IT202100012932A1 - Fermentati con super food - Google Patents
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Description
"FERMENTATI CON SUPER FOOD"
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione concerne preparato nutraceutico a base di una combinazione di composti biologicamente attivi.
La presente invenzione origina nel settore dei prodotti nutrizionali e degli integratori dietetici.
In particolare, la presente invenzione concerne una composizione a base di selezionati ingredienti biologicamente attivi di origine naturale la cui combinazione determina un effetto vantaggioso sull?organismo umano con benefici a livello intestinale, immunitario e a livello dell'epidermide.
STATO DELLA TECNICA
La formulazione dei prodotti latto-fermentati (alimenti funzionali), ? un trend produttivo che negli ultimi anni ha visto un aumento esponenziale nell'industria alimentare/nutraceutica, grazie ai diversi effetti benefici del prodotto fermentato, ovvero maggiore digeribilit?, aumento del contenuto vitaminico, rilascio di molecole bioattive dalla matrice alimentare non digerita, produzione di molecole con effetti benefici per l'uomo (esempio, acido butirrico, acido lattico, eco.) da parte dei lieviti attivi nel prodotto, fonte non casearia di batteri lattici.
Sebbene il latte sia un tipico terreno di crescita per lo sviluppo di batteri dell'acido lattico (LAB), diversi ceppi hanno mostrato una crescita sufficiente in terreni diversi e sono in grado di mantenere il loro contenuto al di sopra di 10<6 >CFU ml<-1 >durante il periodo di conservazione (6?C/21 giorni).
Il dattero da palma ? un terreno di coltura accettabile dal punto di vista microbiologico e, in base alla valutazione sensoriale, gode di un'accettabilit? complessiva attraente e rappresenta un'alternativa adeguata per i pazienti celiaci, le persone che soffrono di allergie alle proteine del latte o intolleranza al lattosio.
I fermenti lattici (LAB) rappresentano una specie ubiquitaria ed eterogenea con caratteristica comune della produzione di acido lattico per effetto del metabolismo degli zuccheri che porta a un'acidificazione dell'ambiente fino a un pH di 3,5.
I batteri lattici sono Gram-positivi, non sporulanti, non pigmentati e non mobili, la maggior parte dei quali sono anaerobi non respiratori ma aero-tolleranti. I LAB tendono ad essere nutrizionalmente esigenti, spesso richiedono amminoacidi specifici, vitamine del gruppo B e altri fattori di crescita. Alcuni assorbono ossigeno attraverso la mediazione delle flavoproteine ossidasi, producendo cos? perossido di idrogeno e/o riossidante NADH durante la deidrogenazione degli zuccheri. L'energia cellulare deriva dalla fermentazione dei carboidrati per produrre il principale acido lattico. Poich? molte specie di batteri dell'acido lattico (LAB) e altri batteri associati agli alimenti hanno una lunga associazione storica con gli alimenti umani, essi sono riconosciuti come batteri generalmente considerati sicuri (GRAS). Le infezioni da LAB sono caratterizzate come opportunistiche che si basano su fattori dell'ospite piuttosto che sulla patogenicit? intrinseca. Sono stati riportati solo rari casi di infezioni cliniche nell'uomo, ad esempio in pazienti con endocardite o con immunodeficienza.
I lattobacilli si trovano comunemente in una variet? di ambienti, nei latticini e nei prodotti a base di carne, nelle verdure fermentate e in salamoia, che aderiscono alle superfici della mucosa umana (nel tratto gastrointestinale e vaginale), nonch? nel suolo e nelle piante. I lattobacilli intestinali (L. rhamnosus, L. acidophilus, L. reuteri, L. plantarum e L. paracasei) interagiscono con l'ospite e sono stati associati a numerosi benefici per la salute. Il L. reuteri ? uno dei batteri probiotici pi? utilizzato, aggiunto alla formula del latte in polvere per neonati per bambini con intolleranza al lattosio o per il riallestimento dopo la diarrea. I lattobacilli sono naturalmente presenti nel latte materno, in particolare le specie di L. fermentum, L. rhamnosus, L. gasseri e L. salivarius. Inoltre, il L. plantarum ? stato identificato frequentemente nel latte materno di madri sane.
I batteri lattici possono produrre sostanze e quindi creare condizioni dannose per batteri, lieviti e muffe indesiderati che portano all'aumento della durata di conservazione degli alimenti. Il prodotto principale della fermentazione dei batteri lattici ? l'acido lattico. La maggior parte delle sostanze antimicrobiche isolate e identificate prodotte dai batteri dell'acido lattico sono a basso peso molecolare composte da acidi organici, reuterina, perossido di idrogeno, acidi grassi idrossilici, composti fenolici e proteici.
I probiotici sono definiti come organismi e sostanze che contribuiscono all'equilibrio microbico intestinale. La definizione pi? frequentemente citata ? quella di Fuller (1992), che li ha definiti "un integratore alimentare microbico vivo, che ha un effetto benefico sull'animale ospite migliorandone l'equilibrio microbico intestinale". Food and Agriculture Organization / World Health Organization (FAO / WHO), descrive i probiotici come microrganismi vivi che, se somministrati in quantit? adeguate, conferiscono benefici per la salute all'ospite (2002).
