IT202100018455A1 - Biomarcatori della malattia di alzheimer - Google Patents
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Description
Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:
?BIOMARCATORI DELLA MALATTIA DI ALZHEIMER?
La presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi o prognosi della malattia di Alzheimer, o per prevederne l?insorgenza, basato sull?analisi di molecole di N-acilfosfatidiletanolammine (NAPE) come biomarcatori. L?invenzione rende inoltre disponibile un kit per l?attuazione del metodo diagnostico, prognostico o predittivo della malattia, comprendente mezzi e reagenti utili per determinare la concentrazione dei biomarcatori nel campione di analisi.
Background dell?invenzione
La malattia di Alzheimer (AD) ? un disordine neurodegenerativo a lungo termine che colpisce le funzioni motorie e cognitive, il linguaggio, il carattere e l?attivit? mentale dei soggetti che ne sono affetti. Con il progressivo invecchiamento della popolazione, l?incidenza di AD ? in costante aumento e rappresenta una enorme sfida per il sistema sanitario. Sulla base dei dati attualmente disponibili, si ? stimato che, ogni anno, nei paesi europei 9 persone su 1000 con un?et? compresa tra 75 e 79 anni possono sviluppare AD. Attualmente, la diagnosi e la prognosi di AD utilizzano essenzialmente la valutazione clinica, la scansione del liquido cefalorachidiano e/o la medicina radiologica e nucleare (per lo pi? risonanza magnetica e tomografia a emissione di positroni). Tuttavia, nessuno di questi approcci ? sufficientemente sensibile da fornire una diagnosi precoce precisa, in quanto i sintomi dovuti al danno cerebrale devono essere evidenti prima di effettuare una diagnosi finale in vivo. Infatti, la malattia pu? essere diagnosticata solo dopo la manifestazione dei sintomi e quindi in uno stadio avanzato del danno neuronale, quando le opzioni terapeutiche disponibili per i medici (soprattutto neurologi, psichiatri e geriatri) sono notevolmente ridotte. Di fatto, ad oggi, nella pratica clinica non sono disponibili biomarcatori molecolari efficaci per AD, sebbene ne siano stati proposti diversi. Pertanto, ? altamente desiderabile poter disporre di un biomarcatore misurabile con un semplice test del sangue, che sia predittivo della malattia o correlato alla sua insorgenza e al suo stato di avanzamento, e che permetta di valutarne l?evoluzione nel tempo.
Stato dell?arte
WO2019/091952, a nome degli stessi richiedenti, descrive un metodo per la diagnosi o prognosi di malattia neurodegenerativa comprendente l?analisi dei livelli plasmatici di diverse N-acilfosfatidiletanolammine (NAPE), considerate singolarmente e/o in combinazione tra loro. Gli autori hanno osservato una correlazione tra la diminuzione della concentrazione plasmatica delle molecole di NAPE e l?insorgenza o l?avanzamento delle malattie di Parkinson e Alzheimer, e hanno individuato i valori soglia dei biomarcatori che permettono di discriminare gli individui affetti da tali malattie.
Risultati simili, per quanto riguarda i biomarcatori della malattia di Parkinson, sono riportati nell?articolo Hamid Z. et al., ?Gender specific decrease of a set of circulating N-acylphosphatidyl ethanolamines (NAPEs) in the plasma of Parkinson?s disease patients?, Metabolomics (2019) 15:74.
WO2007/050318 descrive un metodo per correlare il profilo lipidico con la progressione di un disturbo del sistema nervoso centrale (SNC), ad esempio un disturbo psichiatrico o un disturbo neurodegenerativo. Tra i metaboliti utilizzati come biomarcatori per i disturbi del SNC sono citate le fosfatidiletanolammine e la fosfatidilcolina.
EP1482920 riguarda l'impiego di miscele di fosfolipidi contenenti N-acetilfosfatidiletanolammine (NAPE) e/o miscele di fosfolipidi contenenti N-acetiletanolammine (NAE) insieme ad acidi fosfatidici (PA) e/o lisofosfatidici (LPA), per la preparazione di medicinali aventi attivit? anoressizzante o di medicamenti o prodotti alimentari per il trattamento di varie patologie, tra cui AD, PD e la demenza senile.
