IT202100013244A1 - MODULATORI DI PrPC E LORO USI - Google Patents

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IT202100013244A1
IT202100013244A1 IT102021000013244A IT202100013244A IT202100013244A1 IT 202100013244 A1 IT202100013244 A1 IT 202100013244A1 IT 102021000013244 A IT102021000013244 A IT 102021000013244A IT 202100013244 A IT202100013244 A IT 202100013244A IT 202100013244 A1 IT202100013244 A1 IT 202100013244A1
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IT
Italy
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4alkyl
haloalkyl
compound
nhc1
formula
Prior art date
Application number
IT102021000013244A
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English (en)
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Emiliano Biasini
Maria Letizia Barreca
Giuseppe Manfroni
Francesca Fallarino
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Fond Telethon
Univ Degli Studi Di Perugia
Univ Degli Studi Di Trento
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Description

MODULATORI DI PrPC E LORO USI
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda composti in grado di modulare l'attivit? della proteina prionica cellulare (PrPC) e loro uso per il trattamento di malattie neurodegenerative. In particolare, i composti dell'invenzione sono utili nel trattamento di malattie da prioni, malattia di Alzheimer, sclerosi multipla ed encefalite autoimmune.
SFONDO DELL'INVENZIONE
L'invecchiamento ? collegato ad un'ampia gamma di cambiamenti molecolari, cellulari e funzionali, che colpiscono in particolare l'integrit? del sistema nervoso. Un processo fondamentale alterato dall'invecchiamento ? il ripiegamento delle proteine. Quando le proteine si ripiegano in modo errato, acquisiscono conformazioni alternative in grado di seminare una cascata di eventi molecolari, avendo infine come risultato disfunzione neuronale e morte. In effetti, una vasta gamma di disturbi correlati all'et? ? collegata al ripiegamento errato e all'aggregazione delle proteine nel cervello. Esempi includono disturbi comuni come la malattia di Parkinson e la malattia di Alzheimer, nonch? disturbi pi? rari come le malattie da prioni<1>. La malattia di Alzheimer ? la forma pi? comune di demenza nella popolazione anziana, che attualmente colpisce quasi 36 milioni di individui in tutto il mondo. Il numero aumenter? drasticamente nei prossimi decenni con l'invecchiamento della popolazione, producendo devastanti conseguenze mediche e socioeconomiche. Secondo l'ipotesi della cascata amiloide, la malattia di Alzheimer ? una conseguenza dell'accumulo nel cervello del peptide A? di 40-42 amminoacidi, un prodotto di clivaggio della proteina precursore dell'amiloide (APP). La maggior parte dei casi di malattia di Alzheimer si manifesta come forma sporadica ad insorgenza tardiva. Tuttavia, circa il 5% dei casi ? ereditato in modo autosomico dominante. Queste forme, collettivamente indicate come malattia di Alzheimer familiare, sono collegate ad almeno 230 mutazioni nei geni codificanti per APP o preseniline (PS1 o PS2)<2>. Si ritiene che le mutazioni favoriscano l'accumulo di peptide A? nel cervello, aumentandone la sua produzione o riducendone la sua clearance. Il peptide A? forma spontaneamente polimeri che vanno da oligomeri piccoli e solubili a fibrille grandi e insolubili. Una grande quantit? di evidenze suggerisce che gli oligomeri di A? solubili, anzich? gli aggregati fibrillari, sono principalmente responsabili della disfunzione sinaptica alla base del declino cognitivo nella malattia di Alzheimer<3>. Si ritiene che gli oligomeri di A? agiscano legandosi a recettori di superficie cellulare che trasducono i loro effetti dannosi sulle sinapsi. L'identificazione di tali siti di recettore ha importanti implicazioni terapeutiche, in quanto rappresentano potenziali bersagli per l'intervento farmacologico. Recentemente, un nuovo candidato ? emerso come recettore per gli oligomeri di A?: la forma cellulare della proteina prionica (PrPC)<4. >La PrPC, una glicoproteina endogena di superficie cellulare con funzione sconosciuta, svolge un ruolo centrale nei disturbi neurodegenerativi trasmissibili comunemente indicati come malattie da prioni.
La PrPC ? stata originariamente scoperta per il suo ruolo centrale nelle encefalopatie spongiformi trasmissibili (chiamate anche malattie da prioni) ed ? stata rivendicata la sua partecipazione a svariate altre patologie del sistema nervoso, incluse la malattia di Alzheimer e la malattia di Parkinson, agendo come recettore di trasduzione della tossicit? per diverse isoforme proteiche ripiegate in modo errato. In modo interessante, ? stato anche riportato che la PrPC esercita importanti funzioni anche al di fuori del sistema nervoso, in particolare nel sistema immunitario, e la proteina ? emersa come fattore chiave per l'omeostasi della mielina. Coerentemente con questi concetti, ulteriori studi hanno rivelato che l'assenza di PrPC esacerba il danno infiammatorio in una variet? di modelli di laboratorio di ischemia cerebrale, trauma cerebrale, encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e colite sperimentale.
Le malattie da prioni, che possono manifestarsi in modo sporadico, ereditario o acquisito, sono causate dalla conversione conformazionale della PrPC in un'isoforma ripiegata in modo errato (chiamata forma scrapie della PrP, o PrPSc) che si accumula nel sistema nervoso centrale degli individui colpiti. La PrPSc ? una proteina infettiva (prione) che si propaga legandosi alla PrPC, innescando la sua ri-disposizione conformazionale in nuove molecole di PrPSc<5>. Una grande quantit? di evidenze indica una distinzione tra infettivit? e tossicit? prionica e suggerisce che una funzione fisiologica della PrPC pu? essere alterata quando si lega a PrPSc, per rilasciare segnali neurotossici. Infatti, ? stato mostrato che la PrPC neuronale con deplezione genetica nei topi infettati da prioni inverte la perdita neuronale e la progressione clinica, nonostante la continua produzione di PrPSc da parte degli astrociti circostanti<6>. Pertanto, la presenza della PrPC sulla superficie neuronale ? fondamentale non solo per supportare la propagazione di PrPSc, ma anche per trasdurne la sua neurotossicit?<7,8>. Questa conclusione ha recentemente trovato un supporto inatteso dai dati che coinvolgono oligomeri di A?. La PrPC ? emersa da uno screening di clonaggio dell'espressione come recettore in grado di legare oligomeri di A? con affinit? nanomolare. In modo importante, ? stato inoltre trovato che la PrPC era un mediatore della sinaptotossicit? indotta da A?<4>. A sostegno di questa conclusione, le fette di ippocampo derivate da topi knock-out (KO) per PrP si sono mostrate resistenti alla soppressione indotta da oligomeri di A? del potenziamento a lungo termine (LTP), un correlato in vitro della memoria e della funzione sinaptica. Coerentemente con ci?, l'applicazione di anticorpi anti-PrP ha mostrato di prevenire la disfunzione sinaptica indotta da A? nelle fette di ippocampo<9>. Infine, la PrPC era necessaria sia per i deficit cognitivi sia per la ridotta sopravvivenza osservata nei modelli murini transgenici della malattia di Alzheimer<10>. Numerosi studi successivi hanno esteso questa osservazione scoprendo che svariati assiemi di A?, inclusi oligomeri neurotossici di A?, si legano con elevata affinit? a PrPC attraverso due siti nella coda N-terminale non strutturata della proteina (residui 23-27 e 95-105)<11. >Questa interazione scatena una segnalazione tossica che coinvolge il recettore metabotropico del glutammato 5 (mGluR5), l'attivazione della tirosin chinasi Fyn e la fosforilazione della subunit? NR2B dei recettori NMDA, producendo infine una disregolazione della funzione recettoriale, eccitotossicit? e retrazione della spina dendritica<12>. Altri studi recenti hanno fornito evidenza che la PrPC pu? mediare la tossicit? non solo degli oligomeri di A?, ma anche di altri conformatori proteici ricchi di foglietti ?, inclusa l'alfa sinucleina, coinvolta nella malattia di Parkinson<13-15>. Questi risultati indicano che assiemi ripiegati in modo errato di svariate proteine patogene diverse possono esercitare i loro effetti bloccando, potenziando o alterando la normale attivit? della PrPC<8>. La conclusione evidenzia una stretta connessione tra il ruolo della PrPC in svariate malattie neurodegenerative e la sua funzione fisiologica. Svariate attivit? sono state attribuite alla PrPC nel sistema nervoso, per la maggior parte sulla base di sottili anomalie rilevate nei topi o nelle cellule deplete per PrPC. Queste includono ruoli nella neuroprotezione, integrit? sinaptica, eccitabilit? neuronale e formazione della memoria<16>. Recentemente, la PrPC ha anche mostrato di svolgere importanti funzioni anche al di fuori del sistema nervoso, in particolare nel sistema immunitario<17>. Dopo le interazioni guidate da MHC/peptide tra cellule T e cellule dendritiche (DC), PrPC migra verso la sinapsi immunologica ed esercita effetti differenziali sulla proliferazione delle cellule T e sulla produzione di citochine, come rivelato mediante ablazione o mascheramento degli anticorpi sulle DC o sul lato del linfocita della sinapsi<18>. Le DC sono APC professionali e anche cellule molto plastiche che svolgono un ruolo importante nella differenziazione delle cellule T helper (Th) e quindi sono coinvolte nell'induzione sia dell'autoimmunit? sia della tolleranza<19>. Sorprendentemente, gli autori dell'invenzione hanno trovato che sottoinsiemi di DC selezionati esprimono PrPC di alto livello. Dati recenti hanno anche mostrato che l'EAE ? peggiore nei topi privi di PrPC, indicando che questa proteina pu? agire come molecola regolatoria e che le cellule prive di PrPC possono diventare pi? infiammatorie e comportarsi in modo pi? aggressivo contro il sistema nervoso centrale. Questi risultati ci hanno portato ad ipotizzare che bersagliare farmacologicamente PrPC possa attivare effetti immunoregolatori protettivi in SM.
Un saggio altamente solido e rapido per rilevare la tossicit? spontanea della PrPC mutante in colture cellulari, denominato saggio cellulare basato su farmaco (DBCA), ? stato descritto in precedenza<20>. Questo nuovo saggio ? stato recentemente impiegato per identificare piccole molecole in grado di abrogare l'attivit? di PrPC mutante<21,22>. In modo importante, i derivati di una di tali molecole (chiamate SM) derivanti da diversi cicli di ottimizzazione chimica hanno recuperato la disfunzione sinaptica indotta da A? nei neuroni di ippocampo primari e hanno recuperato le anomalie elettrofisiologiche indotte dai prioni nelle fette di cervello di topo. Collettivamente, questi dati ci hanno portato ad ipotizzare che la modulazione farmacologica dell'attivit? della PrPC possa conferire un vantaggio terapeutico nella sclerosi multipla (SM), un disturbo neurodegenerativo caratterizzato da progressiva perdita di mielina. Inoltre, in un modello murino di EAE, ? stato scoperto che la somministrazione sistemica di tali modulatori di PrPC ha avuto come risultato una riduzione significativa della gravit? della malattia, rispetto ai controlli non trattati. All'interno di questo quadro concettuale, esiste ancora la necessit? di composti in grado di modulare l'attivit? della PrPC.
RIEPILOGO DELL'INVENZIONE
Nella presente invenzione ? stato sorprendentemente trovato che un'impalcatura di tiazinadiossido adeguatamente funzionalizzata fornisce una serie di composti in grado di abrogare l'attivit? di PrPC mutante. I risultati ottenuti all'interno della presente invenzione dimostrano chiaramente che i composti possono rappresentare nuove opzioni terapeutiche per svariate patologie differenti, come malattia da prioni e di Alzheimer, encefalite autoimmune e SM.
Uno scopo della presente invenzione ? un composto di Formula generale (I):
in cui
A ? un anello di benzene o un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi;
B ? un anello di benzene di struttura generale:
Oppure B ? un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi facoltativamente sostituito con uno o pi? sostituenti ciascuno indipendentemente selezionato tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, CONHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-
4alchilammino;
W ? C(=O), C(=S), CH2 o ? assente;
Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, S, C(=O), PO2 e NR4; preferibilmente Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, C(=O) e NR4;
Z ? N o CH;
X1 e X2 sono ciascuno indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-
4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
X3 ? idrogeno, metile, etile, isopropile o benzile;
X4 e X5 sono indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, C1-3alchile, aloalchile, alogeno, cicloalchile, ammino, idrossi, ciano, nitro; n ? 0, 1, 2, 3, 4;
o i residui X3 e X4 presi insieme rappresentano un legame singolo o un C1-4alcandiile, detto legame singolo o detto C1-4alcandiile formando insieme agli atomi a ponte a cui sono rispettivamente collegati un anello eterociclico di 5 o 6 elementi;
R1, R2, R2a e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, idrossi, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, OC1-4alchilammino, SC1-
4alchile;
R4 ? selezionato tra idrogeno, C1-4alchile, C1-4amminoalchile, C1-4idrossialchile, C1-4nitroalchile, C1-4tioalchile, C1-6aloalchile;
Q ? selezionato tra C1-8alchile, C1-8alchenile, cicloalchile, eterocicloalchile, anello di arile, anello eteroaromatico, in cui:
- C1-8alchile ? facoltativamente sostituito con idrossi, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, N(C1-4alchile)2, NH(C=O)C1-4alchile, arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile, ciascuno di detti arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile essendo facoltativamente sostituito con metile, alogeno, idrossi;
- il cicloalchile e l'eterocicloalchile sono ciascuno facoltativamente sostituiti con OH, OSO2R5, C1-3alchile, NR6R7, in cui:
? R5 ? selezionato tra idrogeno, fenile, eteroarile, amminofenile e nitrofenile;
e in cui
? R6 e R7 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra H, metile, C(=O)CH3, SO2CH3;
- l'anello di arile o l'anello eteroaromatico sono ciascuno facoltativamente sostituiti con uno o pi? sostituenti selezionati tra alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NH2, NHSO2C1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
e qualsiasi loro isomero, stereoisomero per l'uso nel trattamento di una malattia neurodegenerativa, preferibilmente per l'uso nel trattamento della malattia di Alzheimer, della malattia da prioni, della sclerosi multipla e dell'encefalite autoimmune
a condizione che il composto
non sia incluso.
Un ulteriore scopo dell'invenzione ? un composto di formula (I)
in cui
A ? un anello di benzene o un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi;
B ? un anello di benzene di struttura generale:
Oppure B ? un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi facoltativamente sostituito con uno o pi? sostituenti ciascuno indipendentemente selezionato tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, CONHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
W ? C(=O), C(=S), CH2 o ? assente;
Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, S, C(=O), PO2 e NR4; preferibilmente Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, C(=O) e NR4;
Z ? N o CH;
X1 e X2 sono ciascuno indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-
4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
X3 ? idrogeno, metile, etile, isopropile o benzile;
X4 e X5 sono indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, C1-3alchile, aloalchile, alogeno, cicloalchile, ammino, idrossi, ciano, nitro; n ? 0, 1, 2, 3, 4;
o i residui X3 e X4 presi insieme rappresentano un legame singolo o un C1-4alcandiile, detto legame singolo o detto C1-4alcandiile formando insieme agli atomi a ponte a cui sono rispettivamente collegati un anello eterociclico di 5 o 6 elementi;
R1, R2, R2a e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, idrossi, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, OC1-4alchilammino, SC1-
4alchile;
R4 ? selezionato tra idrogeno, C1-4alchile, C1-4amminoalchile, C1-4idrossialchile, C1-4nitroalchile, C1-4tioalchile, C1-6aloalchile;
Q ? selezionato tra C1-8alchile, C1-8alchenile, cicloalchile, eterocicloalchile, anello di arile, anello eteroaromatico, in cui:
- C1-8alchile ? facoltativamente sostituito con idrossi, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, N(C1-4alchile)2, NH(C=O)C1-4alchile, arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile, ciascuno di detti arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile essendo facoltativamente sostituito con metile, alogeno, idrossi;
- il cicloalchile e l'eterocicloalchile sono ciascuno facoltativamente sostituiti con OH, OSO2R5, C1-3alchile, NR6R7, in cui:
? R5 ? selezionato tra idrogeno, fenile, eteroarile, amminofenile e nitrofenile;
e in cui
? R6 e R7 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra H, metile, C(=O)CH3, SO2CH3;
- l'anello di arile o l'anello eteroaromatico sono ciascuno facoltativamente sostituiti con uno o pi? sostituenti selezionati tra alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NH2, NHSO2C1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
e qualsiasi loro isomero, stereoisomero per l'uso nel trattamento della sclerosi multipla e dell'encefalite autoimmune.
Preferibilmente nel composto di formula (I) A ? benzene; e/o Y ? SO2; e/o W ? C(=O) o CH2; e/o Z ? N; e/o X4 e X5 sono H.
In una forma di realizzazione preferita, il composto dell'invenzione viene selezionato dall'elenco seguente:
5
Un ulteriore scopo dell'invenzione ? un composto di Formula generale (II):
in cui
A ? un anello di benzene o un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi;
B ? un anello di benzene di struttura generale:
in cui:
R1, R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, COR, COOR, CONHR, OC1-4alchilammino, idrossi, SC1-4alchile;
R2a ? idrogeno, CF3, F, OH, OC1-4alchile, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino
a condizione che:
- se R2a ? idrogeno o F, allora R2 e/o R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra F, Cl, Br, CF3, OMe, OH; o
- se R1 ? alogeno, allora R2a ? idrogeno e R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, COR, COOR, CONHR, OC1-
4alchilammino, idrossi, SC1-4alchile;
o B ? un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi facoltativamente sostituito con uno o pi? sostituenti ciascuno indipendentemente selezionato tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, COR, COOR, CONHR, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
W ? C(=O), C(=S) o CH2;
Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, S, C(=O), PO2 e NR4; preferibilmente Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, C(=O) e NR4;
Z ? N o CH;
X1 e X2 sono ciascuno indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-
4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
X3 ? idrogeno, metile, etile, isopropile o benzile;
X4 e X5 sono indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, C1-3alchile, aloalchile, alogeno, cicloalchile, ammino, idrossi, ciano, nitro; n ? 0, 1, 2, 3, 4;
o i residui X3 e X4 presi insieme rappresentano un legame singolo o un C1-4alcandiile, detto legame singolo o detto C1-4alcandiile formando insieme agli atomi a ponte a cui sono rispettivamente collegati un anello eterociclico di 5 o 6 elementi;
R1, R2, R2a e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, idrossi, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, OC1-4alchilammino, SC1-
4alchile;
R4 ? selezionato tra idrogeno, C1-4alchile, C1-4amminoalchile, C1-4idrossialchile, C1-4nitroalchile, C1-4tioalchile, C1-6aloalchile;
Q ? selezionato tra C1-8alchile, C1-8alchenile, cicloalchile, eterocicloalchile, anello di arile, anello eteroaromatico, in cui:
- C1-8alchile ? facoltativamente sostituito con OC1-4alchile, NHC1-4alchile, N(C1-
4alchile)2, NH(C=O)C1-4alchile, arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile, ciascuno di detti arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile essendo facoltativamente sostituito con metile, alogeno, idrossi; - il cicloalchile e l'eterocicloalchile sono ciascuno facoltativamente sostituiti con OH, OSO2R5, C1-3alchile, NR6R7, in cui:
? R5 ? selezionato tra idrogeno, fenile, eteroarile, amminofenile e nitrofenile; e in cui
? R6 e R7 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra H, metile, C(=O)CH3, SO2CH3;
- l'anello di arile o l'anello eteroaromatico sono ciascuno facoltativamente sostituiti con uno o pi? sostituenti selezionati tra alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NH2, NHSO2C1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino;
e qualsiasi loro isomero, stereoisomero.
Preferibilmente, nel composto come definito sopra A ? benzene; e/o Y ? SO2; e/o W ? C(=O) o CH2; e/o Z ? N; e/o X4 e X5 sono H. Pi? preferibilmente W ? C(=O) e Z ? N.
Ancora preferibilmente il composto dell'invenzione ? selezionato tra:
In una forma di realizzazione preferita il composto come definito sopra ? per uso medico, preferibilmente per l'uso nel trattamento di una malattia neurodegenerativa, ancora pi? preferibilmente per l'uso nel trattamento di malattia da prioni, malattia di Alzheimer, sclerosi multipla o encefalite autoimmune.
Un ulteriore scopo dell'invenzione ? una composizione farmaceutica comprendente almeno un composto come sopra definito, da solo o in combinazione con almeno un ulteriore composto attivo, e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile per l'uso nel trattamento di una malattia neurodegenerativa, preferibilmente per l'uso nel trattamento della malattia di Alzheimer, della malattia da prioni, della sclerosi multipla e dell'encefalite autoimmune, ancora pi? preferibilmente per l'uso nel trattamento della sclerosi multipla e dell'encefalite autoimmune.
Un ulteriore scopo dell'invenzione ? un processo per la sintesi di un composto di formula generale (I) o di formula (II), in cui A ? benzene e Y ? SO2, comprendente le seguenti fasi: a) far reagire un composto di formula 1a con un'ammina aromatica o eteroaromatica di formula 1b, in presenza di un solvente come diclorometano e un'ammina come piridina, trimetilammina, dietilisopropilammina e simili, per dare un composto di formula 2a:
b) ridurre il gruppo nitro del composto di formula 2a a un gruppo ammino mediante idrogenazione in presenza del catalizzatore nichel Raney o con SnCl2?2H2O in condizioni appropriate, per ottenere un composto di formula 3a:
c) convertire il composto 3a in un composto di formula 5a
mediante una prima fase comprendente la reazione con NaNO2, NaOH e HCl in condizioni appropriate, e una seconda fase impiegando polvere di Cu e DMSO come solvente a temperatura ambiente;
d) convertire un composto di formula 5a in un composto di formula (I):
in cui la reazione comprende almeno una delle seguenti fasi:
- reazione di 5a con un agente alchilante di formula hal-(CH2)n-COOEt o con un agente alchilante di formula hal-(CH2)n-Q in cui hal ? bromo o cloro;
- trattamento con un'ammina di formula Q-NHX3 sotto irradiazione a microonde e in condizioni di purezza;
- accoppiamento con un'ammina di formula Q-NHX3 in presenza di agenti condensanti come TBTU in CH2Cl2 e DIPEA o usando SOCl2 come agente clorurante.
I composti della presente invenzione trovano uso in una variet? di applicazioni per la salute umana e animale. I composti della presente invenzione sono piccole molecole in grado di modulare o abrogare l'attivit? di PrPC mutante. Pi? nello specifico, i composti dell'invenzione sopprimono la citotossicit? spontanea di una forma mutante di PrP (?105-125). Inoltre, poich? le molecole di PrP mutante sensibilizzano le cellule all'effetto citotossico di alcuni antibiotici, inclusi G418 e Zeocin, la soppressione di questo fenotipo di ipersensibilit? antibiotica ? stata usata come lettura cellulare per lo screening di librerie di piccole molecole nel saggio DBCA. Usando questo approccio, ? stato trovato che i composti dell'invenzione esibiscono almeno il 30% di attivit? rispetto a un composto di riferimento nella soppressione del fenotipo neurodegenerativo, preferibilmente pi? del 60%, ancora pi? preferibilmente pi? del 100% del composto di riferimento.
I composti dell'invenzione possono potenzialmente modulare in modo indiretto la via di segnalazione mediata del recettore Farnesoide X (FXR). Il recettore Farnesoide X (FXR) ? un recettore nucleare per gli acidi biliari. FXR attivato da ligando regola la trascrizione dei geni per consentire il controllo di retroazione della sintesi e della secrezione degli acidi biliari. In condizioni fisiologiche, l'attivazione di FXR ? il meccanismo maggiore per sopprimere la sintesi degli acidi biliari inducendo direttamente geni bersaglio sia nel fegato sia nell'intestino, inclusi piccolo partner eterodimero (SHP/Shp, codificato dal gene NR0B2/Nr0b2) e fattore di crescita dei fibroblasti (Fgf) 15 (FGF19 nell'uomo), che a sua volta inibisce, o attiva vie di segnalazione per inibire, la trascrizione genica di CYP7A1/Cyp7a1 e CYP8B1/Cyp8b1.<36 >All'interno della presente invenzione ? stato anche scoperto che analogamente a SM231, l'agonista di FXR WAY-362450 recupera in modo potente la tossicit? della PrP mutante. Inoltre, SM231 ha promosso una significativa attivit? trascrizionale di FXR in epatociti primari murini, sebbene i derivati di SM non agiscano come agonisti diretti del recettore FXR (dati non mostrati). Questi risultati aprono l'ipotesi che una modulazione indiretta dell'attivit? di FXR sia coinvolta nel meccanismo d'azione dei composti dell'invenzione.