La scelta di quale microrganismo utilizzare come probiotico ? determinata da molti fattori: i probiotici devono essere specie sicure, non patogene e non tossiche, sopravvivere al passaggio attraverso il tratto intestinale e aderire alla mucosa intestinale e alla produzione di acido organico, lattico e acetico. La vitalit? dei probiotici negli alimenti ? influenzata da molti fattori come il pH, l'attivit? dell'acqua, il potenziale redox degli alimenti, la presenza di sale, zucchero, perossido di idrogeno, batteriocine, aromi e composti coloranti, condizioni di lavorazione, confezionamento e conservazione. I meccanismi delle propriet? salutari dei probiotici non sono ancora del tutto chiari, ma sono noti la loro attivit? anti-cancerogena e anti-mutagena, la soppressione delle allergie, la riduzione del livello di colesterolo sierico e la riduzione della pressione sanguigna. Il L. bulgaricus ? in grado di fermentare il lattosio, quindi ha effetti benefici per le persone che soffrono di intolleranza al lattosio. Inoltre, L. rhamnosus GG, L. acidophilus, L. casei o L. reuteri hanno effetti benefici contro la diarrea acuta causata dal rotavirus, nel trattamento, nell'accorciamento o nella prevenzione di questa malattia. La somministrazione di S. boulardii come lievito bioterapico non patogeno svolge un ruolo essenziale nel trattamento o nella prevenzione della diarrea associata agli antibiotici causata da C. difficile. I probiotici, in particolare L. acidophilus, L. plantarum, L. rhamnosus e Bifidobacterium, sono in grado di ridurre l'attivit? dell'enzima fecale che converte i procarcinogeni in agenti cancerogeni (? - glucuronidasi, azoreduttasi, ureasi, nitroreduttasi e acido glicolico reduttasi) a causa dei grassi a catena corta produzione di acidi e pu? quindi contribuire a ridurre il rischio di carcinoma del colon-retto. I cereali rappresentano ancora oggi una delle fonti pi? importanti della dieta umana e vengono coltivati per oltre il 73% della superficie totale di raccolta. Numerosi cereali sono coltivati in diversi paesi, tra cui frumento, orzo, avena, mais, segale, riso e miglio, particolarmente importanti dal punto di vista economico. I cereali sono principalmente una fonte di carboidrati e quindi una buona fonte di energia. Formano circa due terzi fino a tre quarti della materia secca. I monosaccaridi sono i componenti di base di oligoe polisaccaridi e sono maggiormente rappresentati nelle forme di esosi (fruttosio, glucosio e galattosio) e pentosi, arabinosio e xilosio. I cereali sono generalmente buone fonti di proteine. Le proporzioni degli amminoacidi essenziali e la loro digeribilit? determinano principalmente la qualit? nutrizionale delle proteine. I cereali possono contribuire all'assunzione di vitamina a causa della presenza della maggior parte delle vitamine del gruppo B e di quantit? apprezzabili di vitamina E. I cereali integrali contengono anche una quantit? considerevole di calcio, magnesio, ferro, zinco, nonch? livelli inferiori di molti oligoelementi, ad esempio, selenio.
La combinazione di questi elementi in modo appropriato permette la realizzazione di cibi funzionali con caratteristiche propriet? benefiche e protettive per l'organismo, importanti nella pratica nutrizionale perch?, se inseriti in un regime alimentare equilibrato, svolgono un'azione preventiva sulla salute.
Per tale motivo, attualmente esiste una esigenza di disporre di nutraceutici che oltre ad avere spiccate propriet? nutrizionali, sono altres? attivi nel dare un vantaggio terapeutico all'organismo, senza la necessit? di dover far uso di medicinali.
Uno scopo della presente invenzione consiste quindi nel fornire una composizione nutraceutica che permetta di migliorare la condizione generale dell?organismo.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
In un primo aspetto l?invenzione concerne una composizione nutraceutica comprendente:
- uno o pi? ceppi di un microorganismo probiotico;
- uno o pi? prebiotici; e
- polpa di dattero di palma, o altra sua forma.
Sotto un secondo aspetto si descrive una composizione nutraceutica per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una malattia o condizione patologica intestinale o della pelle.
Un terzo aspetto riguarda una composizione nutraceutica per l?uso nella stimolazione del sistema immunitario.
Le rivendicazioni dipendenti descrivono forme di realizzazione particolari dell'invenzione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
L?invenzione pertanto concerne una composizione nutraceutica comprendente:
- uno o pi? ceppi di un microorganismo probiotico;
- uno o pi? prebiotici; e
- polpa di dattero di palma, o altra sua forma.
Il dattero, data la sua composizione nutritiva (alto contenuto di zuccheri semplici e fibre) ? una straordinaria fonte di energia, oltre ad avere tutte le caratteristiche che lo candidano ad essere una perfetta matrice prebiotica. I fermenti lattici, in questo terreno, sono liberi di degradare la fibra, e di rilasciare la porzione di polifenoli ad essa legata, aumentando cos? la proporzione di polifenoli liberi, che sono cos? assorbibili a livello intestinale.
In una forma di realizzazione, nella composizione secondo la presente invenzione, detto uno o pi? ceppi di microorganismo probiotico ? scelto dal gruppo consistente in ceppi di batteri lattici, di bifidobatteri, di lieviti o di bacilli.