L?articolo - ?Occurrence, biosynthesis and functions of N-acylphosphatidylethanolamines (NAPE): Not just precursors of N-acylethanolamines (NAE)? descrive il ruolo delle molecole N-acilfosfatidiletiletanolammine bioattive in vari processi fisiologici. L'articolo mostra che i livelli di NAPE aumentano fortemente in risposta a condizioni di stress che comportano cambiamenti degenerativi della membrana plasmatica cellulare. In particolare, i livelli di NAPE sono aumentati fortemente nella corteccia, nell'ippocampo e nel collicolo inferiore.
EP2950102 descrive un metodo per determinare la probabilit? che un paziente con disturbo cognitivo possa sviluppare AD. Il metodo si basa sulla rilevazione in campioni di sangue, siero o plasma dei livelli di diversi biomarcatori, tra i quali la ceramide.
Descrizione dell?invenzione
Si ? ora trovato che certe NAPE, naturalmente presenti nel plasma umano, diverse da quelle precedentemente descritte dagli stessi inventori in WO2019/091952, sono in grado di discriminare tra individui affetti da malattia di Alzheimer (AD) e non, con un livello di accuratezza maggiore rispetto al gruppo di molecole NAPE descritte nella precedente domanda di brevetto e pertanto rappresentano un efficace biomarcatore di AD.
Per giungere a questo risultato, sono stati analizzati campioni di plasma provenienti da pazienti AD confrontandoli con quelli di altrettanti individui sani dal punto di vista cognitivo e comparabili ai primi per genere ed et?. I campioni di plasma sono stati analizzati per determinare il livello di diverse specie NAPE, utilizzando una metodica di cromatografia liquida combinata con spettrometria di massa (LC-MS/MS).
I campioni sono stati acquisiti in ordine casuale da un gruppo di lotti differenti, includendo campioni di controllo qualit? (miscela di plasma murino). I dati sono stati raggruppati e analizzati con tecniche di analisi multivariata, arrivando a identificare un gruppo di NAPE in grado di differenziare tra soggetti malati e sani. L?efficacia discriminante delle NAPE ? stata quindi confermata mediante ulteriori analisi statistiche e si ? potuto definire un modello o ?pattern? di correlazione per ciascuna molecola, in base alla sua variazione rispetto ai controlli, consistente in un aumento (?upregulation?) o in una diminuzione (?downregulation?) della concentrazione di NAPE. Dal confronto delle curve Receiver Operation Characteristics (ROC) delle molecole NAPE oggetto della presente invenzione con quelle descritte in WO2019/091952, le prime sono risultate significativamente pi? efficaci come biomarcatori e/o predittori di malattia AD.
L?analisi della distribuzione delle quantit? delle diverse NAPE nella popolazione sana ha permesso di identificare valori plasmatici di riferimento per ognuna di queste NAPE. Valori misurati al di fuori di questi limiti sono indicativi di presenza di malattia, sua progressione o rischio di sua insorgenza. Valori significativamente diversi da quelli di riferimento potrebbero rendere necessarie ulteriori indagini diagnostiche volte ad accertare la presenza o l?avanzamento della malattia, per esempio attraverso test cognitivi pi? approfonditi.
Pertanto, secondo un primo aspetto, l?invenzione rende disponibile un metodo in vitro per determinare la presenza o il rischio di insorgenza della malattia di Alzheimer in un soggetto, per monitorarne l?evoluzione nel tempo o per determinare l?efficacia di un trattamento farmacologico finalizzato alla sua cura, detto metodo comprendendo:
a) la determinazione, in un campione di plasma del soggetto, della concentrazione di almeno un biomarcatore scelto tra le seguenti N-acilfosfatidiletanolammine (NAPE):
P16:0/18:1/N16:0; P18:0/18:2/N16:0; P16:0/22:5/N16:0; P16:0/22:4/N16:0; P16:0/22:5/N18:1; P18:0/20:4/N18:1; P18:0/20:5/N18:0; P18:0/22:4/N16:0; P16:0/22:4/N18:0; P18:0/22:6/N18:1; P18:0/22:4/N18:1; P18:0/22:4/N18:0; b) il confronto di detta concentrazione con un valore di riferimento corrispondente alla concentrazione del biomarcatore nel plasma di soggetti non affetti dalla malattia di Alzheimer,
dove una differenza tra detta concentrazione rilevata nel campione di plasma del soggetto in esame e il valore di riferimento indica la presenza o il rischio di insorgenza della malattia di Alzheimer, la sua progressione o l?inefficacia del trattamento farmacologico.