Come usato nella presente, "alchile" intende includere gruppi idrocarburici alifatici saturi, sia a catena lineare sia ramificati, aventi il numero specificato di atomi di carbonio. Ad esempio, "C1-6alchile" ? definito includere gruppi aventi 1, 2, 3, 4, 5 o 6 atomi di carbonio in una disposizione lineare o ramificata e include specificamente metile, etile, n-propile, ipropile, n-butile, t-butile, i-butile, pentile, esile e cos? via. Preferibilmente, "C1-6alchile" si riferisce a "C1-4alchile" o "C1-3alchile". Pi? preferibilmente, "C1-6alchile" o "C1-3alchile" si riferiscono a metile.
Come usato nella presente, "C1-4alcandiile" include metilene, 1,2-etandiile e i suoi omologhi superiori.
Come usato nella presente, "O-alchile" o "alcossi" rappresenta un gruppo alchile del numero indicato di atomi di carbonio attaccati attraverso un ponte di ossigeno. "O-alchile" racchiude pertanto le definizioni di alchile di cui sopra. Preferibilmente, O-alchile si riferisce a un gruppo OC1-6alchile lineare o ramificato, un gruppo OC1-4alchile, un gruppo OC1-3alchile, o un gruppo OC1-2alchile o OCH3. Esempi di gruppi O-alchile adatti includono, ma senza limitazioni, metossi, etossi, n-propossi, i-propossi, n-butossi, s-butossi o t-butossi. Gruppi alcossi preferiti includono metossi, etossi e t-butossi.
Come usato nella presente, i termini "aloalchile" e "O-aloalchile" intendono un gruppo alchile o alcossi in cui uno o pi? atomi di idrogeno (in particolare da 1 a 3) sono stati sostituiti con atomi di alogeno, in particolare atomi di fluoro o cloro. Un gruppo aloalcossi ? preferibilmente un gruppo aloalcossi lineare o ramificato, pi? preferibilmente un gruppo aloC1-3alcossi, ancora pi? preferibilmente un gruppo aloC1-2alcossi, ad esempio OCF3, OCHF2, OCH2F, OCH2CH2F, OCH2CHF2 o OCH2CF3, e in particolare OCF3 o OCHF2. Un gruppo aloalchile ? preferibilmente un gruppo aloalchile lineare o ramificato, pi? preferibilmente un gruppo aloC1-3alchile, ancora preferibilmente un gruppo aloC1-2alchile, ad esempio CF3, CHF2, CH2F, CH2CH2F, CH2CHF2, CH2CF3 o CH(CH3)CF3. Ancora preferibilmente, uno qualsiasi tra il gruppo aloalchile, aloC1-6alchile, un gruppo aloC1-
4alchile, aloC1-3alchile si riferisce a: CF3, CHF2, CH(CH3)CF3, CH2CF3 o (CH3)2CF3.
Come usato nella presente, il termine "alchilammino" rappresenta un gruppo alchile del numero indicato di atomi di carbonio sostituiti con almeno un gruppo ammino, in cui detto gruppo ammino ? -NH2 o ? ulteriormente sostituito con uno o due gruppi alchile. Ad esempio, C1-4alchilammino indica butilammina, isobutilammina, terz-butilammina, butil-NH(CH3), isobutil-NH(CH3), terz-butil-NH(CH3), butil-N(CH3)2, isobutil-N(CH3)2, terzbutil-N(CH3)2, butil-N(C2H5), isobutil-N(C2H5), terz-butil-NH(C2H5), butil-N(C2H5)2, isobutil-N(C2H5)2, terz-butil-N(C2H5)2, butil-N(C2H5)(CH3), isobutil-N(C2H5)(CH3), terzbutil-N(C2H5)(CH3), e simili. Come usato nella presente, "OC1-4alchilammino" rappresenta C1-4alchilammino di cui sopra attaccato attraverso un ponte di ossigeno.
Come usato nella presente, "NH-alchile" rappresenta un gruppo alchile del numero indicato di atomi di carbonio attaccati attraverso un ponte di NH. Preferibilmente, NH-alchile si riferisce a un gruppo NHC1-6alchile, un gruppo NHC1-4alchile, un gruppo NHC1-3alchile o un gruppo NHC1-2alchile o NHCH3 lineare o ramificato. Analogamente, "N(alchil)2" rappresenta due gruppi alchile del numero indicato di atomi di carbonio attaccati attraverso un ponte di azoto.
Come usato nella presente, "S-alchile" rappresenta un gruppo alchile del numero indicato di atomi di carbonio attaccati attraverso un ponte di zolfo. "S-alchile" racchiude pertanto le definizioni di alchile di cui sopra. Preferibilmente, S-alchile si riferisce a un gruppo SC1-
6alchile lineare o ramificato, un gruppo SC1-4alchile, un gruppo SC1-3alchile o un gruppo SC1-2alchile o SCH3. Esempi di gruppi S-alchile adatti includono, ma senza limitazioni, tiometile, tioetile, tiopropile, tio-i-propile, tio-n-butile, tio-s-butile o tio-t-butile. Gruppi S-alchile preferiti includono tiometile, tioetile e tiopropile.
Come usato nella presente, il termine "arile" intende un anello aromatico monociclico o policiclico che comprende atomi di carbonio e atomi di idrogeno. Se indicato, tale anello aromatico pu? includere uno o pi? eteroatomi, quindi indicato anche come "eteroarile" o "anello eteroaromatico". Esempi illustrativi di gruppi eteroarile secondo l'invenzione includono eteroarile di 5 o 6 elementi come tiofene, ossazolo, ossadiazolo, tiazolo, tiadiazolo, imidazolo, pirazolo, pirimidina, pirazina e piridina. Un arile preferito secondo la presente invenzione ? fenile. Un eteroarile preferito secondo la presente invenzione ? piridile. Anelli di eteroarile di 5 elementi ulteriormente preferiti sono ossadiazolo e ossazolo. Detto ossadiazolo ? preferibilmente sostituito con un gruppo metile.
Come usato nella presente, il termine "cicloalchile" intende un idrocarburo ciclico saturo (cicloalchile) con 3, 4, 5 o pi? atomi di carbonio ed ? generico per ciclopropile, ciclobutile, ciclopentile, cicloesile e cos? via. Il termine "cicloalchile" si riferisce inoltre a sistemi di anelli policiclici saturi, come decaidronaftalene, ottaidro-1H-indene, adamantano e simili. Detto anello saturo contiene facoltativamente uno o pi? eteroatomi (indicati anche come "eterociclile" o "anello eterociclico" o "eterocicloalchile"), in modo tale che almeno un atomo di carbonio sia sostituito da un eteroatomo selezionato tra N, O ed S, in particolare tra N ed O. Preferibilmente, detto cicloalchile ? cicloesile, ancora preferibilmente ciclopentile. Preferibilmente, detto eterocicloalchile ? piridina, pirrolidina, morfolina, piperazina e altre ammine cicliche. Ancora preferibilmente, detto eterocicloalchile ? tetraidrofurano o tetraidropirano.
Come usato nella presente, il termine "alogeno" si riferisce a fluoro, cloro, bromo e iodio, di cui fluoro, cloro e bromo sono preferiti.
I composti secondo la presente invenzione possono avere centri asimmetrici, assi chirali e piani chirali (come descritto in: E.L. Eliel e S.H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pagine 1119-1190), e si verificano come racemati, miscele racemiche, e come diastereomeri singoli, con tutti i possibili isomeri e le loro miscele, inclusi gli isomeri ottici, tutti tali stereoisomeri essendo inclusi nella presente invenzione.
Breve descrizione delle figure
Verranno esaminate forme di realizzazione ed esperimenti che illustrano i principi dell'invenzione con riferimento alle seguenti figure:
Figura 1. Caratterizzazione chimica e biologica di SM3. Il composto SM3 (indicato come LD24 nello studio originario<21>), struttura mostrata nel pannello (A), ? stato precedentemente identificato in uno screening HTS per la sua capacit? di sopprimere l'ipersensibilit? ?CR PrP-dipendente agli antibiotici cationici in modo dose-dipendente. (B) Il saggio cellulare basato su farmaco (DBCA) ? stato eseguito come descritto in precedenza<20,25>. In breve, le cellule HEK293 trasfettate stabilmente con una PrP tossica mutante che trasporta una delezione nella regione centrale della proteina (?105-125) sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e incubate in terreno contenente 500 ?g/ml di Zeocin, per 48 ore a 37 ?C. La morte cellulare in risposta al co-trattamento con SM3 (0,1-10 ?M) ? stata valutata mediante saggio MTT. I dati sono espressi come percentuale di cellule non trattate.
Figura 2. Valutazione della potenza per i derivati di SM3. Il grafico mostra la capacit? relativa di ciascun composto (testato a 1 ?M) di sopprimere l'ipersensibilit? ?CR PrP-dipendente agli antibiotici cationici. I dati sono espressi come la percentuale media rispetto al composto originario SM3 (indicato nel grafico come LD24). Le barre di errore riflettono la deviazione standard. Ciascun composto ? stato testato in almeno tre replicati biologicamente indipendenti (n ? 3).
Figura 3. Analisi dose-risposta di composti selezionati. (A) Nel pannello sono mostrate le strutture chimiche delle molecole selezionate. (B) ? stata impiegata un'analisi doserisposta usando il DBCA per valutare gli effetti anti-?CR PrP delle diverse molecole. I grafici mostrano una quantificazione dell'effetto dose-dipendente di recupero di ciascuna molecola. I valori medi sono stati ottenuti da un minimo di 3 esperimenti indipendenti (n ? 3), ed espressi come percentuale di vitalit? cellulare in cellule non trattate. I dati sono stati adattati a una funzione sigmoidale usando un modello di regressione non lineare logistica a 4 parametri (4PL), consentendo la stima della concentrazione inibitoria semimassima (IC50). (C) La tossicit? intrinseca di ciascun composto ? stata valutata in cellule HEK293 naive, esposte a ciascuna molecola/concentrazione per 48 ore a 37 ?C. La citotossicit? ? stata valutata mediante MTT. I valori medi sono stati ottenuti da un minimo di 3 esperimenti indipendenti (n ? 3), ed espressi come percentuale di vitalit? cellulare in cellule non trattate. I dati sono stati adattati a una funzione sigmoidale inversa usando un modello di regressione non lineare 4PL, consentendo la stima della dose di tossicit? semimassima (LD50).
Figura 4. SM231 recupera la neurotossicit? di A?. I neuroni dell'ippocampo primari sono stati esposti a diverse concentrazioni di oligomeri di A? per brevi periodi (10, 20 o 60 minuti) o per il controllo con veicolo (VHC). Abbiamo confermato che gli oligomeri inducono una fosforilazione rapida e transitoria della chinasi Fyn (i risultati al punto temporale di 20 minuti sono mostrati nel pannello A). Coerentemente con le osservazioni precedenti, questo effetto ? stato impedito dal co-trattamento con un composto diretto da PrPC, TMPyP. In modo interessante, la co-incubazione con SM231 ha completamente abrogato gli effetti di A?, riportando la fosforilazione di Fyn a livelli normali. (B) I neuroni di ippocampo primari sono stati incubati per 3 ore con oligomeri di A? (3 ?M) o controllo con VHC. Coerentemente con i rapporti precedenti, abbiamo osservato una diminuzione di svariati marcatori post-sinaptici (indicati), come valutato mediante Western blotting delle frazioni insolubili al Triton X. In modo importante, la co-incubazione con SM231 per 20 minuti prima dell'incubazione con oligomeri di A? ha recuperato significativamente i livelli di tutti i marcatori post-sinaptici. Il livello di una proteina di controllo (actina) non ? stato influenzato dagli oligomeri di A? o da SM231. (*p < 0,05; ** p < 0,01 mediante test t di Student).
Figura 5. Studi metabolici su SM231. (A) Il software MetaSite ha suggerito tre regioni della molecola come principali siti metabolici (colori rosso e giallo nella struttura 3D e sfere in grassetto indicate da frecce vuote nella struttura 2D) con il ponte di metilene previsto come il pi? reattivo (evidenziato nella sfera rosso/blu e indicato da una freccia nera continua nella struttura 2D di SM231. (B) Esperimenti di docking contro il sito attivo di CYP450 hanno indicato che solo la frazione cicloesile e C-3 (frecce grigie) potevano essere metabolizzati poich? accessibili agli enzimi metabolici epatici. (C) L'incubazione (per 4 ore) di SM231 con microsomi epatici di ratto (RLM) ha indicato un t1/2 di 25 min (pannello C a destra) e l'analisi HPLC-MS della miscela risultante ha suggerito quattro metaboliti (MET1-4) confermando che il cicloesile e il C-3, in misura minore, sono i principali siti metabolici.
Figura 6. Validazione basata su DBCA dei derivati di recente sviluppo. Le strutture chimiche per ogni molecola sono mostrate all'interno dei grafici. ? stata impiegata un'analisi dose-risposta usando il DBCA per valutare gli effetti anti-?CR PrP delle diverse molecole. I grafici mostrano una quantificazione dell'effetto dose-dipendente di recupero di ciascuna molecola. I valori medi sono stati ottenuti da un minimo di 3 esperimenti indipendenti (n ? 3), ed espressi come percentuale di vitalit? cellulare in cellule non trattate. I dati sono stati adattati a una funzione sigmoidale usando un modello di regressione non lineare 4PL, consentendo la stima della concentrazione inibitoria semimassima (IC50).
Figura 7. SM884 recupera la soppressione di LTP mediante un ceppo prionico. Il grafico a barre mostra la quantificazione dell'effetto di recupero su LTP indotto dalla somministrazione cronica di SM884 a fette di cervello trattate fortemente con un lisato di cellule infettate con il ceppo di prione umano M1000 adattato a topo. I valori sono espressi come media /- SEM e calcolati come percentuale di recupero di LTP sui controlli con veicolo. Le differenze statisticamente significative tra le fette trattate con SM884 e quelle non trattate vengono calcolate con il test t di Student: M1000 rispetto a 884 0,03 ?M M1000 p=0,0038 (*); M1000 rispetto a 884 0,1 ?M M1000 p=0,0031 (*). M1000 n=4; 884 0,03?M M1000 n=4; 8840,1 ?M M1000 n=5.
Figura 8. I sottoinsiemi di DC esprimono PrPC endogena e DC2 trattate con SM231 promuovono cellule Treg in co-colture di cellule DC-T. A. Le cellule DC1 e DC2 di topo selezionate sono state trattate con TMP o SM231 e poi sottoposte ad analisi western blot per valutare l'espressione di PrPc usando uno specifico anticorpo anti-Prpc. I risultati mostrati sono la media ? DS di due esperimenti con EAE indipendenti. *P <0,05; test di Mann?Whitney a due code. B. Frequenza delle cellule CD4+ LAP+FOXP3+ in colture di DC (cio? DC1 o DC2), precondizionate con TMP o SM231 o veicolo, trattate con SiRNA di PrPC specifico o un controllo con SiRNA, coltivate con cellule T CD4+ na?ve per 5 giorni. Risultati rappresentativi della frequenza di cellule CD4+CD25+LAP+FOXP3+ (quadranti in alto a destra) in T: Co-colture di DC2 Risultati rappresentativi di un esperimento su tre.
Figura 9. La somministrazione della molecola legante PrPC di riferimento TMP o di una molecola attivante la PrPC SM231 migliora la gravit? di EAE. A. Schema di induzione e trattamento di EAE. B Punteggi clinici di EAE (?SEM) di topi su una base C57BL/6, trattati con diverse dosi di SM 231 (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; test t di Student). C. Colorazione rappresentativa delle sezioni del midollo spinale di topi immunizzati con MOG 35-55 trattati con PBS o SM231, visualizzazione degli infiltrati immunitari e demielinizzazione al giorno 25 dopo l'immunizzazione in topi trattati con PBS o SM231.
Figura 10. SM231 non agisce direttamente sulla PrPC. (A) SM231 non altera la localizzazione della superficie cellulare della PrPC. Cellule HEK293 che esprimono stabilmente una versione con tag EGFP di PrPC sono state fatte crescere a ~ 60% di confluenza su vetrini coprioggetto, e poi trattate con le concentrazioni indicate di SM231 o CPZ per 24 ore. Dopo fissazione e lavaggio, il segnale verde intrinseco di EGFP-PrPC ? stato acquisito con un microscopio invertito accoppiato a una fotocamera ad alta risoluzione dotata di un filtro di eccitazione a 488 nm. (B) SM231 non altera l'espressione di PrPC. Le cellule HEK293 che esprimono PrPC WT sono state trattate con SM231 a diverse concentrazioni (indicate), per 48 ore. I livelli totali di PrP sono stati valutati in lisati di cellule intere mediante Western blot, usando l'anticorpo anti-PrP D18. L'immagine nel pannello in alto illustra un western blotting rappresentativo. Il grafico nel pannello inferiore mostra la quantificazione dei livelli di PrP, ottenuti mediante analisi densitometrica di quattro esperimenti indipendenti (n=4), normalizzando ciascun valore sulla corrispondente corsia colorata con Ponceau S. Le barre rappresentano la media (? SEM), espressa come percentuale dei livelli nelle cellule non trattate. (C) SM231 non si lega a PrPC. L'interazione della porfirina Fe(III)-TMPyP (abbreviata TP), clorpromazina (CPZ) o SM231 con PrPC ricombinante ? stata valutata mediante DMR. Diverse concentrazioni di ciascun composto (0,1-1000 ?M) sono state aggiunte a superfici di pozzetti di micropiastre prive di marcatore (micropiastra EnSpire-LFB HS, Perkin Elmer) su cui era stata precedentemente immobilizzata PrPC ricombinante umana di lunghezza intera o BSA. Le misurazioni sono state eseguite prima (basale) e dopo (finale) l'aggiunta del composto. La risposta (pm) ? stata ottenuta sottraendo il prodotto al basale ai segnali di prodotto finale. Il segnale di prodotto per ciascun pozzetto ? stato ottenuto sottraendo il segnale dell'area di riferimento rivestita di proteine al segnale dell'area non rivestita. I segnali per TP (punti blu) o CPZ (punti verdi) sono stati adattati (linee blu e verdi) a una funzione sigmoidale usando un modello di regressione non lineare 4PL; R<2 >= 0,99; p = 0,00061. Al contrario, non ? stato rilevato alcun legame per SM231, suggerendo che questo composto non esercita i suoi effetti legandosi direttamente alla PrPC.
Figura 11. Un agonista di FXR recupera fortemente la tossicit? di PrP mutante. Il DBCA ? stato impiegato per valutare la capacit? dei due agonisti di FXR, testati a diverse concentrazioni (indicate), di recuperare l'ipersensibilit? a Zeocin conferita dall'espressione di molecole di ?CR PrP murine espresse in cellule HEK293. I grafici a barre illustrano la quantificazione dell'effetto di recupero dose-dipendente di ciascuna molecola. I valori medi sono stati ottenuti da un minimo di 3 preparazioni di coltura cellulare indipendenti, ed espressi come percentuale di recupero della vitalit? cellulare, usando la seguente equazione: R = (T-Z)/(U-Z) (R: effetto di recupero; T: vitalit? cellulare in campioni trattati con composto; Z: vitalit? cellulare in campioni trattati con zeocin; U: vitalit? cellulare in campioni non trattati).
Figura 12. Attivit? trascrizionale di FXR negli epatociti trattati con SM231. Epatociti murini sono stati trattati per 4 o 12 ore, come indicato. I livelli di mRNA di FXR e Nr0b2 sono stati valutati mediante RT-qPCR. I livelli di mRNA in cellule non trattate sono stati arbitrariamente impostati a 1.
MATERIALI E METODI
Chimica: metodi per realizzare i composti di formula generale (I)
Come usato nella presente, le seguenti abbreviazioni hanno i seguenti significati. Se un'abbreviazione non viene definita, si assume il suo significato generalmente accettato. Abbreviazioni
BOP: sale sodico di N-(benzensolfonil)-L-prolil-L-O-(1-pirrolidinilcarbonil)tirosina; DIPEA: N,N-Diisopropiletilammina; DMF: N,N- Dimetilformammide; DMSO: N,N-dimetilsolfossido; EtOAc: acetato di etile; MeOH: metanolo; TBTU: 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilammino tetrafluoroborato; Pir: Piridina;
Salvo diversa indicazione, i reagenti e i solventi sono stati acquistati da fornitori commerciali comuni e sono stati usati come tali. I solventi di grado HPLC usati per l'analisi HPLC sono stati acquistati da Sigma-Aldrich e tutte le fasi mobili impiegate sono state degassate con sonicazione di 10 minuti prima dell'uso. Soluzioni organiche sono state essiccate su Na2SO4 anidro e concentrate con un evaporatore rotante a bassa pressione. Tutte le reazioni sono state regolarmente controllate mediante cromatografia su strato sottile (TLC) su gel di silice 60F254 (Merck) e visualizzate usando UV o iodio. Le reazioni assistite da microonde sono state effettuate usando il reattore a microonde Biotage Initiator 2.0 e i parametri sono stati regolati secondo la reazione come indicato nei seguenti esempi. Cromatografia flash su gel di silice Merck 60 (mesh 230-400). I punti di fusione sono stati determinati in tubi capillari (B?chi Electrotermal modello 9100) e non sono corretti. Gli spettri <1>H NMR sono stati registrati a 200 o 400 MHz (rispettivamente Bruker Avance DRX-200 o 400) mentre gli spettri <13>C NMR sono stati registrati a 100 MHz (Bruker Avance DRX-400) e <1>H H NMR NOESY 2D condotti in modalit? sensibile alla fase. Gli spostamenti chimici sono riportati in ppm (?) rispetto a TMS. Gli spettri sono stati acquisiti a 298 K. L'elaborazione dei dati ? stata eseguita con il software standard Bruker XwinNMR e i dati spettrali sono coerenti con le strutture assegnate. Le rese erano di prodotti purificati e non sono state ottimizzate. Tutti i composti erano ?95% puri come determinato mediante LC/MS usando una macchina Infinity System Agilent 1290 dotata di rilevatore DAD da 190 a 640 nm. La purezza ? stata rivelata a 270,44 nm usando una fase inversa ZORBAX Eclipse Plus C18 (colonna di dimensioni particellari 2,1 x 50 mm, 1,8 ?M) con gradiente di CH3CN allo 0?100% con acido formico allo 0,1% (canale B) in acqua con acido formico allo 0,1% (canale A) per 20 minuti a 0,3 ml/min. Il volume di iniezione era di 0,5 ?l con una temperatura della colonna di 50 ?C. Tutti i composti erano ?95% puri come determinato mediante HPLC usando una macchina Waters System dotata di rilevatore UV. La purezza ? stata rivelata a 254 e 270 nm usando una fase inversa di X Terra C18 (colonna di dimensione particellare x mm, ?M) usata con eluente isocratico 70:30 di CH3CN (canale C) e acqua con acido formico allo 0,1% (canale B) per 10 minuti a 1 ml/min. Il volume di iniezione era 20 ?l con una temperatura della colonna di 25 ?C. Il tempo di ritenzione di picco ? dato in minuti. Il rilevamento HRMS ? stato basato sulla ionizzazione elettrospray (ESI) in polarit? negativa usando Agilent 1290 Infinity System dotato di un rilevatore MS Agilent 6540UHD Accurate Mass Q-TOF.
I composti dell'invenzione possono essere preparati usando al contempo una serie di reazioni chimiche ben note agli esperti del settore, realizzando insieme il processo di preparazione di detti composti ulteriormente esemplificati. I processi descritti ulteriormente sono esclusivamente intesi come esempi e non intendono in alcun modo limitare l'ambito della presente invenzione. In particolare, i composti della presente invenzione possono essere preparati secondo la procedura generale delineata nei seguenti Schemi 1, 2, 3 e 4. Le vie di sintesi e le strutture di analoghi alternative risulteranno evidenti agli esperti del settore della chimica organica.
Lo Schema 1 mostra una procedura utile per realizzare composti eterociclici di formula (I) aventi un'impalcatura di diossido di dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5, vale a dire in cui A ? un fenile, B ? un fenile, Y ? un gruppo SO2, e in cui W ? carbonile, Z ? azoto, X4 e X5 sono idrogeno, n ? come definito per la formula generale (I). Il sostituente Q pu? essere selezionato da quelli descritti nella formula generale (I).
Schema 1. Procedura di sintesi per preparare intermedi e composti bersaglio.
Reagenti e condizioni: i) anilina, Pyr secco, CH2Cl2 secco, 40 ?C; ii) flusso di nichel Raney, H2, DMF, temperatura ambiente o SnCl2?2H2O, HCl 8 N, riflusso; iii) NaOH, NaNO2 e poi HCl conc., 0 ?C, iv) polvere di Cu, DMSO, temperatura ambiente; v) BrCH2CO2Et, DIPEA, DMF, microonde, 80 ?C o alcool alchilico, PhP3, DEAD, ultrasuoni, 25 ?C; vi) eccesso di ammina, microonde, 120 ?C, condizioni di purezza; vii) 10% di NaOH/EtOH aq. (1:1); riflusso; viii) a) ammina, TBTU, DIPEA, CH2Cl2 secco, temperatura ambiente o b) SOCl2, riflusso, e poi ammina, DMF secca, temperatura ambiente o c) BOP, DIPEA, CH2Cl2 secco, temperatura ambiente.