Preferibilmente detto uno o pi? ceppi di batteri lattici ? scelto dal gruppo consistente in ceppi di L. plantarum, L bulgar?cus, L acidophilus o L. rhamnosus, detto uno o pi? ceppi di bifidobatteri ? scelti dal gruppo consistente in ceppi di B. longum, B. bifidum o B. breve e detto uno o pi? ceppi di bacilli ? un ceppo di B. clausii.
In una forma ancora pi? preferita, detto uno o pi? ceppi di batteri lattici ? scelto dal gruppo consistente in L. plantarum SGL07, L. bulgaricus DSMZ 20081 , L. acidophilus LA3 e L. rhamnosus ATCC 11982.
Vantaggiosamente, in una forma di realizzazione della composizione dell'invenzione, detto uno o pi? prebiotici ? uno o pi? cereali scelto dal gruppo consistente in grano, orzo e avena, ortaggi, tuberi o frutti. Possiamo trovare le fibre prebiotiche - come inulina, frutto-oligosaccaridi (FOS) e betaglucani - in un?ampia variet? di alimenti vegetali: - ortaggi come cicoria, carciofi, asparagi, cipolle, porri e aglio;
- cereali integrali come grano, orzo e avena;
- tuberi come il topinambur;
- frutti come la banana.
In una forma di realizzazione, la composizione dell'invenzione comprende un estratto di dattero di palma in cui detto estratto di dattero di palma ? la polpa di dattero di palma in forma fresca, essiccata, in polvere, liquida o qualsiasi altra sua forma.
Gli inventori hanno sorprendentemente trovato che la combinazione di elementi della composizione dell?invenzione porta ad un prodotto che trova ampia applicazione anche nella dieta di un soggetto sportivo, poich? da un lato ? un'ottima fonte di zuccheri semplici (fonte energetica primaria), e dall'altro ha una quota maggiore di polifenoli biofusibili che, soprattutto nel soggetto sportivo, sono molto importanti per contrastare il forte stress ossidativo a cui ? costantemente sottoposto, vista la loro evidente e provata attivit? antiossidante. Lo stesso prodotto pu? trovare applicazione anche come cibo funzionale sia in adulti che bambini in particolari condizioni patologiche.
Vantaggiosamente, la composizione dell?invenzione pu? comprendere ulteriormente almeno una ulteriore componente biologicamente attiva scelta dal gruppo consistente in kuzu, teff, micronutrienti, sali minerali, e vitamine.
Il Kuzu o Kudzu (Pueraria montana lobata) ? una pianta selvatica rampicante, originaria del Giappone ed appartenente alla famiglia delle Febacee (leguminose). Le parti maggiormente utilizzate sono le radici e, talvolta, anche le foglie.
Il teff tef {Eragrostistef), ? un cereale proprio dell'Etiopia e dell'Eritrea, dal quale si ricava una farina (farina di Teff) che fornisce soprattutto un apporto di carboidrati complessi.
In una forma di realizzazione preferita, la composizione dell?invenzione ? formulata in forma di barretta alimentare o altro preparato nutraceutico.
Questa formulazione rende la composizione facile da trasportare e da consumare.
Sotto un secondo aspetto si descrive una composizione nutraceutica per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una malattia o condizione patologica intestinale o della pelle.
Preferibilmente detta malattia o condizione patologica intestinale ? scelta dal gruppo consistente in disbiosi intestinale, irregolarit? intestinale, diarrea, sindrome di colon irritabile, diverticolosi e in cui detta malattia o condizione patologica della pelle ? scelta dal gruppo consistente in dermatite o eczema e coadiuvante nell?attivit? sportiva.
Sorprendentemente ? stato visto che la composizione dell'Invenzione promuove la regolarit? dell?intestino ed il controllo del colesterolo grazie al contenuto di beta-glucani.
I beta-glucani sono interessanti perch? sono polisaccaridi caratterizzati da una bassissima digeribilit?, ma vengono favorevolmente metabolizzati dal microbiota intestinale, in particolare dai bifidobatteri, preziosi alleati del nostro intestino crasso. Grazie al lavoro svolto sul microbiota intestinale, questi polisaccaridi influiscono anche sulle funzioni metaboliche, in particolare favorendo l'equilibrio dei livelli di colesterolo cattivo, riducendo l'assorbimento degli zuccheri, controllando i livelli della glicemia e modulando favorevolmente il sistema immunitario.
I beta-glucani possono essere solubili, a basso peso molecolare, oppure insolubili, ad alto peso molecolare. Quelli solubili si trovano preferenzialmente in orzo e avena, e una volta ingeriti possono essere fermentati nel colon, popolando il microbiota intestinale. I beta-glucani insolubili invece, raggiungono e oltrepassano inalterati la valvola ileocecale e vengono metabolizzati dal microbiota intestinale, producendo acidi grassi a corta catena, utilissimi per il nutrimento e il trofismo della mucosa intestinale. Inoltre, i beta-glucani insolubili possono essere a loro volta frammentati dal microbiota dando origine a beta-glucani solubili di dimensioni ridotte e a basso peso molecolare che svolgono la preziosa attivit? di modulazione del sistema immunitario. A riguardo dei beta-glucani, EFSA si ? espressa dichiarando che aiutano a ridurre il colesterolo nel sangue e di conseguenza le malattie cardiovascolari. Tali benefici sono riferiti a un apporto giornaliero di almeno 3 g di betaglucani, da assumersi con una dieta varia ed equilibrata. Una volta introdotti con gli alimenti o tramite l'integrazione alimentare, i betaglucani digeriti nel largo intestino riescono ad attivare il sistema immunitario in maniera dolce ed equilibrata, stimolando l'attivit? dei fagociti.