Le strutture delle NAPE qui riportate si riferiscono alle catene di acidi grassi di c atomi di carbonio e n doppi legami legate alle posizioni Sn1 e Sn2 del glicerolo e all?atomo di azoto del residuo etanolamminico, secondo lo schema cc:n/cc:n/Ncc:n. L?acido grasso legato alla posizione Sn1 ? sempre un plasmalogeno (etere lipide). A titolo di esempio, la NAPE P16:0/18:1/N16:0 ha pertanto questa struttura:
Preferibilmente, la concentrazione plasmatica di NAPE ? determinata mediante analisi di cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), come descritto in ?Gender specific decrease of a set of circulating N-acylphosphatidyl ethanolamines (NAPEs) in the plasma of Parkinson?s disease patients?, Metabolomics (2019) 15:74, o secondo la procedura descritta in Basit A. et al, ?Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics?, Metabolomics (2016) 12:50, entrambi qui incorporati per riferimento.
In una modalit? di realizzazione, la metodica LC-MS/MS viene eseguita con uno strumento automatizzato in grado di analizzare diversi campioni disposti su piastre a pozzetti multipli.
La differenza di concentrazione rispetto al valore di riferimento pu? consistere in un aumento o in una diminuzione della concentrazione plasmatica di una certa NAPE, a seconda che quest?ultima sia regolata verso l?alto o verso il basso. In particolare detta differenza corrisponde a un aumento per le seguenti specie: P16:0/18:1/N16:0; P16:0/22:5/N16:0; P16:0/22:4/N16:0; P16:0/22:5/N18:1; P18:0/20:4/N18:1; P18:0/22:6/N18:1; e a una diminuzione per le seguenti specie: P18:0/18:2/N16:0; P18:0/20:5/N18:0; P18:0/22:4/N16:0; P16:0/22:4/N18:0 P18:0/22:4/N18:1; P18:0/22:4/N18:0.
In una realizzazione preferita, l?aumento o la diminuzione rispetto al valore di riferimento ?, in modulo, superiore al 10%, preferibilmente superiore al 30%, pi? preferibilmente superiore al 60%.
L?analisi statistica univariata dei dati acquisiti dall?analisi della popolazione non affetta da AD ha permesso di determinare i seguenti valori di riferimento per ciascuna NAPE:
NAPE valore di riferimento (pmol/ml)
P16:0/18:1/N16:0 30,1
P18:0/18:2/N16:0 40,4
P16:0/22:5/N16:0 84,4
P16:0/22:4/N16:0 190,0
P16:0/22:5/N18:1 33,2
P18:0/20:4/N18:1 74,9
P18:0/20:5/N18:0 31,6
P18:0/22:4/N16:0 21,8
P16:0/22:4/N18:0 49,9
P18:0/22:6/N18:1 19,2
P18:0/22:4/N18:1 7,5
P18:0/22:4/N18:0 7,1
I valori indicati sopra, bench? significativi, attendibili e applicabili allo screening su larga scala, si riferiscono all?intervallo tra il 5 e il 95 quantile della distribuzione dei valori di NAPE plasmatiche osservate nella popolazione di controllo, cognitivamente sana. Detti valori potrebbero variare a seconda del campione di popolazione esaminato (et?, provenienza geografica) e della sua numerosit?. In ogni caso l?esperto, sulla base delle comuni conoscenze del settore, ? in grado di determinare i valori di riferimento riferiti a una determinata popolazione.
In una realizzazione del metodo secondo la presente invenzione, vengono determinate le concentrazioni di 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 delle NAPE qui descritte, e sono poi confrontate con i valori di riferimento relativi a ciascuna molecola. Per una data combinazione di pi? specie NAPE, maggiore ? il numero di NAPE che soddisfa i criteri di variazione rispetto ai rispettivi valori di riferimento come sopra indicati, maggiore ? il valore predittivo del test. Il massimo valore predittivo del metodo si ha quando tutte e 12 le NAPE analizzate contemporaneamente soddisfano i criteri di variazione indicati.