La reazione di accoppiamento di un 2-nitro-benzensolfonil cloruro appropriato di formula (1a) con anilina non sostituita o funzionalizzata, effettuata a 40 ?C in piridina secca, produce le corrispondenti aril 2-nitrobenzensolfonammidi di formula (2a), in rese elevate. Il gruppo nitro di intermedi di formula (2a) ? stato ridotto usando una riduzione catalitica impiegando il flusso di nichel Raney e H2 o SnCl2?2H2O in condizioni acide, a seconda dei substrati, per produrre composti ammino di formula (3a) che sono stati successivamente diazotati usando NaNO2 e HCl seguiti dall'aggiunta di NaOH che promuove la conversione in situ dei composti diazo in intermedi instabili di formula (4a). Questi ultimi sono stati immediatamente isolati come prodotti grezzi e convertiti in intermedi di formula (5a) in rese moderate, impiegando polvere di Cu e DMSO come solvente a temperatura ambiente. I composti di formula (5a) sono stati fatti reagire con etil 2-bromoacetato, sotto irradiazione a microonde a 50 ?C per 15 minuti in DMF e usando DIPEA come scavenger per produrre i composti di formula (6a) in buone rese. Alcuni intermedi di formula (5a) sono stati alchilati sfruttando una reazione di Mitsunobu a dare alcuni composti di formula (6a). Alcuni esempi di intermedi di formula (6a) sono stati trattati con un eccesso di ammine come definito dai sostituenti Q, impiegando irradiazione a microonde a 120 ?C e condizioni di purezza a dare composti bersaglio di formula (8a). In alcuni casi, gli intermedi di formula (7a) sono stati trattati con una miscela di 10% NaOH ed EtOH (rapporto 1:1) aq. per produrre i corrispondenti acidi carbossilici di formula (7a) che sono stati accoppiati con aril ammine o alchil ammine, come definito dal sostituente Q, e sfruttando due diversi metodi che comportano l'uso di agenti condensanti come TBTU in CH2Cl2 e usando DIPEA come scavenger o l'uso di SOCl2 come agente clorurante seguito dall'aggiunta di ammine a dare altri esempi di composti bersaglio di formula (8a). In alcuni esempi, aniline di-sostituite sono state usate per preparare intermedi di formula (5a) come miscela di regioisomeri che sono stati usati tal quali per le fasi di reazione successive per ottenere alcuni composti di formula (8a); i regioisomeri sono stati poi separati in composti finali mediante cromatografia flash per produrre ciascun regioisomero puro.
Lo Schema 2 mostra una procedura utile per realizzare composti eterociclici di formula (I) aventi un'impalcatura di diossido di dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5 in cui A ? un fenile, B ? un fenile, Y ? un gruppo SO2, W ? assente, Z ? azoto, X4 e X5 sono idrogeno, n ? come definito per la formula generale (I). Il sostituente Q pu? essere selezionato da quelli descritti nella formula generale (I).
Schema 2. Procedura di sintesi per la preparazione di alcuni composti bersaglio.
Reagenti e condizioni: alchil alogenuri, DIPEA, microonde, DMF, 70 ?C.
Alcuni composti di formula (5a) sono stati alchilati usando bromo/cloroalchili in cui Z ? stato scelto tra quei sostituenti riportati in formula (I) e con n=1,2,3,4 usando il dialogenuro appropriato sotto irradiazione a microonde a 80 ?C e usando DIPEA come scavenger.
Lo schema 3 mostra una procedura per sintetizzare i composti SM226 e SM230 a partire da un composto SM225 che ? stato demetilato impiegando BBr3 in CH2Cl2 e aggiunto a -60 ?C. La reazione ? stata poi mantenuta a -30 ?C a dare il derivato idrossilico SM226 usato come intermedio per una successiva O-alchilazione usando (2-cloroetil)dimetilammina cloridrato e Cs2CO3 in DMF a 80 ?C a dare il composto bersaglio SM230.
Schema 3. Procedura di sintesi per la preparazione dei composti bersaglio SM226 e SM230.
Reagenti e condizioni: i) BBr3 1 M in CH2Cl2, CH2Cl2 secco, da -60 ?C a -30 ?C; ii) ClCH2CH2N(Me)2?HCl, Cs2CO3, DMF secca, 80 ?C.
Lo Schema 4 raffigura un esempio di composto di formula (I) in cui A ? un fenile, B ? un 3-metil-pirazolo, Y ? un gruppo SO2 e W ? carbonile e il sostituente Q pu? essere selezionato tra quelli indicati nella formula (I).
Schema 4. Procedura di sintesi per la preparazione del composto bersaglio SM879.
Reagenti e condizioni: v) cicloesilammina; TBTU, DIPEA, THF secco, t.a.; vi)
Il composto 11a, riportato in un brevetto coreano KR2011060653, ? stato fatto reagire con cicloesilammina usando TBTU come agente condensante in presenza di DIPEA producendo l'intermedio 12a in buona resa che ? stato poi condensato con idrazina monoidrato in condizioni di purezza a 60 ?C dando il prodotto bersaglio SM879.
I seguenti esempi vengono forniti allo scopo di illustrare la presente invenzione e non devono in alcun modo essere interpretati come limitativi dell'ambito della presente invenzione.
Tabella 1. Elenco di composti bersaglio preparati in questa invenzione - ? incluso il composto di riferimento SM3
I seguenti esempi sono composti acquistati da AMBINTER e testati tal quali per le loro attivit? biologiche. Le procedure sintetiche riportate negli schemi 1-3 possono essere facilmente adattate per preparare composti disponibili in commercio la cui sintesi non ? ancora stata riportata.
Tabella 2. Elenco di composti bersaglio di formula generale 8a acquistati da fonti commerciali.
Sperimentale
Procedura generale per ottenere nitrobenzensolfonammidi di formula 2a (Schema 1):
A una soluzione di 2-nitrobenzensolfonil cloruro commerciale o sintetizzato (1 equiv.) e l'anilina appropriata (2 equiv.) in CH2Cl2, ? stata aggiunta subito piridina (1 equiv.) e la miscela ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a 30 ?C per 2 ore. Dopo concentrazione a un terzo volume, la miscela ? stata versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 3) e dopo digestione sotto agitazione magnetica si ? formato un precipitato. Dopo filtrazione il grezzo ? stato poi triturato con cicloesano/EtOAc (8:2) e filtrato nuovamente a dare benzensolfonammidi di formula 2a.
ESEMPIO 1
2-nitro-N-[3-(trifluorometil)fenil]benzensolfonammide: Seguendo la procedura generale di cui sopra e usando 3-trifluorometilanilina il composto ? stato ottenuto in una resa del 93% come solido rosso: mp 132,6-132,7 ?C; <1>H NMR (200 MHz, acetone-d6): ? 9,40 (brs, 1H, NH), 8,10-7,75 (m, 4H, Ar-H), 7,60-7,30 (m, 4H, Ar-H).
ESEMPIO 2
N-(3-cloro-4-fluorofenil)-2-nitrobenzensolfonammide: Seguendo la procedura generale di cui sopra e usando 3-cloro-4-fluoroanilina il composto ? stato ottenuto come solido rosso con resa del 90%: mp 110,0-110,1 ?C;<1>H NMR (200 MHz, acetone-d6): ? 9,25 (brs, 1H, NH), 8,00-7,70 (m, 4H, Ar-H), 7,50-7,40 (m, 1H, Ar-H), 7,30-7,20 (m, 2H, Ar-H).
ESEMPIO 3
N-(3,5-diclorofenil)-2-nitrobenzensolfonammide: Seguendo la procedura generale sopra riportata e usando 3,4-dicloroanilina, il composto ? stato ottenuto come solido rosso con resa del 95%: mp 128,0-129,0 ?C; <1>H NMR (400 MHz, acetone-d6): ? 9,55 (brs, 1H, NH), 8,20 (d, J = 1,3 e 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 8,10-7,80 (m, 3H, Ar-H), 7,40-7,35 (m, 2H, Ar-H), 7,28 (t, J = 1,8 Hz, 1H, Ar-H).
ESEMPIO 4
5-fluoro-2-nitro-N-[4-(trifluorometil)fenil]benzensolfonammide: Seguendo la procedura generale riportata sopra, l'intermedio 5-fluoro-2-nitrobenzensolfonil cloruro (preparato come riportato in Buhr, WO 212110603) ? stato fatto reagire con 3-trifluorometilanilina commerciale a dare il composto come solido rosso con resa dell'86%: m.p 130-132 ?C; <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 7,30-7,40 (m, 3H, Ar-H), 7,50-7,60 (m, 3H, Ar-H e NH), 7,70 (dd, J = 2,8 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,90 (dd, J = 4,5 e 8,8 Hz, 1H, Ar-H).
ESEMPIO 5
N-(4-bromofenil)-2-nitrobenzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Kurkin, A. et al. in Tetrahedron: Asymmetry, 2009, 20, 1500-1505. Il punto di fusione e i dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 6
N-(3-bromofenil)-2-nitrobenzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Abramovitch, R. A. et al. in J. Org. Chem. 1977, 42, 2914-2919. Il punto di fusione e i dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 7
2-nitro-N-[4-(trifluorometil)fenil]benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Kang, J. G. et al. in Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002, 66, 2677-2682. Il punto di fusione e i dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 8
N-[4-(metiltio)fenil]-2-nitrobenzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata in PCT WO 2007/003962 A2. Il punto di fusione e i dati spettrali concordano con quelli riportati in letteratura.
Procedura generale per ottenere amminobenzensolfonammidi di formula 3a (Schema 1): Una soluzione agitata di derivato nitro di formula (2a) (1 equiv.) in EtOH (150 ml) ? stata idrogenata su una quantit? catalitica di nichel Raney a temperatura ambiente e pressione atmosferica per 2,5 ore. La miscela ? stata poi filtrata su celite e il filtrato ? stato fatto evaporare fino a essiccazione a dare il derivato amminico puro mediante TLC (CHCl3/MeOH 98:2).
ESEMPIO 9
2-ammino-N-[3-(trifluorometil)fenil]benzensolfonammide: Seguendo la procedura generale riportata sopra, il composto ? stato ottenuto con resa del 96% come solido biancastro: mp 88,1-88,2 ?C (dec.);<1>H NMR (200 MHz, acetone-d6): ? 9,50 (bs, 1H, NH), 7,60-7,25 (m, 5H, Ar-H), 7,25-7,15 (m, 1H, Ar-H), 6,75 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 6,50 (t, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 6,75 (bs, 2H, NH2).
ESEMPIO 10
2-ammino-N-(3-cloro-4-fluorofenil)benzensolfonammide: Seguendo la procedura riportata sopra, il composto ? stato ottenuto come solido grigio, con resa del 95%: mp 102.1-102.2 ?C; <1>H NMR (200 MHz, acetone-d6): ? 9,15 (bs, 1H, NH), 7,40 (dd, J = 1,6 e 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,25-7,00 (m, 4H, Ar-H), 6,75 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 6,55 (t, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 5,60 (bs, 2H, NH2).
ESEMPIO 11
2-ammino-N-(3,5-diclorofenil)benzensolfonammide: Seguendo la procedura riportata sopra, il composto ? stato ottenuto come solido grigio, con resa del 92%: mp 103,0-105,0 ?C; <1>H NMR (400 MHz, acetone-d6): ? 9,50 (brs, 1H, NH), 7,59 (dd, J = 1,5 e 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,25 (dt, J = 1,5 e 7,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,18-7,12 (m, 2H, Ar-H), 7,10 (t, J = 2,4 Hz, 1H, Ar-H), 6,85 (dd, J = 0,9 e 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 6,68 (dt, J = 0,9 e 7,0 Hz, 1H, Ar-H), 5,65 (brs, 2H, NH2).
ESEMPIO 12
2-ammino-N-[4-(trifluorometil)fenil]benzensolfonammide: Seguendo la procedura riportata sopra, il composto ? stato ottenuto come solido grigio, con resa dell'85% (tempo di reazione 1,5 h): mp 105,3-105,4 ?C; <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 10,75 (bs, 1H, NH), 7,40-7,60 (m, 3H, Ar-H), 7,20-7,00 (m, 3H, Ar-H), 6,70 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 6,50 (t, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 5,95 (bs, 2H, NH2).
ESEMPIO 13
2-ammino-N-[4-(metiltio)fenil]benzensolfonammide: A una sospensione agitata del corrispondente derivato nitro di formula 2a (0,20 g, 0,62 mmol) in HCl 8 N (9,0 ml), ? stato aggiunto immediatamente SnCl2?2H2O (0,42 g, 1,85 mmol), disciolto in HCl 8 N (2,0 ml) e la miscela ? stata posta a riflusso per 2 ore. NaOH al 10% ? stato aggiunto per raggiungere un pH 6 e il precipitato cos? ottenuto ? stato filtrato e lavato tre volte con CHCl3 (3x15 ml). Le frazioni sono state raccolte e il solvente ? stato essiccato e fatto evaporare fino a essiccazione per ottenere il derivato ammino (0,10 g, resa del 50%) come solido grezzo usato tal quale nella fase di reazione successiva: mp 94,1-94,3. ?C; <1>H NMR (200 MHz, CDCl3): ? 7,40 (dd, J = 1,5 e 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,27-7,20 (m, 1H, Ar-H), 6,75 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,10-6,90 (m, 2H, Ar-H), 6,80-6,90 (m, 2H, Ar-H), 6,75-6,55 (m, 3H, Ar-H e NH), 4,75 (bs, 2H, NH2).
ESEMPIO 14
2-Ammino-5-fluoro-N-[4-(trifluorometil)fenil]benzensolfonammide: Seguendo la procedura riportata sopra, il composto ? stato ottenuto come solido arancione chiaro con resa dell'87% (tempo di reazione 1 h, metodo di purificazione: triturazione mediante cicloesano): m.p 115-117 ?C; <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 4,60 (bs, 2H, NH2), 6,70 (dd, J = 4,3 e 8,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,05 (dt, J = 2,9 e 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,15 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H), 7,30 (dd, J = 2,9 e 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,45 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar-H).
ESEMPIO 15
2-ammino-N-(3-bromofenil)benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Abramovitch, R. A. et al. in J. Org. Chem. 1977, 42, 2914-2919. Il punto di fusione e i dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 16
2-ammino-N-(4-metossifenil)benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Ram?rez-Mart?nez, J. F. et al. in Molecules, 2013, 18, 894-913. I dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 17
2-ammino-N-(4-clorofenil)benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Ram?rez-Mart?nez, J. F. et al. in Molecules, 2013, 18, 894-913. I dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 18
2-ammino-N-(2-bromofenil)benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Giannotti, D. et al. in J. Med. Chem. 1991, 34, 1356-1362. I dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 19
2-ammino-N-(3-clorofenil)benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata in PCT WO 96/05185. Il punto di fusione e i dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
ESEMPIO 20
2-ammino-N-(4-bromofenil)benzensolfonammide: l'intermedio ? stato preparato seguendo la procedura riportata da Ram?rez-Mart?nez, J. F. et al. in Molecules, 2013, 18, 894-913. I dati spettrali corrispondono con quelli riportati in letteratura.
Procedura generale per ottenere 6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossidi di formula 5a (Schema 1): Amminobenzensolfonammide di formula 3a (1 equiv.), NaOH (1,2 equiv.) e NaNO2 (1,2 equiv.) sono stati miscelati in acqua e la soluzione ottenuta ? stata aggiunta goccia a goccia a HCl al 37% (6 equiv.) e mantenuta a 0 ?C. La miscela torbida ? stata miscelata con un'asta di vetro per 30 min verificando la formazione di sale di diazonio mediante il saggio con ?-naftolo. La miscela rossa ? stata poi diluita con H2O e trattata con polvere di AcONa fino a pH = 5 e il solido arancione cos? ottenuto ? stato filtrato e trattato con cicloesano per ottenere un solido grezzo instabile di formula 4a. A causa della sua elevata instabilit?, il solido ? stato immediatamente aggiunto in porzioni a una sospensione in agitazione di polvere di Cu (5% del peso in massa) in DMSO. Dopo 30 min. la miscela di reazione ? stata filtrata su Celite per rimuovere la polvere di Cu e il filtrato ? stato versato in ghiaccio/acqua acidificando con HCl 2 N fino a pH = 4 per produrre un precipitato che era stato filtrato sotto vuoto a dare composti intermedi di formula 5a.
ESEMPIO 21
9-bromo-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, il composto ? stato ottenuto con resa del 70% come solido marrone e usato tal quale nella fase di reazione successiva: mp 229-231 ?C. <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6):? 11,50 (bs, 1H, NH), 8,37 (d, J = 2,3 Hz, 1H, Ar-H),8,25 (d, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,90 (dd, J = 1,3 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,76 (dt, J = 1,4 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,66 (dd, J = 1,1 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,59 (dd, J = 2,1 e 8,6 Hz, 1H,Ar-H), 7,55-7,80 (m, 3H, H-2, H-3 e H-8),7,10 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H-7).
ESEMPIO 22
9-cloro-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, il composto ? stato ottenuto, dopo purificazione mediante cromatografia flash su colonna (CHCl3/MeOH 98:2), come solido marrone con resa del 26% (tempo di reazione 2 h): mp 231,4-231,5 ?C; <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 11,50 (bs, 1H, NH), 8,29-8,25 (m, 2H, Ar-H), 7,89 (dd, J = 1,5 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,75 (dt, J = 1,5 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,62 (dt, J = 1,0 e 9,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,48 (dd, J = 2,3 e 7,2 Hz, 1H, Ar-H).
ESEMPIO 23
9-(Trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, il composto ? stato ottenuto come solido marrone con resa del 66% (tempo di reazione 1 h): mp 235-237 ?C.<1>H-NMR (200 MHz, CDCl3): ? 8,22 (brs, 1H, Ar-H), 8,03-7,98 (m, 2H, Ar-H), 7,80-7,74 (m, 2H, Ar.H), 7,64-7,57 (m, 2H, Ar-H), 7,20 (brs, 1H, NH).
ESEMPIO 24
9-(Metiltio)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a il composto ? stato ottenuto, dopo purificazione mediante cromatografia su colonna flash (CH2Cl2/MeOH 98: 2), come solido marrone chiaro con resa del 25% (tempo di reazione 2 h): mp 211,4-211,6 ?C; <1>H-NMR (200 M Hz, DMSO-d6): ? 11,29 (brs, 1H, NH), 8,25 (d, J= 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,00 (brs, 1H, Ar-H), 7,87 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,85 (t, J = 7,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,61 (t, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,34 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,09 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar-H).
ESEMPIO 26
9-Metossi-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, il composto ? stato ottenuto, dopo purificazione mediante cromatografia su colonna flash (CHCl3/MeOH 97:3), come solido marrone chiaro con resa del 41% (tempo di reazione: 30 min.): mp 198-202 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) ? 10,97 (brs, 1H, NH), 8,25 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,85(dd, J = 1,4 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,75 (dt, J = 1,4 e 7,55 Hz, 1H, Ar-H), 7,68-7,55 (m, 2H, Ar-H), 7,13-6,95 (m, 2H, Ar-H), 3,80 (s, 3H, CH3).
ESEMPIO 27
7-Bromo-6H-dibenzo-[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a il composto ? stato ottenuto come solido giallo con resa del 78%: mp 188,2-188,4 ?C (dec.). <1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): ? 10,80 (brs, 1H, NH), 8,25-8,30 (m, 2H, Ar-H), 7,95 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,85-7,80 (m, 2H, Ar-H), 7,72 (t, J = 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,36 (t, J = 7,9, 1H, Ar-H).
ESEMPIO 28
8,10-Dicloro-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a il composto ? stato ottenuto come solido giallo con resa del 77%: mp 190,0-191,0 ?C (dec.); <1>H-NMR (200 MHz, acetone-d6): ? 10,25 (brs, 1H, NH), 8,58 (dd, J = 1,7 e 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,95 (dd, J = 1,5 e 7,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,83-7,65 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,32 (J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H).
ESEMPIO 29
3-fluoro-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente amminobenzensolfonammide di formula 3a il composto ? stato ottenuto come solido marrone chiaro con una resa dell'83%: m.p. 195-197 ?C. <1>H NMR (400 MHz, DMSO- d 6): ? 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 7,70 (dt, J = 2,7 e 8,7 Hz, 1H, H-2), 7,80 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-8), 7,85 (dd, J = 2,6 e 7,6 Hz, 1H, H-4), 8,50 (dd, J = 4,8 e 8,9 Hz, 1H, H-1), 8,55 (s, 1H, H-10), 12,10 (bs, 1H, NH).
ESEMPIO 30
8-bromo-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido e 10-bromo-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: Seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, ? stata ottenuta una miscela di due regioisomeri difficili da separare e il grezzo ? stato impiegato senza ulteriore purificazione per la fase di reazione successiva.
ESEMPIO 31
8-cloro-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido e 10-cloro-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, ? stata ottenuta una miscela di due regioisomeri difficili da separare e il grezzo ? stato impiegato senza ulteriore purificazione per la fase di reazione successiva.
ESEMPIO 32
8-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido e 10-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, ? stata ottenuta una miscela di due regioisomeri difficili da separare e il grezzo ? stato impiegato senza ulteriore purificazione per la fase di reazione successiva.
ESEMPIO 33
8-Cloro-9-fluoro-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido e 10-cloro-9-fluoro-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente ammino-benzensolfonammide di formula 3a, ? stata ottenuta una miscela di due regioisomeri difficili da separare e il grezzo ? stato impiegato senza ulteriore purificazione per la fase di reazione successiva.
Procedura generale per ottenere 6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazina 5,5-diossido N-6 acetati di etile di formula 6a (Schema 1): In un tubo di reattore a microonde, una soluzione del composto appropriato di formula 5a (1 equiv.), etil bromoacetato (1 equiv.), e DIPEA (3 equiv.) in DMF secca (5 ml) ? stata irradiata a 50 ?C per 15 minuti impostando i seguenti parametri sperimentali: pressione 5 bar, raffreddamento, FHT avviato, assorbimento del solvente molto elevato. La miscela scura ? stata versata in acqua ghiacciata ed estratta tre volte con EtOAc. Gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati e fatti evaporare fino a essiccazione a dare una massa di sospensione grezza che ? stata triturata con EtOH dando un precipitato che ? stato filtrato per produrre il composto desiderato.
ESEMPIO 34
Etil 2-(9-bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, il composto ? stato ottenuto come solido rosa con resa del 75%: mp 89-91 ?C.
<1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 8,40 (d, J = 2,3 Hz, 1H, Ar-H), 8,26 (d, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,90-7,60 (m, 4H, Ar-H),7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 4,77 (s, 2H, NCH2), 3,90 (q, J = 7,0 Hz, 2H, OCH2CH3),0,80 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 35
Etil (9-cloro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, il composto ? stato ottenuto come solido marrone con resa dell'86%: mp 102,8-102,9 ?C; <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3): ? 8,47-7,99 (m, 3H, Ar-H), 7,64 (dt, J = 1,5 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,53 (dt, J = 1,2 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,34 (dd, J = 2,3 e 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,17 (d, J = 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 4,59 (s, 2H, NCH2), 3,96 (q, J = 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3), 1,00 (t, J = 7,2 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 36
Etil [5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, il composto ? stato ottenuto come solido marrone chiaro con resa dell'80%: mp 101-103 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 8,60 (brs, 1H, Ar-H), 8,35 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 8,00-7,75 (m, 3H, Ar-H), 7,74-7,65 (m, 2H, Ar-H), 4,91 (s, 2H, NCH2), 3,92 (q, J = 7,4 Hz, 2H, OCH2CH3), 0,92 (t, J = 7,4 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 37
Etil [9-(metiltio)-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, il composto ? stato ottenuto come solido giallastro con resa del 73%: mp 103-105 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 8,02-7,91 (m, 3H, Ar-H), 7,75 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,61 (t, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,45-7,35 (m, 1H, Ar-H), 7,26-7,23(m, 1H, Ar-H), 4,66 (s, 2H, NCH2), 4,05 (q, J = 6,9 Hz, 2H, OCH2CH3), 2,57 (s, 3H, SCH3), 1,07 (t, J = 6,9 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 38
Etil (9-metossi-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, il composto ? stato ottenuto come solido marrone con resa dell'85%: mp 101-104 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 8,26 (d, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,88-7,74 (m, 2H, Ar-H), 7,70-7,62 (m, 2H, Ar-H), 7,49 (d, J = 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,12 (dd, J = 2,7 e 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 4,75 (s, 2H, NCH2), 3,94-3,77 (m, 5H, OCH3 e OCH2CH3), 0,90 (t, J = 7,0 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 39
Etil (7-bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, il composto ? stato ottenuto, dopo cristallizzazione mediante EtOH, come solido rosa con resa del 50%: mp 169-171 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) ? 7,96-7,90 (m, 3H, Ar-H), 7,75-7,67 (m, 2H, Ar-H), 7,58 (t, J = 7,8, 1H, Ar-H), 7,30 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 4,73 (s, 2H, NCH2), 3,80 (q, J = 7,1 Hz, 2H, OCH2CH3), 1,00 (t, J = 7,1 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 40
Etil (8,10-dicloro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetato: seguendo la procedura generale riportata sopra e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, ? stato ottenuto come solido rosa con resa del 90%: mp 172-173 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3) ? 8,49 (dd, J = 1,3 e 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,90 (dd, J = 1,8 e 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,70-7,55 (m, 2H, Ar-H), 7,10 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 4,51 (s, 2H, NCH2), 4,02 (q, J = 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3), 1,05 (t, J = 7,2 Hz, 3H, OCH2CH3).