? risaputo che i datteri sono ricchi di beta-glucani, in particolare, il beta-D-glucano, che ha le caratteristiche di essere sia solubile che insolubile, grazie al suo peso molecolare. La sua solubilit? consente al beta-D-glucano di legarsi al colesterolo alimentare e di rimuoverlo dal corpo attraverso le feci. Come i beta-glucani contenuti nei cereali integrali e nei funghi, il beta-D-glucano aiuta a mantenere i livelli di glucosio nel sangue, rallentando la velocit? con cui l'intestino tenue assorbe gli zuccheri semplici. Il beta-D-glucano essendo anche insolubile in natura, promuove la salute e la regolarit? dell'intestino aiutando a produrre feci pi? grandi e pi? morbide che sono facili da eliminare ( -Glucan as a Food Ingredient, Asif Ahmad, Muhammad Kaleem, in Biopolymers for Food Design, 2018).
Viene generalmente consigliato agli uomini e alle donne di et? superiore ai 50 anni di assumere rispettivamente 38 e 25 grammi di fibre totali al giorno. Poich? la maggior parte degli anziani richiede meno calorie, uomini e donne oltre i 50 anni hanno un fabbisogno di fibre corrispondentemente inferiore a 30 grammi e 21 grammi, rispettivamente. Le linee guida dietetiche suggeriscono che il consumo di un'ampia gamma di alimenti ricchi di fibre e il rispetto delle raccomandazioni sull'assunzione giornaliera aumentano le probabilit? di ottenere quantit? sufficienti di fibre solubili e insolubili.
Un terzo aspetto riguarda una composizione nutraceutica per l'uso nella stimolazione del sistema immunitario. Si ? infatti visto che soggetti debilitati mostrano un vantaggio
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1: Preparazione di una composizione secondo l'invenzione
La composizione secondo l'invenzione ? stata preparata utilizzando diversi ceppi di lattobacilli.
Ceppi di L. plantarum SGL07, L. bulgaricus DSMZ 20081, L. acidophilus LA3 e L. rhamnosus ATCC 11982 sono stati riattivati mediante coltura due volte in brodo MRS (carne peptone 10,0 gL<-1>; destrosio 20,0 gL<-1>; estratto di lievito 5,0 gL<-1>; estratto di manzo 10,0 gL<-1>; fosfato disodico 2,0 gL<-1>; acetato di sodio 5,0 gL<-1>; citrato di ammonio 2,0 gL<-1>; solfato di magnesio 0,1 gL<-1>; solfato di manganese 0,05 gL<-1>; Tween 80 1,0 gL<-1>) (Thermo scientific, Whalthan, Massachusetts, USA) a 37?C per 18 h per ottenere 10<8 >cellule/mL.
Per preparare l'inoculo, le colture batteriche sono state centrifugate e lavate in soluzione fisiologica sterile (NaCl 8,5 gL<-1>) e risospese in 5 ml della stessa soluzione.
I frutti di dattero da palma freschi vengono acquistati localmente, sono stati disossati e macinati.
La composizione (miscela) ? stata ottenuta da 200 g di polpa di dattero macinata, 100g di cereali (quantit? variabili di frumento, orzo, avena, mais, segale, riso e miglio) colture di 18 h (concentrazione finale > 10<6 >CFU) e acqua sterile, che sono stati miscelati in un mixer per 2 minuti.
Sono state preparate miscele con un ceppo scelto da L. plantarum SGL07, L. bulgaricus DSMZ 20081, L. acidophilus LA3 e L. rhamnosus ATCC 11982, sia da soli che in combinazione a gruppi di due, tre o quattro diversi lattobacilli.
Le diverse miscele sono state successivamente fermentate. Per la fermentazione, le miscele ottenute sono state poste in sacchetti di plastica e incubate a 37?C per 48 ore. Trascorso questo tempo, il pH ? stato misurato seguito dall'essiccazione del campione fino al 15% di contenuto di umidit?. L'estrusione ? stata eseguita utilizzando un estrusore monovite da laboratorio S-45 (Metalchem Gliwice) dopo il tempo di fermentazione.
Le diverse composizioni secondo l'invenzione sono state utilizzate per prepara re delle Barrette Lattofermentate (LDB).
Esempio 2: Analisi delle colture probiotiche
Enumerazione dei microrganismi probiotici e la vitalit? delle colture probiotiche delle diverse miscele ? stata determinata ed espressa come unit? formanti colonie (CFU) mL<-1 >su agar MRS (Oxoid, Milano, Italia).
Le diluizioni seriali sono state preparate in una soluzione fisiologica sterile prima della piastra su agar MRS. Le piastre sono state incubate a 37?C per 48 ore in un sistema anaerobico (Oxoid, Milano, Italia).