Un ulteriore aspetto dell?invenzione riguarda un kit per l?attuazione del metodo qui descritto, comprendente, come standard interni, quantit? note di una o pi? NAPE come sopra definite e, in contenitori separati, reagenti e tamponi per la preparazione del campione da analizzare o per effettuare l?analisi delle molecole NAPE, in particolare mediante la tecnica LC-MS/MS.
In una realizzazione preferita il kit contiene quantit? note di 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 diverse NAPE tra quelle qui descritte.
Gli esempi che seguono e le figure allegate illustrano l?invenzione in maggiore dettaglio.
Breve descrizione delle figure
Figura 1: diagramma del punteggio (score) ottenuto dall?analisi PCA (Principal Component Analysis) del set di dati dei pazienti AD.
Figura 2: diagramma VIP per il set di dati dei pazienti AD. Il numero si riferisce alle 12 specie NAPE riportate in Tabella 1. Nel modello ? stata inclusa la variabile ?et?? insieme ai biomarcatori.
Figura 3: sovrapposizione delle curve ROC riferite ai migliori marcatori risultanti dallo studio precedente (Hamid Z et al., Metabolomics 2019 - coorte di 30 pazienti AD e 30 controlli), rappresentati dalla curva superiore e rispettivamente i migliori marcatori ottenuti dai dati del presente studio (65 pazienti AD contro 65 controlli), rappresentati dalla curva inferiore.
Esempi
Esempio 1
Analisi e determinazione dei livelli plasmatici delle 12 specie di NAPE I campioni di plasma, conservati a -80 ?C fino all'analisi, vengono gradualmente scongelati a 4 ? C. Aliquote di plasma da 0,2 ml vengono quindi dispensate in una piastra a 96 pozzetti di 2 ml di volume. L'estrazione dei pNAPE viene quindi effettuata con l'aggiunta in ogni pozzetto di 1 ml di Isopropanolo: la soluzione viene quindi agitata su vortex per 1 minuto e in seguito centrifugata a 3000g, 4 ? C per 15 minuti. 0.9 ml di surnatante vengono quindi raccolti e trasferiti in una piastra a 96 pozzetti profondi da 1 ml, dove vengono successivamente essiccati sotto corrente di azoto. Tutta la procedura di estrazione dei NAPE dai campioni di plasma viene effettuata usando una workstation automatizzata di preparazione del campione, al fine di ottimizzare la riproducibilit? del protocollo e l?efficienza di estrazione. Al momento dell?analisi, i campioni vengono quindi risospesi in 0,07 ml di soluzione 9: 1 MeOH: CHCl3 per l'analisi LC-MS/MS. L'analisi mirata dei NAPE viene quindi eseguita su un sistema UPLC Waters Acquity accoppiato con uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo Xevo TQ-MS. Analoghi sistemi a triplo quadrupolo, prodotti da altre Ditte (Agilent, Sciex, Shimadzu, Thermo), dopo una adeguata fase di trasferimento del metodo, forniranno risultati analoghi a quelli descritti nella presenta domanda. Le NAPE vengono separate cromatograficamente su una colonna BEH C18 a fase inversa (2,1 x 50 mm, 1,7 um), la cui temperatura ? mantenuta a 55 ?C, ed eluiti a una velocit? di flusso di 0,450 ml /min utilizzando le seguenti condizioni di gradiente: A = 10 mM formiato di ammonio in acetonitrile / acqua (60:40 v / v), B = 10 mM formiato di ammonio in isopropanolo/ acetonitrile (90:10 v / v). Il seguente gradiente viene applicato alla colonna cromatografica:
0,0-1,0 min. 40% B,
1,0-7,0 min 40-100% B
7,0-8,0 min al 100% B.