ESEMPIO 41
Etil [3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetato: seguendo la procedura generale sopra riportata e partendo dalla corrispondente dibenzotiazina di formula 5a, ? stato ottenuto come solido marrone chiaro con una resa dell'85%: m.p. 175-177 ?C; <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): ?1,10 (t, J = 7,2 Hz, 3H, OCH2CH3), 4,10 (q, J = 7,2 Hz, 2H, OCH2CH3), 4,75 (s, 1H, NCH2), 7,35 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7), 7,45 (dt, J = 2,7 e 8,3 Hz, 1H, H-2), 7,60-7,70 (m, 2H, H-4 e H-8), 8,00 (dd, J = 4,6 e 8,8 Hz, 1H, H-1), 8,20 (s, 1H, H-10).
ESEMPIO 42
N-[2-(9-bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)etil]cicloesanammina (SM9). In un tubo di reattore a microonde, una soluzione del composto appropriato di formula 5a (0,6 g, 1,9 mmol), N-(2-cloroetil)cicloesanammina (0,31 g, 1,9 mmol) e DIPEA (0,66 ml, 3,8 mmol) in DMF secca (4 ml) ? stata irradiata a 70 ?C per 60 min. impostando i seguenti parametri sperimentali: pressione 5 bar, raffreddamento, FHT avviato, assorbimento del solvente molto elevato. Il residuo ? stato versato in acqua ghiacciata acidificata a pH 3 con HCl 2 N ed estratto con EtOAc (3 x 20 ml). Gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati e fatti evaporare fino a essiccazione per ottenere una massa di sospensione grezza che ? stata purificata mediante cromatografia flash su colonna eluendo con CHCl3/MeOH (97:3) dando il composto bersaglio SM9 (0,65 g, 79%) come solido marrone chiaro con punto di fusione basso: <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,13 (d, J = 2,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,99 (dd, J = 1,1 e 7,7 Hz, 1H, H-4), 7,92 (d, J = 7,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,73 (dt, J = 1,3 e 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,64-7,58 (m, 2H, Ar-H), 7,40 (d, J = 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 4,00 (t, J = 6,7 Hz, 2H, SO2NCH2), 2,85 (t, J = 6,7 Hz, 2H, NCH2), 2,40-2,25 (m, 1H, Cy-CH), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH2), 1,25-1,00 (m, 4H, Cy-CH2), 1,00-0,80 (m, 2H, Cy-CH2). <13>C NMR (100 MHz, CDCl3): 137,58, 135,22, 133,05, 132,42, 131,16, 128,95, 128,45, 127,15, 125,68, 123,56, 122,51, 118,59, 56,17, 49,17, 44,52, 32,97, 25,87, 24,72. HRMS (ESI) calcolato per C20H23BrN2O2S[M<+>+H]<+>: 435,0739, trovato: 435,0735; LC-MS: tempo di rit. 4,075.
ESEMPIO 43
(R,S)-3-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-1-cicloesilpirrolidin-2-one (SM11). Seguendo la procedura sopra descritta per il composto SM9 e usando 3-bromo-1-cicloesil-2-pirrolidinone<37>, il composto del titolo ? stato purificato mediante cromatografia su colonna flash, eluendo con cicloesano/EtOAc (6:4), e successiva triturazione con etere di petrolio/Et2O, a dare il composto bersaglio racemico SM11 come solido bianco con resa del 70%: mp 177-179 ?C. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,42 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 8,28 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,91 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,85 (t, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,75-7,70 (m, 2H, Ar-H), 7,30 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H-7), 7,37 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H),), 4,90 (t, J = 9,4 Hz, 2-pirrolidone CH), 3,75-3,55 (m, 1H, Cy-CH), 3,20-3,00 (m, 2H, 2-pirrolidone CH), 2,10-2,00 (m, 1H, 2-pirrolidone CH), 1,75-1,48 (m, 6H, Cy-CH2 e 2-pirrolidone CH), 1,40-1,00 (m, 5H, Cy-CH2). <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): 168,65, 136,83, 135,87, 133,56, 133,48, 131,05, 130,15, 129,38, 128,95, 127,40, 126,72, 122,36, 119,96, 62,56, 51,37, 25,45, 25,38, 25,33, 25,19, 22,83. HRMS (ESI) calcolato per C22H23BrN2O3S: [M<+>+ H]<+>: 475,0692, trovato: 475,03691; LC-MS: tempo di rit. 6,015.
ESEMPIO 44
Metil 3-(9-bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)propanoato: A una soluzione sono stati aggiunti il composto appropriato di formula 5a (0,300 g, 0,92 mmol) in THF secco (12 ml), metil 3-idrossipropanoato commerciale (0,12 ml, 1,3 mmol) e PPh3 (0,33 g, 1,3 mmol), e la soluzione ? stata sonicata a 25 ?C per 7 minuti. DEAD (0,20 ml, 1,3 mmol) ? stato poi aggiunto goccia a goccia e la soluzione ? stata sonicata per 18 ore a 25 ?C (circa il 70% della conversione seguita da TLC). La miscela ? stata concentrata a pressione ridotta, versata in acqua ghiacciata, basificata con NaOH acquoso al 10% a pH 10 al fine di rimuovere il materiale di partenza residuo ed estratta con EtOAc (3 x 20 ml). Gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati e fatti evaporare fino a essiccazione. L'olio marrone ottenuto ? stato purificato mediante cromatografia su colonna (etere di petrolio/EtOAc 7:3) seguita da triturazione con Et2O a dare il composto di titolo desiderato di formula 6a (0,100 g, 30%) come solido bianco: mp 101-103 ?C. <1>H NMR (200 MHz, CDCl3): 8,10 (d, J = 2,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,94-7,83 (m, 2H, Ar-H), 7,70 (dt, J = 1,5 e 7,4 Hz, 2H, Ar-H), 7,60-7,50 (m, 2H, Ar-H), 7,28 (d, J = 8,8 Hz, 1H, Ar-H), 4,10 (t, J = 7,4 Hz, 2H, NCH2), 3,50 (s, 3H, CH3), 2,50 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH2).
Procedura generale di ammidazione diretta di composti di formula 6a con cicloesilammina per ottenere composti bersaglio di formula 8a (Schema 1): Usando il forno a microonde una provetta contenente una miscela di dibenzotiazina-etil acetato appropriato o l'intermedio nell'esempio 44 di formula generale 6a (1 equiv.) e cicloesilammina (4 equiv.) ? stata irradiata a 120 ?C per 4 ore impostando i seguenti parametri sperimentali: pressione 5 bar, raffreddamento, FHT avviato, assorbimento del solvente normale. Il residuo ? stato versato in acqua ghiacciata e acidificato con HCl 2 N a pH 3. Il precipitato ottenuto ? stato rimosso per filtrazione e cristallizzato mediante EtOH a dare il composto bersaglio di formula 8a.
ESEMPIO 45
2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM3): seguendo la procedura generale sopra descritta il composto del titolo ? stato ottenuto come solido bianco con una resa del 62%: mp 211-213 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,20 (brs, 1H, Ar-H), 8,00 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,75 (t, J = 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,73 (t, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,57 (d, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,12 (d, J = 8,7 Hz, 1H, H-7), 6,54 (d, J = 7,0 Hz, 1H, NH), 4,42(s, 2H, NCH2), 3,90-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,95-1,75 (m, 2H, Cy-CH), 1,65-1,50 (m, 3H, Cy-CH), 1,45-1,25 (m, 2H, Cy-CH), 1,25-1,05 (m, 3H, Cy-CH). <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): 166,29, 137,11, 134,09, 133,49, 133,12, 131,05, 129,18, 128,57, 125,91, 125,59, 122,56, 121,09, 118,62, 51,64, 48,45, 32,45, 25,35, 24,35. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H21BrN2O3S: 448,0535, trovato: 448,0456; LC-MS: tempo di rit. 5,754.
ESEMPIO 46
2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-ciclopentilacetammide (SM4): seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo cristallizzazione mediante EtOH, come solido bianco con resa del 43%: mp 192-194 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,19 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 8,04 (d, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,99 (d, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,80 (dt, J = 1,2 e 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,69-7,61 (m, 2H, Ar-H), 7,15 (d, J = 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 6,62 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH), 4,46 (s, 2H, NCH2), 4,31-4,24 (m, 1H, ciclopentil-CH), 2,00-1,92 (m, 2H, ciclopentil-CH2), 1,70-1,55 (m, 4H, ciclopentil-CH2), 1,45-1,30 (m, 2H, ciclopentil-CH2). <13>C NMR (100MHz, CDCl3): 166,76, 137,03, 134,04, 133,49, 133,14, 131,00, 129,20, 128,57, 125,90, 125,53, 122,53, 121,04, 118,61, 51,60, 51,49, 32,80, 23,45.HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C19H19BrN2O3S: 435,0379, trovato: 435,03733; LC-MS: tempo di rit. 5,434.
ESEMPIO 47
2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloeptilacetammide (SM5): seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo cristallizzazione mediante EtOH, come solido bianco con resa del 51%: mp 208-210 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,18 (d, J = 1,8 Hz, 1H, Ar-H), 8,03 (d, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,98 (d, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,80 (t, J = 7,6 Hz, 1H, H-2), 7,70-7,60 (m, 2H, Ar-H), 7,15 (d, J = 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 6,60 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH), 4,45 (s, 2H, NCH2), 4,20-3,95 (m, 1H, cicloeptil-CH), 1,90-177 (m, 2H, cicloeptil-CH2), 1,70-1,30 (m, 10H, cicloeptil-CH2). <13>C NMR (100 MHz, CDCl3): 166,01, 137,08, 134,08, 133,47, 133,13, 131,04, 129,18, 128,57, 125,92, 125,55, 122,55, 121,04, 118,60, 51,60, 50,63, 34,59, 27,84, 23,72. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C21H23BrN2O3S: 463,0689, trovato: 463,0688; LC-MS: tempo di rit. 6,018.
ESEMPIO 48
3-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilpropanammide (SM10). seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo purificazione mediante cromatografia flash su colonna (cicloesano/EtOAc 7:3), come solido bianco con resa del 34%: mp114-116 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,13 (brs, 1H, Ar-H), 8,00 (d, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,90 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,75 (t, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,65-7,60 (m, 2H, Ar-H), 7,42 (d, J = 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 5,55 (d, J = 6,4 Hz, 1H, NH), 4,15 (t, J = 6,6 Hz, 2H, NCH2), 3,75-3.60 (m, 1H, Cy-CH), 2,60 (t, J = 6,6 Hz, 2H, CH2), 1,85-1,53 (m, 5H, Cy-CH2), 1,50-1,10 (m, 5H, Cy-CH2). <13>C NMR (100MHz, CDCl3): 168,33, 137,37, 134,19, 132,91, 132,21, 130,81, 128,46, 127,79, 126,07, 125,26, 123,13, 122,13, 118,23, 47,96, 45,98, 36,49, 32,36, 24,90, 24,18. HRMS (ESI) calcolato per C21H23BrN2O3S [M<+>+ H]<+>: 463,0689, trovato: 463,0693; LC-MS: tempo di rit. 4,772.
ESEMPIO 49
2-(9-cloro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM254): seguendo la procedura generale sopra descritta il composto del titolo ? stato ottenuto, dopo cristallizzazione mediante EtOH, come solido bianco con resa del 60%: mp 218-220 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,02-7,95 (m, 2H, Ar-H), 7,92 (d, J = 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,75 (dt, J = 1,2 e 7,7Hz, 1H, Ar-H), 7,63 (dt, J = 0,8 e 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,43 (dd, J = 2,2 e 8,7Hz, 1H, Ar-H), 7,18 (d, J = 8,7 Hz, 1H, H-7), 6,53 (d, J = 7,0 Hz, 1H, NH), 4,42 (s, 2H, NCH2), 3,90-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,75 (m, 2H, Cy-CH), 1,65-1,50 (m, 4H, Cy-CH), 1,40-1,25 (m, 2H, Cy-CH), 1,25-1,05 (m, 2H, Cy-CH). <13>C NMR (100 MHz, CDCl3): 166,29, 136,69, 134,16, 133,08, 131,17, 131,11, 130,58, 129,16, 125,88, 125,61, 125,32,122,58, 120,97, 51,75, 48,45, 32,45, 25,34, 24,32; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H21ClN2O3S: 405,1039, trovato: 404,1032. LC-MS: tempo di rit.
6,492 min.
ESEMPIO 50
N-cicloesil-2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM231): seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo purificazione mediante cromatografia flash su colonna (cicloesano/EtOAc 7:3), come solido bianco con resa del 70%: mp 225-226 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3): ? 8,29 (brs, 1H, Ar-H), 8,03 (d, J = 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,81 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,75-7,65 (m, 2H, Ar-H), 7,35 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar-H), 6,57 (brs, 1H, NH), 4,52 (s, 2H, NCH2), 3,85-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,85-1,75 (m, 2H, Cy-CH), 1,65-1,48 (m, 3H, Cy-CH), 1,40-1,25 (m, 2H, Cy-CH), 1,20-1,10 (m, Cy-CH). <13C >NMR (100 MHz, CDCl3): ? 166,04, 140,60,134,01, 133,29, 131,16, 129,36, 127,33 (q, JC-F = 33,1 Hz, C-9), 127,32 (d, JC-F = 3,5 Hz, C-10), 126,02, 123,86, 123,63 (q, JC-F = 270,7 Hz, CF3), 122,96 (d, JC-F = 3,8 Hz, C-8), 119,49, 51,25, 48,55, 32,43, 25,32, 24,33.HRMS (ESI) m/z [M+Na]<+ >calcolato per C21H21F3N2O3S: 461,1118, trovato: 461,1124. LC-MS: tempo di rit.
4,688 min.
ESEMPIO 51
N-cicloesil-2-[9-(metiltio)-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM340): seguendo la procedura generale sopra descritta, ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo cristallizzazione mediante EtOH, come solido bianco con una resa del 63%: mp 178-180 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,03-7,98 (m, 2H, Ar-H), 7,92 (d, J = 1,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,78 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,64 (t, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,39 (dd, J = 1,9 e 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,20 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 6,60 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH), 4,44 (s, 2H, NCH2), 3,90-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 2,58 (s, 3H, SCH3), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH), 1,75-1,50 (m, 3H, Cy-CH), 1,40-1,25 (m, 2H, Cy-CH), 1,20-1,10 (m, 3H, Cy-CH).<13>C-NMR (100 MHz, CDCl3): ? 166,60, 135,92, 135,61, 134,20, 132,99, 131,79, 129,14, 128,79, 125,81, 124,44, 124,07, 122,59, 120,25, 51,84, 48,39, 32,46, 25,35, 24,35, 16,44. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+>calcolato per C21H24N2O3S2: 417,1309, trovato: 417.1305; LC-MS: tempo di rit. 5,403 min.
ESEMPIO 52
N-Cicloesil-2-(9-metossi-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetammide (SM225): seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo purificazione mediante cromatografia flash su colonna (cicloesano/EtOAc 7:3), come solido bianco con resa del 45%: mp 216-217 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 7,99-7,93 (m, 2H, Ar-H), 7,74 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,59 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,49 (d, J = 2,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,20 (d, J = 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,02 (dd, J = 2,7 e 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 6,59 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 4,32 (s, 2H, NCH2), 3,88-3,75 (m, 4H, OCH3, e Cy-CH), 1,85-1,75 (m, 2H, Cy-CH), 1,65-1,50 (m, 3H, Cy-CH), 1,35-1,25 (m, 2H, Cy-CH), 1,20-1,10 (m, 3H, Cy-CH). <13>C-NMR (100 MHz, CDCl3): ? 166,82, 157,36, 134,29, 132,96, 132,22, 131,86, 128,76, 125,87, 125,50, 122,84, 121,68, 116,50, 110,77, 55,78, 52,75, 48,27, 32,52, 25,39, 24,43. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+>calcolato per C21H24N2O4S: 401,1539, trovato: 401.1533; LC-MS: tempo di rit. 5,544 min.
ESEMPIO 53
2-(7-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM227): seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo purificazione mediante cromatografia flash su colonna (cicloesano/EtOAc 6:4), come solido bianco con resa del 40%: mp 159-160 ?C. <1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) ? 8,15 (d, 2H, H-4 e H-8), 7,70-7,85 (m, 4H, H-1, H-9, H-10 e NH), 7,55-7,70 (t, J = 7,4 Hz, 1H, H-2), 7,40 (t, J = 7,9 Hz, 1H, H-3), 4,40 (brs, 2H, NCH2), 3,00-3,10 (m, 1H, cicloesil CH), 0,60-1,60 (m, 10H, cicloesil CH2). <13>C-NMR (100 MHz, CDCl3): ? 165,51, 139,33, 134,86, 133,55, 133,17, 132,58, 130,40, 129,51, 129,50, 126,35, 125,40, 125,09, 121,45, 54,69, 48,36, 32,70, 25,52, 25,40. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+>calcolato per C20H21BrN2O3S: 448,0539, trovato: 448.0267; LC-MS: tempo di rit. 4,10 min.
ESEMPIO 54
2-(8-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM228) e 2-(10-bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM229): seguendo la procedura generale sopra descritta una miscela dei due regioisomeri di formula 6a ? stata fatta reagire con cicloesilammina ottenendo i due regioisomeri di formula 8a che sono stati separati mediante cromatografia flash su colonna (CH2Cl2/acetone 98:2) e ciascun composto ? stato ulteriormente purificato mediante cristallizzazione con EtOH per produrre i composti bersaglio SM228 (Rf> mediante TLC) e SM229 (Rf< mediante TLC).
SM228: Resa dell'8%: mp 184-185 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,10-7,80 (m, 3H, Ar-H), 7,82 (t, J = 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,65 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,52 (dd, J = 1,5 e 8,5 1H, Ar-H), 7,40 (brs, 1H, Ar-H), 6,55 (d, J = 8,0 Hz, 1H, NH), 4,50 (s, 2H, NCH2), 4,00-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 2,00-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 2H, Cy-CH2), 1,45-1,00 (m, 6H, Cy-CH2). <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): ? 165,60, 140,02, 134,99, 133,22, 131,50, 129,45, 128,16, 127,94, 126,66, 123,86, 123,82, 123,30, 121,76, 50,06, 48,12, 32,67, 25,53, 24,76. HRMS (ESI) m/z [M+Na]<+ >calcolato per C20H21BrN2O3S: 471,0354, trovato: 471.041; LC-MS: tempo di rit. 12,592 min.
SM229: Resa del 21%: mp 211-212 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,62 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 8,00 (dd, J = 1,4 e 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,75-7,65 (m, 4H, Ar-H), 7,28-7,24 (m, 2H, Ar-H), 6,50 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NH), 4,40 (s, 2H, NCH2), 3,80-3,70 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 2H, Cy-CH2), 1,45-1,00 (m, 6H, Cy-CH2). Lo spettro COSY NMR ha mostrato due picchi incrociati NOE rilevanti: H-9 (? 7,70, dd) ? H-8 (? 7,32, t), H-9 ? H-7 (? 7,28, dd). Lo spettro NMR NOESY ha mostrato un picco incrociato NOE rilevante: H-8 ? NCH2.<13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): ? 165,49, 140,92, 134,85, 131,81, 131,48, 131,19, 131,13, 130,37, 129,41, 125,44, 121,64, 121,38, 120,59, 50,77, 48,11, 32,66, 25,52, 24,76. HRMS (ESI) m/z [M+Na]<+ >calcolato per C20H21BrN2O3S: 471,0354, trovato: 471.0407; LC-MS: tempo di rit. 12,893 min.
ESEMPIO 55
2-(8-cloro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM586) e 2-(10-cloro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM585): seguendo la procedura generale sopra descritta una miscela dei due regioisomeri appropriati di formula 6a ? stata fatta reagire con cicloesilammina ottenendo i due regioisomeri di formula 8a che sono stati separati mediante cromatografia flash su colonna (CH2Cl2/acetone 98:2) e ciascun composto ? stato ulteriormente purificato mediante cristallizzazione con EtOH per produrre i composti bersaglio SM586 (Rf> mediante TLC) e SM585 (Rf< mediante TLC).
SM586: Resa del 18%: mp 193-195 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ?8,02-7,90 (m, 3H, Ar-H), 7,74 (dt, J = 1,2 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,60 (dt, J = 0,7 e 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,33 (dd, J = 2,0 e 8,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,28 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 6,50 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH), 4,49 (s, 2H, NCH2), 3,90-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH2), 1,45-1,35 (m, 2H, Cy-CH2), 1,20-1,05 (m, 2H, Cy-CH2); <13>C-NMR (100 MHz, CDCl3): ? 166,05, 139,07, 136,51, 133,87, 133,07, 131,56, 128,74, 126,80, 125,71, 125,68, 122,52, 122,41, 119,71, 51,57, 48,41, 32,41, 25,36, 24,30; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H21ClN2O3S: 405,1039, trovato:405,1037; LC-MS: tempo di rit. 5,628 min.
SM585: Resa del 15%: mp 200-202 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,60 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,95 (dd, J = 1,2 e 8,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,70 (dt, J = 1,3 e 8,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,59 (dd, J = 1,2 e 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,43 (dd, J = 1,1 e 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,34 (t, J = 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,20 (dd, J = 1,1 e 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 6,35 (d, J = 7,0 Hz, 1H, NH), 4,48 (s, 2H, NCH2), 3,90-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH2), 1,45-1,35 (m, 2H, Cy-CH2), 1,20-1,05 (m, 2H, Cy-CH2); <13>C-NMR (100 MHz, CDCl3): ? 166,25, 139,99, 135,69, 132,59, 131,57, 130,35, 130,16, 130,02, 128,78, 128,70, 123,48, 122,29, 118,69, 52,15, 48,38, 32,45, 25,34, 24,33; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H21ClN2O3S: 405,1039, trovato: 405,1037; LC-MS: tempo di rit. 5,631 min.
ESEMPIO 56
N-cicloesil-2-[5,5-diossido-8-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM338) e N-cicloesil-2-[5,5-diossido-10-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM339): seguendo la procedura generale sopra descritta una miscela dei due regioisomeri appropriati di formula 6a ? stata fatta reagire con cicloesilammina ottenendo i due regioisomeri di formula 8a che sono stati separati mediante cromatografia flash su colonna (CH2Cl2/acetone 99:1) e ciascun composto ? stato ulteriormente purificato mediante cristallizzazione con EtOH per produrre i composti bersaglio SM338 (Rf> mediante TLC) e SM339 (Rf< mediante TLC).
SM338: Resa del 40%: mp 230-232 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,20-8,10 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar-H), 8,05-7,98 (m, 2H, Ar-H), 7,78 (dt, J = 1,5 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,78 (dt, J = 1,5 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,69 (dt, J = 1,3 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,65 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (brs, 1H, Ar-H), 6,50 (d, J = 6,9 Hz, 1H, NH), 4,48 (s, 2H, NCH2), 3,903,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH2), 1,45-1,35 (m, 2H, Cy-CH2), 1,20-1,05 (m, 2H, Cy-CH2);<13>C-NMR (100 MHz, CDCl3):? 165,86, 138,57, 134,66, 133,16, 132,50 (q, JC-F = 33,1 Hz, C-8), 131,11, 129,58, 127,08, 126,42, 126,27, 123,79 (q, JC-F = 271,0 Hz, CF3), 122,59, 121,89 (q, JC-F= 5 Hz, C-9), 116,83 (q, JC-F= 6 Hz, C-7), 51,71, 48,44, 32,40, 25,33, 24,33; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C21H21F3N2O3S: 439,1303, trovato: 439,1296; LC-MS: tempo di rit. 6,892 min.
SM339: Resa del 26%: mp 211-212 ?C.;<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,03-7,95 (m, 2H, Ar-H), 7,82-7,58 (m, 4H, Ar-H), 7,51 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 6,35 (d, J = 8,0 Hz, 1H, NH), 4,40 (s, 2H, NCH2), 4,00-3,75 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH2), 1,45-1,05 (m, 4H, Cy-CH2); <13>C-NMR (100 MHz, CDCl3): ? 168,08, 140,01 (brs, C-6a), 139,80, 134,90, 134,32, 132,30, 130,56, 127,7 (d, JC-F = 2,0 Hz, C-8), 124,57, 122,30 (q, JC-F = 29,0 Hz, C-10), 119,60 (q, JC-F = 270,1 Hz, CF3), 117,80 (q, JC-F = 3,1 Hz, C-9), 115,85 (q, JC-F 2,0 Hz, C-10a), 115,09, 52,02, 49,50, 32,40, 26,28, 24,12; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C21H21F3N2O3S: 439,1303, trovato: 439,1298; LC-MS: tempo di rit. 6,598 min.
