionizzata (con un rapporto pari a 0,25 ml di AcOH per grammo di collagene), in modo da ottenere una sospensione di collagene con concentrazione in peso su volume pari al 3%wt/v. La sospensione viene posta in miscelazione per almeno 1 ora a 50 rpm e temperatura ambiente. Il gel cos? ottenuto viene trasferito all?interno di un secondo mixer e ulteriormente mescolato a 200 rpm, per 1 ora a 37?C. A questo punto, al gel in miscelazione viene aggiunta una soluzione proteolitica di pepsina (5% rispetto al peso di collagene) in AcOH (0.07%), e il sistema viene mantenuto in agitazione (200 rpm) a 37?C per 4 ore. Al termine dell?incubazione enzimatica, il gel di collagene viene essiccato tramite ?spray-drying?. La polvere micrometrica cos? ottenuta viene, infine, ulteriormente essiccata tramite ?air-drying?, per 12 ore a temperatura ambiente e conservata per le successive lavorazioni.
La polvere cos? ottenuta mostra la granulometria della Figura 1, i cui dati sperimentali sono riportati nella Tabella della Figura 2.
Esempio 2
Si prepara una soluzione iniettabile in siringhe pre-riempite comprendenti, per ciascuna siringa da 50 ml, 80 mg di polvere di collagene dell?Esempio 1, acqua/soluzione salina, acido ialuronico, condroitin solfato, tamponi qb per raggiungere pH.4,5
Esempio 3
Si prepara una garza medicata comprendente 20 mg di polvere di collagene dell?Esempio 1, integrata in una soluzione acquosa di glicerina al 2%/gr/25cmq.
Esempio 4
Si prepara una miscela di 100 mg di polvere di collagene dell?Esempio1, addizionata di amido di riso o amido di mais, un mix di trigliceridi, isopropanolo e benzina medicale, per la realizzazione di una formulazione in spray ? 10 gr di contenuto in bombolette da 100 ml. Esempio 5
Si prepara un supporto di silicone medicale ad alta porosit?, integrato con un sottile strato di collagene ? lamina ? caricata con 100 mg di polvere di collagene dell?Esempio 1 per una superficie di 100 cmq.
Esempio 6
Si prepara una soluzione di prodotto per irrigazione vaginale in ampolle contenenti, per ciascuna ampolla da 10 ml, 10 mg di polvere di collagene dell'Esempio 1, acqua/soluzione salina e, a seconda delle indicazioni d'uso desiderate uno o pi? componenti scelti tra probiotici, postbiotici e prebiotici; alla composizione cos? ottenuta viene aggiunta una soluzione tampone qb per raggiungere pH 4,5.
Esempio 7
Si prepara una soluzione di prodotto in ovuli vaginali contenenti 5 mg di polvere di collagene dell'Esempio 1, acqua, glicerolo, acido lattico e a seconda delle indicazioni d'uso desiderate uno o pi? componenti scelti tra probiotici, postbiotici e prebiotici.
Esempio 8
Si prepara una fiala con 80 mg della polvere dell?Esempio 1 da utilizzare per la rigenerazione/bio-rivitalizzazione del derma. La polvere va ricostituita con acqua PPI prima dell?uso.
Esempio 9
Si prepara una fiala con 80 mg della polvere dell?Esempio 1 da utilizzare per la viscosupplementazione e rigenerazione nella sinovia in caso di danni osteo-condrali. La polvere va ricostituita con acqua per PPI prima dell?uso.

Claims (10)

Rivendicazioni
1. Polvere di collagene idrolizzato che mostra la seguente granulometria:
- al massimo il 10% delle particelle ha un diametro medio inferiore a 2,5 micron; - almeno il 50% delle particelle ha un diametro medio inferiore a 10 micron;
- almeno il 90% delle particelle ha un diametro medio inferiore a 20 micron.
2. Polvere di collagene secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che detto collagene idrolizzato ? costituito da oligopeptidi aventi i seguenti pesi molecolari: - almeno il 30% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 80 a 120 kDa;
- almeno il 25% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 50 a 70 kDa;
- almeno il 25% delle molecole oligopeptidiche ha un peso molecolare medio ponderale da 25 a 45 kDa;
- almeno l?85% del detto collagene ha un peso molecolare compreso da 25 a 120 kDa.
3. Polvere di collagene secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto che detto collagene ? di tipo I.
4. Polvere di collagene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzata dal fatto che detto collagene ? equino.
5. Polvere di collagene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, caratterizzata dal fatto che mostra la distribuzione granulometrica della Figura 1.
6. Composizione farmaceutica, nutraceutica o cosmetica che comprende la polvere di collagene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, insieme ad almeno un veicolo appropriato.
7. Uso della polvere di collagene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 come integratore alimentare o come prodotto cosmetico.
8. Polvere di collagene secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, per il suo uso in terapia.
9. Polvere di collagene secondo la rivendicazione 8, per l?uso nel trattamento di piaghe, ustioni, ferite, disturbi articolari, invecchiamento della pelle, cistite interstiziale e vulvovaginiti; per la rigenerazione e la bio-rivitalizzazione del derma e per la viscosupplementazione e rigenerazione nella sinovia in caso di danni osteo-condrali.
10. Procedimento per la preparazione della polvere di collagene dell?invenzione che comprende:
(i) sospendere del collagene di tipo I, privato delle porzioni telopeptidiche, in acqua acidificata e sottoporlo a proteolisi; e
(ii) essiccare detto collagene in forma micronizzata.
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