La colonna viene quindi ricondizionata al 40% B per 1 min. Il tempo di analisi totale ? di 9 min e il volume di iniezione ? impostato su 5 ?l. Lo spettrometro di massa opera in modalit? ESI positiva e gli analiti vengono quantificati mediante monitoraggio a reazione multipla (MRM). Le tensioni del capillare e del cono di campionamento sono state impostate rispettivamente a 3 kV e 30 V per tutte le transizioni. La temperatura della sorgente ? stata impostata a 120?C. La desolvatazione e i flussi di gas del cono (N2) sono stati impostati rispettivamente a 800 e 50 l / h. La temperatura di desolvatazione ? stata fissata a 450 ? C. Le analisi vengono effettuate randomizzando i campioni e acquisendoli in diversi lotti. Ogni lotto deve includere almeno un campione QC (consistente di plasma murino) ogni dieci campioni, che includevano un numero consistente di campioni di controllo di
qualit?. I valori misurati nei controlli di qualit? servono a riallineare i risultati dei
diversi lotti. La quantificazione delle specie NAPE presenti nel plasma viene
effettuata grazie all?uso di una curva di calibrazione a 6 punti preparati aggiungendo
una NAPE sintetica (18:1/18:1/N19:0) a concentrazione crescenti (da 1 a 500 nM)
in plasma umano commerciale. La risposta strumentale ottenuta per il NAPE
sintetico pu? essere considerata simile a quella dei NAPE endogeni. Ci? consente
di convertire l'area sottesa ad ogni picco cromatografico nel valore di
concentrazione corrispondente, espresso in picomol / ml.
La seguente Tabella 1 riporta, per ciascuna NAPE, i parametri MS/MS usati
per la loro rilevazione e quantificazione:
ID Nome Parent m/z Frammento m/z
1 P16:0/18:1/N16:0 940,8 282,3
2 P18:0/18:2/N16:0 966,8 282,3
4 P16:0/22:5/N16:0 988,8 282,3
5 P16:0/22:4/N16:0 990,8 282,3
7 P16:0/22:5/N18:1 1014,8 308,3
10 P18:0/20:4/N18:1 1016,8 308,3
11 P18:0/20:5/N18:0 1016,8 310,3
12 P18:0/22:4/N16:0 1018,8 282,3
13 P16:0/22:4/N18:0 1018,8 310,3
15 P18:0/22:6/N18:1 1040,8 308,3
17 P18:0/22:4/N18:1 1044,8 308,3
18 P18:0/22:4/N18:0 1046,8 310,3
Esempio 2
Analisi dei dati
Campioni di plasma di pazienti AD (65, 33M/32F, et? da 50 a 91 anni) sono
stati analizzati comparativamente rispetto a un gruppo di controllo di individui
cognitivamente sani (65, 34M/31F, et? da 54 a 81). I livelli plasmatici delle NAPE sono
stati misurati con il metodo LC-MS/MS descritto nell?esempio 1. I campioni sono stati acquisiti in ordine casuale da un set di diversi lotti. Campioni QC (plasma di topo, 6 campioni per lotto) sono stati inclusi nella lista. Dopo correzione per effetto del lotto, realizzata riallineando i valori osservati nei campioni QC, assunti come invarianti, tutti i dati sono stati combinati e analizzati con tecniche di analisi multivariata.
La Figura 1 mostra il diagramma del punteggio (score) ottenuto dall?analisi PCA (Principal Componente Analysis) del set di dati. Il diagramma dimostra chiaramente che il gruppo di NAPE analizzate ? in grado di differenziare tra soggetti AD e individui sani. Una successiva analisi supervisionata dell?importanza di ciascun lipide rispetto al potere discriminante del modello ha dimostrato che tutte le 12 NAPE selezionate contribuiscono a prevedere lo stato patologico dei pazienti in misura maggiore rispetto alla variabile et? (Figura 2). La tendenza di questi biomarcatori differisce nelle popolazioni AD e PD: nella malattia di Parkinson (PD) si ? osservata una diminuzione generale delle 5 NAPE, mentre nella popolazione AD alcune NAPE sono regolate verso il basso (quadratini chiari) e altre verso l?alto (quadratini scuri).
Le molecole analizzate mostrano un complesso sistema di correlazioni reciproche e questo contribuisce all?alto valore predittivo delle NAPE selezionate.
? stata poi condotta un?analisi statistica univariata sul nuovo gruppo di biomarcatori, per calcolare la soglia di cambiamento nei livelli circolanti di NAPE, utile per fini diagnostici. La Tabella 2 riassume i risultati e riporta la differenzia media dei valori soglia osservati nella popolazione AD rispetto ai controlli, la significativit? (valori P in un t-test spaiato comparativo) e i valori dell?area sotto la curva (AUC) della corrispondente curva Receiver Operation Characteristic (ROC).