ESEMPIO 57
2-(8-cloro-9-fluoro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM336) e 2-(10-cloro-9-fluoro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)-N-cicloesilacetammide (SM337): seguendo la procedura generale sopra descritta una miscela dei due regioisomeri appropriati di formula 6a ? stata fatta reagire con cicloesilammina ottenendo i due regioisomeri di formula 8a che sono stati separati mediante cromatografia flash su colonna (cicloesano/EtOAc 7:3) seguita da cristallizzazione con EtOH per produrre i composti bersaglio SM336 (Rf> da TLC) e SM337 (Rf< da TLC).
SM336: Resa del 21%: mp 211-213 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): ? 7,96 (dd, J = 1,5 e 7,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,8 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,78-7,70 (m, 2H, Ar-H), 7,61 (dt, J = 1,4 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,33 (d, J = 6,4 Hz, 1H, Ar-H), 6,4 (d, J = 9,0 Hz, 1H, Ar-H), 4,35 (s, 2H, NCH2), 3,80-3,70 (m, 1H, Cy-CH), 1,85-1,75 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,45(m, 2H, Cy-CH2), 1,45-1,00 (m, 6H, Cy-CH2).<13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): ? 165,59, 154,86 (d, JC-F = 243,0 Hz, C-9), 136,05 (d, JC-F = 2,6 Hz, C-6a), 135,17, 133,19, 130,80, 130,05, 127,16, 125,69 (d, JC-F = 8,0 Hz, C-10a), 123,97, 121,84, 121,29 (d, JC-F = 20,0 Hz, C-8), 113,96 (d, JC-F = 24,0 Hz, C-10), 50,97, 48,12, 32,62, 25,51, 24,73. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H20ClFN2O3S: 423,0946, trovato: 423,0938; LC-MS: tempo di rit. 6,560 min.
SM337: Resa del 53%: mp 216-217 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,51 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar-H), 8,00 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,73 (dt, J = 1,2 e 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,64 (t, J = 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,35-7,20 (m, 2H, Ar-H), 6,25 (d, J = 7,1 Hz, 1H, NH), 4,25 (s, 2H, NCH2), 3,80-3,70 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH2), 1,40-1,00 (m, 4H, Cy-CH2).<13>C NMR (100 MHz, CDCl3): ? 166,08, 156,77 (d, JC-F = 246,1 Hz, C-9), 135,85 (brs, C-6a), 135,81, 131,72, 129,99, 129,81 (d, JC-F = 2,8 Hz, C-10a), 129,39, 125,44, 122,69, 120,41 (JC-F = 8,1 Hz, C-7), 119,5 (JC-F = 20,1 Hz, C-10), 117,43 (JC-F = 24,0 Hz, C-8), 52,73, 48,45, 32,53, 25,33, 24,39; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H20ClFN2O3S: 423,0946, trovato: 423,0938; LC-MS: tempo di rit. 6,520 min.
ESEMPIO 58
N-cicloesil-2-(8,10-dicloro-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetammide (SM587): seguendo la procedura generale sopra descritta ? stato ottenuto il composto del titolo, dopo cristallizzazione mediante EtOH, come solido bianco con resa del 50%: mp 212,0-213,0 ?C;<1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6) ? 8,50 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,97 (dd, J = 1,3 e 7,8, Hz, 1H, Ar-H), 7,71 (dt, J = 1,4 e 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,61 (dt, J = 0,9 e 7,6, Hz, 1H, Ar-H), 7,45 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,22 (d, J = 2,0 Hz, 1H, Ar-H), 6,28 (d, J = 7,6 Hz, 1H, NH), 4,31 (s, 2H, NCH2), 3,80-3,70 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH), 1,75-1,50 (m, 4H, Cy-CH), 1,40-1,00 (m, 4H, Cy-CH2); <13>C NMR (100 MHz, CDCl3): ? 165,74, 140,50, 135,53, 135,44, 133,58, 131,78, 129,81, 129,75, 129,03, 128,46, 122,36, 122,06, 119,02, 52,00, 48,47, 32,46, 25,32, 24,37; HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H20Cl2N2O3S: 439,0649, trovato: 439,0646; LC-MS: tempo di rit. 1,920 min.
ESEMPIO 59
Acido 2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico (SM7): a una sospensione di LiAlH4 (0,021 g, 0,55 mmol) in THF secco (1 ml) raffreddata a 0 ?C, ? stata aggiunta goccia a goccia sotto N2 una soluzione del composto 1 (0,100 g, 0,22 mmol) in THF secco (4 ml) e quindi la miscela ? stata agitata a 50 ?C per 2 ore. Dopo raffreddamento e spegnimento con EtOAc seguito da MeOH, la miscela ? stata quindi versata in acqua ghiacciata ed estratta con EtOAc (3 x 20 ml). Gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati e fatti evaporare fino a essiccazione. L'olio incolore grezzo ottenuto ? stato purificato mediante cromatografia su colonna flash, eluendo con cicloesano/EtOAc (7:3), a dare SM7 (0,040 g, 49%) come solido bianco: mp 176-178 ?C.
<1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,25-8,00 (m, 3H, Ar-H), 7,77 (dt, J = 1,2 e 8,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,62 (t, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,51 (dt, J = 1,3 e 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,39 (dt, J = 1,0 e 8,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,25 (dd, J = 1,8 e 7,2 Hz, 1H, Ar-H), 6,60 (brs, 1H, NH), 4,48 (s, 2H, N-CH2), 3,91-3,83 (m, 1H, Cy-CH), 1,90-1,80 (m, 2H, Cy-CH2), 1,60-1,50 (m, 3H, Cy-CH), 1,40-1,25 (m, 2H, Cy-CH2), 1,20-1,00 (m, 3H, Cy-CH).<13>C NMR (100 MHz, CDCl3): 166,18, 137,66, 133,57, 132,43, 131,81, 130,31, 127,98, 125,31, 125,21, 124,88, 123,36, 121,96, 118,99, 51,19, 47,85, 31,92, 24,87, 23,81. HRMS (ESI) calcolato per C20H22N2O3S [M<+>+H]<+>: 371,1429, trovato: 371,1397. LC-MS: tempo di rit. 5,212.
ESEMPIO 60
N-Cicloesil-2-(9-idrossi-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6il)acetammide (SM226): a una soluzione del composto bersaglio SM225 (0,22 g. 0,55 mmol) in CH2Cl2 secco (12 ml) e sotto flusso di N2, BBr3 1 M in CH2Cl2 (2,75 g, 2,75 mmol) ? stato aggiunto goccia a goccia a -60 ?C e poi la soluzione ? stata agitata a -30 ?C per 12 ore. Dopo spegnimento dell'eccesso di BBr3 con MeOH, H2O, e soluzione satura di NaHCO3, la miscela ? stata acidificata con HCl 2 N fino a pH ed estratta con CH2Cl2 (3 x 30 ml). Gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati e fatti evaporare fino a essiccazione e il residuo che ? stato purificato mediante cromatografia flash su colonna (CHCl3/MeOH 95:5), a dare il composto SM226, come solido bianco con resa dell'88%: mp 216-217 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): ? 9,77 (s, 1H, OH), 8,15 (d, J = 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,90-7,74 (m, 3H, Ar-H e NH), 7,62 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,45 (d, J = 2,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,25 (d, J = 8,8 Hz, 1H, Ar-H), 6,85 (dd, J = 2,6 e 8,7 Hz, 1H, Ar-H), 4,30 (s, 2H, NCH2), 3,40-3,30 (m, 1H, Cy-CH), 1,75-1,40 (m, 5H, Cy-CH2), 1,30-0,90 (m, 5H, Cy-CH2). <13>C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): ? 166,19, 154,95, 143,08, 135,01, 133,28, 132,00, 129,29, 126,41, 126,31, 123,94, 121,99, 118,10, 111,45, 51,74, 48,13, 32,38, 25,31, 24,59. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H22N2O4S: 387,1380, trovato: 387,1372; LC-MS: tempo di rit. 4,691 min.
ESEMPIO 61
N-Cicloesil-2-[9-[2-(dimetilammino)etossi]-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM230): ad una soluzione del composto bersaglio SM226 (0,18 g. 0,47 mmol) in DMF secca (7 ml), Cs2CO3 (0,23 g. 0,70 mmol) e 1-cloro-N,N-dimetiletanammina cloridrato commerciale (0,07 g. 0,47 mmol) sono stati aggiunti e la miscela ? stata mantenuta sotto agitazione magnetica a 85 ?C per 2 ore. La miscela ? stata versata in acqua ghiacciata, estratta con EtOAc (3 x 20 ml) e gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati e fatti evaporare fino a essiccazione a dare un olio che ? stato purificato mediante cromatografia flash su colonna (CHCl3/MeOH 9:1), per produrre SM230 come solido con punto di fusione basso con resa del 57%: mp 66-67 ?C.
<1>H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): ? 8,23 (d, J = 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,90-7,65 (m, 3H, Ar-H e NH), 7,60-7,55 (m, 2H, Ar-H), 7,28 (d, J = 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 7,10 (dd, J = 2,5 e 9,0 Hz, 1H, Ar-H), 4,40 (s, 2H, SO2N-CH2), 4,20 (t, J = 5,3 Hz, 2H, OCH2), 3,90-3,80 (m, 1H, Cy-CH), 2,80 (t, J = 5,3 Hz, 2H, NCH2), 2,40 (s, 6H, NCH3), 1,75-1,40 (m, 5H, Cy-CH2), 1,30-0,90 (m, 5H, Cy-CH2). <13>C-NMR (100 MHz, DMSO-d6): ? 165,84, 156,34, 135,42, 132,86, 132,29, 132,26, 129,15, 126,89, 126,26, 123,65, 121,87, 117,63, 110,75, 66,68, 51,40, 48,04, 45,99, 32,66, 25,53, 24,77. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C24H31N3O4S: 458,2200, trovato: 458,2200; LC-MS: tempo di rit. 6,360 min.
A seguire viene descritta una procedura sperimentale per realizzare composti di formula 7a nello Schema 1.
ESEMPIO 62
Acido 2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico di formula 7a:
Una miscela agitata di etil 2-(9-bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetato di formula 6a (Esempio 34; 0,600 g, 1,5 mmol) in NaOH acquoso al 10% (7 ml) ed EtOH (7 ml) ? stata posta a riflusso per 30 min, poi raffreddata, concentrata sotto pressione ridotta, versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N fino a pH 2. Il precipitato formato ? stato rimosso per filtrazione a dare il composto (0,540 g, 96%)come solido bianco che ? stato usato come nella fase di reazione successiva: mp 207-209 ?C. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,40 (d, J = 2,2 Hz, 1H, Ar-H), 8,31 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,91 (dd, J = 1,1 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,84 (dt, J = 1,3 e 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,75-7,69 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (d, J = 8,7 Hz, 1H, H-7), 4,80 (s, 2H, NCH2).
ESEMPIO 63
Acido 3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetico di formula 7a: a una soluzione di etil [3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetato di formula 6a (Esempio 41; 1,25 g, 3,09 mmol) in diossano (25 ml) ? stata aggiunta una soluzione di LiOH monoidrato 1 N (2,47 ml). La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 10 min., quindi versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 2). Il precipitato formato ? stato filtrato ed essiccato a dare il composto desiderato come solido bianco (1,16 g, 96%). <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 4,70 (s, 1H, NCH2), 7,35 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-7), 7,40-7,50 (m, 1H, H-2), 7,60-7,65 (m, 1H, H-4), 7,70 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H-8), 8,00 (dd, J = 4,5 e 8,8 Hz, 1H, H-1), 8,20 (s, 1H, H-10).
ESEMPIO 64
2-(9-bromo-5,5-diosso-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6(5H)-il)-N-fenilacetammide (SM6).
Una miscela di acido 2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico di formula generale 7a (Esempio 62) (0,530 g, 1,44 mmol) e SOCl2 (2 ml) ? stata posta a riflusso sotto agitazione magnetica per 1 ora, poi l'eccesso di SOCl2 ? stato rimosso per distillazione e il residuo ? stato lavato 3 volte con toluene secco. Il cloruro di acile ottenuto ? stato solubilizzato in DMF secca (7 ml) e aggiunto goccia a goccia, in atmosfera di N2, ad una soluzione agitata di anilina (0,264 ml, 2,88 mmol) ed Et3N (0,401 ml, 2,88 mmol) in DMF secca (3 ml) a temperatura ambiente. La miscela ? stata lasciata sotto agitazione magnetica per una notte, poi versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N a pH 3. Il precipitato ? stato filtrato e purificato mediante cromatografia flash su colonna, eluendo con CHCl3, a dare il composto bersaglio SM6 (0,150 g, 25%) come solido bianco: mp 128-130 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): 8,37 (bs, 1H, NH), ), 8,20 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 8,10 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 8,00 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,80 (t, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H), 7,70 (t, J = 7,7 Hz, 1H, Ar-H),7,60 (dd, J = 2,2 e 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,55-7,48 (m, 2H, Ar-H), 7,35-7,30 (m, 2H, Ar-H), 7,20 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,10 (t, J= 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 4,52 (s, 2H, CH2).<13>C NMR (100MHz, CDCl3): 165,47, 137,03, 136,86, 133,88, 133,75, 133,33, 131,09, 129,30, 129,06, 128,73, 126,02, 125,66, 125,09, 122,76, 121,21, 120,04, 118,98, 52,02. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H15BrN2O3S: 443,0069, trovato: 443,0057; LC-MS: tempo di rit. 5,571.
ESEMPIO 65
Il composto appropriato di formula generale 7a acido (2-(9-Bromo-5,5-diossido-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico; Esempio 62) (0,59 g, 1,6 mmol) ? stato clorurato come sopra riportato e il corrispondente acil cloruro, solubilizzato in DMF secca (8 ml), ? stato aggiunto goccia a goccia, in atmosfera di N2, a una soluzione di N-metilcicloesilammina (0,83 ml, 6,4 mmol) in DMF anidra (2 ml) a temperatura ambiente. La miscela ? stata riscaldata a 40 ?C per 1,5 ore, poi versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N a pH 3. Il precipitato ? stato filtrato e purificato mediante cromatografia flash su colonna, eluendo con CHCl3, e successiva triturazione con etere di petrolio/Et2O a dare il composto bersaglio SM8 (0,197 g, 30%) come solido bianco: mp 170-172 ?C. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): (miscela di rotameri) 8,42 (d, J = 1,7 Hz, 1H, Ar-H), 8,30 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,87 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar-H), 7,82 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,75-7,65 (m, 2H, Ar-H), 7,43 (t, J = 8,9 Hz, 1H, H-7), 4,97 (s, 0,88H, NCH2), 4,90 (s, 1,12H, NCH2), 4,00-3,90 (m, 0,54H, Cy-CH), 3,60-3,50 (m, 0,46H, Cy-CH), 2,80 (s, 1,68H, NCH3), 2,60 (s, 1,32H, NCH3), 1,75-0,95 (m, 10H, Cy-CH2). <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): (miscela di rotameri) 165,91, 165,87, 138,45, 138,32, 135,56,135,52, 133,15, 133,11, 132,94, 132,91,
131,09, 129,59, 128,36, 126,96, 126,92, 123,76, 123,73, 121,54, 121,48, 117,71, 117,65,
55,11, 52,84, 50,10, 30,59, 29,48, 28,68, 27,38, 25,61, 25,45, 25,30, 25,15. HRMS (ESI)
calcolato per C21H23BrN2O3S [M<+>+ H]<+>: 463,0692, trovato: 463,0678. LC-MS: tempo di rit. 6,034. I due rotameri si riducono a una molecola dopo aver registrato lo spettro NMR a 50 ?C.
ESEMPIO 66
Acido 2-(3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico (7a(Int-1)) e acido 2-(3-etossi-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico (7a(Int-2)): Una miscela agitata di composto di formula 6a(Int-1) (0,40 g, 0,99 mmol) in NaOH acquoso al 10% (3 ml) ed EtOH (3 ml) ? stata posta a riflusso per 30 minuti. Dopo il raffreddamento, il solvente organico ? stato fatto evaporare a pressione ridotta e il residuo ? stato versato in acqua ghiacciata e acidificato con HCl 2 N (pH = 2). Il precipitato formato ? stato rimosso per filtrazione a dare una miscela di due composti (7a(Int-1) e 7a(Int-2) in un rapporto 1:1 come evidenziato dalla presenza di due punti in TLC (CHCl3:MeOH 8:2) e confermato anche dallo spettro <1>H-NMR. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,20 (bs, 0,5H, H-10), 8,17 (bs, 0,5H, H-10), 7,90 (dd, J = 5 e 9 Hz, 0,5H, H-1), 7,85 (d, J = 9 Hz, 0,5H, H-1), 7,73-7,60 (m, 1H, H-4 e H-8), 7.60 (d, J = 8,5 Hz, 0,5H, H-8), 7,45 (m, 0,5H, H-2), 7,40 (s, 0,5H, H-4), 7,35 (d, J = 8 Hz, 0,5H, H-7), 7,20-7,30 (m, 1H, H-2 e H-7), 4,67 (s, 1H, N-CH2), 4,65 (s, 1H, N-CH2), 4,10 (q, J = 7,0 Hz, 1H, OCH2), 1,45 (t, J = 7,0 Hz, 1,5H, CH3). I composti 7a(Int-1) e 7a(Int-2) sono stati ottenuti come solido arancione che ? stato usato come tale nella successiva fase di ammidazione.
ESEMPIO 67
Schema 5: Preparazione di composti bersaglio derivanti da intermedi di formula generale 7a non inclusi nello Schema 1.
N-cicloesil-2-(3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetammide (SM882) e N-cicloesil-2-(3-etossi-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetammide (SM883): Una miscela agitata di 7a(Int-1) e 7a(Int-2) (0,50 g, 1,33 mmol), cicloesilammina (0,18 ml, 1,6 mmol), TBTU (0,55 g, 1,7 mmol) e DIPEA (0,93 ml, 5,33 mmol) in CH2Cl2 secco (3 ml) ? stata fatta reagire a temperatura ambiente per 1 ora. Il solvente ? stato poi fatto evaporare fino a essiccazione e il residuo ? stato versato in acqua ghiacciata ottenendo un precipitato che ? stato filtrato e il prodotto grezzo ? stato purificato mediante cromatografia flash eluendo con CH2Cl2 ottenendo rispettivamente SM882 (Rf>) e SM883 (Rf<). Ogni composto ? stato ulteriormente purificato mediante cristallizzazione con EtOH a dare:
SM882: solido bianco (0,064 g, 14%), mp 232-233 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ?1,10-1,20 e 1,30-1,40 (m, ogni 2H, cicloesil CH2), 1,50-1,70 (m, 4H, cicloesil CH2), 1,80-1,90 (m, 2H, cicloesil CH2), 3,85-3,95 (m, 1H, cicloesil CH), 4,55 (s, 1H, NCH2), 6,45 (d, J = 7,5 Hz, 1H, CONH), 7,40 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,55 (dt, J = 2,6 e 8,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,75-7,85 (m, 2H, Ar-H), 8,10 (dd, J = 4,6 e 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,30 (s, 1H, Ar-H); <13>C NMR (101 MHz, CDCl3): ? 24,2, 25,2, 32,4, 48,5, 51,4, 109,8 (d, JC-F = 25,4 Hz), 119,8, 120,8 (d, JC-F = 22,2 Hz), 122,7 (d, JC-F = 3,6 Hz), 123,5, 128,8 (q, JC-F = 273,3 Hz), 127,1 (d, JC-F = 3,3 Hz), 127,4, 127,7, 128,5 (d, JC-F = 8,1 Hz), 135,4 (d, JC-F = 7,3 Hz), 140,1, 162,2 (d, JC-F = 256,9 Hz), 165,6. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C21H20F4N2O3S: 457,1210, trovato: 457,1207.
SM883: solido bianco (0,069 g, 15%), mp 201-202 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ?1,10-1,20 (m, 4H, cicloesil CH2), 1,30-1,40 (m, 2H, cicloesil CH2), 1,50 (t, J = 6,9 Hz, 3H, OCH2CH3), 1,60-1,70 e 1,80-1,90 (m, ogni 2H, cicloesil CH2), 3,80-3,90 (m, 1H, cicloesil CH), 4,20 (q, J = 6,9 Hz, 2H, OCH2CH3), 4,55 (s, 1H, NCH2), 6,55 (d, J = 7,7 Hz, 1H, CONH), 7,30-7,40 (m, 2H, Ar-H), 7,50 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Ar-H), 7,70 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,95 (d, J = 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,25 (s, 1H, Ar-H); <13>C NMR (101 MHz, CDCl3): ?, 14,4, 24,2, 25,2, 32,3, 48,4, 51,2, 64,4, 106,1, 119,3, 121,1, 122,1 (d, JC-F = 3,6 Hz), 123,9, 126,1 (d, JC-F = 3,3 Hz), 127,5, 134,9, 139,6, 159,6, 166,0. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C23H25F3N2O4S: 483,1566, trovato: 483,1565.
ESEMPIO 68
N-(1-etilpropil)-2-[3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM884): Una miscela agitata di acido 3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetico di formula 7a (Esempio 63; 0,30 g, 0,8 mmol), 3-amminopentano (0,084 g, 0,96 mmol), TBTU (0,33 g, 1,04 mmol), DIPEA (0,56 ml, 3,2 mmol) in CH2Cl2 (6 ml) ? stata mantenuta a temperatura ambiente per 3 ore. Il solvente organico ? stato fatto evaporare e il residuo ? stato versato in ghiaccio/acqua e la miscela ? stata acidificata con HCl 2 N (pH = 4) mantenendo la miscela sotto agitazione per 40 min. fino a quando ? stato osservato un precipitato. Il precipitato ? stato filtrato, essiccato e cristallizzato mediante cicloesano/EtOAc (rapporto 3:1) per ottenere SM884 come solido rosato in 34%: mp184-185 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 0,80 (t, J = 7,4 Hz, 6H, pentil CH3), 1,30-1,40 e 1,45-1,55 (m, ogni 2H, pentil CH3), 3,75-3,80 (m, 1H, pentil CH), 4,50 (s, 1H, NCH2), 6,25 (d, J = 8,6 Hz, 1H, CONH), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (dt, J = 2,6 e 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,70-7,75 (m, 2H, Ar-H), 8,10 (dd, J = 4,6 e 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,25 (s, 1H, Ar-H); <13>C NMR (100 MHz, CDCl3): ? 9,9, 27,0, 51,4, 52,7, 109,8 (d, JC-F = 25,5 Hz), 119,8, 120,9 (d, JC-F = 22,3 Hz), 122,7 (d, JC-F = 3,5 Hz), 123,4, 126,1 (q, JC-F = 273,0 Hz), 127,1 (d, JC-F = 3,2 Hz), 127,7, 128,6 (d, JC-F = 8,1 Hz), 135,3 (d, JC-F = 7,3 Hz), 140,1, 162,2 (d, JC-F = 257,0 Hz), 166,4. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H20F4N2O3S: 445,1210, trovato: 445,1207.
ESEMPIO 69
2-[3-Fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]-N-(tetraidro-2H-piran-4-il)acetammide (SM885): seguendo la procedura riportata sopra per il composto SM884 e usando tetraidro-2H-piran-4-ammina, il composto bersaglio ? stato ottenuto dopo cristallizzazione mediante cicloesano/EtOAc, con una resa del 34% come solido rosa chiaro: mp 241-242 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 1,40-1,50, 1,80-1,90, 3,40-3,50, e 3,75-3,85 (m, ciascun 2H, piran CH2), 4,00-4,10 (m, 1H, piran CH), 4,50 (s, 1H, NCH2), 6,45 (d, J = 7,4 Hz, 1H, CONH), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (dt, J = 2,7 e 8,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,65-7,75 (m, 2H, Ar-H), 8,05 (dd, J = 4,6 e 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,25 (s, 1H, Ar-H); <13>C NMR (100 MHz, CDCl3): ? 32,4, 46,0, 51,3, 66,2, 109,8 (d, JC-F = 25,5 Hz), 119,7, 121,0 (d, JC-F = 22,2 Hz), 122,7 (d, JC-F = 3,5 Hz), 123,4, 126,1 (q, JC-F = 273,0 Hz), 127,2, 127,4 (d, JC-F = 3,2 Hz), 127,8, 128,6 (d, JC-F = 8,1 Hz), 135,3 (d, JC-F = 7,3 Hz), 140,0, 162,2 (d, JC-F = 257,2 Hz), 166,0. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H18F4N2O4S: 459,1002, trovato: 459,1002.