La vitalit? dei probiotici di ciascuna miscela ? stata studiata dopo 48 ore di incubazione a 37?C e dopo 4 settimane di conservazione a 4?C. Al fine di valutare le potenziali variazioni in termini di potere antiossidante e contenuto polifenolico, le miscele sono state sottoposte ad estrazione chimica dopo il tempo di fermentazione e dopo 4 settimane di conservazione a 4?C. Le miscele (10 g) sono state trattate con 60 mL di metanolo all'80% (0,5% di acido formico), omogeneizzate per 5 minuti da ultra-turrax (T25-digital, IKA, Staufen im Breisgau, Berlino, Germania) e agitate su un agitatore orbitale (Sko -DXL, Argolab, Carpy, Italy) a 300 rpm per 15 min. Quindi, i campioni sono stati posti in un bagno ad ultrasuoni per altri 10 min, prima di essere centrifugati a 6000 rpm per 10 min. I supernatanti sono stati raccolti e conservati al buio, a 4?C. I pellet ottenuti sono stati riestratti, come descritto sopra, con 40 mL della stessa miscela di solventi. Infine, gli estratti ottenuti sono stati filtrati sottovuoto, la frazione metanolica ? stata eliminata per evaporazione e la frazione acquosa ? stata liofilizzata.
Esempio 3: Analisi HPLC-MS
Gli estratti dalle barrette di datteri sono stati solubilizzati con acido formico all'1%. Le analisi sono state eseguite su un sistema Jasco Extrema LC-4000 (Jasco Inc., Easton, MD) dotato di rivelatore a serie di fotodiodi (DAD). La colonna selezionata era una colonna Kinetex<?>C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 ?m; Phenomenex, Torrance, CA). Le analisi sono state eseguite a una velocit? di flusso di 1 mL/min, con solvente A (2% di acido acetico) e solvente B (0,5% di acido acetico in acetonitrile e acqua 50:50, v/v). Dopo una tenuta di 5 min al 10% di solvente B, l'eluizione ? stata eseguita secondo le seguenti condizioni: dal 10% (B) al 55% (B) in 50 min e al 95% (B) in 10 min, seguite da 5 min di manutenzione. Flavonoli, procianidine, diidrocalconi, flavanoli e acidi idrossicinnamici sono stati monitorati a 280 nm. Per l'analisi quantitativa, le curve standard per ciascuno standard di polifenoli sono state preparate su un intervallo di concentrazione di 0,1-1,0 ?g / ?L con sei diversi livelli di concentrazione e inie zioni duplicate a ciascun livello. L'identit? dei polifenoli ? stata confermata dagli esperimenti LC-ESI / MS e i dati sono stati confrontati con quelli degli standard commerciali. Lo stesso apparato e le stesse condizioni cromatografiche (sistema HPLC, eluizione in gradiente, colonna, temperatura) sono stati accoppiati a uno spettrometro di massa Advion Expression (Advion Inc., Ithaca, NY) dotato di una sorgente Electrospray (ESI). Gli spettri di massa sono stati registrati da m / z = 50 a 1200, sia in modalit? di ionizzazione negativa che positiva. La tensione del capillare era impostata a - 28 V, la tensione dello spray era a 3 kV e l'offset della lente del tubo era a - 10 V in modalit? di ioni negativi, mentre la tensione del capillare era impostata a 34 V, la tensione dello spray era a 3,5 kV e l'offset della lente del tubo era a 55 V in modalit? ioni negativi. La temperatura del capillare era di 275?C. I dati sono stati acquisiti in modalit? scansione completa e SIM. Contenuto totale di fenolo (TPC). Il contenuto di fenolo totale (TPC) ? stato determinato mediante il metodo di Folin-Ciocalteau, utilizzando acido gallico come standard (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). In breve, 0,1 mL di campioni (opportunamente diluiti con acqua per ottenere un valore di assorbanza entro il range lineare dello spettrofotometro) sono stati sottoposti ad aggiunta di: 0,5 mL di Folin-Ciocalteau (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 0,2 mL di una soluzione acquosa di Na2CO3 7% (p / v%), portando il volume finale a 10 mL con acqua. Dopo la miscelazione, i campioni sono stati tenuti al buio per 90 min. Dopo il periodo di reazione, l'assorbanza ? stata misurata a 760 nm. Ciascun campione ? stato analizzato in triplicato e la concentrazione dei polifenoli totali ? stata calcolata in termini di equivalenti di acido gallico (GAE).
Attivit? Antiossidante: Dosaggio DPPH
L'attivit? antiossidante dei campioni ? stata misurata rispetto alla capacit? di scavenging dei radicali degli antiossidanti presenti nel campione standard utilizzando il radicale stabile 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA). L'analisi ? stata eseguita aggiungendo 100 ?L di ciascun campione a 1000 ?L di una soluzione metanolica di DPPH (153 mmol L ). La diminuzione dell'assorbanza ? stata determinata con uno spettrofotometro UV-visibile (Beckman, Los Angeles, CA, USA). L'assorbanza del radicale DPPH senza antiossidante, cio? il controllo, ? stata misurata come base. Tutte le determinazioni erano in triplice copia. L'inibizione ? stata calcolata secondo la formula: [(Ai - Af) / Ac] ? 100]. Statistiche Salvo diversa indicazione, tutti i risultati sperimentali sono stati espressi come media ? deviazione standard (SD) di tre determinazioni. L'analisi statistica dei dati ? stata eseguita dal test t di Student. Valori di P inferiori a 0,001 sono stati considerati significativi.