Tabella 2: differenze osservate nella concentrazione di plasma delle 12 NAPE oggetto dell?invenzione analizzate nella popolazione AD rispetto ai controlli; livelli di significativit? in un t-test spaiato a 2 code (controllo vs AD) e valori AUC della curva ROC corrispondente.
Le due popolazioni analizzate differiscono significativamente tra loro. I dati sui pazienti AD sono stati ottenuti come riportato in precedenza (WO2019/091952) da un campione di 30 individui residenti in Italia, mentre i dati ottenuti con le NAPE qui descritte si riferiscono a una coorte di 65 individui residenti in Austria. La differente numerosit? e provenienza geografica (e quindi il tipo di dieta) dei pazienti pu? spiegare le differenze osservate nei livelli di NAPE.
Successivamente sono state confrontate le due migliori curve ROC ottenute con i precedenti biomarcatori e rispettivamente con quelli della presente invenzione. Tre NAPE del precedente gruppo di biomarcatori hanno mostrato valori di AUC molto simili (Tabella 2). Dalle curve ROC dei nuovi biomarcatori si ricava il pi? alto valore di AUC per la NAPE P16:0-22:5-N18:1, quale predittore di AD. La Figura 3 riporta le curve sovrapposte di P18:0-22:-N18:0, miglior marcatore secondo la prior art, e P16:0-22:5-N18:1, miglior marcatore secondo la presente invenzione (curva superiore).
Dall?analisi dei quantili 5% e 95% della distribuzione di ciascuna NAPE nella la popolazione sana risulta che i livelli plasmatici di NAPE inferiori o superiori ai valori di riferimento riportati nella seguente Tabella 3, sono indicativi di un potenziale stato AD:
Tabella 3. Valori soglia della concentrazione di NAPE (in pmol/ml) indicativi di uno stato AD. I dati sono calcolati sulla base dei quantili 5% e 95% osservati nella popolazione cognitivamente sana.
Per determinare questi valori di riferimento ? stata analizzata la distribuzione dei livelli di ciascuna NAPE nei 65 individui della coorte di controllo, assumendo che questi livelli rappresentano l?intervallo di concentrazione normale di questi lipidi nel plasma di una generica popolazione cognitivamente sana. ? stata quindi calcolata la media delle corrispondenti NAPE nella coorte AD e confrontata con il quantile 5% o 95% della coorte di controllo. I valori di riferimento per AD sono stati fissati assumendo un rischio di errore del 5% e sono stati determinati sotto il quantile 5% per quelle NAPE che mostravano una tendenza a decrescere nel gruppo AD, e sopra il quantile 95% per le NAPE che mostravano una tendenza ad aumentare nella popolazione AD.
? evidente che, rispetto ai dati precedenti (WO2019/091952), il gruppo di biomarcatori AD della presente invenzione ? molto pi? specifico e sensibile. Mentre la migliore curva AUC ottenuta con i precedenti biomarcatori su 30 individui (provenienza Italia) ? pari a 0,78, la curva AUC ottenuta con i biomarcatori NAPE P16:0-22:5-N18:1 secondo la presente invenzione (provenienza pazienti: Austria) ? pari a 0,92, e dunque significativamente maggiore. Attraverso la combinazione di biomarcatori secondo la presente invenzione ? possibile aumentare il potere predittivo complessivo fino a 0,95.
Esempio 3
Kit diagnostico
Il kit contiene:
1) descrizione dettagliata di tutta la procedura analitica;
2) descrizione dettagliata del protocollo di automatizzazione, comprendente le istruzioni passo-passo per la stazione automatizzata, qualora il Laboratorio utilizzatore ne disponga;
3) vials pre-pesati di ammonio formiato ad altissima purezza, pronto per essere disciolto in acqua e acetonitrile ad altissima qualit? (LC-MS grade) nel laboratorio dove verr? effettuata l?analisi;
4) vials pre-pesati contenenti NAPE esogena prodotta per sintesi (18:1/18:1/N19:0), utile a preparare la curva di calibrazione con cui quantificare i NAPE;
5) vials pre-aliquotati di plama umano commerciale, prelevato da popolazione NON oggetto di indagine, utili a preparare la curva di calibrazione;
6) aliquote di vials pre-aliquotati di plasma murino, utili a preparare i campioni QC.