ESEMPIO 70
2-[3-fluoro-5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]-N-morfolin-4-ilacetammide (SM881): seguendo la procedura riportata per il composto SM884 e usando morfolin-4-ammina, il composto bersaglio ? stato ottenuto dopo cristallizzazione mediante EtOH, in una resa del 34% come solido rosa chiaro: mp 276-278 ?C. Due rotameri sono stati identificati mediante <1>H-NMR e si sono ridotti a una molecola effettuando esperimenti a 60 ?C. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25 ?C): ? 2,50-2,60, 2,75-2,95, 3,40-3,50, e 3,60-3,80 (m, ogni 2H, morfolina CH2), 4,50 e 5,00 (s, ogni 1H, NCH2), 7,60-7,75 (m, 2H, Ar-H), 7,75-7,80 e 7,80-7,90 (m, ogni 1H, Ar-H), 8,45 (dd, J = 4,6 e 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 8,55 (s, 1H, Ar-H), 8,80 e 9,25 (s, ogni 0,5H, CONH); <13>C NMR (100 MHz, DMSO-d6): ? 32,4, 46,0, 66,2, 110,1 (d, JC-F = 25,5 Hz), 119,7, 122,0 (d, JC-F = 22,2 Hz), 123,7 (d, JC-F = 3,5 Hz), 123,4, 125,1 (q, JC-F = 273,0 Hz), 127,2, 127,4 (d, JC-F = 3,2 Hz), 127,8, 129,2, (d, JC-F = 8,1 Hz), 134,2 (d, JC-F = 7,3 Hz), 140,0, 161,2 (d, JC-F = 257,2 Hz), 166,0. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C19H17F4N3O4S: 460,0955, trovato: 460,0954.
ESEMPIO 71
N-(2-cloropiridin-4-il)-2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide (SM880): Il composto del titolo ? stato preparato a partire dall'acido 2-(5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico di formula 7a (Esempio 72) e seguendo la procedura riportata per il composto SM884 e usando 2-cloro-4-piridinammina. Il composto del titolo ? stato ottenuto dopo cristallizzazione mediante cicloesano/EtOAc, come solido rosa chiaro con una resa del 34%: mp 184-185 ?C. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3): ? 0,80 (t, J = 7,4 Hz, 6H, pentil CH3), 1,30-1,40 e 1,45-1,55 (m, ogni 2H, pentil CH3), 3,75-3,80 (m, 1H, pentil CH), 4,50 (s, 1H, NCH2), 6,25 (d, J = 8,6 Hz, 1H, CONH), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,50 (dt, J = 2,6 e 8,3 Hz, 1H, Ar-H), 7,70-7,75 (m, 2H, Ar-H), 8,10 (dd, J = 4,6 e 8,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,25 (s, 1H, Ar-H); <13>C NMR (101 MHz, CDCl3): ? 9,9, 27,0, 51,4, 52,7, 109,8 (d, JC-F = 25,5 Hz), 119,8, 120,9 (d, JC-F = 22,3 Hz), 122,7 (d, JC-F = 3,5 Hz), 123,4, 126,1 (q, JC-F = 273,0 Hz), 127,1 (d, JC-F = 3,2 Hz), 127,7, 128,6 (d, JC-F = 8,1 Hz), 135,3 (d, JC-F = 7,3 Hz), 140,1, 162,2 (d, JC-F = 257,0 Hz), 166,4. HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C20H20F4N2O3S: 445,1210, trovato: 445,1207.
Schema 6: Preparazione di composti bersaglio derivanti da intermedi di formula generale 7a, non inclusi nello Schema 1.
ESEMPIO 72
Acido 2-(5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico (7a(Int-3)): il composto di formula 7a(Int-3) ? stato preparato a partire da etil [5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetato secondo la procedura riportata per un composto simile descritto nell'Esempio 62. L'intermedio ? stato ottenuto come solido marrone con una resa dell'81%: <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,55 (d, J = 2,2 Hz, 1H, Ar-H), 8,27 (d, J = 8,0 Hz, 1H, Ar-H), 8,00-7,75 (m, 4H, Ar-H), 7,50-7,50 (m, 2H, Ar-H), 4,75 (s, 2H, NCH2).
ESEMPIO 73
N-(1-benzilpiperidin-4-il)-2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide di formula 8a(Int-3): a una soluzione di acido 2-(5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il)acetico di formula 7a(Int-3) (Esempio 72; 0,280 g, 0,78 mmol) in CH2Cl2 secco (10 ml), sono stati aggiunti N-benzil-4-amminopiperidina (0,180 g, 0,94 mmol), TBTU (0,376 g, 0,12 mmol), e DIPEA (0,510 ml, 0,31 mmol). La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 4 ore, e quindi versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 2). La miscela ? stata estratta con CH2Cl2 (3 x 30 ml) e gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati su Na2SO4 e fatti evaporare fino a essiccazione a dare un olio marrone che ? stato purificato mediante cromatografia flash su colonna (CHCl3/MeOH 95:5), per produrre N-(1-benzilpiperidin-4-il)-2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetammide come solido con una resa del 45%: mp ?C. <1>H-NMR (200 MHz, CDCl3): ? 8,27 (s, 1H, Ar-H), 8,03-7,99 (d, J = 7,9 Hz, 2H, Ar-H), 7,82-7,60 (m, 3H, Ar-H), 7,32-7,15 (m, 6H, Ar-H), 6,53 (d, J = 7,3 Hz, 1H, NH), 4,54 (s, 2H, benzilic-CH2), 4,83-4,71 (m, 1H, piperidina-CH), 3,45 (s, 2H, CH2), 2,67-2,62 (m, 2H, piperidina-CH2), 2,15-1,80 (m, 6H, piperidina-CH2 x 2), 1,47-1,32 (m, 2H, piperidina-CH2).
ESEMPIO 74
2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]-N-piperidin-4-ilacetammide di formula generale 8a (SM655): ad una soluzione del composto appropriato di formula 8a (0,180 g, 0,34 mmol) in EtOH (20 ml), ? stato aggiunto Pd/C (20% p/p, 0,036 g). La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 7 ore facendo gorgogliare H2. La miscela ? stata filtrata su Celite<? >e il filtrato ? stato fatto evaporare fino a essiccazione a dare un solido marrone che ? stato cristallizzato da EtOH per produrre SM665 come solido bianco con una resa del 27%. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,55 (s, 1H, Ar-H), 8,38-8,35 (m, 2H, Ar-H), 7,91-7,81 (m, 3H, Ar-H), 7,71 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,62 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 4,63 (s, 2H, benzilico-CH2), 3,70-3,59 (m, 1H, piperidina-CH), 3,16-3,13 (m, 2H, piperidina-CH2), 2,82 (t, J = 10,7 Hz, 2H, piperidina-CH2), 1,77-1,74 (m, 2H, piperidina-CH2), 1,49-1,37 (m, 2H, piperidina-CH2).
Schema 7: Preparazione di composti bersaglio derivanti da intermedi di formula generale 7a, non inclusi nello Schema 1.
ESEMPIO 75
2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]-N-(trans-4-idrossicicloesil)acetammide di formula 8a(Int-4): ad una soluzione di composto di formula 7a(Int-3) (Esempio 72; 0,100 g, 0,30 mmol) in CH2Cl2 secco (4 ml), trans-4-amminocicloesanolo (0,041 g, 0,36 mmol), BOP (0,199 g, 0,45 mmol), e DIPEA (0,200 ml, 1,2 mmol) sono stati aggiunti a 0 ?C. La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 12 h, poi ? stata concentrata sotto vuoto e versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 4). La miscela ? stata estratta con EtOAc (3 x 20 ml) e gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati su Na2SO4 e fatti evaporare fino a essiccazione a dare un solido marrone che ? stato cristallizzato mediante EtOH per produrre SM588 8a(Int-4) come solido bianco con una resa dell'88%: mp 212-213 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,29 (d, J = 1,3 Hz, 1H, Ar-H), 8,03 (d, J = 7,3 Hz, 2H, Ar-H), 7,81 (td, J = 1,3 e 7,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,72 (dd, J = 1,6 e 6,3 Hz, 1H, Ar-H), 6,67 (t, J = 7,5 Hz, 1H, Ar-H), 7,33 (d, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 6,52 (d, J = 7,6 Hz, 1H, NH), 4.51 (s, 2H, benzil-CH2), 3,85-3,77 (m, 1H, cicloesil-CH), 3,61-3,46 (m, 1H, cicloesil-CH), 1,99-1,89 (m, 4H, cicloesil-CH2 x 2), 1,46 (s, 1H, OH), 1,42-1,34 (m, 2H, cicloesil-CH2), 1,23-1,16 (m, 2H, cicloesil-CH2).
ESEMPIO 76
trans-4-({2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetil}ammino)cicloesil 4-nitrobenzensolfonato di formula generale 8a (SM589): ad una soluzione di un composto appropriato SM588 di formula 8a(Int-4) (0,350 g, 0,77 mmol) in CH2Cl2 secco (6 ml), sono stati aggiunti 4-nitrobenzensolfonil cloruro (0,355 g, 1,60 mmol), DMAP (0,094 g, 0,77 mmol) ed ET3N (0,320 ml, 2,30 mmol) a 0 ?C. La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 2 ore, poi ? stata concentrata sotto vuoto e versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 4). La miscela ? stata estratta con CH2Cl2 (3 x 20 ml) e gli strati organici combinati sono stati lavati con salamoia, essiccati su Na2SO4 e fatti evaporare fino a essiccazione a dare un solido bianco che ? stato cristallizzato da EtOH per produrre SM589 come solido bianco con una resa del 38%: mp 151-152 ?C. <1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): ? 8,35 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar-H), 8,29 (s, 1H, Ar-H), 8,12-7,93 (m, 4H, Ar-H), 7,81 (t, J = 7,0 Hz, 1H, Ar-H), 7,72-7,61 (m, 2H, Ar-H), 7,26 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 6,64 (d, J = 7,5 Hz, 1H, NH), 4,60-4,51 (m, 1H, cicloesil-CH), 4,49 (s, 2H, CH2), 3,91-3,85 (m, 1H, cicloesil-CH), 2,01-1,88 (m, 4H, ogni 2H cicloesil-CH2), 1,68-1,59 (m, 2H, cicloesil-CH2), 1,52 (s, 1H, OH), 1,32-1,10 (m, 2H, cicloesil-CH2).
ESEMPIO 77
trans-4-({2-[5,5-diossido-9-(trifluorometil)-6H-dibenzo[c,e][1,2]tiazin-6-il]acetil}ammino)cicloesil 4-amminobenzensolfonato di formula 8a (SM656): ad una soluzione del composto SM589 (0,400 g, 0,63 mmol) in DMF (30 ml), ? stato aggiunto nichel Raney (10% p/p, 0,046 g). La miscela di reazione ? stata agitata a temperatura ambiente per 2 ore facendo gorgogliare H2. La miscela ? stata filtrata su Celite<? >e il filtrato ? stato fatto evaporare fino a essiccazione a dare un solido marrone che ? stato cristallizzato mediante EtOH per produrre SM656 come solido marrone con una resa del 58%. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 8,45 (s, 1H, Ar-H), 8,37 (d, J = 7,9 Hz, 1H, Ar-H), 8,05 (d, J = 7,2 Hz, 1H, Ar-H), 7,90-7,80 (m, 3H, Ar-H e NH), 7,70 (t, J = 7,6 Hz, 1H, Ar-H), 7,57 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar-H), 7,44 (d, J = 8,8 Hz, 2H, Ar-H), 6,59 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar-H), 6,19 (s, 2H, NH2), 4,58 (s, 2H, CH2), 4,11-4,23 (m, 1H, cicloesil-CH), 1,69-1,61 (m, 4H, ogni 2H, cicloesil-CH2), 1,39-1,31 (m, 2H, cicloesil-CH2), 1,17-1,08 (m, 2H, cicloesil-CH2).
ESEMPIO 78
2-(3-acetil-4-idrossi-1,1-diossido-2H-1,2-benzotiazin-2-il)-N-cicloesilacetammide (12a) (Schema 4). Una miscela di 11a, preparata secondo la letteratura, (0,63 g, 2,11 mmol), cicloesilammina (0,53 ml, 4,66 mmol), TBTU (1,63 g, 5,08 mmol) ed Et3N (4 equiv.) in THF secco ? stata fatta reagire a temperatura ambiente per 2 ore. La miscela di reazione ? stata quindi versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 4) ottenendo un precipitato che ? stato filtrato ed essiccato a dare 12a (0,75 g, 94%) sotto forma di solido giallo chiaro. <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): ? 0,80-1,20 e 1,40-1,60 (m, ogni 5H, cicloesil CH2), 2,40 (s, 3H, CH3), 4,00 (s, 2H, NCH2), 7,75-7,85 (m, 4H, Ar-H e CONH), 7,95-8,10 (m, 1H, Ar-H), 15,20 (bs, 1H, OH).
ESEMPIO 79
N-cicloesil-2-(3-metil-5,5-diossidopirazolo[4,3-c][1,2]benzotiazin-4(1H)-il)acetammide (SM879). La miscela di 12a (0,30 g, 0,79 mmol) e idrazina monoidrato (0,19 ml, 3,96 mmol) ? stata fatta reagire a 60 ?C per 1 ora. Dopo raffreddamento, la miscela di reazione ? stata versata in acqua ghiacciata e acidificata con HCl 2 N (pH = 4), rendendo un precipitato che ? stato filtrato e purificato mediante cromatografia flash eluendo con CH2Cl2:MeOH 97:3 seguita da cristallizzazione mediante EtOH per produrre SM879 (0,08 g, 54%) come solido bianco. <1>H NMR (400 MHz, CDCl3) ? 1,10-1,20 e 1,25-1,45 (m, ogni 2H, cicloesile CH2), 1,50-1,75 (m, 4H, cicloesile CH2), 2,80-2,90 (m, 2H, cicloesile CH2), 2,30 (s, 1H, CH3), 3,75 (m, 1H, cicloesile CH), 4,05 (s, 2H, NCH2), 6,50 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NH), 7,55 (dt, J = 1,2 e 7,8 Hz, 1H, Ar-CH), 7,70 (dt, J = 1,2 e 7,7 Hz, 1H, Ar-CH), 7,80 (dd, J = 0,9 e 7,8 Hz, 1H, Ar-CH), 7,95 (d, J = 7,3 Hz, 1H, Ar-CH), 10,50 (bs, 1H, CONH). HRMS (ESI) m/z [M+H]<+ >calcolato per C24H31N3O4S: 375,1460, trovato: 375,1485; LC-MS: tempo di rit. 4,109 min.
Biologia
Cellule e plasmidi.
Le linee cellulari usate in questo documento sono state coltivate in terreno minimo essenziale di Dulbecco (DMEM, Gibco, n. 11960-044), 10% di siero bovino fetale inattivato termicamente (?56-FBS), penicillina/streptomicina (Pen/Strep, Corning n. 20-002-Cl), amminoacidi non essenziali (NEAA, Gibco, n. 11140-035) e L-glutammina (Gibco, #25030-024), se non diversamente specificato. Le cellule HEK293 sono state ottenute da ATCC (ATCC CRL-1573). Abbiamo usato un subclone (A23) di HEK293 che esprime stabilmente una PrP con tag WT, ?CR, o EGFP murini. Le cellule sono state fatte passare in beute T25 o in piastre Petri da 100 mm in terreni contenenti 200 ?g/ml di igromicina e divise ogni 3-4 giorni. Le cellule non sono state fatte passare pi? di 20 volte dalla soluzione originaria. I composti usati negli esperimenti sono stati risospesi a 30 o 50 mM in DMSO, e diluiti per realizzare una soluzione madre 1000X, che ? stata poi usata per diluizioni in serie. Un'aliquota di 1 ?l di ciascun punto di diluizione del composto ? stata poi aggiunta a cellule piastrate in 1 ml di terreno senza antibiotici di selezione. Le strategie di clonaggio usate per generare i cDNA codificanti per la PrP con tag WT, ?CR o EGFP sono state descritte in precedenza<20,31,32>. Il costrutto EGFP-PrP contiene una versione monomerizzata di EGFP inserita dopo il codone 34 di PrP murina. L'identit? di tutti i costrutti ? stata confermata sequenziando l'intera regione codificante. Tutti i costrutti sono stati clonati nel plasmide di espressione pcDNA3.1(+)/hygro (Invitrogen). Tutti i plasmidi sono stati trasfettati usando Lipofectamina 2000 (Life Technologies), seguendo le istruzioni del produttore.
Saggio cellulare basato su farmaco (DBCA) e saggio MTT.
Il DBCA ? stato eseguito come descritto in precedenza<24>, con modifiche minori. In breve, le cellule HEK293 che esprimono ?CR PrP sono state coltivate a ~ 60% di confluenza in piastre a 24 pozzetti il giorno 1. Il giorno 2, le cellule sono state trattate con 500 ?g/ml di Zeocinfor. Il terreno (contenente Zeocin fresco e/o composto o veicolo) ? stato sostituito ogni 24 ore. Il giorno 5, il terreno cellulare ? stato rimosso e le cellule sono state incubate con 1 mg/ml di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) in PBS per 30 min a 37 ?C. MTT ? stato rimosso con attenzione, e le cellule sono state risospese in 500 ?l di DMSO. I valori per ciascun pozzetto sono stati ottenuti misurando a 570 nm, usando uno spettrofotometro per piastre (Biotek).
Elettrofisiologia.
Fette di ippocampo murino di potenziali eccitatori post-sinaptici di campo (EPSP) di topi C57BL/6 di 11 settimane sono state misurate con un sistema di array multi-elettrodo (MEA). Le fette sono state registrate per un basale di 30 minuti, l'LTP ? stato poi indotto con una stimolazione tetanica (3 treni, 500 MHz ciascuno) e registrato per ulteriori 30 minuti. La sinaptotossicit? del prione ? stata indotta incubando le fette per 5 minuti al basale con un lisato al 4% p/v di cellule MoRK13 cronicamente infettate con ceppo prionico M1000. Al fine di valutare la potenziale attivit? di recupero di SM884, la molecola ? stata continuamente perfusa durante l'intera registrazione. La percentuale di LTP ? stata calcolata considerando l'ampiezza di EPSP medio degli ultimi 10 minuti di registrazione, sull'ampiezza di EPSP medio degli ultimi cinque minuti prima della stimolazione tetanica.
Immunofluorescenza.
Le cellule che esprimono EGFP-PrP sono state piastrate su micropiastre CellCarrier-384 Ultra (Perkin Elmer) ad una concentrazione di 12.000 cellule/pozzetto e fatte crescere per approssimativamente 24 ore, per ottenere uno strato semi-confluente (60%). Un veicolo (DMSO allo 0,1%, equivalente in volume) ? stato usato come controllo negativo. Le cellule sono state trattate per 24 ore e poi fissate per 12 minuti a temperatura ambiente aggiungendo paraformaldeide priva di metanolo (Thermo Fisher Scientific) ad una concentrazione finale del 4%. Le piastre sono state poi lavate due volte con PBS e controcolorate con Hoechst 33342. La localizzazione cellulare di EGFP-PrP ? stata monitorata usando un sistema di imaging ad alto contenuto Operetta (Perkin Elmer). L'imaging ? stato eseguito in una modalit? widefield usando un obiettivo NA alto 20X (0,75). Cinque campi sono stati acquisiti in ciascun pozzetto su due canali (380-445 Excitation-Emission per Hoechst e 475-525 per EGFP e Alexa 488). L'analisi delle immagini ? stata eseguita usando il software Harmony versione 4.1 (Perkin Elmer).
Western blotting.
I campioni sono stati diluiti 1:1 in tampone campione Laemli 2X (2% di SDS, 10% di glicerolo, Tris-HCl 100 mM pH 6,8, blu bromofenolo allo 0,002%, DTT 100 mM), riscaldati a 95 ?C per 10 minuti, quindi analizzati mediante SDS-PAGE. Le proteine sono state trasferite elettroforeticamente su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF), che sono state poi bloccate per 20 min in latte scremato in polvere al 5% (p/v) in soluzione salina tamponata con Tris contenente Tween-20 allo 0,05%. Dopo incubazione con anticorpi primari e secondari appropriati, i segnali sono stati rivelati usando una chemiluminescenza potenziata (Luminata, BioRad) e visualizzati mediante uno scanner di immagini Bio-Rad XRS Chemidoc (Bio-Rad).
Preparazione di oligomeri di A?.
Il Peptide A? (1-42) sintetico (Cat. Numero KP2107, Karebay Biochem., Rochester, NY) ? stato disciolto in esafluoro-2-propanolo, incubato per 10 minuti in un bagno di sonicazione alla massima potenza, centrifugato a 15.000 x g per 1 minuto, suddiviso in aliquote, essiccato e conservato a -80 ?C. Prima dell'uso, il film essiccato ? stato disciolto usando DMSO e diluito a 100 ?M in terreno F12 (Invitrogen, Waltham, MA). Gli oligomeri sono stati ottenuti incubando il peptide per 16 ore a 25 ?C. Questa preparazione produce abitualmente oligomeri che eluiscono vicino al volume di vuoto di una colonna di esclusione dimensionale Superdex 75 10/300 (GE Healthcare, Little Chalfont, Regno Unito) e che reagiscono con l'anticorpo oligomero-specifico A11. Le concentrazioni finali di oligomeri di A? sono state considerate come equivalenti monomerici, poich? la dimensione degli oligomeri ? eterogenea.
Neuroni di ippocampo coltivati.
Le colture neuronali primarie sono state derivate dagli ippocampi di topi al giorno 2 postnatale, e coltivate come descritto in precedenza<11>. I neuroni sono stati piastrati su piastre da 35 mm (500.000 cellule/piastra) pre-rivestite con 25 ?g/ml di poli-D-lisina (Sigma P6407) in terreno B27/Neurobasal-A integrato con glutammina 0,5 mM, 100 unit?/ml di penicillina e 100 ?g/ml di streptomicina (tutti da Invitrogen). Gli esperimenti sono stati eseguiti 12 giorni dopo il piastramento. I neuroni sono stati pre-trattati per 20 minuti con ciascun composto candidato o controlli e poi esposti per 20 minuti o 3 ore a oligomeri di A? (3 ?M). Le frazioni insolubili al Triton (TIF) sono state analizzate mediante immunoblot con anticorpi contro fosfo-SFK (Tyr 416) o Fyn. L'anticorpo fosfo-SFK rileva pY416 in svariate SFK, ma studi precedenti hanno mostrato che l'attivazione PrPC-dipendente delle chinasi ? specifica per Fyn. L'actina ? stata usata come controllo del caricamento. Il frazionamento subcellulare ? stato eseguito come riportato in precedenza, con modifiche minori. I neuroni sono stati omogeneizzati usando un omogeneizzatore Potter-Elvehjem in tampone di saccarosio ghiacciato 0,32 M (pH 7,4) contenente HEPES 1 mM, MgCl2 1 mM, NAF 10 mM, NaHCO3 1 mM e PMSF 0,1 mM in presenza di inibitori della proteasi (Complete mini, Roche Applied Science, Penzberg, Germania) e inibitori della fosfatasi (PhosSTOP, Roche Applied Science). I campioni sono stati centrifugati a 13.000 x g per 15 minuti per ottenere una frazione di membrana grezza. Il pellet ? stato risospeso in tampone contenente KCl 150 mM e Triton X-100 allo 0,5% ed ? stato centrifugato a 100.000 x g per 1 ora. Il pellet finale, indicato come frazione insolubile al Triton, ? stato riomogeneizzato in HEPES 20 mM integrato con inibitori della proteasi e della fosfatasi e poi conservato a -80 ?C o direttamente usato in ulteriori esperimenti. La concentrazione proteica in ciascun campione ? stata quantificata usando il saggio Bradford (Bio-Rad), e le proteine (5 ?g) sono state quindi analizzate mediante Western blotting. Gli anticorpi primari erano come segue: anti-GluN2A e anti-GluN2B (entrambi 1:2000; Invitrogen), anti-GluA1 e anti-GluA2 (entrambi 1:1000; Millipore, Billerica, MA), anti-PSD-95 (proteina di densit? post-sinaptica 95; 1:2000; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) e anti-actina (1:5000; Millipore). I Western blot sono stati analizzati mediante densitometria usando il software Quantity One (Bio-Rad). Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti su almeno 4 preparazioni di coltura indipendenti (n ? 4).
Produzione di PrP ricombinante.