Risultati
Risultati Analisi microbica
I quattro ceppi di batteri lattici acidi utilizzati erano in grado di crescere in terreni di barrette di dattero di palma senza integrazione prebiotica esterna o regolazione del pH, raggiungendo una concentrazione compresa tra 3,1 e 9,9 x 109CFU/g dopo 48 ore di incubazione (tabella 1). L'analisi della shelf-life effettuata, consistente in 4 settimane di conservazione a 4 ?C, ha indicato che la sopravvivenza cellulare ? stata facilmente influenzata dalla conservazione, e il prodotto fermentato mantiene una concentrazione probiotica funzionale (approssimativamente di 109CFU/g) in grado di esercitare effetti benefici per chi ne fa uso. Per quanto riguarda il pH, viene diminuito di circa una singola unit? (con leggera differenza a seconda del ceppo batterico utilizzato) e rimane pressoch? invariato dopo il tempo di conservazione.
Tabella 1. Monitoraggio del pH e della sopravvivenza cellulare (espressa come CFU/g di LDB) nella versione fermentata e non fermentata delle barrette di dattero. Medie e deviazioni standard forn = 3.
Polifenoli totali e attivit? antiossidante
Al fine di ottenere una panoramica sugli effetti della lattofermentazione sulla composizione polifenolica delle barrette di dattero di palma, ? stato eseguito il saggio di Folin-Ciocalteau su estratti idroalcolici di LDB e di controllo (barrette non fermentate). Con questo saggio possiamo valutare la variazione quantitativa non specifica dei composti polifenolici negli estratti idroalcolici, quindi possiamo valutare la variazione in termini di polifenoli estraibili. Le barre di dattero non inoculate hanno mostrato un contenuto totale di fenolo di 44,86 mg GAE (equivalente di acido gallico). Questo valore ? aumentato dopo 48 ore di incubazione con batteri lattici acidi e la sua variazione positiva cambia in modo specifico per ceppo. Come riportato nella tabella 2, le barrette fermentate con L. rhamnosus, hanno mostrato un aumento del contenuto polifenolico totale del 71,58% rispetto al controllo, mentre l'inoculo con L. bulgaricus e L. acidophilus, portano a risultati di poco inferiori con un aumento rispettivamente del 41,19% e 59,03%. La fermentazione del L. plantarum, invece, ha mostrato un'influenza completamente diversa sulla composizione fenolica, con un'attivit? trascurabile sull'aumento dei polifenoli liberi. Lo stesso andamento ? stato mantenuto anche, dopo quattro settimane di conservazione a 4 ?C, dove i relativi incrementi di composti fenolici liberi ottenuti, sono stati mantenuti con leggere riduzioni (tabella 2). L'attivit? antiossidante di LDB e di controllo, invece, ? stata valutata mediante test DPPH ed i risultati ottenuti sono stati espressi come mg di trolox equivalente/ LDB (tabella 3). I risultati ottenuti hanno dimostrato che l'estratto idroalcolico di LDB inoculato con L. rhamnosus, possiede una maggiore attivit? antiossidante rispetto alle altre versioni fermentate, con un aumento dell'attivit? di radical scavenging del 39,97%. Anche gli altri ceppi batterici hanno mostrato un'influenza positiva sul potenziale antiossidante di questo prodotto. In particolare, la fermentazione di L. acidophilus ha mostrato un notevole effetto sull'attivit? antiossidante del presente prodotto, con un aumento dell'attivit? antiossidante del 30,91%, mentre le LDB inoculate con L. plantarum e L. bulgaricus hanno mostrato una debole variazione in termini di attivit? di lavaggio dei radicali, con lievi aumenti di TE/LDB compresi tra 3 e 24% rispetto al controllo. Anche in questo caso, la conservazione per 4 settimane a 4 ? C, sembra non intaccare in modo significativo il potenziale antiossidante del LDB.
Tabella 2. Contenuto totale di fenoli (TPC) valutato con metodo Folin-Ciocalteu in barrette di datteri fermentati e non fermentati dopo 48 ore di incubazione a 37 ? C e 4 settimane di conservazione a 4 ?C. I dati sono espressi come valore medio (mg equivalenti di acido gallico (GAE) / g LDB) ? DS di tre ripetizioni.
Statistical significance is calculated by Student's t -test analysis: * p < 0.0001 TPC of L .acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus LDB vs. control; **p < 0.001 TPC of L. plantarum LDB vs. control; the same both for 48 h of incubation and after 4 weeks of storage.
Tabella 3. Attivit? di scavenging radicale valutata con il metodo DPPH in barre di datteri fermentati e non fermentati dopo 48 ore di incubazione a 37 ?C e 4 settimane di conservazione a 4 ?C. I dati sono espressi come valore medio (mg Trolox equivalenti (TE) / g LDB) ? DS di tre ripetizioni.
Statistical significance is calculated by Student's t -test analysis: * p < 0.0001 TPC of L .acidophilus, L. bulgaricus, L. rhamnosus LDB vs. control; **p < 0.001 TPC of L. plantarum LDB vs. control; the same both for 48 h of incubation and after 4 weeks of storage.