Claims (10)
1. Metodo in vitro per determinare la presenza o il rischio di insorgenza della malattia di Alzheimer in un soggetto, per monitorarne l?evoluzione nel tempo e/o per determinare l?efficacia di un trattamento farmacologico della stessa, detto metodo comprendendo:
a) determinare, in un campione di plasma del soggetto, la concentrazione di almeno una delle seguenti N-acilfosfatidiletanolammine (NAPE):
P16:0/18:1/N16:0; P18:0/18:2/N16:0; P16:0/22:5/N16:0; P16:0/22:4/N16:0; P16:0/22:5/N18:1; P18:0/20:4/N18:1; P18:0/20:5/N18:0; P18:0/22:4/N16:0; P16:0/22:4/N18:0; P18:0/22:6/N18:1; P18:0/22:4/N18:1; P18:0/22:4/N18:0; b) confrontare detta concentrazione con un valore di riferimento, corrispondente alla concentrazione di NAPE nel plasma di soggetti non affetti dalla malattia di Alzheimer,
dove una differenza tra la concentrazione rilevata nel campione di plasma del soggetto in esame e un corrispondente valore di riferimento indica la presenza o il rischio di insorgenza della malattia di Alzheimer, la sua progressione o l?inefficacia del trattamento farmacologico.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui la concentrazione di NAPE nel campione di plasma ? determinata mediante analisi di cromatografia liquida con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).
3. Metodo secondo la rivendicazione 2, in cui detta analisi LC-MS/MS viene eseguita con uno strumento automatizzato in grado di analizzare diversi campioni disposti su piastre a pozzetti multipli.
4. Metodo secondo la rivendicazione 1, dove detta differenza rispetto al valore di riferimento corrisponde a:
a) un aumento della concentrazione per le seguenti NAPE: P16:0/18:1/N16:0; P16:0/22:5/N16:0; P16:0/22:4/N16:0; P16:0/22:5/N18:1; P18:0/20:4/N18:1; P18:0/22:6/N18:1;
b) una diminuzione della concentrazione per le seguenti NAPE: P18:0/18:2/N16:0; P18:0/20:5/N18:0; P18:0/22:4/N16:0; P16:0/22:4/N18:0 P18:0/22:4/N18:1; P18:0/22:4/N18:0.
5. Metodo secondo la rivendicazione 4, dove detto valore di riferimento per ciascuna NAPE ? il seguente, espresso in pmol/ml:
P16:0/18:1/N16:0 30,1
P18:0/18:2/N16:0 40,4
P16:0/22:5/N16:0 84,4
P16:0/22:4/N16:0 190,0
P16:0/22:5/N18:1 33,2
P18:0/20:4/N18:1 74,9
P18:0/20:5/N18:0 31,6
P18:0/22:4/N16:0 21,8
P16:0/22:4/N18:0 49,9
P18:0/22:6/N18:1 19,2
P18:0/22:4/N18:1 7,5
P18:0/22:4/N18:0 7,1.
6. Metodo secondo le rivendicazioni 1 e 4-5, in cui sono determinate le differenze tra le concentrazioni di NAPE e i valori di riferimento per 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 diverse specie NAPE tra quelle indicate nella rivendicazione 1.
7. Metodo secondo la rivendicazione 6, in cui sono determinate le differenze tra le concentrazioni di NAPE e i valori di riferimento per tutte le 12 diverse specie NAPE indicate nella rivendicazione 1.
8. Kit per l?attuazione di un metodo secondo le rivendicazioni precedenti, comprendente quantit? note di una o pi? specie NAPE come definite nella rivendicazione 1, come standard di calibrazione.
9. Kit secondo la rivendicazione 8, comprendente quantit? note di 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 diverse specie NAPE tra quelle indicate nella rivendicazione 1.
10. Kit secondo le rivendicazioni 8-9, comprendente inoltre reagenti e tamponi per la preparazione del campione da analizzare e per effettuare l?analisi, in particolare mediante la tecnica LC-MS/MS.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4370931A1 (en) | 2024-05-22 |
| WO2023285462A1 (en) | 2023-01-19 |
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