RecHuPrP23-231 ? stata espressa da batteri E. coli Rosetta (DE3) competenti che ospitano il vettore di espressione pOPIN E contenente un costrutto di Prnp umana wild type (N-KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGWGQPHGGG WGQPHGGGWGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAGAVVGGLGGYML GSAMSRPIIHFGSDYEDRYYYRENMHRYPNYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCV NITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYYYQRGSS-C; SEQ ID N. 1). I batteri da glicerolato mantenuto a -80 ?C sono stati fatti crescere in un pallone Erlenmeyer da 250 ml contenente 50 ml di brodo LB per tutta la notte. La coltura ? stata poi trasferita in due palloni Erlenmeyer da 2 l contenenti ciascuno 500 ml di terreno minimo integrato con 3 g/l di glucosio, 1 g/l di NH4Cl, MgSO4 1 M, CaCl2 0,1 M, 10 mg/ml di tiamina e 10 mg/ml di biotina. Quando la coltura ha raggiunto OD600 di 0,9-1,2 AU, ? stato aggiunto isopropil ?-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) per indurre l'espressione di PrP per tutta la notte nelle stesse condizioni di temperatura e agitazione. I batteri sono stati poi pellettati, sottoposti a lisi, i corpi di inclusione raccolti mediante centrifugazione e solubilizzati in Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,5 M, Gnd/HCl 6 M, pH = 8. Sebbene la proteina non contenga un tag His, la purificazione della proteina ? stata eseguita con una colonna di affinit? all'istidina (HisTrap FF grezzo 5 ml, GE Healthcare Amersham) sfruttando l'His naturale presente nella regione di ripetizione dell'ottapeptide di PrP. Dopo eluizione con tampone contenente Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazolo 500 mM e guanidina-HCl 2 M, pH = 8, la qualit? e la purezza dei lotti proteici sono state valutate mediante colorazione BlueSafe (NZYTech, Lisbona) dopo elettroforesi in gel SDS-PAGE. La proteina ? stata ripiegata alla conformazione di PrPC mediante dialisi contro tampone di acetato di sodio 20 mM, pH = 5. Il materiale aggregato ? stato rimosso mediante centrifugazione. La corretta ripiegatura ? stata confermata mediante CD e concentrazione proteica, mediante misurazione dell'assorbanza a 280 nm. La proteina ? stata concentrata usando dispositivi centrifughi Amicon e la soluzione concentrata conservata a -80 ?C fino all'uso.
Ridistribuzione di massa dinamica.
Per effettuare le analisi DMR ? stato usato il lettore di piastre multimodale EnSight (Perkin Elmer, Waltham, MA). L'immobilizzazione di PrPC ricombinante umana di lunghezza intera (residui 23-230) (15 ?l/pozzetto di una soluzione di PrPC 2,5 ?M in tampone di acetato di sodio 10 mM, pH 5) su micropiastre prive di marcatore (micropiastre ad alta sensibilit? EnSpire-LFB, Perkin Elmer) ? stata ottenuta mediante chimica di accoppiamento amminico. L'interazione tra ciascuna molecola, diluita a diverse concentrazioni in tampone di saggio (PO4 10 mM, pH 7,5, KCl 2,4 mM, NaCl 138 mM, Tween-20 allo 0,05%) e PrPC, ? stata monitorata dopo un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Tutte le fasi sono state eseguite impiegando una stazione di lavoro per manipolazione di liquidi Zephyr Compact (Perkin Elmer). Il software Kaleido (Perkin Elmer) ? stato usato per acquisire ed elaborare i dati.
Analisi statistiche di dati biologici.
Tutti i dati sono stati raccolti e analizzati in cieco da due operatori diversi. Le analisi statistiche, eseguite con il software Prism versione 7.0 (GraphPad), includevano tutti i punti dati ottenuti, ad eccezione degli esperimenti in cui i controlli negativi e/o positivi non davano il risultato atteso, i quali venivano scartati. Non ? stato impiegato alcun test per valori anomali. ? stato applicato il test di normalit? di Kolmogorov-Smirnov (quando possibile, n ?5). I risultati sono stati espressi come la media ? errori standard, se non specificato. In alcuni casi, gli esperimenti dose-risposta sono stati dotati di un modello di regressione logistica non lineare a 4 parametri (4PL), e l'adattamento ? stato stimato calcolando R<2>. Tutti i dati sono stati analizzati con il test ANOVA a una via, inclusa una valutazione della normalit? dei dati, e corretti mediante test post-hoc di Dunnet. I valori di probabilit? (p) < 0,05 sono stati considerati significativi (*<0,05, **<0,01, ***<0,001).
Cellule dendritiche derivate da midollo osseo in vitro
Le cellule del midollo osseo sono state isolate da topi C57BL/6 come descritto in precedenza (DOI: 10.1073/pnas.1619863114). Il BM ? stato raccolto da femore, tibia e pelvi usando mortaio e pestello in PBS 1x integrato con BSA allo 0,5% e EDTA 2 mM (tampone MACS), fatto passare attraverso un setaccio per cellule da 70 ?m e centrifugato a 1400 r.p.m per 5 minuti. Gli eritrociti sono stati sottoposti a lisi con tampone di lisi ACK (cloruro di ammonio 0,15 M, carbonato di potassio 10 mM) e i detriti sono stati rimossi mediante centrifugazione a gradiente usando Histopaque1119 (n. 11191, Sigma-Aldrich) prima della coltura. Le cellule sono state risospese a 2 ? 106 cellule/ml in terreno Dulbecco modificato di Iscove (IMDM, n. 12440053, Thermo Fisher) integrato con amminoacidi non essenziali 0,1 (n. 11140-035 Thermo Fisher), Piruvato di sodio 1 mM (n. 11360-070, Thermo Fisher), glutammina 5 mM (n. 25030-024, Thermo Fisher), 2-Mercaptoetanolo 50 ?M (n. 31350-010, Thermo Fisher), 100 U/ml di penicillina, 100 g/ml di streptomicina (n.
15140-122, Thermo Fisher) e FBS al 10% (n. 10270-106, Thermo Fisher) (IMDM completo) contenente il 5% di Flt3-L murino e sono state seminate 5 ml/pozzetto in piastre di coltura tissutale a 6 piastre a 37 ?C per 8-10 giorni. Per tutti gli esperimenti di coltura, le cellule poco aderenti e in sospensione sono state raccolte mediante pipettaggio delicato nel punto temporale indicato.
cDC1 e cDC2 sono state separate in IMDM completo e separate mediante FACSAria Fusion come pDC B220+Bst2+, cDC1 B220?CD11c+MHC-II+CD24+CD172??, cDC2 come B220?CD11c+MHCII+CD24?CD172?+. La purezza di separazione >95% ? stata confermata mediante analisi post-separazione prima che le cellule fossero usate per ulteriori esperimenti.
Induzione di EAE
Tutti i topi usati erano animali di 12 settimane sullo sfondo C57BL/6. EAE ? stata indotta con 200 ?g di frammento di glicoproteina oligodendrocita-mielina MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (peptide MOG35?55; n. crb1000205n Cambridge Research Biochemicals) miscelati con adiuvante incompleto di Freund (n. 263910, BD) contenente 4 mg/ml di Mycobacterium tuberculosis TB H37 Ra (n. 231141 BD), in un rapporto di 1:1 (v/v). I topi hanno ricevuto 2 iniezioni sottocutanee di 100 ?l ciascuna della miscela MOG/CFA. I topi hanno quindi ricevuto una singola iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse (n. 180, List Biological Laboratories) ad una concentrazione di 1 ng/?l in 200 ?l di PBS. I topi hanno ricevuto una seconda iniezione di tossina della pertosse alla stessa concentrazione due giorni dopo l'induzione iniziale di EAE. I topi sono stati trattati per via orale con diverse dosi di SM231 disciolte in PBS 1x a giorni alterni a partire dal giorno 10 post-induzione di EAE. I topi sono stati monitorati e successivamente ? stato loro assegnato un punteggio giornalmente. I punteggi clinici di EAE sono stati definiti come segue: 0 ? nessun segno, 1 ? coda completamente floscia, 2 ? debolezza arti posteriori, 3 ? paralisi degli arti posteriori, 4 ? paralisi degli arti anteriori, 5 ? moribondo, come descritto in precedenza (Mayo et al., 2014; Rothhammer et al., 2016). Le differenze di sesso non sono state analizzate, ma solo un singolo sesso ? stato usato all'interno di qualsiasi serie di esperimenti di EAE. I topi sono stati assegnati in modo casuale a gruppi di trattamento.
RISULTATI
Identificazione, caratterizzazione e ottimizzazione di SM3. Le mutazioni nella regione centrale della PrPC, incluse le delezioni artificiali o le mutazioni puntiformi associate alla malattia, inducono un'attivit? del canale ionico tossico che pu? essere rilevata nelle cellule trasfettate mediante tecniche di patch-clamp<23,24>. Cellule che esprimono PrP mutanti sono anche ipersensibili a svariati farmaci cationici comunemente usati per la selezione di linee cellulari trasfettate, tra cui amminoglicosidi e analoghi della fleomicina<20>. Quest'ultimo effetto ? stato usato per stabilire un nuovo saggio cellulare per lo studio della tossicit? correlata a PrPC mutante, chiamato "saggio cellulare basato su farmaco", o DBCA<25>. In modo importante, la co-espressione della PrPC wild type (WT) sopprime sia l'attivit? del canale sia la citotossicit?, indicando probabilmente che le forme di PrP mutante attivano in modo aberrante una via di segnalazione normalmente regolata dalla PrPC. Pertanto, il DBCA rappresenta uno strumento unico per identificare composti in grado di modulare l'attivit? della PrPC. Abbiamo sviluppato un formato ottimizzato e in scala del DBCA in piastre da 384 pozzetti, che ? stato successivamente impiegato per selezionare decine di migliaia di piccole molecole<21,22>. ? stato trovato che svariati composti sopprimevano la tossicit? di PrP mutante, senza alcuna tossicit? rilevabile nelle cellule WT. Abbiamo concentrato gli sforzi su uno di questi composti (chiamato SM3 [dibenzo [3,4][c,e]tiazina 5,5-diossido], mostrato nella Figura 1A). SM3 possiede un'impalcatura chimica simile al farmaco adatta per esperimenti di ottimizzazione e relazione struttura-attivit? (SAR). Decine di derivati (Figura 1C) sono stati progettati e sintetizzati, e la loro attivit? biologica testata mediante DBCA. Sono state esplorate tre regioni chimiche del composto, con il duplice scopo di migliorare la potenza e acquisire informazioni di SAR. Prendendo come riferimento l'attivit? biologica del composto originario SM3 (Figura 1B), abbiamo valutato l'attivit? dei diversi derivati (Figura 2). Abbiamo fatto svariate osservazioni importanti su SM3. Le modificazioni chimiche realizzate alla regione spaziatrice non sono state fruttuose. Al contrario, le sostituzioni all'anello C hanno migliorato la potenza, i derivati 9-CF3 essendo i pi? potenti. I sostituenti ramificati sul gruppo cicloesile non sono stati tollerati, mentre gli anelli di fenile sostituiti hanno generato analoghi con potenza paragonabile al composto di riferimento. Collettivamente, questi risultati hanno fornito importanti informazioni di SAR su SM3 e hanno suggerito direttamente schemi chimici per ingegnerizzare ulteriori derivati e analoghi funzionalizzati. Inoltre, abbiamo identificato un potente derivato, chiamato SM231, che ha mostrato attivit? da parte del DBCA nell'intervallo sub-micromolare (Figura 3).
Tabella 3. Effetto protettivo sulle cellule HEK293: il valore ? espresso come percentuale di recupero (%RMAX) prodotta dai composti bersaglio rispetto alla molecola colpita SM3; IC50
e LD50 dei composti bersaglio derivati da DBCA.
Note:
1. RMax indica l'effetto massimo di recupero alla concentrazione di 1 ?M, espresso come percentuale dell'effetto di SM3(LD24) alla stessa concentrazione.
2. Dose di recupero al 50%, espressa in ?M. Questa si ottiene tipicamente testando una curva dose-risposta a 8 punti, eseguita solo per composti che mostrano un'attivit? migliorata (>110%) rispetto A SM3(LD24).
3. Dose letale al 50%, espressa in ?M. Questa si ottiene tipicamente testando una curva dose-risposta a 8 punti, eseguita solo per composti selezionati.
NS= non solubile, i dati ottenuti da questi composti non sono affidabili a causa di problemi di solubilit?
SM231 inibisce gli effetti sinaptotossici degli oligomeri di A?. Studi recenti hanno identificato un ruolo della PrPC nella tossicit? di vari oligomeri ripiegati in modo errato di proteine associate alle malattie, come l'amiloide ?, il cui accumulo sottolinea il declino cognitivo che si verifica nella malattia di Alzheimer<2,4>. L'interazione tra PrPC e oligomeri di A? scatena una rapida via di segnalazione tossica che coinvolge il recettore metabotropico del glutammato 5 (mGluR5), l'attivazione della tirosin chinasi Fyn e la fosforilazione della subunit? NR2B del recettore NMDA, producendo infine una disregolazione della funzione recettoriale, eccitotossicit? e retrazione della spina dendritica<12>. Al fine di valutare l'effetto di SM231 sull'attivazione indotta da A? di Fyn, abbiamo esposto neuroni di ippocampo primari a diverse concentrazioni di oligomeri di A? per brevi periodi (10, 20 o 60 minuti). Abbiamo confermato che gli oligomeri inducono una rapida fosforilazione della chinasi Fyn (i risultati al punto temporale di 20 minuti sono mostrati nella Figura 4). Coerentemente con le osservazioni precedenti<26>, questo effetto ? stato impedito mediante trattamento con un composto diretto da PrPC [chiamato Fe(III)-TMPyP]<35>. In modo interessante, la co-incubazione con SM231 ha completamente abrogato gli effetti di A?, riportando la fosforilazione di Fyn a livelli normali (Figura 4A).
Successivamente, abbiamo testato direttamente la capacit? di SM231 di bloccare la sinaptotossicit? dipendente da oligomeri di A?. I neuroni di ippocampo primari sono stati incubati per 3 ore con oligomeri di A? (3 ?M). Coerentemente con i rapporti precedenti<11>, abbiamo osservato una diminuzione di svariati marker post-sinaptici (subunit? del recettore NMDA, GluN2A e GluN2B, e AMPA, GluA1 e GluA2, e della proteina di densit? postsinaptica 95, PSD-95), come valutato mediante Western blotting delle frazioni insolubili al Triton. Questi effetti sono stati recuperati mediante trattamento con la molecola anti-PrPC Fe(III)-TMPyP. In modo importante, la co-incubazione con SM231 per 20 minuti ha recuperato significativamente i livelli di tutti i marker post-sinaptici. Il livello di una proteina di controllo (actina) non ? stato influenzato dagli oligomeri di A? o da SM231. Questi dati dimostrano che SM231 inibisce la capacit? degli oligomeri di A? di sovvertire la funzione di PrPC e attivare una via di segnalazione neurotossica.
Ottimizzazione chimica di SM231 a derivati pi? metabolicamente stabili. All'interno della presente invenzione ? stato effettuato un ulteriore ciclo di ottimizzazione chimica delle posizioni funzionalizzanti previste per migliorare positivamente la stabilit? metabolica (Figura 5). In particolare, la posizione C-3 del nucleo di dibenzotiazina ? stata funzionalizzata da F e EtO (rispettivamente derivati di SM882 e SM883) mentre in altre tre molecole il cicloesile ? stato sostituito da un gruppo pi? stabile e idrofilo (morfolina e tetraidropirano) o aperto a dare una catena ramificata (SM881, SM884 e SM885). In modo interessante, quando saggiato su DBCA, il composto SM884 ? risultato pi? potente di SM231 (Figura 6), rendendo queste due molecole come composti principali promettenti per un ulteriore sviluppo.
SM884 recupera gli effetti sinaptotossici di prioni nelle fette di cervello di topo. Per testare se SM884 ? in grado di inibire la tossicit? indotta da prioni in un contesto rilevante per la malattia, ci siamo rivolti a un modello di tossicit? ex vivo sviluppato di recente<27,28>. Questo saggio si basa su fette di cervello di topo intensamente esposte a omogeneati cerebrali di topi malati terminali infettati con lisati di linee cellulari cronicamente infettati con il ceppo prionico umano M1000 adattato a topo. Abbiamo trovato che la somministrazione di SM884 ad una concentrazione di 0,1-0,03 ?M induce un recupero significativo (rispettivamente del 34% e 71%) del potenziamento a lungo termine (LTP; Figura 7). La potenza superiore rilevata alla dose pi? bassa probabilmente rifletteva una propensione all'aggregazione osservata della molecola nelle condizioni sperimentali. Questi risultati erano anche pienamente coerenti con la dose di recupero semimassima stimata del composto nelle cellule (0,018 ?M), come valutato mediante DBCA, e mostravano chiaramente che SM884 ? in grado di sopprimere la compromissione sinaptica indotta dai prioni nell'intervallo di bassa concentrazione nanomolare.
I sottoinsiemi di DC1 e DC2 murini esprimono PrPC, e DC2 trattate con SM231 promuovono l'espansione delle cellule Treg in co-colture di cellule DC-T. Le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo sono state analizzate per l'espressione di PrPC dopo stimolazione con due diverse concentrazioni di SM231 o Fe(III)-TMPyP o veicolo. Per questa analisi, l'espressione di PrPC in ciascun sottoinsieme di DC ? stata determinata mediante Western blot usando anticorpo anti-PrPC specifico. Gli autori della presente invenzione hanno trovato che DC1 e DC2 esprimevano un livello al basale di PrPC che aumenta leggermente dopo il trattamento con SM231, specialmente in DC2 (Figura 8A). Per valutare la funzione inibitoria delle cellule DC1 o DC2 dopo il trattamento con SM231 o Fe (III)-TMPyP abbiamo eseguito co-colture in vitro di DC con cellule T CD4+ na?ve. ? stato trovato che la capacit? di priming di DC2 convenzionale era significativamente influenzata dal trattamento di DC2 con SM231. Nello specifico queste cellule erano in grado di favorire l'espansione di cellule T che esprimono marker di cellule Treg FoxP3 e LAP e questo effetto richiedeva l'espressione di PrPC nelle DC, poich? veniva impedito nelle cellule DC2 che erano state trasfettate da uno specifico siRNA di PrPC ma non da un siRNA di controllo (Figura 8B). Nel complesso, questi dati suggeriscono che la stimolazione della PrPC pu? conferire funzione tollerogenica a DC2, sopprimendo il programma immunogenico predefinito di questo sottogruppo.
La somministrazione di SM231 migliora l'EAE e sopprime le citochine infiammatorie in vivo. Gli autori dell'invenzione hanno studiato se i modulatori di PrPC potessero avere un ruolo protettivo in questo modello sperimentale. Gruppi di topi C57BL/6 di sesso femminile WT sono stati immunizzati con il peptide MOG35-55 e sottoposti a iniezione per via intraperitoneale (i.p.) con Fe(III)-TMPyP o SM231 a due dosi a giorni alterni dal giorno 3 al giorno 24 dopo la vaccinazione. I topi di controllo hanno ricevuto solo il veicolo. I punteggi clinici di EAE sono stati registrati giornalmente in questo lasso di tempo (Figura 9A). Abbiamo scoperto che la somministrazione di SM231 (Figura 9B) ha avuto come risultato una malattia ridotta rispetto ai topi di controllo (P < 0,05). Al giorno 25 dopo la vaccinazione, la demielinizzazione della sostanza bianca e gli infiltrati infiammatori sono stati ridotti da SM231 rispetto al controllo trattato con il veicolo (Figura 9C). Inoltre, il trattamento con SM231 in vivo ha avuto come risultato una ridotta secrezione di citochine infiammatorie come IL-17A e GM-CSF da parte delle cellule T CD4+ purificate dai linfonodi cervicali e ri-stimolate con MOG in vitro. Questi dati supportano il valore terapeutico e anche fisiologico dell'attivazione della PrPC nel controllo della neuroinfiammazione. Inoltre, questi dati suggeriscono che molecole come SM231 possono esercitare questi effetti regolando potenziali cellule che presentano antigeni infiammatori anche in vivo. In modo importante, questi dati erano simili a quelli ottenuti con altri derivati di SM231.
SM231 non agisce bersagliando direttamente la PrPC. Alla luce della promettente capacit? dei composti SM di modulare l'attivit? della PrPC in svariati contesti sperimentali, ? stata testata l'ipotesi che queste molecole agiscano bersagliando direttamente la proteina. In primo luogo, ? stato ipotizzato che il composto pu? promuovere la ri-localizzazione della PrPC dalla superficie cellulare, una modalit? di azione recentemente osservata per un derivato fenotiazinico anti-prionico (clorpromazina, CPZ)<29,30>. Cellule HEK293 che esprimono stabilmente una versione di PrPC con tag EGFP sono state trattate con diverse concentrazioni di SM231, CPZ o controllo con veicolo, e la localizzazione di PrPC sulla superficie cellulare ? stata monitorata mediante tecniche di imaging (Figura 10A). I risultati hanno mostrato che la CPZ ha indotto una rilocalizzazione dose-dipendente di EGPF-PrPC dalla superficie cellulare ai compartimenti intracellulari, in linea con i dati precedenti<30>. Al contrario, non sono stati rilevati cambiamenti per SM231, suggerendo che questo composto non esercita i suoi effetti inducendo la rilocalizzazione della PrPC dalla superficie cellulare. Successivamente, ? stato testato se SM231 potesse alterare l'espressione di PrPC. Cellule HEK293 che esprimono stabilmente PrPC wild-type sono state trattate con SM231 a concentrazioni differenti. I livelli totali di PrPC sono stati poi valutati in lisati di cellule intere mediante Western blotting (Figura 10B). Ancora una volta, non ? stata trovata alcuna differenza nell'espressione di PrPC dopo il trattamento con SM231. Infine, il legame diretto di SM231 alla PrPC ricombinante ? stato testato mediante ridistribuzione di massa dinamica (DMR), una tecnica biofisica precedentemente impiegata per rilevare l'interazione di piccole molecole con la PrPC<26>. Come controllo sono stati usati Fe(III)-TMPyP e clorpromazina (CPZ), due composti che hanno riportato in precedenza di mostrare rispettivamente un'affinit? elevata e bassa per PrPC<19,30>. Tuttavia, non ? stata osservata alcuna interazione tra SM231 e PrPC ricombinante, anche alla concentrazione massima (1 mM, Figura 10C). Collettivamente, questi risultati indicano che SM231 non agisce legando direttamente PrPC, o alterandone la sua espressione o localizzazione.
Un inibitore di FXR sopprime la citotossicit? di PrP mutante. I due agonisti di FXR, WAY-362450 e Fexaramina, la cui struttura ? riportata di seguito, sono stati testati usando il saggio DBCA.
WAY-362450 Fexaramina
Cellule HEK293 che esprimono ?CR PrP sono state coltivate a ~ 60% di confluenza in piastre da 24 pozzetti al giorno 1. Il giorno 2, le cellule sono state trattate con 500 ?g/ml di Zeocin e/o singoli agonisti di FXR a diverse concentrazioni (0,03-30 ?M) per 72 ore. Il terreno (contenente Zeocin fresco e/o agonisti di FXR) ? stato sostituito ogni 24 ore. Il giorno 5, il terreno cellulare ? stato rimosso e le cellule sono state incubate con 1 mg/ml di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) in PBS per 30 min a 37 ?C per valutare la vitalit? cellulare. In modo interessante, l'agonista di FXR WAY-362450 ha recuperato la citotossicit? ?CR PrP-dipendente in modo dose-dipendente, con una concentrazione inibitoria al valore del 50% (IC50) nell'intervallo sub-micromolare (Figura 11). In modo importante, l'agonista di FXR Fexaramina ha mostrato un effetto minore, probabilmente riflettendo una diversa attivit? dei due agonisti contro specifiche isoforme di FXR e/o reclutando anche coattivatori diversi. Collettivamente, questi risultati stabiliscono una connessione farmacologica diretta tra la tossicit? di PrP mutante e l'attivit? del recettore di FXR, e suggeriscono che questo recettore pu? essere il bersaglio dei composti SM.
SM231 media l'attivit? trascrizionale del gene di FXR negli epatociti murini. Gli epatociti primari murini sono stati isolati da topi di sesso maschile C57Bl6/J wild type di 6-8 settimane (da Charles River). 3x10<6 >epatociti primari sono stati stimolati con concentrazioni crescenti di SM231 o WAY-362450, un potente e selettivo agonista del recettore Farnesoid X (FXR) per 4 o 12 ore. L'espressione di FXR (nr1h4) e del gene bersaglio di FXR NrOb2, ? stata valutata mediante RT-qPCR usando primer specifici. In questo esperimento, in modo simile all'agonista di riferimento WAY- 362450, SM231 ha promosso una significativa attivit? trascrizionale di FXR in queste cellule, in particolare tre ore dopo il trattamento (Figura 12). Gli effetti si sono persi dopo 6 ore di attivazione per entrambe le molecole. Questi dati suggeriscono che SM231 pu? agire nelle cellule come un agonista del recettore FXR.