Composizione polifenolica di LDB
I risultati dell'analisi quantitativa LC-MS dei principali polifenoli rappresentativi della palma da dattero presenti in LDB e controllo sono riportati nella tabella 4. I dati mostrano che la fermentazione ha effetti notevoli sulla composizione qualitativa della frazione polifenolica del dattero. Le concentrazioni totali di acido fenolico vengono aumentate dopo la fermentazione lattica. La quantit? di acido gallico ? significativamente aumentata (8 volte rispetto al controllo) in LDB inoculate con L. rhamnosus. Risultati inferiori, ma comunque significativi, sono stati ottenuti dalla fermentazione con gli altri ceppi (Tabella 4). Le quantit? di acido caffeico, acido ferulico e acido siringico sono quasi raddoppiate nel prodotto fermentato, e in particolare l'incremento maggiore ? stato ottenuto, ancora una volta, in LDB con L. rhamnosus. Per quanto riguarda l'acido fenolico, solo la concentrazione clorogenica ? stata drasticamente ridotta dopo la lattofermentazione; infatti, la sua concentrazione ? dimezzata nei prodotti formulati. In relazione alla composizione dei flavonoidi, ? interessante notare che la quantit? di quercetina ? aumentata di circa il 50% in tutte le diverse versioni di LDB formulate.
Tuttavia, questi ultimi risultati sono accompagnati da una significativa diminuzione di quercitrina e isoquercetina.
Tabella 4. Composizione polifenolica delle barrette di dattero (controllo) e delle sue versioni lattofermentate (LDB) formulate per incubazione con diversi ceppi di Lactobacillus.
Statistical significance is calculated by Student's t -test analysis: * p < 0.0001 polyphenolic composition of L.acidophilus,L. bulgaricus, L.rhamnosusLDB vs. control; **p < 0.0001 polyphenolic composition of L.plantarum LDB vs. control.
Discussione dei Risultati
I nostri risultati hanno indicato che tutti i ceppi di batteri inoculati nella polpa del dattero sono in grado di crescere bene, senza integrazione di nutrienti o regolazione del pH. Questi risultati sono in accordo con altri studi, che hanno proposto diversi succhi di frutta o verdura come buoni terreni per la crescita dei probiotici. Durante l'ultimo decennio, il consumo di prodotti probiotici ? una tendenza in continua evoluzione a causa dei loro effetti di promozione della salute ampiamente documentati e variabili. Fondamentale ? sottolineare il concetto che, per esercitare effetti benefici nell'ospite, ? fondamentale che i batteri probiotici siano vivi e abbondanti nel prodotto al momento del consumo. Ad oggi non ? stato raggiunto un accordo generale sulla concentrazione di probiotici necessaria per ottenere effetti benefici nell'uomo, tuttavia ? generalmente consigliato un apporto giornaliero compreso tra 10<6 >e 10<8 >CFUmL-1. I prodotti LDB possiedono, dopo la fermentazione, una concentrazione di probiotici, ampiamente superiore all'assunzione giornaliera minima di probiotici raccomandata. In particolare, il ceppo L. rhamnosus, ha dimostrato di crescere al meglio nella polpa del dattero, utilizzando i componenti del dattero come fonte nutritiva per la loro crescita e sviluppo, raggiungendo la concentrazione di 4,9 x 10<9 >CFU/g di LDB. I nostri risultati sono in linea con i risultati di altri autori, che hanno indicato il ceppo di L. rhamnosus come il ceppo pi? in grado di sopravvivere in condizioni sfavorevoli come il succo di frutta o verdura.
potenzialit? probiotica dei prodotti formulati ? in linea con un'altra caratteristica nutraceutica rilevante di questo: l'aumento della frazione polifenolica bioaccessibile. I risultati ottenuti dopo la fermentazione lattica della polpa di dattero di palma hanno indicato un aumento generale del livello polifenolico totale (tabella 2) e la relativa attivit? antiradicalica dei prodotti fermentati (tabella 3). Questi cambiamenti chimici e biologici positivi variano in modo specifico al ceppo (Tabelle 2 e 3), dove il L. rhamnosus, ha dimostrato di essere il pi? efficace per migliorare le caratteristiche biochimiche delle LDB. Questi dati sarebbero correlati alle attivit? enzimatiche dei batteri (idrolasi, esterasi, ecc.), che catalizzerebbero il rilascio di composti fenolici dalla fibra del frutto del dattero solubile e insolubile, aumentando cos? potenzialmente la loro bioaccessibilit? intestinale e la conseguente biodisponibilit? potenziale dei polifenoli del dattero. ? ampiamente documentato che i composti polifenolici sono massicciamente assorbiti a livello dell'intestino tenue ed ? anche noto che la biodisponibilit? intestinale dei polifenoli ? bassa, soprattutto a causa del loro elevato peso molecolare e polarit?. In questo scenario la lattofermentazione ? una preziosa strategia per liberare composti polifenolici dalla matrice alimentare, ma anche uno strumento per rimodellare la composizione polifenolica del frutto della palma da dattero a favore di quella pi? piccola e meno polare, quindi molecole bioattive ragionevolmente pi? assorbibili. Le analisi LC-MS degli estratti polifenolici delle LDB, hanno indicato un drastico cambiamento in termini di composizione polifenolica. La versione fermentata delle barrette di dattero da palma, ha mostrato una radicale riduzione dell'acido clorogenico a favore dei suoi componenti molecolari, ossia, l'acido caffeico. Questa molecola pu? esercitare effetti promotori pi? salutari rispetto al suo precursore e, in virt? della sua minore polarit? e dimensione, ? meglio assorbita nell'intestino tenue rispetto ai suoi precursori. L'aumento ottenuto degli acidi cinnamici (cio? acido ferulico e caffeico) ? anche correlato agli enzimi feruloil esterasi (EC 3.1.1.73), prodotti dai batteri, responsabili di catalizzare la risoluzione delle forme polifenoliche esterificate alla parete cellulare vegetale, che trasformandosi in rilascio di acidi fenolici liberi, disponibili per essere assorbiti a livello intestinale]. ? stato osservato il rilascio di acido gallico nelle LDB considerate nel nostro studio. Questo composto pu? essere rilasciato tramite l'attivit? della tannasi. La tannasi o tannino acilidrolasi (EC 3.1.1.20) catalizza l'idrolisi dei legami esterei presenti nei tannini idrolizzabili e negli esteri dell'acido gallico, rilasciando glucosio e acido gallico. La versione fermentata, inoltre, era anche arricchita in quercetina, un polifenolo non polare largamente assorbito a livello intestinale. l'? -ramnoside microbico (in gran parte prodotto da L. rhamnosus) pu? idrolizzare la quercitrina (quercetina 3-O- ramnoside) nella sua forma aglicone (quercetina), ma anche la rutina, pu? essere idrolizzata dall'aramnosidasi per produrre quercetina-3-O- glucoside, e quindi ulteriormente idrolizzato dall'? -glucosidasi (enzima batterico) per rilasciare quercetina. Alla luce di quanto sopra, la ricchezza polifenolica di questi prodotti, non solo ? fortificata dal profondo rimodellamento operato dall'attivit? batterica, ma una generale stabilit? polifenolica ? stata migliorata dal cambio di pH (da acido neutro ad acido lieve), esaltandone la loro bioaccessibilit? intestinale e biodisponibilit?.