Claims (14)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Composto di Formula generale (I):
    in cui A ? un anello di benzene o un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi; B ? un anello di benzene di struttura generale:
    Oppure B ? un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi facoltativamente sostituito con uno o pi? sostituenti ciascuno indipendentemente selezionato tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, CONHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1- 4alchilammino; W ? C(=O), C(=S), CH2 o ? assente; Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, S, C(=O), PO2 e NR4; Z ? N o CH; X1 e X2 sono ciascuno indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1- 4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; X3 ? idrogeno, metile, etile, isopropile o benzile; X4 e X5 sono indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, C1-3alchile, aloalchile, alogeno, cicloalchile, ammino, idrossi, ciano, nitro; n ? 0, 1, 2, 3, 4; o i residui X3 e X4 presi insieme rappresentano un legame singolo o un C1-4alcandiile, detto legame singolo o detto C1-4alcandiile formando insieme agli atomi a ponte a cui sono rispettivamente collegati un anello eterociclico di 5 o 6 elementi; R1, R2, R2a e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, idrossi, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, OC1-4alchilammino, SC1- 4alchile; R4 ? selezionato tra idrogeno, C1-4alchile, C1-4amminoalchile, C1-4idrossialchile, C1-4nitroalchile, C1-4tioalchile, C1-6aloalchile; Q ? selezionato tra C1-8alchile, C1-8alchenile, cicloalchile, eterocicloalchile, anello di arile, anello eteroaromatico, in cui: - C1-8alchile ? facoltativamente sostituito con idrossi, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, N(C1-4alchile)2, NH(C=O)C1-4alchile, arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile, ciascuno di detti arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile essendo facoltativamente sostituito con metile, alogeno, idrossi; - il cicloalchile e l'eterocicloalchile sono ciascuno facoltativamente sostituiti con OH, OSO2R5, C1-3alchile, NR6R7, in cui: ? R5 ? selezionato tra idrogeno, fenile, eteroarile, amminofenile e nitrofenile; e in cui ? R6 e R7 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra H, metile, C(=O)CH3, SO2CH3; - l'anello di arile o l'anello eteroaromatico sono ciascuno facoltativamente sostituiti con uno o pi? sostituenti selezionati tra alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NH2, NHSO2C1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; e qualsiasi loro isomero, stereoisomero per l'uso nel trattamento di una malattia neurodegenerativa, preferibilmente per l'uso nel trattamento della malattia di Alzheimer, della malattia da prioni, della sclerosi multipla e dell'encefalite autoimmune a condizione che il composto non sia incluso.
  2. 2. Composto di Formula generale (I):
    in cui A ? un anello di benzene o un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi; B ? un anello di benzene di struttura generale:
    Oppure B ? un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi facoltativamente sostituito con uno o pi? sostituenti ciascuno indipendentemente selezionato tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, CONHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; W ? C(=O), C(=S), CH2 o ? assente; Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, S, C(=O), PO2 e NR4; Z ? N o CH; X1 e X2 sono ciascuno indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; X3 ? idrogeno, metile, etile, isopropile o benzile; X4 e X5 sono indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, C1-3alchile, aloalchile, alogeno, cicloalchile, ammino, idrossi, ciano, nitro; n ? 0, 1, 2, 3, 4; o i residui X3 e X4 presi insieme rappresentano un legame singolo o un C1-4alcandiile, detto legame singolo o detto C1-4alcandiile formando insieme agli atomi a ponte a cui sono rispettivamente collegati un anello eterociclico di 5 o 6 elementi; R1, R2, R2a e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, idrossi, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, OC1-4alchilammino, SC1-4alchile; R4 ? selezionato tra idrogeno, C1-4alchile, C1-4amminoalchile, C1-4idrossialchile, C1- 4nitroalchile, C1-4tioalchile, C1-6aloalchile; Q ? selezionato tra C1-8alchile, C1-8alchenile, cicloalchile, eterocicloalchile, anello di arile, anello eteroaromatico, in cui: - C1-8alchile ? facoltativamente sostituito con idrossi, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, N(C1-4alchile)2, NH(C=O)C1-4alchile, arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile, ciascuno di detti arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile essendo facoltativamente sostituito con metile, alogeno, idrossi; - il cicloalchile e l'eterocicloalchile sono ciascuno facoltativamente sostituiti con OH, OSO2R5, C1-3alchile, NR6R7, in cui: ? R5 ? selezionato tra idrogeno, fenile, eteroarile, amminofenile e nitrofenile; e in cui ? R6 e R7 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra H, metile, C(=O)CH3, SO2CH3; - l'anello di arile o l'anello eteroaromatico sono ciascuno facoltativamente sostituiti con uno o pi? sostituenti selezionati tra alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NH2, NHSO2C1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; e qualsiasi loro isomero, stereoisomero per l'uso nel trattamento della sclerosi multipla e dell'encefalite autoimmune.
  3. 3. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti in cui: - A ? benzene; e/o - Y ? SO2; e/o - W ? C(=O) o CH2; e/o - Z ? N; e/o - X4 e X5 sono H.
  4. 4. Composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, essendo:
  5. 5. Composto secondo la rivendicazione 2, essendo:
  6. 6. Un composto di Formula generale (II):
  7. in cui A ? un anello di benzene o un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi; B ? un anello di benzene di struttura generale:
  8. in cui: R1, R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, COR, COOR, CONHR, OC1-4alchilammino, idrossi, SC1-4alchile; R2a ? idrogeno, CF3, F, OH, OC1-4alchile, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino a condizione che: - se R2a ? idrogeno o F, allora R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra F, Cl, Br, CF3, OMe, OH; o - se R1 ? alogeno, allora R2a ? idrogeno e R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, COR, COOR, CONHR, OC1- 4alchilammino, idrossi, SC1-4alchile; o B ? un anello eteroaromatico di cinque o sei elementi facoltativamente sostituito con uno o pi? sostituenti ciascuno indipendentemente selezionato tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, COR, COOR, CONHR, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; W ? C(=O), C(=S) o CH2; Y ? selezionato tra CH2, SO2, SO, S, C(=O), PO2 e NR4; Z ? N o CH; X1 e X2 sono ciascuno indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1- 4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; X3 ? idrogeno, metile, etile, isopropile o benzile; X4 e X5 sono indipendentemente selezionati in ciascun caso tra idrogeno, C1-3alchile, aloalchile, alogeno, cicloalchile, ammino, idrossi, ciano, nitro; n ? 0, 1, 2, 3, 4; o i residui X3 e X4 presi insieme rappresentano un legame singolo o un C1-4alcandiile, detto legame singolo o detto C1-4alcandiile formando insieme agli atomi a ponte a cui sono rispettivamente collegati un anello eterociclico di 5 o 6 elementi; R1, R2, R2a e R3 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra idrogeno, alogeno, nitro, ciano, idrossi, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, OC1-4alchilammino, SC1-4alchile; R4 ? selezionato tra idrogeno, C1-4alchile, C1-4amminoalchile, C1-4idrossialchile, C1- 4nitroalchile, C1-4tioalchile, C1-6aloalchile; Q ? selezionato tra C1-8alchile, C1-8alchenile, cicloalchile, eterocicloalchile, anello di arile, anello eteroaromatico, in cui: - C1-8alchile ? facoltativamente sostituito con OC1-4alchile, NHC1-4alchile, N(C1-4alchile)2, NH(C=O)C1-4alchile, arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile, ciascuno di detti arile, eteroarile, eterocicloalchile, cicloalchile, cicloalchenile essendo facoltativamente sostituiti con metile, alogeno, idrossi; - il cicloalchile e l'eterocicloalchile sono ciascuno facoltativamente sostituiti con OH, OSO2R5, C1-3alchile, NR6R7, in cui: ? R5 ? selezionato tra idrogeno, fenile, eteroarile, amminofenile e nitrofenile; e in cui ? R6 e R7 sono ciascuno indipendentemente selezionati tra H, metile, C(=O)CH3, SO2CH3; - l'anello di arile o l'anello eteroaromatico sono ciascuno facoltativamente sostituiti con uno o pi? sostituenti selezionati tra alogeno, nitro, ciano, tiolo, C1-4alchile, aloalchile, O-aloalchile, OC1-4alchile, NH2, NHSO2C1-4alchile, NHC1-4alchile, C(=O)C1-6alchile, C(=O)OC1-6alchile, C(=O)NHC1-4alchile, idrossi, SC1-4alchile, OC1-4alchilammino; e qualsiasi loro isomero, stereoisomero. 7. Composto di formula (II) secondo la rivendicazione 6, in cui: - A ? benzene; e/o - Y ? SO2; e/o - W ? C(=O) o CH2; e/o - Z ? N; e/o - X4 e X5 sono H. 8. Composto di formula (II) secondo le rivendicazioni 6 e 7 essendo:
  9. 9. Composto di formula (II) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 8 per uso medico.
  10. 10. Composto secondo la rivendicazione 9 per l'uso nel trattamento di una malattia neurodegenerativa, preferibilmente per l'uso nel trattamento della malattia da prioni, della malattia di Alzheimer, della sclerosi multipla o dell'encefalite autoimmune.
  11. 11. Composto per l'uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, o il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 10 che modula l'attivit? della proteina prionica cellulare (PrPC).
  12. 12. Composizione farmaceutica comprendente almeno un composto come definito in una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, da solo o in combinazione con almeno un ulteriore composto attivo, e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile, per l'uso secondo qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5.
  13. 13. Composizione farmaceutica comprendente almeno un composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 8, da solo o in combinazione con almeno un ulteriore composto attivo, e almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile, preferibilmente detta composizione ? per l'uso nel trattamento di una malattia neurodegenerativa, preferibilmente la malattia neurodegenerativa ? una malattia da prioni, malattia di Alzheimer, sclerosi multipla o encefalite autoimmune.
  14. 14. Processo per la sintesi di un composto di formula generale (I) secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 e 2 o per la sintesi di un composto di formula generale (II) secondo la rivendicazione 4, in cui in ciascuna delle formule (I) e (II) A ? benzene e Y ? SO2, comprendente le seguenti fasi: a) far reagire un composto di formula 1a con un'ammina aromatica o eteroaromatica di formula 1b, in presenza di un solvente come diclorometano e un'ammina come piridina, trimetilammina, dietilisopropilammina e simili, per dare un composto di formula 2a:
    b) ridurre il gruppo nitro del composto di formula 2a a un gruppo ammino mediante idrogenazione in presenza del catalizzatore nichel Raney o con SnCl2?2H2O in condizioni appropriate, per ottenere un composto di formula 3a:
    c) convertire il composto 3a in un composto di formula 5a:
    mediante una prima fase comprendente la reazione con NaNO2, NaOH e HCl in condizioni appropriate, e una seconda fase impiegando polvere di Cu e DMSO come solvente a temperatura ambiente; d) convertire il composto di formula 5a in un composto di formula (I) o di formula (II), in cui la reazione comprende almeno una delle seguenti fasi: - reazione di 5a con un agente alchilante di formula hal-(CH2)n-COOEt o con un agente alchilante di formula hal-(CH2)n-Q in cui hal ? bromo o cloro; - trattamento con un'ammina di formula Q-NHX3 sotto irradiazione a microonde e in condizioni di purezza; - accoppiamento con un'ammina di formula Q-NHX3 in presenza di agenti condensanti come TBTU in CH2Cl2 e DIPEA o usando SOCl2 come agente clorurante.
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3420823A (en) * 1965-04-13 1969-01-07 Ici Ltd Dibenzothiazines
WO1996005185A1 (en) 1994-08-16 1996-02-22 Mitsubishi Chemical Corporation Novel alkylamino derivatives as sigma 2 selective ligands
US6194439B1 (en) * 1991-05-29 2001-02-27 Pfizer Inc. Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
WO2007003962A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Prosidion Limited Gpcr agonists
KR20110060653A (ko) 2009-11-30 2011-06-08 한국화학연구원 아세트아마이드기를 갖는 사이클릭설폰아미드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물
US20120316342A1 (en) * 2010-02-01 2012-12-13 Masanori Baba Therapeutic agent for hepatitis c
WO2021010603A1 (ko) 2019-07-12 2021-01-21 삼성전자주식회사 근안 디스플레이 장치, 이를 포함한 증강 현실 안경 및 그 작동 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120214803A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Vifor (International) Ag Novel Sulfonaminoquinoline Hepcidin Antagonists

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3420823A (en) * 1965-04-13 1969-01-07 Ici Ltd Dibenzothiazines
US6194439B1 (en) * 1991-05-29 2001-02-27 Pfizer Inc. Tricyclic polyhydroxylic tyrosine kinase inhibitors
WO1996005185A1 (en) 1994-08-16 1996-02-22 Mitsubishi Chemical Corporation Novel alkylamino derivatives as sigma 2 selective ligands
WO2007003962A2 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Prosidion Limited Gpcr agonists
KR20110060653A (ko) 2009-11-30 2011-06-08 한국화학연구원 아세트아마이드기를 갖는 사이클릭설폰아미드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물
US20120316342A1 (en) * 2010-02-01 2012-12-13 Masanori Baba Therapeutic agent for hepatitis c
WO2021010603A1 (ko) 2019-07-12 2021-01-21 삼성전자주식회사 근안 디스플레이 장치, 이를 포함한 증강 현실 안경 및 그 작동 방법

Non-Patent Citations (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABRAMOVITCH, R. A. ET AL., J. ORG. CHEM., vol. 42, 1977, pages 2914 - 2919
AULIC, S. ET AL.: "alpha-Synuclein Amyloids Hijack Prion Protein to Gain Cell Entry, Facilitate Cell-to-Cell Spreading and Block Prion Replication", SCI REP, vol. 7, 2017, pages 10050, XP055457460, DOI: 10.1038/s41598-017-10236-x
BALLERINI, C. ET AL.: "Functional implication of cellular prion protein in antigen-driven interactions between T cells and dendritic cells", J IMMUNOL, vol. 176, 2006, pages 7254 - 7262
BARMADA, S.PICCARDO, P.YAMAGUCHI, K.GHETTI, B.HARRIS, D. A: "GFP-tagged prion protein is correctly localized and functionally active in the brains of transgenic mice", NEUROBIOL DIS, vol. 16, 2004, pages 527 - 537
BERMAN, H.M.BATTISTUZ, T.BHAT, T.N.BLUHM, W.F.BOURNE, P.E.BURKHARDT, K.FENG, Z.GILLILAND, G.L.IYPE, L.JAIN, S.: "The protein data bank, Acta Crystallogr", SECT. D BIOL. CRYSTALLOGR., vol. 58, 2002, pages 899 - 907
BIASINI, E.TURNBAUGH, J. A.UNTERBERGER, U.HARRIS, D. A.: "Prion protein at the crossroads of physiology and disease", TRENDS NEUROSCI, vol. 35, 2012, pages 92 - 103
BIGGI, S. ET AL.: "Identification of compounds inhibiting prion replication and toxicity by removing PrP(C) from the cell surface", J NEUROCHEM, vol. 152, 2020, pages 136 - 150
BRANDNER, S. ET AL.: "Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity", NATURE, vol. 379, 1996, pages 339 - 343
CHITI, F.DOBSON, C. M.: "Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade", ANNU REV BIOCHEM, vol. 86, 2017, pages 27 - 68, XP055741690, DOI: 10.1146/annurev-biochem-061516-045115
CHUNG, E. ET AL.: "Anti-PrPC monoclonal antibody infusion as a novel treatment for cognitive deficits in an Alzheimer's disease model mouse", BMC NEUROSCI, vol. 11, 2010, pages 130, XP021073269, DOI: 10.1186/1471-2202-11-130
D. BISWAS, ET AL.: "Synthesis of conformationally restricted sulfonamides via radical cyclisation", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 51, no. 20, 19 May 2010 (2010-05-19), Elsevier Science Publishers, Oxford, GB, pages 2681 - 2684, XP027077118, ISSN: 0040-4039, DOI: 10.1016/j.tetlet.2010.03.089 *
DAS, B.VENKATESWARLU, K.MAHENDER, G.MAHENDER, I: "A simple and efficient method for a-bromination of carbonyl compounds using N-bromosuccinimide in the presence of silica-supported sodium hydrogen sulfate as a heterogeneous catalyst.", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 46, no. 17, 2005, pages 3041 - 3044, XP025385756, DOI: 10.1016/j.tetlet.2005.03.020
E.L. ELIELS.H. WILEN: "Stereochemistry of Carbon Compounds", 1994, JOHN WILEY & SONS, pages: 1119 - 1190
ESTERHAZY, D. ET AL.: "Classical dendritic cells are required for dietary antigen-mediated induction of peripheral T(reg) cells and tolerance", NAT IMMUNOL, vol. 17, 2016, pages 545 - 555
FERREIRA, D. G. ET AL.: "alpha-synuclein interacts with PrP(C) to induce cognitive impairment through mGluR5 and NMDAR2B", NAT NEUROSCI, vol. 20, 2017, pages 1569 - 1579
FLUHARTY, B. R. ET AL.: "An N-terminal fragment of the prion protein binds to amyloid-beta oligomers and inhibits their neurotoxicity in vivo", J BIOL CHEM, vol. 288, 2013, pages 7857 - 7866
FOLIAKI, S. T. ET AL.: "Early existence and biochemical evolution characterise acutely synaptotoxic PrPSc", PLOS PATHOG, vol. 15, 2019, pages el007712
FOLIAKI, S. T. ET AL.: "Prion acute synaptotoxicity is largely driven by protease-resistant PrPSc species", PLOS PATHOG, vol. 14, 2018, pages 007214
FRIESNER, R.A.BANKS, J.L.MURPHY, R.B.HALGREN, T.A.KLICIC, J.J.MAINZ, D.T.REPASKY, M.P.KNOLL, E.H.SHELLEY, M.PERRY, J.K.: "Glide: a new approach for rapid, accurate docking and scoring. 1. Method and assessment of docking accuracy", J. MED. CHEM., vol. 47, 2004, pages 1739 - 1749, XP002592019, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.1021/jm0306430> DOI: 10.1021/JM0306430
GIANNOTTI, D. ET AL., J. MED. CHEM., vol. 34, 1991, pages 1356 - 1362
GIMBEL, D. A. ET AL.: "Memory impairment in transgenic Alzheimer mice requires cellular prion protein", J NEUROSCI, vol. 30, 2010, pages 6367 - 6374
H. FUKUDA, ET AL.: "Phenanthridin-6-one derivatives as the first class of non-steroidal pharmacological chaperones for Niemann-Pick disease type C1 protein", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 27, no. 12, 22 April 2017 (2017-04-22), Elsevier Science Publishers, Oxford, GB, pages 2781 - 2787, XP055887203, ISSN: 0960-894X, DOI: 10.1016/j.bmcl.2017.04.062 *
IMBERDIS, T. ET AL.: "Identification of Anti-prion Compounds using a Novel Cellular Assay", J BIOL CHEM, vol. 291, 2016, pages 26164 - 26176, XP055398460, DOI: 10.1074/jbc.M116.745612
IVANOVA, L.BARMADA, S.KUMMER, T.HARRIS, D. A: "Mutant prion proteins are partially retained in the endoplasmic reticulum", J BIOL CHEM, vol. 276, 2001, pages 42409 - 42421
KANG, J. G. ET AL., BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 66, 2002, pages 2677 - 2682
KURKIN, A. ET AL., TETRAHEDRON: ASYMMETRY, vol. 20, 2009, pages 1500 - 1505
L. DABUL, ET AL.: "Creutzfeldt-Jakob disease and Hashimoto's thyroiditis: a case report illustrating prion-induced encephalitis", JOURNAL OF NEUROINFECTIOUS DISEASES, vol. 7, no. 1, 204, 15 February 2016 (2016-02-15), OMICS International,Visakhapatnam, IN, XP055887682, DOI: 10.4172/2314-7326.1000204 *
LAUREN, J.GIMBEL, D. A.NYGAARD, H. B.GILBERT, J. WSTRITTMATTER, S. M.: "Cellular prion protein mediates impairment of synaptic plasticity by amyloid-beta oligomers", NATURE, vol. 457, 2009, pages 1128 - 1132, XP009120514, DOI: 10.1038/nature07761
LINDEN, R: "The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules", FRONT MOL NEUROSCI, vol. 10, 2017, pages 77
LU, T.T.MAKISHIMA, M.REPA, J.J.SCHOONJANS, K.KERR, T.A.AUWERX, J.MANGELSDORF, D.J: "Molecular basis for feedback regulation of bile acid synthesis by nuclear receptors", MOL CELL., vol. 6, no. 3, September 2000 (2000-09-01), pages 507 - 15, XP002209572, DOI: 10.1016/S1097-2765(00)00050-2
MALLUCCI, G. ET AL.: "Depleting neuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis", SCIENCE, vol. 302, 2003, pages 871 - 874, XP003016511, DOI: 10.1126/science.1090187
MANNI, G. ET AL.: "The cellular prion protein beyond prion diseases", SWISS MED WKLY, vol. 150, 2020, pages w20222
MASSIGNAN, T. ET AL.: "A cationic tetrapyrrole inhibits toxic activities of the cellular prion protein", SCI REP, vol. 6, 2016, pages 23180
MASSIGNAN, T. ET AL.: "A novel, drug-based, cellular assay for the activity of neurotoxic mutants of the prion protein", J BIOL CHEM, vol. 285, 2010, pages 7752 - 7765
MASSIGNAN, T. ET AL.: "A Small-Molecule Inhibitor of Prion Replication and Mutant Prion Protein Toxicity", CHEMMEDCHEM, vol. 12, 2017, pages 1286 - 1292
MASSIGNAN, T.BIASINI, E.HARRIS, D. A: "A Drug-Based Cellular Assay (DBCA) for studying cytotoxic and cytoprotective activities of the prion protein: A practical guide", METHODS, vol. 53, 2011, pages 214 - 219, XP028170803, DOI: 10.1016/j.ymeth.2010.11.005
N. CONDE, ET AL.: "A further decrease in the catalyst loading for the palladium-catalysed direct intramolecular arylation of amides and sulfonamides", ADVANCED SYNTHESIS AND CATALYSIS, vol. 357, no. 7, 16 April 2015 (2015-04-16), John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, US, pages 1525 - 1531, XP055885786, ISSN: 1615-4150, DOI: 10.1002/adsc.201401129 *
NICOLL, A.J.CLARE R. TREVITT, M.TATTUM, H.RISSE, E.QUARTERMAN, E.AVILA IBARRA, A.WRIGHT, C.GRAHAM, S. J.SESSIONS, R.B.FARROW, M.: "Pharmacological chaperone for the structured domain of human prion protein", PNAS, vol. 107, no. 41, 12 October 2010 (2010-10-12), Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.1073/pnas.1009062l07.>
PRUSINER, S. B, PRIONS. PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 95, 1998, pages 13363 - 13383
RAMIREZ-MARTINEZ, J. F. ET AL., MOLECULES, vol. 18, 2013, pages 894 - 913
RESENBERGER, U. K.WINKLHOFER, K. F.TATZELT, J: "Cellular prion protein mediates toxic signaling of amyloid beta", NEURODEGENER DIS, vol. 10, 2012, pages 298 - 300
S. SHARMA, ET AL.: "Microwave assisted synthesis of phenanthridinones and dihydrophenanthridines by vasicine/KOtBu promoted intramolecular C-H arylation", ORGANIC AND BIOMOLECULAR CHEMISTRY, vol. 14, no. 36, 1 August 2016 (2016-08-01), Royal Society of Chemistry, Cambridge, GB, pages 8536 - 8544, XP055887205, ISSN: 1477-0520, DOI: 10.1039/c6ob01362g *
S. WOJTOWICZ, ET AL.: "Multiple sclerosis and prions", MEDICAL HYPOTHESES, vol. 40, no. 1, January 1993 (1993-01-01), Elsevier Science Publishers, Oxford, GB, pages 48 - 54, XP023027111, ISSN: 0306-9877, DOI: 10.1016/0306-9877(93)90196-W *
SELKOE, D. J.HARDY, J.: "The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years", EMBO MOL MED, vol. 8, 2016, pages 595 - 608
SOLOMON, I. H. ET AL.: "An N-terminal polybasic domain and cell surface localization are required for mutant prion protein toxicity", J BIOL CHEM, vol. 286, 2011, pages 14724 - 14736
SOLOMON, I. H.BIASINI, E.HARRIS, D. A.: "Ion channels induced by the prion protein: mediators of neurotoxicity", PRION, vol. 6, 2012, pages 40 - 45
STINCARDINI, C. ET AL.: "An antipsychotic drug exerts anti-prion effects by altering the localization of the cellular prion protein", PLOS ONE, vol. 12, 2017, pages e0182589
T. IMBERDIS, ET AL.: "Identification of anti-prion compounds using a novel cellular assay", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 291, no. 50, 1 November 2016 (2016-11-01), American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Rockville, MD, US, pages 26164 - 26176, XP055398460, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M116.745612 *
UM, J. W. ET AL.: "Alzheimer amyloid-beta oligomer bound to postsynaptic prion protein activates Fyn to impair neurons", NAT NEUROSCI, vol. 15, 2012, pages 1227 - 1235
WALSH, D. M. ET AL.: "Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo", NATURE, vol. 416, 2002, pages 535 - 539, XP002348771, DOI: 10.1038/416535a

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