Conclusione
Sulla base di questi ingredienti funzionali contenuti nel dattero, i prodotti LDB, e in particolare quelli con L. rhamnosus, possono essere proposti come prototipo di alimento funzionale, indicato principalmente per l'alimentazione e l'integrazione atletica. In realt?, il prodotto cos? strutturato ? da considerarsi bifunzionale, poich? dopo la biotrasformazione, aumenta il tasso di composti fenolici liberi e semplici, pi? assorbibili a livello intestinale e allo stesso tempo fungono da vettore per i probiotici. Le quantit? pi? elevate, di composti fenolici liberi, possono essere un impareggiabile alleato per contrastare il forte stress ossidativo a cui gli atleti o soggetti in particolari condizioni patologiche, sono costantemente sottoposti; l'alto livello di glucosio ? un'ottima fonte di energia e gli alti livelli di minerali possono riequilibrare la perdita di minerali durante attivit? sportive od in seguito a patologie sistemiche. Infine, i probiotici vivi possono fornire agli atleti benefici per la salute secondari che potrebbero influenzare positivamente le prestazioni atletiche attraverso un migliore recupero dalla fatica, una migliore funzione immunitaria e il mantenimento di una sana funzione gastrointestinale e del tratto respiratorio superiore. Infine, una recente sperimentazione clinica ha dimostrato l'importanza della supplementazione di probiotici per contrastare l'elevato livello di stress ossidativo e per aumentare la forza e la resistenza muscolare .
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante la composizione della presente invenzione. In particolare, tale composizione si ? mostrata sorprendentemente e vantaggiosamente adatta per nella prevenzione e/o trattamento di una malattia o condizione patologica intestinale o della pelle.
Claims (10)
1. Una composizione nutraceutica comprendente:
- uno o pi? ceppi di un microorganismo probiotico;
- uno o pi? prebiotici; e
- polpa di dattero di palma, o altra sua forma.
2. La composizione secondo la rivendicazione 1, in cui detto uno o pi? ceppi di microorganismo probiotico ? scelto dal gruppo consistente in ceppi di batteri lattici, di bifidobatteri, di lieviti o di bacilli.
3. La composizione secondo la rivendicazione 2, in cui detto uno o pi? ceppi di batteri lattici ? scelto dal gruppo consistente in ceppi di L. plantarum, L. bulgaricus, L. acidophilus o L. rhamnosus, detto uno o pi? ceppi di bifidobatteri ? scelti dal gruppo consistente in ceppi di B. longum, B. bifidum o B. breve e detto uno o pi? ceppi di bacilli ? un ceppo di B. clausii.
4. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui detto uno o pi? prebiotici ? uno o pi? cereali scelto dal gruppo consistente in grano, orzo e avena, ortaggi, tuberi o frutti.
5. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, in cui detto estratto di dattero di palma ? la polpa di dattero di palma in forma fresca, essiccata, in polvere, liquida o qualsiasi altra sua forma.
6. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, comprendente ulteriormente almeno una ulteriore componente biologicamente attiva scelta dal gruppo consistente in kuzu, teff, micronutrienti, sali minerali, e vitamine.
7. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, in cui detta composizione ? formulata in forma di barretta alimentare, o altro preparato nutraceutico.
8. Composizione nutraceutica secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7, per l?uso nella prevenzione e/o trattamento di una malattia o condizione patologica intestinale o della pelle.
9. La composizione per l'uso secondo la rivendicazione 8, in cui detta malattia o condizione patologica intestinale ? scelta dal gruppo consistente in disbiosi intestinale, irregolarit? intestinale, diarrea, sindrome di colon irritabile, diverticolosi e in cui detta malattia o condizione patologica della pelle ? scelta dal gruppo consistente in dermatite o eczema, e coadiuvante nell?attivit? sportiva,
10. Composizione nutraceutica secondo una delle rivendicazioni da 1 a 7, per l?uso nella stimolazione del sistema immunitario.
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